Động học sinh trưởng của vi tảo chlorella vulgaris trong hệ thống closed photobioreactor ở điều kiện nuôi cấy khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đ ỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHLORELLA V

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ THỐNG CLOSED - PHOTOBIOREATO Ở ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY KHÁC NHAU

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH SVTH: HOÀNG THỊ HỒNG

MSSV: 12116031

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2016

S K L 0 0 4 4 2 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MÃ SỐ: 2016-12116031

ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI

TẢOCHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ

THỐNG CLOSED – PHOTOBIOREACTOR

ỞĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY KHÁC NHAU

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH SVTH: HOÀNG THỊ HỒNG

MSSV: 12116031

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đ ỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO

CHLORELLA VULGARIS TRONG HỆ THỐNG CLOSED

– PHOTOBIOREACTOR Ở ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

KHÁC NHAU

GVHD: TS VŨ TRẦN KHÁNH LINH SVTH: HOÀNG THỊ HỒNG

MSSV: 12116031

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2014

Em xin gửi đến cô Vũ Trần Khánh Linh, lời cảm ơn chân thành nhất Cô đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện

đề tài

Con cũng xin cảm ơn ba mẹ, gia đình, bạn bè là nguồn động viên tinh thần, là động lực

để con vượt qua giai đoạn khó khăn này

Cảm ơn bạn Phạm Thị Minh Hiền đã cùng mình vượt qua những giây phút khó khăn trong

đồ án Em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả bạn bè, tập thể lớp 121160 đã quan tâm, ủng hộ, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Trong thời gian thực hiện đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót, kính mong sự thông cảm

từ quý thầy cô Mặc dù đã nỗ lực, cố gắng để hoàn thành đề tài nhưng không tránh khỏi những sai sót Rất mong sẽ nhận được những lời góp ý chân thành từ quý thầy cô, các anh chị và các bạn để bài báo cáo được hoàn chỉnh hơn

Chân thành cảm ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, 25 tháng 7 năm 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp

đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định

Ngày 26 tháng 7 năm 2016

Ký tên

MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Error! Bookmark not defined

LỜI CẢM ƠN 2

Trong khoảng thời gian thực hiện đề tài em đã nhận được nhiều sự động viên, giúp đỡ từ thầy cô, gia đình, bạn bè để hoàn thành tốt đề tài dù gặp nhiều khó khăn ii

LỜI CAM ĐOAN iii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 1

3 Nội dung nghiên cứu 1

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về vi tảo 3

1.1.1 Chlorella vulgaris 3

1.1.2 Động học sinh trưởng của tảo 5

1.2 Các kiểu trao đổi chất của vi tảo 6

1.2.1 Quang tự dưỡng (phototrophic cultivation) 6

1.2.2 Dị dưỡng (heterotrophic cultivation) 7

1.2.3 Hỗn hợp (mixotrophic cultivation) 7

1.2.4 Quang dị dưỡng (photoheterotrophic cultivation) 7

1.3 Hệ thống nuôi cấy 8

1.3.1 Hệ thống mở 8

1.3.2 Hệ thống kín (Closed-photobioreactor) 10

1.4 Điều kiện nuôi cấy 11

1.4.1 Ánh sáng 11

1.4.2 Nhiệt độ 12

1.4.3 Mật độ tế bào 12

1.4.4 Dinh dưỡng 13

1.5 Ứng dụng 16

1.5.1 Sử dụng vi tảo làm thức ăn cho động vật 16

1.5.2 Sử dụng vi tảo trong sản xuất thực phẩm cho con người .16

1.5.3 Vi tảo sử dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm 17

1.5.4 Vi tảo ứng dụng trong xử lý môi trường 17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy và hóa chất 18

2.1.1 Vi tảo 18

2.1.2 Môi trường nuôi cấy tảo 18

2.1.3 Hóa chất 19

2.2 Bố trí thí nghiệm 20

2.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 20

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris .20

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ glycerol:glucose ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 21

2.3 Các phương pháp phân tích 22

2.3.1 Phương pháp xác định số lượng tế bào C.vulgaris 22

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng sinh khối khô của tảo 23

2.3.3 Xác định tốc độ tăng trưởng riêng của C vulgaris 24

2.3.4 Xác định hàm lượng PO 4 3- -P .24

2.3.5 Xác định hàm lượng NO 3 - -N 25

2.3.6 Xác định đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử axit dinitro salicylic (DNS) 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 28

