Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly chlorophyll từ lá rau ngót và ứng dụng tính chất tạo màu của chlorophyll trong sản phẩm kem

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ÐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY CHLOROPHYL

TỔNG QUAN

Tổng quan về rau ngót

Rau ngót hay bù ngót, rau tuốt, hay bồ ngót là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới châu Á nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, như ở Việt Nam

 Giới: Plantae - plantes, Planta, Vegetal

 Loài: Sauropus androgynus (L.) Merr - chekkurmani, star-gooseberry, katuk

 Tên thường gặp: Katuk, Star Gooseberry, Sweet Leaf, Sabah Vegetable (National Plant Data Center, 2000)

Hình 1.1 Hình ảnh minh họa cho rau ngót

Tên chi Sauropus của nó có nguồn gốc từ hai từ tiếng Hy Lạp "sauros" và "pous" có nghĩa là "một chân" Biểu tượng cụ thể có nguồn gốc từ từ tiếng Latin “androgynus” có nghĩa là cả hoa đực lẫn hoa cái đều được sinh ra trên cùng một cây

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Rau ngót là một cây bụi thuộc họ Euphorbiaceae, phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ướt và là một trong những loại thảo mộc phổ biến nhất ở Nam Á, Đông Nam Á, và Trung Quốc, được trồng rộng rãi cho các mục đích y học cổ truyền (Hamidun và cộng sự,

2015) Đây là một loại cây bụi mọc thẳng có thể cao đến 500cm Nó rất mềm và có các nhánh hình trụ Lá có hình lưỡi liềm, kích thước 2,0–7,5cm và nhọn Hoa đực có hình tròn hoặc gần như tròn Quả hình cầu, đường kính lên đến 1,5cm và màu trắng Cây này được trồng rộng rãi và có nguồn gốc từ Đông Nam Á bao gồm Bangladesh, Ấn Độ, Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam và Vân Nam (P.T Li và cộng sự, 2008)

Các thành phần gần đúng hay hàm lượng dinh dưỡng của lá rau ngót được mô tả trong Bảng 1.1 Lá có độ ẩm dao động từ 69,9% đến 89,9%, và hàm lượng protein của cả mẫu khô và tươi nằm trong khoảng từ 4,2% đến 29,15% Một số mẫu có hàm lượng chất xơ cao, và hàm lượng carbohydrate của nó chưa được báo cáo bởi một số nghiên cứu trước đây (Hock Eng Khoo và cộng sự, 2015)

Bảng 1.1 Hàm lượng dinh dưỡng có trong lá rau ngót (A.J.A Petrus, 2013)

Thành phần Ấn độ Thái

Năng lượng (kcal) 28,0 40,4 317 401,4 - - 100,5 Độ ẩm (%) 88,0 88,5 89,9 - 82,9 86,9 79,4

Bảng 1.2 Hàm lượng vitamin có trong lá rau ngót (A.J.A Petrus, 2013)

Vitamin C (Ascorbic acid) Ấn Độ - - - 22,0

Bảng 1.3 Hàm lượng các loại chất khoáng có trong lá rau ngót (A.J.A Petrus, 2013)

Thành phần Ấn Độ Thái Lan Thái Lan Indonesia Việt Nam

1.1.4 Công dụng của rau ngót

Giá trị dinh dưỡng: được biết đến là “multigreen” do hàm lượng vitamin và chất dinh dưỡng cao Loại rau này thường được ăn sống trong salad, xào, dùng trong cà ri, hoặc nấu trong súp ở hầu hết các nước ở Đông Nam Á (Hamidun Bunawan và cộng sự, 2015)

Nó rất giàu vi chất dinh dưỡng và chất phytochemical (hóa chất thực vật: những hóa chất tự nhiên có nguồn gốc và tồn tại trong thực vật) Những loại rau hoang dã này chứa các chất chống oxy hóa mạnh (A.J.A Petrus, 2013) Các tài liệu trước đây đã báo cáo rằng lá của rau ngót có hàm lượng chất chống oxy hóa sinh học cao Sử dụng nhiều rau

5 ngót góp phần đáng kể vào việc hấp thu vi chất dinh dưỡng ở những phụ nữ nông thôn Việt Nam (Ogle và cộng sự, 2001) Trong số các chất phytochemical, polyphenol là các chất hoạt tính sinh học nổi tiếng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh khác nhau Bên cạnh các hợp chất phenolic, guanosine là một hoạt tính sinh học tiềm năng trong lá rau ngót thể hiện hoạt động chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương oxy hóa (Gudkov và cộng sự, 2006)

Chống béo phì: rau ngót còn được biết đến như là một chất có khả năng giảm béo Tuy nhiên, một số nghiên cứu mô tả rằng việc tiêu thụ quá nhiều rau ngót có thể gây buồn ngủ, táo bón, viêm phế quản và có thể dẫn đến suy hô hấp (A.J.A Petrus, 2013)

Ngăn ngừa bệnh đái tháo đường: các nghiên cứu đánh giá tác động của việc tiêu thụ rau ngót lên mức glucose sau bữa ăn trong máu người cho thấy chỉ số glycemic index (GI) cho bệnh nhân được sử dụng rau ngót thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng Kết quả này cho thấy rằng cây này có tiềm năng cao trong việc làm giảm lượng đường trong máu người, có khả năng sẽ hỗ trợ trong cuộc chiến toàn cầu để giảm bệnh tiểu đường (Hamidun Bunawan và cộng sự, 2015)

Hoạt động chống oxy hóa: Một số nghiên cứu đã báo cáo hoạt tính chống oxy hóa tích cực của rau ngót Các nghiên cứu cho thấy nó có tiềm năng chống oxy hóa mạnh, hàm lượng flavonoid cao nhất trong số 11 loại rau có nguồn gốc Indonesia Một nghiên cứu trước đây về các hoạt động chống oxy hóa trên dịch chiết của 25 loại thực vật nhiệt đới cho thấy rau ngót có hàm lượng polyphenol cao, đẩy lùi gốc tự do và giảm các đặc tính chống oxy hóa ion sắt (Hamidun Bunawan và cộng sự, 2015).

Chlorophyll

Chlorophyll là một sắc tố màu xanh lá cây được tìm thấy trong hầu hết các loại thực vật, tảo, vi khuẩn lam Tên của nó có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp chloros (màu xanh lá cây) và phyllon (lá) Có ít nhất 4 dẫn xuất tương tự nhau, tỉ lệ các dẫn xuất này thay đổi tùy theo loài thực vật mà chúng ta nghiên cứu (Blankenship, R.E., 2008) Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém hấp thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng Do đó, màu

6 các mô chứa chlorophyll có màu xanh lá cây Hàm lượng của Chlorophyll trong cây xanh chiếm khoảng 1% chất khô (Speer, Brian R, 1997)

Chlorophyll là chất màu tự nhiên quan trọng, tuy nhiên vì độ bền màu thấp nên được sử dụng rất hạn chế Nó được sử dụng nhiều trong mỹ phẩm Trong thực phẩm, người ta sử dụng một lượng rất nhỏ cho các sản phẩm mứt kẹo, yoghurt và kem

Số lượng chlorophyll tự nhiên có thể chưa được biết đầy đủ Chlorophyll a và b là thành phần chính của hệ thống quang học trong các sinh vật quang hợp Các loại sắc tố chlorophyll khác nhau có trong tự nhiên theo thứ tự quan trọng giảm dần được đưa ra trong Bảng 1.4

