Bài giảng Kỹ thuật sản xuất vacin

Phân loại vaccin Vaccin bất hoạt vaccin chết Chứa các vi sinh vật độc đã được làm chết bằng các chất hóa học hoặc nhiệt độ, do đó không còn sinh sôi trong chủ thể được nữa Ưu: nói chu

Sản xuất vaccin

Yêu cầu :

1 Phân biệt được các loại vaccin.

2 Nêu qui trình cơ bản để sản xuất vaccin vi khuẩn

3 Nêu qui trình cơ bản để sản xuất vaccin virus

• Thành công trong quá khứ

• Triển vọng cho tương lai

Vaccin

một hoặc nhiều loại vi sinh vật, dùng để

gây miễn dịch chủ động dự phòng

Vaccin lý tưởng

 Sinh miễn dịch

Bắt chước nhiễm tự nhiên

 Cho sự bảo vệ kéo dài

Khoảng cách giữa các liều xa

 Không gây tác dụng phụ nghiêm trọng

 Ổn định

Phân loại vaccin

Vaccin bất hoạt (vaccin chết) Vaccin sống giảm hoạt lực Vaccin độc tố

Vaccin dưới đơn vị

Một số vaccin mới

Vaccin idiotyp Vaccin liên hợp Vaccin vector tái tổ hợp Vaccin DNA

Vaccin tổng hợp

Phân loại vaccin

Vaccin bất hoạt (vaccin chết)

Chứa các vi sinh vật độc đã được làm chết bằng các chất hóa

học hoặc nhiệt độ, do đó không còn sinh sôi trong chủ thể

được nữa

Ưu: nói chung an toàn, nhưng không phải là tuyệt đối

Các nội độc tố bề mặt trên vaccin ho gà bất hoạt đôi khi

bệnh chết không thể đi vào tế bào chủ  không tác dụng

nếu là nhiễm nội bào

Cần nhiều liều hơn để cho bảo vệ lâu dài

Ví dụ vaccin chống lại cúm, tả, ho gà, dại, dịch hạch, viêm

chứa các vi sinh vật sống được làm suy yếu độc lực hoặc vi

sinh vật gần giống nhưng ít nguy hiểm hơn( BCG)

Ưu: Kích thích kháng nguyên liên tục đủ lâu để sản xuất tế

bào nhớ  tạo đáp ứng miễn dịch bền

Phân loại vaccin

Vaccin độc tố

chứa các độc tố đã bất hoạt không còn gây bệnh

Ví dụ

các vaccin độc tố uốn ván và bạch hầu,

vaccin độc tố Crotalis atrox chống lại rắn chuông

cắn dùng cho chó

Chứa một phần nhỏ của tác nhân gây bệnh sản xuất từ vi sinh

vật an toàn hoặc tế bào nuôi cấy để gây ra đáp ứng miễn dịch

Bằng cách này, có thể tránh được các độc tố mạnh, hoặc loại

bỏ được các vật liệu mơ hồ hoặc đáp ứng miễn dịch lấn át

Ưu: Ít tác dụng phụ hơn vaccin cổ điển

An toàn hơn

Ví dụ

vaccin Haemophilus influenza type b,

vaccin chống lại HBV chỉ chứa các protein bề mặt của virus vaccin tiểu phần giống virus chống lại HPV chứa protein

capsid chính của virus

Phân loại vaccin

Một số vaccin mới

Vaccin idiotyp Vaccin liên hợp Vaccin vector tái tổ hợp Vaccin DNA

Vaccin tổng hợp

Kháng thể

epitopVirus

kháng thể

Tạo kháng thể kháng lại kháng thể idiotyp

Kháng thể

kháng-idiotyp

Kháng thể kháng- idiotyp bắt chước epitop

Vaccin idiotyp (tt)

