Động học sinh trưởng của vi tảo chlorella vulgaris trong hệ thống closed photobioreactor ở mật độ tế bào và thành phần môi trường dinh dưỡng khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨMKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ THỐN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ THỐNG

CLOSE - PHOTOBIOREACTOR Ở MẬT ĐỘ TẾ BÀO VÀ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG KHÁC NHAU

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH SVTH: PHẠM THỊ MINH HIỀN

MSSV: 12116028

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2016

S K L 0 0 4 8 0 0

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MÃ SỐ: 2016-12116028

ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO

CHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ

THỐNG CLOSED – PHOTOBIOREACTOR Ở MẬT ĐỘ TẾ BÀO VÀ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG KHÁC NHAU

SVTH: PHẠM THỊ MINH HIỀN MSSV: 12116028

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đ ỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO

CHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ THỐNG

CLOSED – PHOTOBIOREACTOR Ở MẬT ĐỘ

TẾ BÀO VÀ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG

DINH DƯỠNG KHÁC NHAU

SVTH: PHẠM THỊ MINH HIỀN MSSV: 12116028

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2014

4

6

8

10

i

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng thời gian thực hiện đề tài em đã nhận được nhiều sự động viên, giúp đỡ từ

thầy cô, gia đình, bạn bè để hoàn thành tốt đề tài dù gặp nhiều khó khăn

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Tp.HCM đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường, trang bị cho em nhiều kiến thức thật sự quý báu để làm hành trang bước vào đời và phục vụ cho cuộc sống sau này

Em xin gửi đến cô Vũ Trần Khánh Linh, lời cảm ơn chân thành nhất Cô đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện

đề tài

Con cũng xin cảm ơn ba mẹ, gia đình, bạn bè là nguồn động viên tinh thần, là động lực

để con vượt qua giai đoạn khó khăn này

Cảm ơn bạn Hoàng Thị Hồng đã cùng mình vượt qua những giây phút khó khăn trong đồ

án Em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả bạn bè, tập thể lớp 121160 đã quan tâm, ủng

hộ, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Trong thời gian thực hiện đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót, kính mong sự thông cảm

từ quý thầy cô Mặc dù đã nỗ lực, cố gắng để hoàn thành đề tài nhưng không tránh khỏi những sai sót Rất mong sẽ nhận được những lời góp ý chân thành từ quý thầy cô, các anh chị và các bạn để bài báo cáo được hoàn chỉnh hơn

Chân thành cảm ơn !

Tp.Hồ Chí Minh, 25 tháng 7 năm 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp

đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định

Ngày 26 tháng 7 năm 2016

Ký tên

iii

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN Error! Bookmark not defined.

LỜI CẢM ƠN 4

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

TÓM TẮT KHÓA LUẬN vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 1

3 Nội dung nghiên cứu 1

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tổng quan về tảo và phương pháp nuôi cấy 3

1.1.1 Tổng quan về tảo 3

1.1.2 Phương pháp nuôi cấy 4

1.2.Các kiểu trao đổi chất của vi tảo 5

1.3.Các hệ thống nuôi cấy 5

1.3.1 Hệ thống nuôi cấy mở (open pond) 6

1.3.2 Hệ thống nuôi cấy kín (closed photobioreactor) 6

1.4.Điều kiện nuôi cấy tảo 7

1.4.1 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tảo 7

1.4.2 Các yếu tố tác động đến sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris 9

1.5.Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của vi tảo 11

1.5.1 Thành phần dinh dưỡng của tế bào vi tảo 11

1.5.2 Ứng dụng của vi tảo 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1.Vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy và hóa chất 13

2.1.1 Vi tảo 13

2.1.2 Môi trường nuôi cấy tảo 13

2.1.3 Hóa chất 14

2.2.Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris 15

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ N/P ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris 15

2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaHCO3 ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 16

2.3.Các phương pháp phân tích 17

2.3.1 Phương pháp xác định số lượng tế bào C.vulgaris 17

2.3.3 Xác định tốc độ tăng trưởng riêng của C vulgaris 19

2.3.4 Xác định hàm lượng PO43- -P 19

2.3.5 Xác định hàm lượng N-NO3- 21

2.3.6 Xác định đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử axit dinitro salicylic (DNS) 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris 23

3.2.Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ N/P ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris 27

3.3.Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaHCO3 ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 32

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

4.1.Kết luận 38

4.2.Đề xuất ý kiến 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1: Buồng đếm hồng cầu và cấu tạo buồng đếm hồng cầu 18 Hình 2 2: Tế bào tảo Chlorella vulgaris trên buồng kính hồng cầu 19 Hình 2 3: Phản ứng khử 3,5- axit dinitro salicylic thành 3-amino- 5-nitro axit salicylic 22

Hình 3 1: Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên (a) số lượng tế bào C.vulgaris, (b) sự tiêu

Hình 3 2: Ảnh hưởng của tỉ lệ N/P ban đầu lên (a) số lượng tế bào C.vulgaris, (b) sự tiêu thụ