Ban đầu, chlorophyll được phân ra bốn loại - chlorophyll a, b, c và d (Vernon và Seely, 1966) Nhưng sau đó, một loại tảo lục mới được phát hiện trong stromatolite (một cấu trúc đá cứng được tạo ra bởi vi khuẩn lam) ở Tây Úc được đặt tên là chlorophyll f Do đó, cuối cùng chlorophyll được chia thành năm lớp là chlorophyll a, b, c, d và f

Bảng 1.4 Các loại chlorophyll khác nhau trong tự nhiên, theo thứ tự phong phú từ hầu hết

Chlorophyll có công thức phân tử là C55H70O6N4Mg và cấu trúc 2-formyl- chlorophyll đã được phân tích dựa trên quang học và phổ khối (Müller và cộng sự, 2007)

Cấu trúc hoá học của chlorophyll là gần giống hemoglobin ở máu người, cũng gồm

4 nhóm heme gắn với một nguyên tố kim loại Ở người, nhóm heme gắn với nguyên tố sắt, còn ở thực vật và tảo, nguyên tố magie (Mg) thay thế cho nguyên tố sắt Người ta còn gọi chlorophyll là máu của thực vật (A Humphrey, 2004)

Cấu trúc hóa học của các dạng chlorophyll được tóm tắt trong Hình 1.2 (Sunil,

2010) Chlorophyll có đầu và đuôi dài (ngoại trừ loại chlorophyll c) Đầu bao gồm một vòng porphyrin hoặc hạt nhân tetrapyrrole, từ đó kéo dài một cái đuôi tạo thành một nhóm 20-carbon gọi là phytol Đuôi của dạng c ngắn và liên kết với vòng porphyrin từ C17 (Benjamin, 2012)

Sự có mặt của một chuỗi hydroracbon nhánh bên khiến cho phân tử chlorophyll có đặc tính tan trong lipid

Mặt khác, đồng có thể thay thế magie trong công thức phân tử của chlorophyll Hợp chất mới có chức năng este, có khả năng xà phòng hóa Các hợp chất có đồng này đều bền vững hơn và cải thiện tính tan trong nước Tuy nhiên, vì các hợp chất này không tồn tại trong tự nhiên cho nên chúng không được coi là chlorophyll tự nhiên (Benjamin, 2010)

Phức chlorophyll và chlorophyll nhân Cu được phép sử dụng như chất màu thực phẩm rộng rãi ở châu Âu Ở châu Mỹ, họ chỉ dùng cho sản phẩm về răng (như kem đánh răng, nước súc miệng,…) Đây là các sản phẩm được điều chế từ chlorophyll và có độ bền cao hơn Hàm lượng sử dụng chlorophyll nhân Cu là 30-50 ppm đối với sản phẩm kẹo có màu và từ 50-100 ppm đối với sản phẩm kem (A Levent İnanỗ, 2011)

Trong tự nhiên, chlorophyll tồn tại ở hai dạng:

Hai loại này khác nhau về hàm lượng oxy, hydro và một số tính chất riêng

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các loại chlorophyll (Sunil., 2010)

Trong đa số thực vật bậc cao thì tỉ lệ Chlorophyll a/Chlorophyll b = 3/1 Tỉ lệ này có thể thay đổi dựa vào nhiều yếu tố như loài, trạng thái, môi trường (độ ẩm, độ sáng, chất khoáng,…) (G.W Francis, 2000) Ví dụ: thực vật sống ở nơi có ánh sáng nhiều thì tỉ lệ chlorophyll a so với chlorophyll b cao hơn những loài thực vật sống ở chỗ mát, tối Đối với trái cây, khi chín, tỉ lệ 3/1 này có khuynh hướng giảm xuống nhưng trong vài trường hợp đặc biệt thì tỉ lệ này lại tăng lên do chlorophyll b bị phân hủy nhanh hơn chlorophyll a

Màu của chlorophyll b nhạt hơn màu của chlorophyll a Chlorophyll b khác chlorophyll a ở chỗ: nhóm –CHO thay cho nhóm –CH3 ở chlorophyll a

1.2.4 Tính chất vật lý (Nguyễn Thị Ngọc Hợp, 2006)

 Dịch chiết trong cồn có màu xanh đậm

 Tan trong ethanol, acetone, benzene

 Tan ít trong ete dầu hỏa

 Nhiệt độ nóng chảy: Tnc0-130 o C

Loại chlorophyll này được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật quang hợp, tức là thực vật, tảo, vi khuẩn lam và thủy sinh (Nakamura và cộng sự, 2003; Jordanet, 2001)

 Dịch chiết trong cồn có màu xanh lá mạ

 Nhiệt độ nóng chảy: Tnc0-130 o C

Trước đây, nó được gọi là chlorophyll β Chlorophyll b đã được xác nhận là có trong tảo xanh và cả ở thực vật bậc cao Nó hỗ trợ chlorophyll a trong quá trình quang hợp Sắc tố này có màu vàng ở trạng thái tự nhiên nhưng hấp thụ ánh sáng xanh từ toàn bộ phổ mặt trời (Strain và cộng sự, 1963)

 Ít tan trong ete dầu hỏa

 Tan trong ethanol, acetone, ethylacetate

Chlorophyll c là một sắc tố màu vàng nâu đi kèm với chlorophyll a trong quá trình quang hợp như một sắc tố đi kèm Nó có ba lớp con, được đặt tên là chlorophyll c 1 , c 2 và c 3 , được tìm thấy trong các loại tảo khác nhau (Beale, 1999) Sắc tố này được tìm thấy rộng

10 rãi ở các sinh vật biển khác nhau như tảo cát, tảo nâu và các loại tảo biển khác (Strain và cộng sự, 1963; Smith và Benitez, 1955)

 Ít tan trong ete dầu hỏa

Chlorophyll d là nhóm chlorophyll nhỏ đã được xác định trong tảo đỏ (Rhodophyta) bởi Strain (1958) Nó thu được đầu cực đỏ của quang phổ của ánh sáng mặt trời Nó có thể được điều chế trong phòng thí nghiệm với sự trợ giúp của thuốc tím bằng cách oxy hóa chlorophyll a (Holt và Morley, 1959)

Chlorophyll f là nhóm chlorophyll cuối cùng được phát hiện Nó đã được tìm thấy trong vi khuẩn lam từ các stromatolite sâu ở khu vực phía tây Australia bởi Min Chen và các đồng nghiệp của ông Trong số tất cả các loại chlorophyll được biết đến, đó là loại có thể sử dụng điểm quang phổ thấp nhất từ cực cuối của phổ hồng ngoại để quang hợp Min Chen nhấn mạnh sự cần thiết phải sửa đổi vai trò năng động của chất chlorophyll Vì khám phá ra chất chlorophyll mới này đã đảo ngược hoàn toàn quan niệm truyền thống rằng quang hợp cần ánh sáng năng lượng cao (Chen và cộng sự, 2010)

Chlorophyll e là một loại hiếm, được báo cáo trong tảo vàng có tên là Vaucheria hamata và Tribonema bombycinum (Eugene và Govindjee, 1969) Cơ chế làm việc riêng của nó đã không được báo cáo rõ ràng