3.2 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng lên sự phát triển của Chlorella vulgaris 33

3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ glycerol : glucose ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris 39

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Kiến nghị: 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Đường cong sinh trưởng 5

Hình 2 1: Buồng đếm hồng cầu và cấu tạo buồng đếm hồng cầu 23

Hình 2 2: Tế bào tảo Chlorella vulgaris trên buồng kính hồng cầu 23

Hình 3 1: Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sự phát triển của tảo C vulgaris 29

Hình 3 2: Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng lên sự phát triển của tảo C.vulgaris 35

Hình 3 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ glycerol : glucose lên sự phát triển của tảo C vulgaris 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Thành phần hóa học của tảo Chlorella vulgaris 3

Bảng 1 2: Hàm lượng Amino acid có trong tảo Chlorella vulgaris 4

Bảng 1 3: Hàm lượng Acid béo có trong tảo Chlorella vulgaris 4

Bảng 1 4: Hàm lượng khoáng chất trong tảo Chlorella vulgaris 4

Bảng 1 5: Hàm lượng vitamin trong tảo Chlorella vulgaris 5

Bảng 1 6: So sánh đặc điểm của các kiểu trao đổi chất khác nhau 8

Bảng 1 7: Ưu điểm và hạn chế của hệ thống ao mở và hệ thống kín 9

Bảng 2 1: Thành phần trong môi trường BBM 18

Bảng 2 2: Bảng liệt kê điều kiện thí nghiệm trong khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến động học sinh trưởng của Chlorella vulgaris 20

Bảng 2 3: Bảng liệt kê điều kiện thí nghiệm trong khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 21

Bảng 2 4: Liệt kê các điều kiện thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ glycerol:glucose ban đầu đến động học sinh trưởng của tảo Chlorella vulgaris 22

Bảng 3 1: Hàm lượng sinh khối và hiệu suất thu sinh khối của Chlorella vulgaris ở các điều kiện bổ sung mật độ giống cấy ban đầu khác nhau 33

Bảng 3 2: Hàm lượng sinh khối và hiệu suất thu sinh khối của Chlorella vulgaris ở các cường độ chiếu sáng khác nhau 38

Bảng 3 3: Hàm lượng sinh khối và hiệu suất thu sinh khối của Chlorella vulgaris ở các tỷ lệ glycerol : glucose khác nhau 44

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Động học sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris được khảo sát dưới các điều kiện môi

trường nuôi cấy khác nhau bao gồm: mật độ tế bào ban đầu, cường độ chiếu sáng và tỷ lệ glycerol: glucose ban đầu trong môi trường Kết quả thu được cho thấy hiệu suất thu hồi sinh

mật độ tế bào này, C.vulgaris sinh trưởng và phát triển tốt ở cường độ chiếu sáng là 150 µmol

glucose vào môi trường BBM sự sinh trưởng của C vulgarischo hiệu suất thu hồi sinh khối cao

nhất đạt 0.291 g/L.ngày Những kết quả thu được trong nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc bước đầu xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của tảo

nước ngọt C vulgaris nhằm đạt được hiệu suất thu hồi sinh khối cao nhất

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, sản xuất sinh khối tảo ngày càng được chú trọng trên toàn thế giới do chúng mang lại rất nhiều lợi ích trong thủy sản, dinh dưỡng, công nghiệp, bảo vệ môi trường, y tế và nông nghiệp(Vega và cộng sự, 2012) Sinh khối tảo có chứa một lượng lớn carbohydrate (23.2

%) và các chất chất béo không no Ngoài ra còn có các hợp chất có giá trị như: β-carotene, lutein, astaxanthin, vitamin,…rất có lợi cho sức khỏe con người (Markou,2013) Nên xu hướng trong tương lai là nuôi trồng vi tảo để làm thực phẩm mà con người có thể sử dụng được với giá thành rẻ và có lợi cho sức khỏe Từ những lợi ích mà sinh khối tảo hay việc nuôi tảo thu sinh khối đem lại, các nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển của tảo ở các điều kiện nuôi cấy khác nhauđang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, để góp phần tìm ra những điều kiện nuôi tảo tốt hơn, từ đó giúp thu nhận sinh khối tảo tốt cả về số lượng lẫn chất lượng