35

DANH MỤC BẢNG

1963) 13 Bảng 2 2: Tóm tắt các thí nghiệm trong khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu 15 Bảng 2 3: Tóm tắt điều kiện các thí nghiệm khảo sát tỉ lệ N/P trong môi trường nuôi tảo 16

Bảng 3 1: Tốc độ sinh trưởng riêng và sinh khối của C.vulgaris trong khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu 26 Bảng 3 2: Tốc độ tăng trưởng và sinh khối thu được của các thí nghiệm trong khảo sát tỉ lệ N/P 31

Bảng 3 4: Tốc độ tăng trưởng và sinh khối thu được của các thí nghiệm trong khảo sát hàm

vii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Động học sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris được khảo sát dưới các điều kiện môi trường

nuôi cấy khác nhau bao gồm: mật độ tế bào ban đầu, tỉ lệ N/P ban đầu trong môi trường, và hàm lượng NaHCO3 ban đầu trong môi trường Kết quả thu được cho thấy hiệu suất thu hồi sinh khối cao nhất đạt được là 0.432 g/L.ngày tại mật độ tế bào ban đầu là 5.2 x 105 tế bào/ml)

Tại mật độ tế bào này, C.vulgaris sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng tỉ lệ N/P từ 2.33

đến 10 trong môi trường BBM có chứa 5 g/L glucose Ngoài ra, khi bổ sung 1 g/L NaHCO3vào

môi trường BBM có 0.5 g/L glucose, sự sinh trưởng của C vulgaris là nhanh nhất trong 4 nồng

độ bổ sung NaHCO3 khảo sát Những kết quả thu được trong nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc bước đầu xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển

của tảo nước ngọt C vulgaris nhằm đạt được hiệu suất thu hồi sinh khối cao nhất

vi tảo, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện nuôi cấy khác nhau

cho vi tảo nước ngọt Chlorella vulgaris nhằm thu được hiệu suất thu hồi sinh khối tảo cao nhất

2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris trong hệ thống nuôi cấy kín (closed-photobioreactor) với mật độ tế bào ban đầu, tỉ lệ

N/P ban đầu trong môi trường và hàm lượng NaHCO3 ban đầu khác nhau nhằm lựa chọn điều

kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của Chlorella vulgaris

3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài: “Động học sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris trong hệ thống

closed-photobioreactor ở mật độ tế bào và thành phần môi trường dinh dưỡng khác nhau” gồm các nội dung cụ thể sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ N/P ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaHCO3 ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo

Chlorella vulgaris

Trong các khảo sát trên, để nghiên cứu động học sinh trưởng của C vulgaris, chúng tôi

theo dõi sự thay đổi mật độ tế bào, sự thay đổi của hàm lượng glucose, N, P … trong quá trình nuôi cấy tảo…

2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Kết quả khảo sát động học sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris trong nghiên cứu này

sẽ là nền tảng cho việc thiết lập và xây dựng điều kiện nuôi cấytối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo trong hệ thống closed-photobioreactor

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần tìm ra phương pháp sản xuất tảo tốt nhất trong thực tế để giảm chi phí đầu tư mà vẫn thu được sinh khối cao, chất lượng tốt

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về tảo và phương pháp nuôi cấy

Vi tảo có thể phân loại thông qua màu sắc, các thành phần của thành tế bào hay hình thái học (Tomaselli, 2004) Tảo được chia làm 2 loại là tảo nhân nguyên thủy (prokaryotic algae)

và tảo nhân thật (eukaryotic algae) Các tế bào prokaryote thiếu các cơ quan liên kết thành tế bào như plastid, mitochondria, nuclei, thể Golgi, và flagella Nhóm còn lại là eukaryote thì có

các cơ quan trên (Lee, 2008) Những loài tảo thông thường bao gồm: Spirulina, Chlorella, Dunaliella, Nostoc và Aphanizomenon (Carlsson và cộng sự, 2007; Pulz và cộng sự, 2004)

Vi tảo có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng, các chất chống oxy hóa, mỹ phẩm, các acid béo không bão hòa dưới dạng viên nén, viên bao hay dung dịch để con người sử dụng (Carlsson và cộng sự, 2007 ) Ngoài ra, vi tảo còn là một ứng viên tiêu biểu cho công nghệ nhiên liệu sinh học; sinh khối vi tảo được sử dụng để tạo ra xăng sinh học, dầu sinh học, hydrogen, acetone, butanol, methane, điện… (Dragone và cộng sự, 2010)

Chlorella là giống quan trọng nhất trong công nghiệp sản xuất sinh khối vi tảo vì nó chứa

nhiều thành phần có giá trị dinh dưỡng với hàm lượng cao như protein, lipid,… (Chisti, 2007)

Vì vậy Chlorella được nuôi cấy và sử dụng như một thực phẩm tốt cho sức khỏe con người (Richmond, 1990) Chlorella là một giống tảo xanh nhỏ, đơn bào, tế bào hình cầu, và không di chuyển được Chlorella sống trong nước ngọt, thuộc ngành Chlorophyta; các chuỗi Chlorella thông dụng bao gồm C.protothecoides, C.vulgaris, C.emersonii, C.sorokini và C.minuitissima (Zelitch, 1971; Rosenberg và cộng sự 2008, Liu và cộng sự 2008) Chlorella có thể phát triển

trong điều kiện tự dưỡng (autotrophic), dị dưỡng (mixotrophic), và hỗn hợp (mixotrophic) (Richmond, 1990)