 Sự phân bố của chlorophyll ở trạng thái tự nhiên của chúng được tóm tắt trong Bảng 1.5

Bảng 1.5 Sự phân bố chlorophyll trong tự nhiên (Chen và cộng sự, 2010; Scheer, 1991)

Loại Sự hiện diện và phân bố

Chlorophyll a Tất cả các thực vật quang hợp (không bao gồm vi khuẩn)

Chlorophyll b Thực vật bậc cao và các loại tảo xanh

Chlorophyll c Tảo nâu và tảo cát

Chlorophyll d Các loại tảo đỏ khác nhau, được báo cáo trong tảo đỏ Rhodophyta Chlorophyll e Tảo vàng (Vaucheria hamata)

Dưới tác dụng của nhiệt độ và acid của dịch bào, màu xanh của chlorophyll bị mất đi tạo màu sẫm, một mặt là do protein bị đông tụ làm vỏ của tế bào phá hủy, mặt khác là do liên kết giữa chlorophyll và protein bị đứt làm cho chlorophyll dễ dàng tham gia phản ứng:

Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll

1.3.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp tách chiết chlorophyll

Do nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nước và kết hợp với protein màng, trong khi đó đuôi dài carbon của gốc rượu phytol lại mang tính kị nước và hướng tới cấu trúc lipid của màng tilacoit, nên phân tử chlorophyll chủ yếu hòa tan trong các dung môi hữu cơ Tuy nhiên, để tách chlorophyll ra khỏi lá một cách hiệu quả, người ta không dùng ether petrol hay benzen mà dùng cồn hoặc acetone pha với một ít nước để tách được hết phân tử chlorophyll từ lá Các sắc tố thuộc nhóm carotenoid cũng được chiết tách theo phương pháp này

Chlorophyll tách rời khỏi phức hệ sắc tố vẫn có khả năng hoạt động quang hóa, tức là vẫn có khả năng bị kích thích bởi ánh sáng và khi đó có thể làm được vai trò chuyển H + và e trung gian Hiện tượng này gọi là tính chất cảm quang của chlorophyll (Park S.Nobel

1.3.2 Các phương pháp chiết tách (Nguyễn Thị Minh Trang, 2012)

1.3.2.1 Trích ly có hỗ trợ sóng siêu âm

Khi áp dụng âm thanh vào trong chất lỏng, các sóng âm thanh sẽ được tạo thành và di chuyển trong nước, thay đổi đều từ tình trạng áp suất cao qua áp suất thấp Ở giai đoạn áp suất thấp, trong nước hình thành các bọt chân không chứa nhiều năng lượng Khi bọt chân không đủ lớn chúng sẽ nổ bùng vào bên trong (implode) trong giai đoạn áp xuất cao

Khi nổ, các lực có năng lượng cao được giải phóng và sẽ tạo ra các khoảng không bị ép Tại vùng bị phát nổ sẽ hình thành áp suất rất cao, các lực ép sẽ làm vỡ tế bào và tạo điều kiện trao đổi chất dễ dàng hơn Hiệu ứng này hỗ trợ sự chiết xuất chất lipid của tảo được dễ dàng hơn

Nếu áp dụng phương pháp chiết xuất bằng enzyme, thì lực áp siêu âm có thể hỗ trợ enzyme thâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng Qua đó, giải pháp này sẽ cho ra kết quả tốt hơn và nước sẽ đóng vai trò hòa tan như các dung dịch khác trong khi enzyme phân hủy các thành tế bào

Bộ chiết soxhlet là một loại máy ở phòng thí nghiệm được phát minh năm 1879 bởi Franz Von Soxhlet Ban đầu nó được thiết kế để chiết tách lipid từ vật liệu rắn Thông thường bộ chiết soxhlet chỉ cần được yêu cầu là nơi để hòa tan các hợp chất mong muốn vào dung môi, và không hòa tan các tạp chất vào dung môi đó Nếu các hợp chất mong muốn có mức hòa tan đáng kể vào trong dung môi thì sau đó chỉ cần một quá trình lọc đơn giản là có thể phân tách các hợp chất từ các chất không hòa tan

Thông thường thì một loại nguyên liệu rắn có chứa một vài hợp chất cần tách chiết, sẽ được gói vào trong một loại giấy được làm từ giấy lọc dày, rồi được nạp vào buồng chính của bộ soxhlet (bình trụ chiết)

1.3.2.3 Phương pháp trích ly siêu tới hạn

Tại trạng thái này CO2 mang hai đặc tính: Đặc tính phân tách của quá trình trích ly và đặc tính phân tách của quá trình chưng cất

Nó có khả năng hoà tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được thoát ra ở bình hứng Ở mỗi điều kiện nhiệt độ, áp suất khác nhau sẽ tương ứng với mỗi một đối tượng cần chiết tách khác nhau

17 Ưu điểm của phương pháp so với các phương pháp truyền thống:

 Sản phẩm có chất lượng cao: đối với tinh dầu thì có màu, mùi tự nhiên, không lẫn nhiều thành phần không mong muốn, với các hợp chất tự nhiên thì tách được các chất có hoạt tính cao;

 Không còn lượng dung môi dư;

 Tách các hoạt chất với hàm lượng cao;

 Không gây ô nhiễm môi trường;

 Là một phương pháp có công nghệ cao và an toàn với các sản phẩm tự nhiên

Một số loại dung môi chiết chlorophyll (Nguyễn Thị Minh Trang, 2012)

Dung môi acetone được sử dụng rộng rãi trong cả hai phương pháp trắc quang và huỳnh quang Đối với phương pháp trắc quang cần ly tâm để loại bỏ ảnh hưởng của độ đục của dung dịch, nhưng với phương pháp huỳnh quang thì có thể bỏ qua vì kĩ thuật này không nhạy với độ đục ở mức độ bình thường Nếu mẫu trắng (blank) có giá trị đo huỳnh quang cao hoặc không thể xét giá trị bằng 0 cho máy huỳnh quang bằng một dung môi acetone trắng, thì có nghĩa là acetone đã bị nhiễm bẩn Sự nhiễm bẩn thông thường là do sự sánh dầu từ quá trình chế tạo các bình chứa kim loại

Methanol có hiệu quả hơn acetone trong một vài trường hợp Phương pháp này có thể đo huỳnh quang trực tiếp khi không cần độ chính xác cao và hàm lượng phaeophytin thấp Khi cần độ chính xác cao hơn và phaeophytin có mặt với lượng đáng kể, dịch chiết methanol được làm khô và chuyển sang acetone 90% Phổ phaeophytin a và b khá nhạy với pH của môi trường trong dung môi methanol nhưng không nhạy trong dung môi acetone 90% Nếu có thể loại bỏ ảnh hưởng của pH thì có thể hiệu chỉnh trong quá trình tính toán, nhưng thường là không thể Kết quả của những ảnh hưởng này là những biểu hiện không theo qui tắc nào trong các phép xác định trắc quang cũng như phương pháp đo huỳnh quang

Dung môi này có hiệu quả khi ngâm chiết các loại tảo nâu, loại tảo này không bị ngâm chiết bởi các dung môi khác Dung môi này cho phép ngâm chiết hầu như hoàn toàn các loại tảo, chúng không để lại một chút sắc tố nào trong bã thải Dường như DMSO phá vỡ các thể hạt bên trong và cấu trúc màng của tảo nâu và tảo lam