Kháng thểkháng-kháng-idiotyp

Kháng thể cho kháng

thể kháng-idiotyp

Gắn và trung hòa virus

Kháng thể kháng-idiotype

Kháng thểkháng-kháng-idiotyp

Kháng thểkháng-kháng-idiotyp

Dùng như vaccin

Vaccin idiotyp (tt)Dùng kháng thể kháng-idiotyp làm vaccin

Phân loại vaccin

Vaccin liên hợp

Vaccin polysacchride

Vỏ ngoài polysacchrid là KN không phụ thuộc T- cell, tạo miễn dịch yếu ở trẻ nhỏ, không tạo hoặc ít trí nhớ miễn dịch, ảnh hưởng nhắc lại kém

 liên kết các polysacchrid này với protein (độc tố) 

KN protein

Vaccin chống viêm phổi do phế cầu chứa 23 loại

polysaccharide từ nang của 23 chủng St pneumoniae Vaccin Haemophilus influenzae type B

Vaccin vector tái tổ hợp

Là kết hợp sinh lý của một vi sinh vật và DNA của

vi sinh vật khác, để chống lại các bệnh có quá trình

nhiễm phức tạp

Ví dụ

Vaccin phòng một số bệnh do virus được làm bằng

cách tái tổ hợp biến chủng virus đậu bò với các

gen vô hại của virus gây bệnh,

Giá mang Mycobacterium bovis (chủng BCG)

Phân loại vaccin

Virus đậu bò thuộc họ Orthopoxvirus

Sinh sản trong nhiều vật chủ

Virus ADN gồm 150-200 gen , ADN xoắn kép có

187.000 cặp nucleotid bao bọc bởi vỏ lipid

Loại trừ một phần hệ gen của virus đậu bò 

không còn đặc tính gây bệnh nào nữa

Tạo virus tái tổ hợp

• ADN mã hóa các kháng nguyên virus gây bệnh được

phân lập và biến đổi để gen thể hiện được trong ADN

của virus đậu bò  Ghép với ADN của virus đậu bò

 gen mã hóa ngưng kết hồng cầu tố của virus cúm

 kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B

 glycoprotein của virus herpes thông thường, virus dại, virus Epstein-Barr, virus HIV, virus gây viêm đường tiêu hóa dễ lây …

• Làm vaccin đa giá gồm 20 loại KN virus khác nhau

Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò

Phân loại vaccin

Ưu điểm

• Vaccin virus đậu bò có tác dụng miễn dịch

kéo dài do ổn định về mặt di truyền

• Trình tự ADN dễ biến đổi trong phòng thí nghiệm 

Ta có thể đối phó với các thay đổi của tác nhân nhiễm

• Bằng cách dùng plasmid trong vaccin để mã hóa cho

tổng hợp kháng nguyên, protein kháng nguyên được

sản xuất được biến đổi hậu dịch mã theo cùng cách

với protein của virus chống lại sự phòng vệ khi đi vào

 Tạo kháng nguyên tốt hơn là protein tinh khiết

Phân loại vaccin

• Có thể sản xuất vaccin phổ rộng nếu dùng hỗn hợp

plasmid mã hóa cho nhiều đoạn protein từ một hay

nhiều loại virus

• Plasmid không sao chép và chỉ mã hóa các protein

quan tâm

• Không có thành phần protein nên sẽ không có đáp

ứng miễn dịch chống lại vector

• Cách trình diện này của kháng nguyên  Đáp ứng

CTL trực tiếp chống lại bất cứ kháng nguyên nào của

mầm bệnh Đáp ứng CTL cũng phòng vệ các bệnh

gây bởi các tác nhân nội bào bắt buộc (ví dụ M

tuberculosis)

không đặc hiệu với kháng nguyên đó)

Phân loại vaccin

Ưu điểm của vaccin ADN cho cúm:

Đáp ứng CTL có thể chống lại protein nội sinh

Ở chuột vaccin ADN nucleoprotein có hiệu quả

chống lại nhiều virus có hemagglutinin khác nhau

Phân loại vaccin

Vaccin tổng hợp

Chứa các peptid, các carbohydrat hoặc các kháng

nguyên tổng hợp phần chính hoặc toàn phần

 Vaccin peptid tổng hợp vi khuẩn

T rung hòa độc tố Vaccin peptid tổng hợp độc tố bạch hầu và tả

 Vaccin peptid tổng hợp virus

C ác vùng không biến đổi Các vaccin peptid tổng hợp cho các protein và glycoprotein HIV đang được phát triển

 Vaccin peptid tổng hợp ký sinh trùng

vaccin peptid tổng hợp cho các epitop bào tử

Một số tên phân loại vaccin khác

 Vaccin hấp phụ: Vaccin DPT được hấp phụ trên “giá

đỡ” gel nhôm hydroxyt.

 Vaccin khác chủng: Vaccin có tác dụng chống lại vi

sinh vật khác với loài dùng để chế nó Ví dụ: vaccin từ đậu

bò để phòng đậu người.

 Vaccin đa giá: Vaccin chứa các kháng nguyên bảo vệ

của nhiều chủng thuộc về một loài vi khuẩn gây bệnh Ví dụ:

TAB.

 Vaccin hỗn hợp : Vaccin gồm nhiều kháng nguyên của

các loài vi sinh vật khác nhau, để phòng nhiều bệnh nhiễm

trùng Ví dụ: DPT, Priorix.

Phương pháp

sản xuất vaccin

Kháng nguyên 1

Kháng nguyên 2

Kháng nguyên 3

Tá chất

1 Hệ thống giống

2 Sản xuất vi khuẩn và các thành phần vi khuẩn

của vaccin vi khuẩn

3 Sản xuất virus và các thành phần virus của

vaccin virus

4 Phối trộn

5 Đóng ống và làm khô

6 Kiểm soát chất lượng

Phương pháp sản xuất vaccin

Phân lập vi sinh vật thích thích hợp

từ các nhiễm trùng ở người thao tác và chọn lọc thêm Làm lô giống (seed lot)

nhân vi sinh vật thích thích hợp lên phân vào ống

bảo quản ở -70 0 C hoặc đông khô

Kiểm tra độ an toàn và hiệu quả thử lâm sàng Khi

các kết quả thử lâm sàng đạt công nhận, lô giống

được dùng thường qui cho sản xuất vaccin

2 Sản xuất vi khuẩn và các thành phần

vi khuẩn của vaccin vi khuẩn

Lên men Thu vi khuẩn

Phương pháp sản xuất vaccin

- Hoạt hóa giống vi khuẩn từ -70 0 C /đông khô

- Cấy chuyển một hoặc vài lần vào môi trường nhân

giống  đủ lượng

- Cấy chuyển giống vào môi trường lên men

khuấy liên tục, theo dõi và điều chỉnh pH và thế

oxy hóa khử của môi trường suốt quá trình nuôi

- Thời gian: 1 ngày - 2 tuần

 Thu hoạch

Sản phẩm lên men:

tế bào vi khuẩn, các sản phẩm chuyển hóa và môi trường cạn kiệt

Phương pháp sản xuất vaccin

Vaccin sống giảm hoạt lực

tách vi khuẩn không độc ra hòa vào dung môi thích hợp, có thể đông khô

Quá trình thu vi khuẩn

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

1 Giết chết

Dùng nhiệt và chất tẩy uế

Bordetella pertusis làm vaccin ho gà - dùng đun

nóng /hoặc formalin

Vibrio cholerae trong vaccin tả và Salmonella typhi

trong vaccin thương hàn - dùng phenol

Phương pháp sản xuất vaccin

2 Tách

dùng ly tâm

Thu tế bào và hòa vào hỗn hợp muối hoặc

Thu dịch lỏng, bỏ tế bào

3 Phân đoạn

Chiết các thành phần từ tế bào hoặc từ môi trường

nuôi vi khuẩn

Tinh chế bằng dung môi thích hợp và kết tủa

Làm khô thành bột, bảo quản và hợp nhất vào vaccin

4 Khử độc tố

chuyển độc tố của vi khuẩn thành độc tố không hại

dùng Formalin khử độc tố của C diphthe và C tetani

Tiến hành trên dịch nuôi cấy trong nồi lên men hoặc

trên độc tố tinh khiết sau khi phân đoạn

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

5 Hấp phụ

Chất hấp phụ: tá chất khoáng, nhôm hydroxid, nhôm

phosphat và canxi phosphat  tăng tính kháng

nguyên và giảm độc tính tại chỗ và hệ thống của

vaccin

Vaccin bạch hầu và vaccin bạch hầu/uốn ván/ho gà

Phương pháp sản xuất vaccin

6 Kết hợp

Để tăng cảm ứng đáp ứng miễn dịch

Polysaccharide nang của H influenzae Type b + độc

tố bạch hầu và uốn ván + protein màng ngoài của

3 Sản xuất virus và các thành phần virus

của vaccin virus

Nuôi virus Thu virus

Nuôi virus trong phôi gà, vịt hoặc nuôi cấy mô

- Chọn mô thích hợp cho virus

- Cần tuyệt đối vô trùng trong quá trình nuôi cấy, kiểm nghiêm ngặt động vật tuyệt đối KHÔNG

được để nhiễm virus lạ vào phôi

Trứng gà có phôi

Virus cúm tích tụ trong dịch túi niệu của trứng

Virus sốt vàng da tích tụ trong hệ thống thần kinh của phôi

Phương pháp sản xuất vaccin

Nuôi virus

Nuôi cấy chìm

Vaccin cúm : ly tâm dịch túi niệu  huyền trọc virus tinh khiết một phần và đậm đặc  xử lý với ete

hoặc với tác nhân phá vỡ khác để cắt virus thành

các thành phần của nó nếu muốn có vaccin virion

hoặc kháng nguyên bề mặt

Vaccin sốt vàng da: đồng hóa phôi gà trong nước

thành bột nhuyễn chứa virus  ly tâm kết tủa hầu

hết mảnh vỡ của phôi và virus sốt vàng da

Lọc và thu dịch có chứa virus

Không có giai đoạn bất hoạt vì hầu hết vaccin làm từ

nuôi cấy tế bào chứa virus sống suy yếu

Ngoại trừ 2 trường hợp

Vaccin virus bại liệt bất họat được bất hoạt với

formalin loãng hoặc β 3-propiolactone  hấp phụ và rửa

Vaccin dại được bất hoạt với β 3-propiolactone 

siêu lọc

Khi hoàn tất, khối nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt

độ -70 0 C đến khi trộn thành vaccin cuối

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu virus

mỗi lô sản phẩm

Thực hiện theo ba cách: (1) kiểm soát trong quá

trình; (2) kiểm soát sản phẩm cuối và (3) yêu cầu

phù hợp cho mỗi nguyên liệu sản xuất ban đầu,

trung gian, sản phẩm cuối và các phương pháp

xử lý Các kết quả kiểm tra kiểm soát chất lượng

luôn được ghi chi tiết.

Kiểm tra độ an toàn gồm các kiểm tra tổng quát

là: (1) Độ vô trùng, (2) Không có độc tố bất

thường, (3) Sự hiện diện của nhôm và calci, (4)

Formalin tự do và (5) Nồng độ phenol

Phương pháp sản xuất vaccin

Ví dụ

Nuôi cấy

Làm bất hoạt

Kiểm tra độ tinh khiết và đáp ứng miễn dịch

Bào chế

Hòa 5x10 8 vi khuẩn /1ml NaCl đẳng trương

Môi trường lỏng casein Cấy giống 5%-10% V Nuôi cấy liên tục có hệ thống khuấy 180-300 vòng/1 phút Sục khí vô trùng 1lít/1phút; Thêm dung dịch glucose 40%