Trong giống Chlorella thì loài tảo Chlorella vulgaris được nghiên cứu và khảo sát nhiều

nhất do nó là loài vi sinh vật lâu đời, dễ nuôi và phát triển nhanh (Ming và cộng sự, 2010)

4

Chlorella vulgaris có kích thước rất nhỏ từ 5 đến 10 micromet, chúng có thể được sử dụng làm

nguồn nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu hóa thạch, là một nguồn nguyên liệu chứa các chất hóa học có gía trị như protein, lipid, vitamin…, giúp xử lý nước thải và làm thức ăn cho môi trường biển.Thành phần dinh dưỡng trong tế bào tảo cung cấp dưỡng chất và năng lượng cần thiết cho

sự sinh trưởng và phát triển của ấu trùng và các sinh vật biển nhỏ (Pulz và cộng sự, 2004) Để

nuôi cấy Chlorella vulgaris, nhiệt độ tối ưu khoảng 25 0C, pH trong khoảng 6.5 – 7.5, và độ mặn (salinity) tối ưu là 0% NaCl (w/v), tối đa là 1% NaCl (w/v) Môi trường nuôi cấy thường

sử dụng là Bolds basal (Borowitzka, 1988)

1.1.2 Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy mẻ (batch culture) là một trong các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật phổ biến Nuôi cấy mẻ là nuôi cấy trong một hệ thống kín với một lượng cơ chất ban đầu giới hạn và vi sinh vật sẽ phát triển theo một đường cong sinh trưởng với 4 pha chính là pha lag, pha log, pha

ổn định và pha chết (Stanbury và cộng sự, 1995) Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật sẽ phản ánh lên những thay đổi trong sinh khối và môi trường nuôi cấy của chúng (Richmond, 2004)

Pha lag: là giai đoạn đầu của đường cong sinh trưởng, là thời gian để vi sinh vật thích nghi với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy, vì vậy không có sự sinh trưởng của vi sinh vật mà

có thể có sự hiện hiện của các tế bào chết trong giai đoạn này Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chiều dài của pha lag là thành phần dinh dưỡng của môi trưởng giống, thành phần dinh dưỡng có trong môi trường mới, loại vi sinh vật, tuổi của vi sinh vật, lượng vi sinh vật bỏ vào, thiết bị nuôi cấy và các yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH,… (Sikyta, 1995)

Pha log (pha exponential) là pha sinh trưởng của vi sinh vật, là giai đoạn sau pha lag Ở giai đoạn này tế bào đã thích nghi với môi trường mới, bắt đầu phát triển nhân đôi và có tốc độ sinh trưởng là một hằng số (Stanbury và cộng sự, 1995)

Pha stationary (pha ổn định): là pha có tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật bằng 0 và có số

tế bào vi sinh vật cao nhất (Bull, 1974) Ở pha ổn định nguồn dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt (Stanbury và cộng sự, 1995) và nguồn ánh sáng được tế bào hấp thu hoàn toàn (Richmond, 2004) Tuy nhiên, vi sinh vật vẫn tiếp tục các hoạt động trao đổi chất để tạo ra các sản phẩm bậc 2 (sản phẩm này không được tạo ra trong pha log) (Borrow và cộng sự, 1961 và Bu’Lock và cộng sự ,1965)

Pha death (pha chết): là pha cuối cùng trong đường cong sinh trưởng Tốc độ sinh trưởng giảm và số lượng tế bào chết tăng lên

1.2 Các kiểu trao đổi chất của vi tảo

Nuôi cấy tự dưỡng (phototrophic cultivation)

Nuôi cấy tự dưỡng là vi tảo sử dụng ánh sáng (như ánh sáng tự nhiên từ mặt trời, hoặc ánh sáng nhân tạo từ đèn huỳnh quang, đèn LED…) làm nguồn năng lượng và carbon vô cơ (như CO2, NaHCO3, Na2CO3…) làm nguồn carbon để chuyển hóa thành năng lượng hóa học thông qua quá trình quang hợp (Huang và cộng sự 2010) Lợi thế chính của kiểu nuôi cấy này

là có thể sử dụng nguồn ánh sáng mặt trời và CO2 từ tự nhiên hay từ các nhà máy thải ra để nuôi vi tảo phát triển, vì thế chi phí tiêu tốn sẽ giảm đi đáng kể Ngoài ra, so với các kiểu nuôi cấy khác thì nuôi cấy tự dưỡng giảm nguy cơ nhiễm các vi sinh vật khác hơn Do đó, người ta hay sử dụng kiểu nuôi cấy này cho hệ thống nuôi cấy mở (Mata và cộng sự, 2010)

Nuôi cấy dị dưỡng (heterotrophic cultivation)