1.3.3 Các phương pháp xác định chlorophyll

Có 4 phương pháp xác định chlorophyll

 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ( HPLC);

Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn phương pháp trắc quang Do đó, đối với các mẫu có hàm lượng chlorophyll nhỏ, phương pháp huỳnh quang sẽ ưu tiên được sử dụng HPLC là thiết bị phức tạp hơn nhưng vẫn dựa trên nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang và trắc quang

Phương pháp điện hóa xác định chlorophyll a bằng cực phổ tuần hoàn trực tiếp thông qua điện cực màng carbon (SPCE) thu được mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dương ở EV = +400 mV, điện cực so sánh là Ag/AgCl Theo kết quả nghiên cứu cho thấy là chlorophyll a hấp thụ trên bề mặt màng SPCE Hiện tượng hút bám này cho phép phát triển phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a dựa trên sự trao đổi trung gian bằng cực phổ tích góp hòa tan (AdSV) Phương thức cuối cùng để tối ưu phương pháp là khảo sát pH của dung dịch đệm tích góp, thời gian tích góp và lượng acetone của đệm tích góp

Sử dụng phương pháp tối ưu này để xác định hàm lượng chlorophyll a trong dung dịch đệm phosphate với nồng độ khoảng 0,014-2,24àM

Phương pháp đo trực tiếp: phương pháp này cho phép xác định chlorophyll trong sinh vật phù du mà không cần chiết hay xử lí hóa học Phương pháp đo huỳnh quang trực tiếp này có thể thực hiện theo 2 cách:

 Đo trên dòng chảy liên tục áp dụng cho giám sát môi trường;

 Đo trên mẫu nước riêng lẻ tại hiện trường hoặc phòng thí nghiệm

Thiết bị cho phương pháp đo trực tiếp này là máy đo huỳnh quang hiện trường 10-

AU hay máy huỳnh quang cho phòng thí nghiệm DT-700

Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp):

Tình hình nghiên cứu

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về chlorophyll trong nước chủ yếu áp dụng cho việc đánh giá năng suất sinh học sơ cấp ở vùng sinh thái biển ven bờ, thông qua việc đánh giá hàm lượng chlorophyll a Số liệu được thu thập thông qua các đơn vị gam Chlorophyll a/m 3 hay gam Chlorophyll a/m 2 (Nguyễn Thị Minh Trang, 2012)

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Đã hơn thế kỷ nay, các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao để ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll Chlorophyll lần đầu tiên được tách ra bởi Joseph Bienaimé Caventou và Pierre Joseph Pelletier năm 1817 (Delépine và cộng sự,1951)

Chlorophyll được chiết xuất dễ dàng từ các loại lá cây xanh bằng các loại dung môi thích hợp Khi sử dụng làm phụ gia thực phẩm có ký hiệu là E140

Chlorophyllin (E141) là dẫn xuất bán tổng hợp từ chlorophyll, khi đun trong môi trường kiềm và bổ sung các muối như đồng, magnesium, sắt, kẽm người ta đã bán tổng hợp ra các sản phẩm tương ứng Những loại này khác nhau về màu sắc, tỷ trọng nhưng có tác dụng gần giống nhau Thực tế sử dụng trong ngành dược và công nghệ thực phẩm người ta hay dùng chlorophyllin được bán tổng hợp từ chlorophyll tự nhiên do màu xanh đậm hơn, đẹp hơn và bền vững hơn trong quá trình bảo quản và chịu đựng được nhiệt độ cao hơn, không còn bị tác dụng của acid - dễ dàng sử dụng theo đường ăn uống

Vào những năm 80 của thế kỷ trước các nhà khoa học Nga và Grudia đã nghiên cứu chất màu thực phẩm từ chè Để nhận được chất màu xanh, người ta chiết xuất từ nguyên liệu chè tươi bằng rượu etylic 96% Sau đó đuổi rượu, chiết tách làm sạch, cố định màu, cô đặc, sấy phun ta sẽ có màu xanh lá cây (Ngô Xuân Cường, 2012)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

Rau ngót được mua ở chợ Linh Trung, quận Thủ Đức, TP HCM Chọn loại có màu xanh đậm, ít dập nát và ít bị sâu Rau sau khi mua được nhặt lá, bỏ cành và những lá hư, sau đó rửa sạch, để ráo và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh

 Ethanol – C2H5OH (VN Chemsol, Việt Nam);

 Methanol – CH 3 OH (Xilong, Trung Quốc);

 Acetone – CH 3 COCH 3 (Xilong, Trung Quốc);

 Magnesium chloride hexahydrate – MgCl2.6H2O (Xilong, Trung Quốc);

 DPPH (1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl) (Sigma-Aldrich, USA);

 Sữa tươi Vinamilk, Whipping cream Anchor, hương đậu xanh

 Bể điều nhiệt (Memmet, Đức);

 Tủ lạnh (Hitachi, Nhật Bản);

 Hệ thống cô quay chân không (Heidolph, Đức);

 Cân phân tích 4 số (Precisa, Thụy Sỹ);

 Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis (Hitachi, Nhật Bản);

 Bình tam giác, bình cầu, cốc đong, ống đong, bình định mức;

Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

 Khảo sát loại dung môi chiết: ethanol, methanol, acetone

 Khảo sát nồng độ dung môi chiết: 99%/95%, 90%, 80%, 70%, 50%

 Khảo sát tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 10/1, 15/1, 20/1, 25/1, 30/1, 35/1 (ml/g)

 Khảo sát thời gian trích ly: 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h, 30h, 36h, 40h, 48h

 Khảo sát nhiệt độ trích ly: 30 o C, 40 o C, 50 o C,

 Khảo sát hàm lượng xúc tác MgCl2.6H2O: 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1,0%

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly chlorophyll

Xác định một số chỉ tiêu của nguyên liệu

 Tổng quan về rau ngót

 Tổng quan về chất màu chlorophyll

 Một số phương pháp xác định chlorophyll

 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về chlorophyll Tổng quan tài liệu

Khảo sát khả năng chống oxy hóa và một số đặc tính của chất màu chlorophyll Ứng dụng chất màu chlorophyll trong chế biến kem

 Khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH

 Đánh giá sơ bộ hiệu suất trích ly chlorophyll

 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của chlorophyll

 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm về màu

 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm về mùi

 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm về độ yêu thích chung

Chuẩn bị mẫu: rau ngót được nhặt lá, loại bỏ những lá bị héo, úng, sâu Sau đó rửa sạch lại bằng nước, để ráo Lá được gói trong giấy báo sạch và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh Lá có thể được sử dụng trong khoảng 3 ngày

Chiết: cân chính xác 1g nguyên liệu cho vào ống nghiệm được bọc giấy bạc, thêm dung môi chiết, cho mẫu vào bể điều nhiệt để đảm bảo nhiệt độ cần thiết trong suốt quá trình chiết Sau khoảng thời gian xác định, dịch chiết được đem đi lọc bằng giấy lọc

Hình 2.2 Quy trình trích ly chlorophyll từ rau ngót

2.2.3.1.Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu

Xác định hàm lượng tro, độ ẩm

Bã Điều kiện khảo sát:

 Khảo sát loại dung môi chiết

 Khảo sát nồng độ dung môi chiết

 Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

 Khảo sát thời gian trích ly

 Khảo sát nhiệt độ trích ly

 Khảo sát hàm lượng xúc tác

 Khảo sát thời gian trích ly

Bảng 2.1 khảo sát một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu

Chỉ tiêu Hàm lượng Độ ẩm (%) Tro (%)

2.2.3.2.Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly chlorophyll trong rau ngót

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng chlorophyll trong quá trình trích ly

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi chiết

Mục đích: lựa chọn ra loại dung môi cho hiệu suất trích ly chlorophyll từ rau ngót cao nhất

Lọc Đo hàm lượng chlorophyll

Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 20/1 Thời gian: 12h

Cách thực hiện: ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu suất trích ly chlorophyll được nghiên cứu với 3 loại dung môi: ethanol 95%, methanol 99% và acetone 99% 1g lá rau ngót được trích ly với các hệ dung môi kể trên trong 12h ở nhiệt độ 40 o C, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1 (ml/g), 1 lần trích trong điều kiện bóng tối Dịch trích được đem đi lọc trước khi được phân tích

Thông số cần đo: hàm lượng chlorophyll (μg/g nguyên liệu)

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng chlorophyll trong quá trình trích ly

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung môi chiết

Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng chlorophyll và lựa chọn được nồng độ cho hiệu suất trích ly chlorophyll từ rau ngót cao nhất

Chọn nồng độ dung môi

Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 20/1 Thời gian: 12h

Cách thực hiện: ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu suất trích ly chlorophyll được nghiên cứu ở 4 nồng độ khác nhau là 90%, 80%, 70%, 50% 1g lá rau ngót được trích ly với hệ dung môi được chọn từ thí nghiệm 1 trong 12h ở nhiệt độ 40 o C, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1 (ml/g), 1 lần trích trong điều kiện bóng tối Dịch trích được đem đi lọc trước khi được phân tích

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng chlorophyll trong quá trình trích ly

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi, nguyên liệu

Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng chlrophyll và lựa chọn được tỉ lệ cho hiệu suất trích ly chlorophyll từ rau ngót cao nhất

Cách thực hiện: ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất trích ly chlorophyll được nghiên cứu ở 5 tỉ lệ khác nhau là 10/1, 15/1, 25/1, 30/1, 35/1 (ml/g) 1g lá rau ngót được trích ly với tỉ lệ kể trên, hệ dung môi được chọn từ thí nghiệm 1, nồng độ dung môi được chọn từ thí nghiệm 2 trong 12h ở nhiệt độ 40 o C, 1 lần trích trong điều kiện bóng tối Dịch trích được đem đi lọc trước khi được phân tích

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng chlorophyll trong quá trình trích ly

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng chlorophyll thu được và lựa chọn ra thời gian cho hiệu suất trích ly chlorophyll từ rau ngót cao nhất

Cách thực hiện: ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly chlorophyll được nghiên cứu ở 9 khoảng thời gian khác nhau là 4h, 8h, 16h, 20h, 24h, 30h, 36h, 40h, 48h vì các khoảng thời gian này thuận tiện cho một ngày làm việc trong phòng thí nghiệm

Chọn thời gian trích ly Nguyên liệu

29 thông thường (Kerry Smith và cộng sự, 2007) 1g lá rau ngót được trích ly với hệ dung môi được chọn từ thí nghiệm 1, nồng độ dung môi được chọn từ thí nghiệm 2, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu được chọn từ thí nghiệm 3 ở nhiệt độ 40 o C, 1 lần trích trong điều kiện bóng tối Dịch trích được đem đi lọc trước khi được phân tích

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng chlorophyll trong quá trình trích ly

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ trích ly

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng chlorophyll thu được và lựa chọn ra nhiệt độ cho hiệu suất trích ly chlorophyll từ rau ngót cao nhất

Cách thực hiện: ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly chlorophyll được nghiên cứu ở 5 nhiệt độ khác nhau là 30 o C, 50 o C, 60 o C, 70 o C, 80 o C 1g lá rau ngót được trích ly với hệ dung môi được chọn từ thí nghiệm 1, nồng độ dung môi được chọn từ thí nghiệm 2, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu được chọn từ thí nghiệm 3 ở thời gian được chọn

Chọn nhiệt độ trích ly

30 từ thí nghiệm 4, 1 lần trích trong điều kiện bóng tối Dịch trích được đem đi lọc trước khi được phân tích

Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của MgCl 2 6H 2 O đến hàm lượng chlorophyll trong quá trình trích ly

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng xúc tác

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác MgCl2.6H2O đến hàm lượng chlorophyll thu được và lựa chọn ra hàm lượng cho hiệu suất trích ly chlorophyll từ rau ngót cao nhất

Cách thực hiện: ảnh hưởng của xúc tác MgCl2.6H2O đến hiệu suất trích ly chlorophyll được nghiên cứu ở 4 hàm lượng khác nhau là 0,25%, 0,5%, 0,75% và 1% so với nguyên liệu 1g lá rau ngót được trích ly với hệ dung môi được chọn từ thí nghiệm 1, nồng độ dung môi được chọn từ thí nghiệm 2, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu được chọn từ thí

Chọn hàm lượng xúc tác Nguyên liệu

31 nghiệm 3 ở thời gian được chọn từ thí nghiệm 4, nhiệt độ trích ly được chọn ở thí nghiệm

5, 1 lần trích trong điều kiện bóng tối Dịch trích được đem đi lọc trước khi được phân tích

Thí nghiệm 7: Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của cao chlorophyll

Sau khi có được các thông số của quá trình trích ly, tiến hành thí nghiệm với 100g lá rau ngót Sau trích ly tiến hành cô quay chân không ở 50 o C đến khi lượng dung dịch còn lại bằng khoảng 1/5 đến 1/6 so với lượng dung dịch ban đầu để thu được sản phẩm cao chlorophyll (Ngô Xuân Cường, 2012)

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Một số chỉ tiêu hóa lý của lá rau ngót

Kết quả xác định hàm lượng tro và độ ẩm được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu

Chỉ tiêu Hàm lượng Độ ẩm (%) 82,15 ± 0,04

Kết quả nghiên cứu trên cho thấy độ ẩm của lá rau ngót khá cao (82,15%) Kết quả này gần tương đương với kết quả nghiên cứu của V B Hoe (1999) Tác giả đã xác định được độ ẩm của lá rau ngót là 79,4% Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của N Benjapak và cộng sự (2008) cho thấy độ ẩm của lá rau ngót là rất cao: 88,32% Độ ẩm có ảnh hưởng đến sự suy thoái của chất màu chlorophyll Kết quả nghiên cứu của Akashi Hirata và cộng sự (1980) cho thấy: ở độ ẩm thấp hơn 4,8% ở 40 o C, tốc độ phân hủy chlorophyll rất thấp Nhưng ở độ ẩm hơn 6,5%, tốc độ phân hủy chlorophyll tăng lên Bên cạnh đó, chlorophyll cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Do đó, nếu sử dụng lá rau ngót đã sấy khô thì tổn thất chlorophyll càng đáng kể (Hande Selen ERGE và cộng sự,

Chính vì những lý do trên nên quá trình trích ly chlorophyll trong nghiên cứu này sử dụng lá rau ngót tươi được bảo quản lạnh nhằm giảm thiểu tổn thất xuống mức tối thiểu