Nhằm tìm hiểu kỹ hơn về điều kiện sinh trưởng của C.vulgaris, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề tài: “Động học sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris trong hệ thống closed-

photobioreactor ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau”

2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát động học sinh trưởng của tảo C.vulgaris trong

hệ thốnghệ thống nuôi cấy kín (closed-photobioreactor) với mật độ tế bào ban đầu, cường độ chiếu sáng và tỷ lệ glycerol:glucose ban đầu khác nhau nhằm lựa chọn điều kiện nuôi cấy tốt

nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của C.vulgaris

3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài: “Động học sinh trưởng của vi tảo Chlorella vulgaris trong hệ thống

closed-photobioreactor ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau”, gồm các nội dung cụ thể sau:

C.vulgaris

tảo C.vulgaris

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: vi tảo Chlorella vulgaris

Phạm vi nghiên cứu: thực hiện nuôi cấy C vulgaris ở quy mô phòng thí nghiệm (trong

các bình tam giác thủy tinh dung tích 500 mL)

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Kết quả khảo sát động học sinh trưởng của C.vulgaris trong nghiên cứu này sẽ là cơ sở

khoa học cho các nghiên cứu động học về sau, và đặt nền tảng cho việc thiết lập và xây dựng

quy trình sản xuất thu nhận sinh khối tảo ở quy mô lớn hơn với chi phí sản xuất thấp hơn

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần đề ra phương pháp sản xuất sinh khối tảo C vulgaris ở mật độ tế bào tốt

nhất giúp tảo thích nghi nhanh với môi trường và chohàm lượng sinh khối cao nhất Đề tài góp

phần tìm ra cường độ chiếu sáng thích hợp cho sản xuất vi tảo và tỷ lệ glycerol:glucose ban đầu

trong môi trường thích hợpgiúp sản xuất sinh khối cao nhất mà tiết kiệm chi phí cho sản xuất

cao được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel) và công nghiệp thực phẩm do thànhphần dinh dưỡng trong tế bào tảo rất đa dạng: lipid (10.2%), protein (55%),carbonhydarte

(23.2%),các sắc tố và thành phần vitamin… Chlorellađược tiêu thụ chủ yếu theo dạng thực

phẩm chức năng (Richmond, 1990)

Trong giốngChlorella thì C vulgaris được nghiên cứu và khảo sát nhiều nhất do nó là

loài vi sinh vật lâu đời, dễ nuôi và phát triển nhanh (Ming và cộng sự, 2010) Nó có khả năng cho thu hoạch rất nhanh chỉ từ 7-10 ngày (Martins và cộng sự, 2010) với hàm lượng sinh khối,

lượng chất béo tích lũy khá cao C vulgaris có kích thước rất nhỏ(từ 5 đến 10 micromet), C

vulgaris được sử dụng làm nguồn nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu hóa thạch, giúp xử lý nước

thải và làm thức ăn cho thủy hải sản Thành phần hóa học của C vulgaris được trình bày trong

Bảng 1 2: Hàm lượng Amino acid có trong tảo Chlorella vulgaris (Hagiwara,1997)

Bảng 1 3:Hàm lượng Acid béo có trongtảo Chlorella vulgaris(Hagiwara,1997)

Acid béo % tổng acid béo

Bảng 1 4:Hàm lượng khoáng chất trong tảo Chlorella vulgaris (Hagiwara,1997)

Khoáng chất Hàm lượng (mg g -1 chất khô)

Bảng 1 5:Hàm lượng vitamin trong tảo Chlorella vulgaris(Hagiwara,1997)

Vitamin Hàm lượng (µg g -1 chất khô)

1.1.2 Động học sinh trưởng của tảo

Trong quá trình nuôi cấy mẻ tảo phát triển theo một đường cong sinh trưởng với 4 pha chính là pha lag, pha log, pha ổn định và pha suy vong(Stanbury và cộng sự, 1995) Đường cong sinh trưởng của tảo sẽ phản ánh lên những thay đổi trong sinh khối và môi trường nuôi cấy của chúng (Richmon, 2004) Hình 1.1 biểu diễn đường cong sinh trưởng của vi sinh vật nói chung trong nuôi cấy mẻ