Khi vi tảo sử dụng nguồn carbon hữu cơ vừa là nguồn năng lượng vừa là nguồn carbon cho sự phát triển thì được gọi là nuôi cấy dị dưỡng (Chojnacka và cộng sự, 2004) Loại hình nuôi cấy này sẽ tránh những hạn chế về việc hấp thu ánh sáng của tế bào trong quá trình nuôi cấy tự dưỡng (Huang và cộng sự, 2010).Vi tảo có thể sử dụng các nguồn carbon hữu cơ đa dạng như glucose, acetate, glycerol, fructose, sucrose, lactose, galactose and mannose cho sự phát triển (Liang và cộng sự, 2009)

Sự sinh trưởng của vi tảo và hàm lượng lipid thu được ở nuôi cấy dị dưỡng cao hơn nhiều

so với nuôi cấy tự dưỡng (Ming và cộng sự, 2010) Tuy nhiên, khó khăn lớn nhất của nuôi cấy

dị dưỡng là dễ gặp các vấn đề về nhiễm vi sinh vật khác

Nuôi cấy hỗn hợp (mixotrophic cultivation)

Nuôi cấy hỗn hợp là khi vi tảo trải qua quá trình quang hợp và sử dụng cả những hợp chất hữu cơ và carbon vô cơ (CO2) để phát triển Điều này có nghĩa là vi tảo có thể sống dưới điều kiện tự dưỡng và dị dưỡng Nuôi cấy quang dị dưỡng (photoheterotrophic cultivation)

Nuôi cấy quang dị dưỡng là vi tảo yêu cầu ánh sáng khi sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon Khác nhau chính của nuôi cấy hỗn hợp và nuôi cấy quang dị dưỡng là nuôi cấy quang dị dưỡng yêu cầu ánh sáng như một nguồn năng lượng, trong khi đó nuôi cấy hỗn hợp

có thể sử dụng những hợp chất hữu cơ để phục vụ cho mục đích này Vì vậy, nuôi cấy quang dị dưỡng cần cả đường và ánh sáng cùng một lúc (Chojnacka và cộng sự, 2004)

1.3 Các hệ thống nuôi cấy

Trong nuôi cấy sinh khối tảo có hai hệ thống nuôi cấy chính là nuôi cấy mở (open pond)

và nuôi cấy kín (closed photobioreactor)

6

1.3.1 Hệ thống nuôi cấy mở (open pond)

Hệ thống nuôi cấy mở thường được thiết kế để nuôi tảo trong các vùng nước tự nhiên (hồ, đầm, ao), các hồ nhân tạo hoặc các bình chứa mở Năng suất nuôi cấy cao nhất trong các hệ thống mở đạt được ở hệ thống raceway Raceway là hệ thống hồ nuôi tảo được thiết kế thành một vòng khép kín có các kênh tuần hoàn hình oval, độ sâu hồ ở khoảng từ 0.2 đến 0.5 m Raceway thường có một bánh guồng (paddle wheel) để pha trộn và đảm bảo sự luân chuyển đồng đều của tảo và các chất dinh dưỡng, nhờ đó ổn định năng suất và sự phát triển của tảo (Brennan và cộng sự, 2009)

Raceway thường được xây dựng bằng bê tông, nhưng đáy ao làm bằng nhựa màu trắng Trong một chu kỳ sản xuất liên tục, môi trường và chất dinh dưỡng được đưa vào ở phía trước của bánh guồng và luân chuyển qua các vòng lặp để thu hoạch sinh khối tại cuối bánh guồng Các bánh guồng hoạt động liên tục để ngăn chặn sự lắng đọng trầm tích sinh khối Vi tảo thường

sử dụng CO2 từ không khí bề mặt, nhưng thiết bị sục khí chìm có thể được cài đặt để tăng cường

sự hấp thụ CO2 (Brennan và cộng sự, 2009)

Raceway là hệ thống nuôi cấy có chi phí thiết kế và vận hành rẻ nhưng năng suất thu hồi sinh khối thấp do dễ nhiễm các vi sinh vật khác, bị ảnh hưởng bởi sự biến đổi nhiệt độ của môi trường, hiệu quả trộn lẫn,sự hấp thu CO2 và ánh sáng kém (Brennan và cộng sự, 2009)

1.3.2 Hệ thống nuôi cấy kín (closed photobioreactor)

Để khắc phục những nhược điểm của hệ thống nuôi cấy mở như…, hệ thống nuôi cấy kín (closed photobioreactor) là một giải pháp khả thi Các hệ thống nuôi cấy kín chủ yếu bao gồm:

hệ thống nuôi cấy kín dạng ống (tubular), hệ thống nuôi cấy kín dạng bản phẳng (flat plate) và

hệ thống nuôi cấy kín dạng cột (column)

Hệ thống nuôi cấy dạng bản phẳng (flat plate photobioreactor, hình 2.1b) là dạng được biết sớm nhất trong hệ thống nuôi cấy kín (Samson, 1985) Hệ thống này có bề mặt tiếp xúc lớn cho việc hấp thu ánh sáng (Ugwu và cộng sự, 2008) và thu được sinh khối cao (>80 g L-1) (Kurano và cộng sự, 1998) Các vật liệu trong hệ thống đều trong suốt và bề dày của bản phẳng phải mỏng để có thể hấp thu ánh sáng tốt nhất (Kurano và cộng sự, 1998) Hệ thống nuôi cấy dạng bản phẳng phù hợp cho sản xuất tảo với mật độ cao bởi khả năng tích tụ oxy hòa tan thấp

và hiệu quả quang hợp cao hơn so với dạng ống (Richmond, 2000)