Trộn sinh khối với EtOH 96 0 lần 1- 1:4 , lần 2- 1:10

Đưa dung dịch về điểm đẳng điện bằng NaCl có chứa 0,25% phenol, 1ml vaccin cồn chứa 5x10 9 vi khuẩn

Đóng ống và đông khô ở -40  -50 0 C Đóng gói

6x10 10 vi khuẩn/ 1ml

Nuôi cấy Làm khô sinh khối bằng cồn Chiết bằng nước cất (3 lần)

Tủa bằng cồn Lần 1: cồn + NaCl bão hòa Lần 2: cồn pH 3,5 – 3,8 Lần 3: cồn 46-52%

Đông khô

Bào chế Hòa kháng nguyên Vi trong NaCl đẳng trương 40 µg/ml

Sản xuất kháng nguyên Vi (vỏ) tinh khiết từ

vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi

Kháng nguyên Vi dùng ở dạng mono vaccin hoặc

Vi = virulence

 Giống Clostridium tetani

 Tinh khiết hóa

hấp phụ lại với Al(OH) 3

 Kiểm tra độ tinh khiết và đáp ứng miễn dịch

 Bào chế

1 ml vaccin chứa 20 đơn vị ngưng kết, pH 6,8-7,6

Sản xuất vaccin chống viêm gan B

Nguyên nhân: HBV, truyền qua đường tiêm chích, tình dục

Mỹ: 200.000 người nhiễm/năm, trong đó 20.000 người mang mầm bệnh và 1/5 số này chết do xơ gan, 1/20 bị ung thư gan

1963: phát hiện kháng thể HBV trong máu bệnh nhân ưa chảy máu

1968: HBsAg

nuôi HBV trên tế bào gan - KHÓ1970: huyết thanh người nhiễm HBV mãn

người bị nhiễm virus hepatitis B mãn tính

Không dùng phương pháp nuôi cấy mô được đây là virus ái gan

mà tế bào gan nguyên thủy lại khó nuôi cấy

Các bước chính

Máu người nhiễm viêm gan siêu vi B mãn tính

Bất hoạt bằng permalin, T o và hydroxyt nhôm hoặc

pepsin, urease và formalin Tinh chế kháng nguyên

Thử độc tính và đáp ứng miễn dịch Thử độc tính trên tinh tinh / 65 tuần cho mỗi lô vaccin Thử hoạt tính kháng nguyên của vaccin trên chuột lang

và chuột nhắt

Đi từ tế bào vi khuẩn và nấm men

• phân lập gen mã hóa HBsAg

• đưa gen này vào E coli hoặc S cerevisae

• sản xuất HBsAg bằng nuôi cấy vi khuẩn hoặc nấm men

• tách kháng nguyên từ tế bào 1-3 µg/1ml dịch nuôi cấy

Sản xuất vaccin chống viêm gan B

tái tổ hợp

Ưu điểm

• Các virus này có thể sao chép độc lập trong tế bào

như những plasmid vi khuẩn

• Các tế bào động vật có vú có khả năng khuyếch đại

lớn các kháng nguyên: 1 ml dịch nuôi cấy cho 24 µg kháng nguyên

• Tỷ lệ glycozyl hóa cao, dễ tách kháng nguyên từ dịch

và kháng nguyên được sản xuất liên tục

Pp truyền thống

huyết thanh người mang HBV

Bất hoạt (formaldehyde)   Tinh chế kháng nguyên

Thư độc tính và đáp ứng miễn dịch

(tinh tinh/ 65 tuần cho mỗi lơ) Thử hoạt tính (chuột lang và chuột nhắt)

40 lít  1 liều văc-xin

Pp mới 40 lít dịch nuơi cấy S cereviseae tái tổ hợp mang gen mã

hĩa protein S từ HBV  nhiều liều văc-xin

Sản xuất vaccin chống HBV: so sánh pp truyền thống và tái tổ hợp

Sản xuất vaccin chống viêm gan B