Hình 1 1: Đường cong sinh trưởng (Singh và Dwivedi, 2004)

Pha lag là giai đoạn đầu của đường cong sinh trưởng, là thời gian để tảo thích nghi với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy.Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chiều dài của pha lag là thành phần dinh dưỡng của môi trường nhân giống, thành phần dinh dưỡng có trong môi trường mới, tuổi của giống tảo, lượng tảo bỏ vào, thiết bị nuôi cấy và các yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH,… (Sikyta, 1995)

Pha loglà pha sinh trưởng nhanh của tảo, là giai đoạn sau pha lag Ở giai đoạn này tế bào

đã thích nghi với môi trường mới, bắt đầu phát triển nhân đôi và có tốc độ sinh trưởng là một hằng số (Stanbury và cộng sự, 1995)

Pha ổn định là pha có tốc độ sinh trưởng của tảo bằng 0 và có số tế bào vi sinh vật cao nhất (Bull, 1974) Ở pha ổn định nguồn dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt (Stanbury và cộng sự, 1995) và nguồn ánh sáng được tế bào hấp thu hoàn toàn (Richmon, 2004) Tuy nhiên,

vi sinh vật vẫn tiếp tục các hoạt động trao đổi chất để tạo ra các sản phẩm bậc 2 (sản phẩm này không được tạo ra trong pha log) (Borrow và cộng sự, 1961 và Bu’Lock và cộng sự,1965) Pha chết (death phase) là pha cuối cùng trong đường cong sinh trưởng trong giai đoạn này tốc độ sinh trưởng của tảo giảm và số lượng tế bào chết tăng lên (Singh và Dwivedi, 2004)

1.2 Các kiểu trao đổi chất của vi tảo

Các đặc điểm sinh trưởng và và thành phần hóa học của vi tảo phụ thuộc rất nhiều vào các kiểu trao đổi chất của tảo.Có 4 kiểu trao đổi chất chính để nuôi cấy vi tảo: quang tự dưỡng,

dị dưỡng, hỗn hợp (mixotrophic) và quang dị dưỡng (Chojnacka và Rocha, 2004)

1.2.1 Quang tự dưỡng (phototrophic cultivation)

Trao đổi chất theo kiểu quang tự dưỡng là tảo sẽ sử dụng nguồn ánh sáng (như ánh sáng

là nguồn carbon để tạo thành năng lượng hóa học thông qua quang hợp (Huang và cộng sự, 2010) Đây là kiểu nuôi cấy được sử dụng phổ biến nhất cho sự phát triển của vi tảo (Gouveia

và cộng sự, 2009; Illman và cộng sự, 2000; Mandal, 2009; Yoo và cộng sự, 2010)

Ưu điểm chính của việc sử dụng kiểu nuôi cấy quang tự dưỡng là có thể sử dụng nguồn

các địa điểm nuôi trồng vi tảo phải gần nhà máy công nghiệp, nhà máy điện để có thể tận dụng

trên nên các hệ thống nuôi cấy ngoài trời thường sử dụng điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng (Mata và cộng sự, 2010)

1.2.2 Dị dưỡng (heterotrophic cultivation)

Một số loài vi tảo không chỉ phát triển trong điều kiện quang tự dưỡng mà còn có thể phát triển được cả trong điều kiện không có ánh sáng và sử dụng nguồn carbon hữa cơ để phát triển Khi vi tảo sử dụng nguồn carbon hữu cơ vừa là nguồn năng lượng vừa là nguồn carbon cho sự phát triển thì được gọi là trao đổi chất theo kiểu dị dưỡng (Chojnacka và cộng sự, 2004) Đây

là kiểu trao đổi chất có thể tránh được những vấn đề liên quan đến sự hạn chế ánh sáng khi môi

trường chứa mật độ tế bào tảo cao (Huang và cộng sự, 2010)

Vi tảo trong điều kiện trao đổi chất theo kiểu dị dưỡng có thể đồng hóa nhiều nguồn carbon hữu cơ khác nhau như: glucose, acetate, glycerol, fructose, sucrose, lactose, galactose

và mannose cho sự tăng trưởng (Liang và cộng sự, 2009) Tuy nhiên nuôi cấy dị dưỡng bằng các nguồn carbon hữu cơ dễ dẫn đến các vấn đề lây nhiễm cao