Hệ thống nuôi cấy dạng ống (tubular photobioreactor, hình 2.1a) bao gồm một dàn các ống thủy tinh (hoặc plastic) thẳng có khả năng hấp thu ánh sáng và có thể được sắp xếp thành hàng ngang, thẳng đứng , nằm nghiêng hay hình xoắn ốc (Brennan và cộng sự 2009) Các ống

này thường có đường kính từ 0.1m trở xuống (Chisti 2007) Môi trường nuôi tảo sẽ được tuần hoàn và hòa trộn bằng bơm cơ học hoặc hệ thống sục khí Tuy nhiên, hệ thống nuôi cấy dạng ống vẫn tồn tại một số nhược điểm như sự giới hạn về chiều dài của ống, chiều dài của ống phụ thuộc vào thành phần O2, CO2 và độ pH trong môi trường (Eriksen, 2008)

Hệ thống nuôi cấy dạng cột (column photobioreactor, hình 2.1c) là dạng thiết bị có hiệu quả phối trộn cao nhất, có tốc độ luân chuyển thể tích môi trường cao nhất và các điều kiện nuôi cấy được kiểm soát tốt nhất (Eriksen, 2008) Hệ thống nuôi cấy dạng cột có chi phí thiết

kế thấp, nhỏ gọn và dễ dàng vận hành Các cột dọc được sục khí từ phía dưới và được chiếu sáng thông qua các bức tường trong suốt (Eriksen, 2008)

Ngày nay, các hệ thống nuôi cấy kín được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong sản xuất sinh khối vi tảo vì nó có thể được kiểm soát các điều kiện nuôi cấy và cho năng suất sinh khối cao hơn hệ thống mở (Brennan và cộng sự, 2009)

1.4 Điều kiện nuôi cấy tảo

Thành phần dinh dưỡng có trong môi trường nuôi tảo cũng như các nhân tố môi trường xung quanh không chỉ tác động đến quá trình quang hợp và năng suất thu hồi sinh khối tế bào

mà còn tác động đến các hoạt động trao đổi chất, con đường sinh tổng hợp bên trong tế bào (Richmond 2004) Trong mục này, chúng tôi sẽ mô tả sơ lược ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và các nhân tố vật lí đến xu hướng phát triển của tế bào, từ đó tìm ra được điều kiện nuôi cấy phù hợp cho các mục đích nghiên cứu khác nhau

1.4.1 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tảo

Để sinh trưởng và phát triển tốt, tảo cần 3 thành phần dinh dưỡng chính là: carbon, nitrogen, phosphorus và các chất dinh dưỡng vi lượng như calcium, magnesium, potassium, iron, mangan, sulfur, zinc, copper và cobalt

1.4.1.1 Nguồn carbon

Nguồn carbon là thành phần dinh dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng của vi tảo Thông thường vi tảo được phát triển dưới điều kiện tự dưỡng, dị dưỡng và hỗn hợp thông qua việc sử dụng các nguồn carbon đa dạng khác nhau như carbon dioxide, methanol, acetate, glucose và các hợp chất hữu cơ khác (Xu và cộng sự , 2006) Như đã đề cập ở mục 2.2, sinh trưởng theo kiểu tự dưỡng nghĩa là vi tảo sử dụng nguồn carbon vô cơ (ví dụ CO2 hay các muối bicarbonate) như nguồn carbon để tạo ra năng lượng hóa học thông qua quá trình quang hợp Một vài loài tảo có thể sử dụng trực tiếp carbon hữu cơ trong điều kiện có ánh sáng hoặc không có ánh sáng (sinh trưởng theo kiểu dị dưỡng)

8

Trong sản xuất sinh khối vi tảo, nguồn carbon vô cơ từ CO2 và các muối bicarbonate thường được sử dụng bởi vì nguồn carbon hữu cơ có giá thành cao và làm tăng nguy cơ nhiễm các loài vi sinh vật khác (Pandey và cộng sự 2014, Borowitzka và cộng sự, 2013) CO2 hay được sử dụngtrong công nghệ nuôi tảo vì là nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có Tuy nhiên khả năng hòa tan của CO2 trong nước kháthấp;các phân tử CO2 tự do dễ dàng bị thất thoát ra ngoài không khí, vì vậy cần phải sục khí CO2 một cách liên tục để đảm bảo cung cấp đủ carbon cho quá trình quang hợp của tảo; ion bicarbonate (HCO3-) từ sodium bicarbonate (NaHCO3) có thể trở thành nguồn carbon thay thế để vi tảo tự dưỡng sinh trưởng và phát triển, bởi vì khả năng hòa tan của NaHCO3 trong nước cao hơn so với khí CO2