Ngoài ra, hàm lượng tro của lá rau ngót được xác định là 2,23% Kết quả này tương đương với kết quả của V B Hoe (1999) là 2,0% và cao hơn kết quả của N Benjapak và cộng sự (2008) là 0,17% Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau có thể là do thời tiết, điều kiện trồng trọt,… (A.J.A Petrus, 2013)

Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng chlorophyll từ lá rau ngót

trong quá trình trích ly

3.2.1 Kết quả ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng chlorophyll từ lá rau ngót trong quá trình trích ly

Bảng 3.2 Kết quả hàm lượng chlorophyll theo loại dung môi trích ly

Loại dung môi Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll tổng % Chlorophyll a Methanol 99 22,710 ± 0,594 b 51,353 ± 0.615 c 74,063 ± 0,315 c 30,663 Acetone 99 17,985 ± 0,700 a 9,388 ± 1,676 a 27,366 ± 1,515 a 60,528 Ethanol 95 31,967 ± 0,691 c 17,341 ± 1,185 b 49,308 ± 0,837 b 64,831

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng chlorophyll

Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.1, chúng tôi nhận thấy chlorophyll chịu ảnh hưởng của loại dung môi chiết Hàm lượng chlorophyll tổng thu được từ các loại dung môi giảm dần theo thứ tự: methanol (74,063 μg/g nguyên liệu), ethanol (49,308 μg/g nguyên liệu) và thấp nhất là dung môi acetone (27,366 μg/g nguyên liệu) Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của M Henriques (2007) và Holm-Hansen và cộng sự (1978) khi trích ly chlorophyll trên đối tượng sinh vật phù du

Acetone tạo ra các đỉnh hấp thu chlorophyll rất sắc nét và là dung môi hữu hiệu cho việc phân tích chlorophyll (Ritchie, 2006) Nhưng acetone không phải là dung môi lý

40 tưởng để trích ly chlorophyll cho các mẫu thực phẩm Sự thay đổi acetone thành nước là một yếu tố gây sai số quan trọng khi hệ số hấp thụ riêng của chlorophyll a và b thay đổi theo nồng độ acetone (ví dụ acetone với nồng độ 79% là hơi khác so với 80%) (Wellburn,

1994) Theo Sumanta và cộng sự (2014), acetone dễ bay hơi, dễ cháy, kích thích da và ảnh hưởng đến polystyrene và polymethylacrylate và do đó không thể dùng cuvet nhựa cho việc đo quang phổ Do đó, việc trích ly với acetone với nồng độ 80% là không hiệu quả Đôi khi có hiệu quả nhưng yêu cầu làm ướt, vỡ mô, lọc, ly tâm với thời gian chuẩn bị dài (Manolopoulou E và cộng sự, 2016) Hơn nữa, dung môi acetone có tính acid và đã được chứng minh là có chứa phaeophytin làm tăng sự thoái hóa chlorophyll (Brown & Hooker,

1977) Kết quả trực tiếp của quá trình acid hóa chlorophyll thành phaeophytin làm thay thế

Mg 2+ bằng H + (Kong và cộng sự, 1999) Theo đó, phải có sự tăng pH được thúc đẩy bởi việc bổ sung xúc tác mới có thể ức chế được quá trình này Trong thí nghiệm 1, do chưa bổ sung xúc tác nên với dung môi acetone, quá trình trích ly chlorophyll là kém hiệu quả

Methanol là một chất trích ly rất tốt cho chlorophyll Tuy nó không dễ bay hơi và dễ cháy như acetone nhưng rất độc hại (M Henriques, 2007) Nó là một chất độc ngấm ngầm bởi vì nó dễ dàng hấp thụ bằng cách hít vào và qua da Do đó không nên sử dụng dung môi methanol trong phòng thí nghiệm Methanol làm mờ dần các cuvet polystyrene dẫn đến các kết quả sai và không thể sử dụng ở tất cả các cuvette polystyrene và polymethylacrylat (PMMA)

Ethanol được coi là dung môi an toàn hơn nhiều so với acetone hoặc methanol Mặc dù các phương trình tính toán cho chlorophyll a và chlorophyll b với dung môi này là có sẵn, nó vẫn không được sử dụng phổ biến Mặc dù dễ cháy nhưng nó không quá độc hại và phù hợp để sử dụng trong phòng thí nghiệm giảng dạy Ethanol không tấn công polystyrene Vì vậy, có thể sử dụng loại dung môi này cho cuvet nhựa polystyrene Có những lợi thế về an toàn và kinh tế đáng kể trong việc sử dụng ethanol làm dung môi cho trích ly và kiểm tra chlorophyll (Lichtenthaler HK, 1987)

Trích ly bằng dung môi methanol cho lượng chlorophyll thu được cao nhất, nhưng vì lý do an toàn với mục đích thu nhận dịch màu và ứng dụng cho thực phẩm nên dung môi ethanol được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo (S E Hagerthey, 2006)

3.2.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng chlorophyll từ lá rau ngót trong quá trình trích ly

Bảng 3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng chlorophyll được trích ly

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng chlorophyll

Nồng độ ethanol ảnh hưởng lớn đến lượng chlorophyll được trích ly, hàm lượng các chất hòa tan đi kèm trong quá trình chiết, cũng như độ ổn định của dịch chiết theo thời gian Vì chlorophyll không tan trong nước nhưng lại tan trong các dung môi hữu cơ như cồn, methanol, acetone, nên khi càng tăng nồng độ ethanol, lượng chlorophyll thu được càng nhiều và đạt cao nhất ở ethanol 80% (61,592 μg/g nguyên liệu) Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hồng Ánh (2016) và Sartory (1984) khi trích ly chlorophyll trên đối tượng sinh vật phù du

Nồng độ Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll tổng % Chlorophyll a Ethanol 95 31,967 ± 0,691 c 17,341 ± 1,185 b 49,308 ± 0,837 b 64,831 Ethanol 90 19,278 ± 0,136 b 39,979 ± 1,246 b 59,258 ± 1,199 c 32,533 Ethanol 80 21,047 ± 0,157 c 40,545 ± 0,04 b 61,592 ± 0,182 d 34,171 Ethanol 70 23,621 ± 0,524 d 7,624± 0,309 a 31,245 ± 0,305 b 75,599 Ethanol 50 17,730 ± 0,923 a 8,117 ± 0,563 a 25,847 ± 1,164 a 68,599

Có thể nhận thấy rằng hàm lượng chlorophyll tăng lên khi nồng độ ethanol tăng Kết quả này có thể được giải thích như sau: nồng độ ethanol cao hơn có nghĩa là độ nhớt của dung môi thấp hơn Điều này sẽ dẫn đến việc khả năng làm ướt chất rắn trích ly của nó cao hơn và do đó làm tăng tốc độ chiết Các báo cáo trước đây cho thấy rằng nồng độ tối thiểu được sử dụng để trích ly chlorophyll phải từ 70% (Isam Kamal và cộng sự, 2006; Othmer, 1964)

Mặt khác, theo một số nghiên cứu trước đây, enzyme chlorophyllase vẫn còn giữ hoạt tính ở các nồng độ dung môi khác nhau, làm cho chlorophyll bị chuyển thành các dạng đồng phân khác (R Dashwood et.al, 1996) Do hoạt động của enzyme này trong quá trình trích ly (giai đoạn chuẩn bị mẫu, ngâm chiết trong dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau) đã dẫn đến sự khác biệt về lượng chlorophyll thu được (Lê Thị Hồng Ánh,