1.2.3 Hỗn hợp (mixotrophic cultivation)

Trao đổi chất theo kiểu hỗn hợp là khi vi tảo vừa quang hợp vừa sử dụng cả các hợp chất carbon vô cơ và hữu cơ là nguồn carbon cho sự tăng trưởng Như vậy vi tảo có khả năng phát triển theo một trong hai điều kiện tự dưỡng, dị dưỡng hoặc cả hai Vi tảo hấp thụ các hợp chất

tảo tái sử dụng (Mata và cộng sự, 2010)

1.2.4 Quang dị dưỡng (photoheterotrophic cultivation)

Quang dị dưỡnglà kiểu trao đổi chất đòi hỏi ánh sáng như là nguồn năng lượng để sử dụng các hợp chất hữu cơ như chất dinh dưỡng Sự khác biệt chính giữa nuôi trồng theo kiểu hỗn hợp và quang dị dưỡng là trao đổi chất theo kiểu quang dị dưỡng đòi hỏi ánh sáng như một nguồn năng lượng, trong khi nuôi theo kiểu hỗn hợp có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ để phục vụ cho mục đích này Do đó trao đổi chất theo kiểu quang dị dưỡng cần cả đường và ánh sáng tại cùng một lúc (Chojnacka và Marquez-Rocha, 2004) Kiểu nuôi trồng này rất hiếm khi được sử dụng trong nuôi cấy vi tảo.Bảng 1.6 trình bày so sánh đặc điểm của các kiểu trao đổi chất trong nuôi cấy vi tảo như sau

Bảng 1 6: So sánh đặc điểm của các kiểu trao đổi chất khác nhau (Chen,2011)

Điều kiện

nuôi cấy

Nguồn năng lượng

Nguồn carbon

Hàm lượng

tế bào

Hệ thống nuôi cấy

Gía cả Những vấn đề liên

quan

pond) hay thiết

bị phản ứng sinh học

Có nguy cơ nhiễm các loại vi sinh vật khác

Gía cả cơ chất cao

Thiết bị phản ứng quang sinh học kín

các loại vi sinh vật khác

Giá cả thiết bị cao Gía cả cơ chất cao

1.3.1 Hệ thống mở

Nuôi tảo trong hệ thống ao mở (open ponds) đã được sử dụng kể từ năm 1950 (Borowitzka,1999) Các hệ thống này có thể được phân loại thành các vùng nước tự nhiên (hồ, đầm, ao) và các hồ nhân tạo hoặc các bình chứa Raceway là hệ thống nhân tạo phổ biến nhất được sử dụng (Jime´nez và cộng sự, 2003).Raceway thường được xây dựng thành một ao hình oval khép kín, và có độ sâu khoảng 0.2 đến 0.5 m Raceway với một bánh guồng để đảm bảo

năng suất và sự phát triển của tảo Nhu cầu CO2 cho tảo được đáp ứng từ không khí tiếp xúc

và cộng sự, 2009)

So với hệ thống kín, thì hệ thống mở là phương pháp rẻ hơn trong sản xuất sinh khối tảo

ở quy mô lớn Nguyên nhân do yêu cầu về năng lượng đầu vào thấp(Rodolfi và cộng sự, 2008), bảo trì và làm sạch dễ dàng hơn (Ugwu,2008)nên có thể quay vòng sản xuất lớn hơn (Rodolfi

và cộng sự, 2008)

Hệ thống ao mở cho khả năng thu hồi sinh khối kém hiệu quả hơn so với hệ thống nuôi kín Nguyên nhân có thể dodễ nhiễm vi sinh vật, nhiệt độ cao dẫn đến sự bốc hơi nước, sự phối

nước cao của ao mở cũng là một hạn chế lớn làm ảnh hưởng tới thành phần các chất dinh dưỡng trong ao(Pulz,2001) Bảng 1.7 tóm tắt các ưu nhược điểm của các hệ thống ao mở và hệ thống kín

Bảng 1 7: Ưu điểm và hạn chế của hệ thống ao mở và hệ thống kín(Brennan và Owende,