1.4.1.2 Nguồn nitrogen

Nitrogen (N) là một thành phần thiết yếu của tất cả các protein cấu trúc và protein chức năng trong tế bào, nó thường chiếm khoảng 7-10% khối lượng tế bào khô Trong nuôi cấy tảo, nguồn nitrogen chủ yếu được cung cấp dưới dạng muối nitrat (NO3-), ngoài ra amoniac và urea cũng được sử dụng cho sự sinh trưởng của vi tảo

Khi vi tảo được nuôi trong điều kiện nitrogen bị hạn chế thì qúa trình tổng hợp protein trong tế bào sẽ được thay thế bằng quá trình tổng hợp lipid hoặc carbonhydrate (Richmond 2004) Trong suốt quá trình sinh trưởng của vi tảo, tinh bột sẽ được tổng hợp đầu tiên để dự trữ năng lượng, sau đó lipid sẽ được tạo thành và dự trữ trong tế bào khi môi trường bị ức chế (ví

dụ như sự thiếu hụt nitrogen) Tuy sự thiếu hụt nitrogen có hiệu quả trong việc tăng hàm lượng lipid trong vi tảo nhưng lại dẫn đến sự sự giảm đáng kể tốc độ sinh trưởng của vi tảo Vì vậy thời gian nuôi cấy tảo thường được chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn đảm bảo sinh trưởng tốt (điều kiện đủ nitrogen) và giai đoạn tích lũy lipid (điều kiện thiếu hụt nitrogen) để đảm bảo năng suất sản xuất lipid (Pandey và cộng sự, 2014)

1.4.1.3 Nguồn phosphorus

Phosphorus (P) cần thiết cho sự sinh trưởng và các quá trình trao đổi chất bên trong tế bào như sự vận chuyển năng lượng, tổng hợp sinh học của các acid nucleic, DNA … Phosphorus thường được bổ sung vào môi trường dưới dạng PO43- và sự hấp thu của PO43- -P phụ thuộc vào năng lượng cung cấp cho tế bào Tảo cũng có thể lưu trữ phosphorus dư thừa trong tế bào trong điều kiện nuôi cấy có hàm lượng phosphorus cao (Richmond, 2004)

Sự cung cấp P cũng phụ thuộc vào các thành phần có trong sinh khối tảo Hàm lượng P bên trong tế bào và bên ngoài môi trường tác động đến hàm lượng lipid và các carbohydrare trong

tế bào (Borowitzka, 1988) Tỉ lệ N/P cũng quan trọng trong môi trường sinh trưởng bởi vì tỉ lệ

N/P phù hợp không chỉ cho năng suất thu hồi sinh khối tảo cao nhất mà còn duy trì tính ưu thế của giống tảo trong môi trường (Richmond 2004) Xin và cộng sự (2010) cho rằng tỉ lệ N/P trong môi trường nằm trong khoảng phù hợp sẽ cho tốc độ hấp thu nitrogen và phosphorus hiệu quả nhất

1.4.1.4 Nguồn khoáng

Ngoài các nguồn dinh dưỡng đa lượng, tảo cũng cần các nguồn dinh dưỡng vi lượng như

Fe, Mn….Vai trò của từng thành phần như sau:

- Iron (Fe) cần thiết cho sự phát triển của tất cả các thực vật phù du, nó đóng vai trò quan trọng trong các quá trình trao đổi chất thiết yếu bên trong tế bào như sự vận chuyển electron quang hợp, sự vận chuyển electron hô hấp, sự khử nitrate và nitrite, sự khử sulfate, Tế bào tảo có nhu cầu hấp thu Fe cao khi cường độ chiếu sáng giảm (Raven

1990, Sunda và cộng sự, 1997) và khoảng thời gian chiếu sáng giảm (Sunda và cộng sự, 2004)

- Mangan (Mn) là một thành phần quan trọng trong quá trình quang hợp, Mn cũng như Fe cần một lượng lớn hơn cho sự phát triển của tế bào trong điều kiện ánh sáng thấp (Sunda

và cộng sự, 1998) Mangan tham gia vào thành phần cấu tạo của superoxide dismutase – một enzyme có khả năng di chuyển các gốc tự do superoxide độc (Raven và cộng sự, 1999; Peers và cộng sự, 2004) Bởi vì mangan có ít hơn trong những thành phần trao đổi chất nên nhu cầu sử dụng mangan cho sự phát triển ít hơn sắt (Raven, 1990)

- Zinc (Zn) có mặt trong carbonic anhydrase- một enzyme có chức năng vận chuyển và cố định CO2 (Morel và cộng sự, 1994) Một lượng lớn hơn enzyme này cần thiết dưới điều kiện CO2 bị hạn chế(Andersen, 2005)

- Copper (Cu) cần thiết cho tất cả các thực vật phù du bởi chức năng của nó trong cytochrome oxidase, một protein cần thiết trong chuỗi vận chuyển electron hô hấp Copper có vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp (Raven và cộng sự, 1999)

- Molybdenum (Mo) đóng vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa nitrogen Molybdenum phản ứng với sắt trong các enzyme khử nitrate và nitrogenase, và nó cần cho việc tiêu thụ nitrate (Raven, 1988)