Căn cứ vào kết quả thu được, dung môi ethanol với nồng độ 80% cho tỉ lệ hàm lượng chlorophyll a không phải là cao nhất (chỉ đạt 34,171% so với hàm lượng chlorophyll tổng), nhưng lại cho hàm lượng chlorophyll tổng cao nhất (61,592 μg/g nguyên liệu) Do đó, chúng tôi chọn dung môi ethanol 80% được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

3.2.3 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng chlorophyll từ lá rau ngót trong quá trình trích ly

Bảng 3.4 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng chlorophyll được trích ly

Tỉ lệ Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll tổng % Chlorophyll a 10/1 20,073 ± 0,224 c 43,642 ± 1,115 c 66,716 ± 0,941 d 30,087 15/1 22,787 ± 0,453 c 41,198 ± 0,410 c 63,984 ± 0,731 d 35,613 20/1 21,047 ± 0,157 c 40,545 ± 0,04 b 61,592 ± 0,182 d 34,172 25/1 24,044 ± 0,341 d 9,100 ± 1,431 b 33,143 ± 1,745 c 72,545 30/1 19,911 ± 0,163 b 6,754 ± 0,569 b 26,665 ± 0,220 b 74,671 35/1 17,901 ± 0,141 a 2,996 ± 1,484 a 20,900 ± 1,373 a 85,650

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng chlorophyll

Từ bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy dung môi ethanol với nồng độ 80% có ảnh hưởng đến lượng chlorophyll thu được Lượng chlorophyll thu được giảm dần từ tỉ lệ 10/1 (ml/g) đến tỉ lệ 35/1 (ml/g) Hàm lượng chlorophyll tổng giảm từ 66,716 (μg/g nguyên liệu) với tỉ lệ 10/1 xuống 63,984 (μg/g nguyên liệu) với tỉ lệ 15/1 (ml/g) và giảm dần đến 2,996 (μg/g nguyên liệu) với tỉ lệ 35/1 (ml/g)

Nguyên nhân của sự thay đổi trên là do với cùng một khối lượng nguyên liệu, khi lượng dung môi quá ít sẽ không đủ để hòa tan và trích ly chlorophyll ra khỏi tế bào; khi tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly tăng do tăng sự chênh lệch gradient nồng độ của cấu tử cần trích ly giữa nguyên liệu và dung môi Tuy nhiên, nếu sử dụng lượng dung môi quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích Khi đó, nếu muốn thu nhận sản phẩm trích ly, ta phải thực hiện quá trình cô đặc hay sử dụng các phương pháp để tách bớt dung môi (Lê Thị Hồng Ánh, 2016) Vì thế, với mỗi quá trình trích ly, cần xác định tỉ lệ phù hợp giữa nguyên liệu và dung môi để thu được hiệu suất trích ly cao nhất và tiết kiệm chi phí dung môi Như vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 10/1 (ml/g) để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.2.4 Kết quả ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng chlorophyll từ lá rau ngót trong quá trình trích ly

Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng chlorophyll được trích ly

Thời gian Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll tổng % Chlorophyll a 4h 15,982 ± 0,744 a 5,368 ± 0,680 a 21,350 ± 1,395 a 74,856 8h 25,295 ± 0,486 b 13,243 ± 0,672 b 38,583 ± 0,449 b 65,636 12h 20,073 ± 0,224 c 43,642 ± 1,115 c 66,716 ± 0,941 d 30,088 16h 55,625 ± 0,810 c 21,897 ± 1,231 c 77,521 ± 2,027 c 71,754 20h 84,365 ± 1,673 e 23,715 ± 0,405 c 108,080 ± 1,283 e 78,058 24h 82,124 ± 0,512 de 53,989 ± 1,275 f 136,113 ± 1,755 f 60,335 30h 135,020 ± 1,552 g 58,739 ± 0,841 g 193,760 ± 0,825 i 69,684 36h 114,460 ± 1,553 f 47,238 ± 0,979 e 161,698 ± 1,247 h 70,786 40h 112,639 ± 0,589 f 39,183 ± 1,482 d 151,822 ± 1,027 g 74,191 48h 98,915 ± 2,217 d 22,177 ± 0,858 c 101,092 ± 1,378 d 78,063

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng chlorophyll

Kết quả từ bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy có sự thay đổi hàm lượng chlorophyll trong các khoảng thời gian trích ly khác nhau Thời gian càng dài, lượng chlorophyll thu được càng cao và đạt cực đại sau 30 giờ Từ 4 giờ đến 30 giờ trích ly, hàm lượng

Một số đặc tính của cao chlorophyll

3.3.1 Kết quả đánh giá sơ bộ hiệu suất trích ly chlorophyll từ lá rau ngót

Sau khi xác định được các thông số trích ly tối ưu, chúng tôi tiến hành trích ly triệt để chlorophyll trong lá rau ngót và đánh giá sơ bộ hiệu suất thu hồi chlorophyll Kết quả được biểu diễn theo hình 3.7

Hình 3.7 Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết

Dựa vào kết quả ở hình 3.7, chúng tôi nhận thấy sau 2 lần chiết đã chiết tách được hoàn toàn lượng chlorophyll có trong nguyên liệu Sau lần chiết đầu tiên, hơn 90% lượng chlorophyll đã được chiết tách Từ kết quả nghiên cứu ở hình 3.7, cho thấy hiệu suất chiết tách chlorophyll trong quá trình nghiên cứu là rất cao, đạt 95,98% Kết quả này tương tự với kết quả của Nguyễn Thị Minh Trang (2012) trên lá bắp

3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll

Bảng 3.8 Phần trăm bắt gốc tự do (DPPH) ở các thể tích dịch chiết khác nhau

Phần trăm (%) bắt gốc tự do ở

Chất chống oxy hóa là một chất hoặc một nhóm hợp chất có ngăn ngừa và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Chất chống oxy hóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi mào bởi các gốc tự do (Trần Văn Tiến, 2017)

Từ kết quả nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của cao chlorophyll được trình bày trong bảng 3.8, chúng tôi nhận thấy hiệu suất kháng oxy hóa của chlorophyll tỉ lệ thuận với liều lượng Ở lượng mẫu thử thấp nhất là 200μl, khả năng bắt gốc tự do cũng đạt giá trị thấp nhất là 15,03% Càng tăng lượng mẫu thử, khả năng bắt gốc tự do cũng tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 49,67% với 1000μl chlorophyll

Có nhiều báo cáo mô tả hoạt động chống oxy hóa có trong trái cây, thực vật, tảo và các sinh vật biển (Kuda và cộng sự, 2005; Linda và cộng sự 2004; Pietta và cộng sự 1998; Dykens và cộng sự, 1992) Những sản phẩm tự nhiên này đã cho thấy chúng là những chất ức chế gốc tự do tiềm năng Tương tự, kết quả nghiên cứu trong bảng 3.8 cũng cho thấy khả năng chống oxy hóa của chlorophyll trích ly từ lá rau ngót là tương đối cao Điều này chứng minh rằng nguồn thu nhận chlorophyll từ rau ngót cũng có khả năng chống oxy hóa tự nhiên

3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của cao chlorophyll từ lá rau ngót

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát cao chlorophyll ở các khoảng nhiệt độ

Hình 3.8 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền màu của cao chlorophyll trong thời gian 30 phút

Dung dịch cao chlorophyll được xử lý ở 30 o C trong thời gian 30 phút có độ bền màu khá ổn định, có thể bảo quản sản phẩm và ứng dụng sản phẩm trong điều kiện nhiệt độ này

51 Ở 70°C và 100 o C, độ hấp thu ánh sáng của dung dịch cao chlorophyll giảm 20- 30%, tuy nhiên màu xanh của cao chlorophyll sản phẩm còn khá cao Do đó, có thể sử dụng chế phẩm cao chlorophyll tạo màu trong chế biến thực phẩm đến nhiệt độ 100 o C

Kết quả này tương tự với kết quả của Nguyễn Thị Minh Trang (2012) trên lá bắp.