1.4.2 Các yếu tố tác động đến sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris

1.4.2.1.Mật độ tế bào

Myuers và cộng sự (1958) cho rằng năng suất của quá trình quang hợp chịu tác động bởi hàm lượng tế bào có trong môi trường Mật độ tế bào phù hợp sẽ cho khả năng hấp thu ánh sáng

10

trên từng tế bào là tốt nhất Mật độ tế bào thấp trong điều kiện chiếu sáng cao có thể xảy ra hiện tượng quang ức chế, phá hỏng bộ máy quang học trong tế bào Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng mật độ tế bào tối ưu trong môi trường sẽ cho sự thích ứng và hấp thu ánh sáng tốt nhất (Richmond 2004) Ngoài ra, nguy cơ nhiễm các loài sinh vật vào môi trường nuôi tảo (ví dụ

như Chlorella và Spirulina ) sẽ ít xảy ra hơn khi mật độ tế bào trong môi trường cao (Richmond

và cộng sự, 1990) Vì vậy mật độ tế bào ban đầu là một yếu tố cần quan tâm nghiên cứu …

1.4.2.2 Ánh sáng

Quang phổ và cường độ ánh sáng là những nhân tố tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng của vi tảo Trong hệ thống quang hợp, 8 bức xạ photon cùng với 1 phân tử CO2 sẽ tạo nên carbonhydate, vì vậy vi tảo cần cung cấp ánh sáng phù hợp cho hiệu quả quang hợp cao nhất Nhiều nghiên cứu cho thấy hàm lượng các sắc tố, các acid không bão hòa, carbohydrate và protein trong tế bào tảo phụ thuộc vào sự tăng hay giảm cường độ ánh sáng (Renaud và cộng

sự, 1991; Ma và cộng sự, 1997; Brown và cộng sự, 2002)

1.4.2.3.Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong các nhân tố chính ảnh hưởng đến hình thái học và sinh lý học của

tế bào cũng như tác động đến sự sản xuất sinh khối vi tảo Ở nhiệt độ cao, các hoạt động trao đổi chất của vi tảo thường tăng nhanh và ở nhiệt độ thấp sự sinh trưởng của tảo có thế bị ức chế Nhiệt độ cũng tác động đến các nhân tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy như sự cân bằng ion trong nước, pH và khả năng hòa tan của O2 và CO2 Các loài vi tảo khác nhau sẽ bị tác động bởi nhiệt ở các mức độ khác nhau (Park và cộng sự, 2011)

1.4.2.5.Độ pH

pH môi trường tác động đến việc sử dụng CO2 trong quá trình quang hợp và các chất dinh dưỡng trong môi trường Từng loại vi sinh vật sẽ có từng giá trị pH tối thích cho sự phát triển khác nhau Một số loài vi tảo có pH tối thích khoảng pH 7.0, tuy nhiên, một số loại lại có thể

chịu đựng được pH rất cao (Spirulina, pH 11.0) hoặc pH rất thấp (Chlorococcum, pH 4.0)

(Kumar và cộng sự, 2010)

1.5 Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của vi tảo

1.5.1 Thành phần dinh dưỡng của tế bào vi tảo

Các acid béo không bão hòa

Vi tảo không chỉ là nguồn nguyên liệu chính sản xuất racác acid béo không bão hòa (PUFA), mà còn sản xuất ra các acid béo có tính chất tốt hơn so với dầu cá như không gây mùi khó chịu, giảm mức độ rủi ro do quá trình nhiễm bẩn hóa học và khả năng tinh lọc tốt hơn (Otto Pulz và cộng sự, 2004) PUFA tinh khiết được thêm vào trong công thức sữa cho trẻ em đang

phát triển ở châu Âu và những con gà mái được cho ăn vi tảo Schizochytrium để sản xuất ra

những quả trứng có hàm lượng OMEGA cao Các acid béo không bão hòa này cũng được ứng dụng trong công nghệ làm đẹp, cụ thể là các sản phẩm chăm sóc da (Otto Pulz và cộng sự, 2004)

Polysaccharide

Polysaccharide như agar, alginate và carrageenan của các loại tảo lớn (macroalgae) là sản phẩm có vai trò kinh tế quan trọng Chúng được sử dụng trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau bởi tính năng làm dày và tạo gel của nó (Namikoshi, 1996)

Các chất chống oxy hóa

Do vi tảo sống trong điều kiện tự dưỡng, chúng sẽ phát triển trong điều kiện có chứa oxy

và các gốc tự do cao Vì vậy, chúng tự sinh ra cơ chế tạo ra các chất chống oxy hóa và quét sạch các gốc tự do.Cơ chế này sẽ giúp nó chống lại các hoạt động phá hoại tế bào Từ đó, ta có thể thu được các chất chống oxy hóa từ nguồn vi tảo tự nhiên này Các sản phẩm chống oxy hóa từ vi tảo được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực mỹ phẩm (như các sản phẩm chống nắng) và dược phẩm ( các bệnh có liên quan đến quá trình oxy hóa như viêm) (Otto Pulz và cộng sự ,2004)

1.5.2 Ứng dụng của vi tảo

Sinh khối của vi tảo thường được sản xuất dưới dạng bột khô hay dạng nén thành viên Sinh khôi này thu được từnước tự nhiên hay từ môi trường hồ nhân tạo hay hệ thống kín photobioreactor (Otto Pulz và cộng sự, 2004) Sản phẩm cuối cùng của sản xuất sinh khối tảo thì thường ở dạng bột xanh hay cam và được bán trong thị trường thực phẩm dinh dưỡng (Otto Pulz và cộng sự, 2004)

 Dinh dưỡng cho con người:

Suốt nhiều thập kỉ qua, sinh khối vi tảo được sử dụng trong thị trườngthực phẩm dinh dưỡng với hơn 75% và thường được sản xuất dưới dạng bột, dạng viên bọc Nhiều công ty của Đức đã bắt đầu sử dụng vi tảo và cyanobacteria vào sản xuất thực phẩm như pasta, bánh

nay, có bằng chứng cho rằng với một lượng rất nhỏ sinh khối vi tảo như Chlorella, Scenedesmus

và Spirulina cũng có thể tác động một cách tích cực đến sinh lí của động vật (Otto Pulz và cộng

sự, 2004)

 Biofertilizer (phân sinh học)

Tảo lớn được sử dụng trong môi trường đất ở nhiều nước trên thế giới để làm tăng khả năng liên kết nước và tăng hàm lượng khoáng chất của đất (Critchley và cộng sự, 1998) Xu hướng tương lai là sử dụng các hoạt tính sinh học của các sản phẩm vi tảo chống lại các bệnh gây ra bởi các loại virus (Otto Pulz và cộng sự, 2004)

 Nguồn cung cấp dinh dưỡng dưới nước

Vi tảo đóng một vai trò chính trong môi trường nước, đặc biệt là trong môi trường nước biển, nó là nguồn thức ăn cho nhiều loại ấu trùng, động vật thân mềm, động vật giáp xác và cá Ngoài ra, vi tảo còn là nguồn thức ăn cho các sinh vật trôi nổi (các động vật được sử dụng để nuôi ấu trùng, cá…) (Lavens và cộng sự, 1996)

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy và hóa chất

2.1.1 Vi tảo

Loài tảo nước ngọt Chlorella vulgaris mua từ Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng Thủy sản

2 (Tp.HCM) được sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu

2.1.2 Môi trường nuôi cấy tảo

Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng để nuôi tảo như: Môi trường BBM, môi trường Walne, Guillard, Ryther, Tamya, Ito và môi trường phân vô cơ Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng môi trường Bold’s Basal Medium (BBM) để lưu trữ giống trên đĩa petri, nhân giống

và khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác nhau Thành phần của môi trường BBM được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 2 1: Thành phần trong môi trường BBM gấp 3 lần NaNO 3 -N (Bold 1949,

Bischoff và Bold 1963)

Dung dịch

lưu trữ Các thành phần Thể tích

Hàm lượng trong dung dịch lưu trữ (g/L)

Hàm lượng trong môi trường cuối (M)

CuSO4 5 H2O Co(NO3)2 6 H2O

1 ml

8.82 1.44 0.71 1.57 0.49

3.07.10-5

7.28.10-64.93.10-66.29 10-61.68 10-6

 Phương pháp nhân giống

Môi trường nhân giống vi tảo được sử dụng là môi trường BBM có bổ sung thêm 5 g/L

glucose C vulgaris được lưu trữ trên môi trường BBM agar và bảo quản ở 4oC Khi tiến hành

nhân giống, khuẩn lạc C vulgaris từ BBM agar sẽ được chuyển sang bình tam giác đựng 200

mL BBM lỏng có bổ sung 5 g/L đường glucose trong điều kiện vô trùng Bình tam giác sau đó được đậy bằng nút bông và được lắc ở 240 rpm (sử dụng máy lắc IKA – KS 130 BASIC xuất

xứ từ Đức) và chiếu sáng liên tục bằng đèn LED (Light Emitting Diodes) ở cường độ ánh sáng

150 µmol photons/m2s Thời gian nhân giống khoảng 3-4 ngày đến khi đạt được số lượng VSV như mong muốn Tất cả các bình tam giác (có đậy nút bông) đựng môi trường, pipette tip, … đều được tiệt tùng ở 121 0C trong 5 phút trước khi sử dụng

 Phương pháp bổ sung giống

Giống sau khi được xác định số lượng bằng buồng đếm hồng cầu sẽ được tính toán lượng thể tích cần bổ sung cho phù hợp với mật độ giống ban đầu Bổ sung lượng thể tích dung dịch giống đã xác đinh vào ống ly tâm đã tiệt trùng Ly tâm và rửa bằng nước cất ba lần để loại bỏ môi trường nuôi cấy với tốc độ ly tâm là 2500 rpm (máy ly tâm Hermle Z300 xuất xứ từ Đức) trong 7 phút mỗi lần quay (Ranklin và cộng sự 2001) Sau đó lấy giống trong ống ly tâm bổ sung vào môi trường khảo sát trong điều kiện vô trùng

2.1.3 Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm được mua ở Công ty Hóa Nam, độ tinh khiết

là 99 %