Ứng dụng bổ sung chất màu chlorophyll vào sản phẩm kem

3.4.1 Sản phẩm kem bổ sung chất màu chlorophyll

Chlorophyll an toàn cho con người và từ thời xa xưa, con người đã sử dụng chúng bằng cách ăn trái cây và rau quả Các nguồn chlorophyll thương mại bao gồm chlorophyll từ tảo lục chlorella, tảo xanh Spirulina, rong Enteromorpha và rong Ulva; tất cả các nguồn được đề cập trước đây được sử dụng làm thực phẩm cho con người (Ayehunie và cộng sự,

1996) trong món salad và súp Chlorophyll được sử dụng làm chất màu thực phẩm và về vấn đề này, chlorophyll có thể được thêm một cách an toàn vào một số thực phẩm ở dạng nguyên chất hoặc phức chất với đồng Chúng cũng được sử dụng trong một số ứng dụng khác bao gồm mỹ phẩm (xà phòng, kem và sữa dưỡng thể), các sản phẩm vệ sinh răng miệng (nước súc miệng, kem đánh răng) cũng như bánh kẹo (gum và kẹo cứng) vì màu xanh đậm của chúng Các sản phẩm có màu chlorophyll được bảo quản tốt nhất trong điều kiện khô ráo và bảo vệ khỏi không khí, ánh sáng và nhiệt để giữ màu tốt hơn

Dựa trên các kết quả nghiên cứu và khả năng ứng dụng của chlorophyll, chúng tôi quyết định bổ sung chlorophyll và sản phẩm kem Đây là sản phẩm không có quá trình xử lý ở nhiệt độ cao, được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp và không có ánh sáng Nồng độ chất màu chlorophyll được bổ sung vào sản phẩm kem ở 0,07%, 0,14%, 0,21%, 0,28%, 0,35%, 0,42% để tạo màu xanh nhạt

Sản phẩm kem sau khi bổ sung màu chlorophyll cho màu xanh nhạt, kết hợp với hương đậu xanh làm sản phẩm trở nên hấp dẫn hơn Đây là sản phẩm hoàn toàn tự nhiên, hoàn toàn không bổ sung bất kì phụ gia nào Việc thay thế bằng chlorophyll tự nhiên không những tránh được những tác hại do chất màu tổng hợp gây ra, mà chlorophyll còn là chất chống oxy hóa, có những lợi ích tốt cho người sử dụng như đẹp da, ngăn ngừa bệnh tim mạch,…

Hình 3.9 Sản phẩm kem bổ sung chất màu chlorophyll ở các nồng độ từ thấp đến cao (từ bên trái qua, từ trên xuống)

3.4.2 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm kem bổ sung chất màu chlorophyll

3.4.2.1.Kết quả đánh giá cảm quan sự yêu thích của người tiêu dùng về sản phẩm kem bổ sung chlorophyll

Kết quả đánh giá cảm quan về sự yêu thích sản phẩm kem bổ sung màu chlorophyll được thể hiện trong hình 3.9

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn kết quả đánh giá cảm quan của sản phẩm kem bổ sung màu chlorophyll

Kiểm định Friedman được sử dụng cho phép thử thị hiếu so hàng

Tra phụ lục 6a (Hà Duy Tư, 2006) với mức ý nghĩa α = 0,05, n1 = 5, n2 = ta thu được Ftra bảng = 2,21 Ftest = 142,68 > F tra bảng = 2,21 vậy giả thuyết H 0 bị loại bỏ, các mẫu khác nhau có ý nghĩa

Dựa vào kết quả ở hình 3.9, có thể thấy mẫu kem có bổ sung 0,14% chlorophyll là mẫu được yêu thích nhất (45 lần được xếp vị trí cao nhất) Các mẫu ít được yêu thích nhất là mẫu thêm 0,07% và 0,28% chlorophyll Dựa vào kết quả trên, có thể thấy màu sắc sản phẩm ảnh hưởng lớn đến sự lựa chọn của người tiêu dùng Mẫu thêm 0,07% chlorophyll dược đánh giá là màu sắc đậm hơn một chút so với mẫu kem mà họ thường thấy nhưng lại quá nhạt nếu so với màu xanh Với các mẫu có hàm lượng chlorophyll bổ sung cao hơn 0,14% thì không được đánh giá cao Nhưng ngoại lệ là mẫu bổ sung 0,42% chlorophyll lại được yêu thích thứ nhì chỉ sau mẫu 0,14% chlrophyll

Kiểm định Friedman được sử dụng cho phép thử thị hiếu so hàng

Tra phụ lục 6a (Hà Duy Tư, 2006) với mức ý nghĩa α = 0,05, n 1 = 5, n 2 = ta thu được Ftra bảng = 2,21 Ftest = 46,37 > Ftra bảng = 2,21 vậy giả thuyết H0 bị loại bỏ, các mẫu khác nhau có ý nghĩa

Từ hình 3.9 có thể thấy mẫu bổ sung 0,28% chlorophyll được yêu thích nhất (31 lần được xếp vị trí cao nhất), tiếp đến là mẫu bổ sung 0,14% chlorophyll (13 lần được xếp vị trí cao nhất) Các mẫu còn lại không được đánh giá cao về mùi và có giá trị tương đương nhau

Vì chất màu chlorophyll được dùng như hương liệu nên nó không quá ảnh hưởng đến cấu trúc và vị Đồng thời chlorophyll bổ sung vào sản phẩm kem với lượng rất nhỏ nên ta không xét đến sự khác nhau về cấu trúc và vị giữa các mẫu Đối với màu sắc, mẫu bổ sung 0,14% chlorophyll được yêu thích nhất Còn đối với mùi là mẫu 0,28% chlorophyll Xét mặt bằng chung, mẫu bổ sung 0,14% chlorophyll được đánh giá cao hơn cả Cho nên với mức độ yêu thích của người tiêu dùng và lợi ích sức khỏe mà nó mang lại, có thể xem xét phát triển sản phẩm kem bổ sung 0,14% chlorophyll trên thị trường

Các nguyên nhân gây ra sự khác biệt giữa các mẫu có thể kể đến như: điều kiện thử mẫu chưa thật sự thích hợp, còn sự tác động của ngoại cảnh đến người cảm quan cũng như người tiến hành cảm quan chưa thật sự nghiêm túc với phần cảm quan của mình

Định dạng
Số trang	105
Dung lượng	5,98 MB