- Năng lượng đầu vào thấp

- Dễ dàng bảo trì

- Năng suất sinh khối thấp

- Yêu cầu diện tích đất lớn

- Giới hạn trong một vài chủng loại tảo

- Sự phối trộn hiệu suất thấp,

- Gía thành tương đối thấp

- Hiệu suất thu hồi sinh khối cao

- Tế bào tảo có thể bám trên thành ống

- Cặn bẩn trên thành ống

- Cần diện tích đất sử dụng lớn

- Sự biến thiên/thay đổi của

- Đường truyền ánh sáng tốt

- Thích hợp cho nuôi cấy ngoài trời

- Khó kiểm soát nhiệt độ

- Một số tế bào phát triển trên thành thiết bị

Hệ thống kín bao gồm các hệ thống nuôi cấy dạng: ống (tubular photobioreactor), tấm phẳng (flat plate photobioreactor) và cột (column photobioreactor)

Hệ thống nuôi cấy dạng bản phẳng (flat plate photobioreactor) là dạng được biết sớm nhất

thu ánh sáng (Ugwu và cộng sự,2008) và thu được tế bào với mật độ cao (>80 g/ L) (Kurano

và cộng sự, 1998) Các vật liệu trong hệ thống đều trong suốt và bề dày của bản phẳng phải mỏng để có thể hấp thu ánh sáng tốt nhất (Kurano và cộng sự) Hệ thống nuôi cấy dạng bản phẳng phù hợp cho sản xuất tảo với mật độ cao bởi khả năng tích tụ oxy hòa tan thấp và hiệu quả quang hợp cao hơn so với dạng ống (Richmond, 2000)

Hệ thống nuôi cấy dạng ống (tubular photobioreactor) bao gồm một dàn các ống thủy tinh (hoặc plastic) thẳng có khả năng hấp thu ánh sáng và có thể được sắp xếp thành hàng ngang, thẳng đứng , nằm nghiêng hay hình xoắn ốc (Brennan và cộng sự2009) Các ống này thường

có đường kính từ 0.1m trở xuống (Chisti, 2007) Môi trường nuôi tảo sẽ được tuần hoàn và hòa trộn bằng bơm cơ học hoặc hệ thống sục khí Tuy nhiên, hệ thống dạng ống vẫn còn tồn tại một

biến đổi pH trong hệ thống (Eriksen, 2008)

Hệ thống nuôi cấy dạng cột (column photobioreactor) là dạng thiết bị có hiệu quả phối trộn cao nhất, có tốc độ luân chuyển thể tích môi trường cao nhất và các điều kiện nuôi cấy được kiểm soát tốt nhất (Eriksen, 2008) Hệ thống nuôi cấy dạng cột có chi phí thiết kế thấp, nhỏ gọn và dễ dàng vận hành Các cột dọc được sục khí từ phía dưới và được chiếu sáng thông qua các bức tường trong suốt (Eriksen, 2008)

Ngày nay, các hệ thống nuôi cấy kín được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong sản xuất sinh khối vi tảo vì thu hàm lượng sinh khối đạt cả số lượng và chất lượng rất cao do nó có thể kiểm soát nghiêm ngặt các điều kiện nuôi cấy và cho năng suất sinh khối cao hơn hệ thống mở (Brennan và cộng sự, 2009)

1.4 Điều kiện nuôi cấy

1.4.1 Ánh sáng

Giống như nhiều loài thực vật vi tảo cần quá trình quang hợp để hấp thụ cacbon vô cơ chuyển hóa thành các chất hữu cơ cần thiết Ánh sáng là nguồn năng lượng điều khiển các phản ứng này, vì vậy các khía cạnh của sự chiếu sáng như cường độ ánh sáng, phổ ánh sáng và thời gian chiếu sáng là các yếu tố cần được xem xét Cường độ ánh sáng đóng vai trò quan trọng, nhưng yêu cầu về cường độ ánh sáng thay đổi rất lớn theo độ sâu của môi trường nuôi và mật

độ tảo trong môi trường Tảo chỉ chịu được ánh sáng mặt trời trực tiếp khi mật độ tảo đạt được khá cao (Guillard, 1975) Cường độ ánh sáng quá lớn có thể ức chế quá trình quang hợp (Lavens

và Sorgeloos, 1996) Theo Bholavà cộng sự (2010), cường độ ánh sáng tối ưu cho sự gia tăng

Nguồn chiếu sáng và cường độ chiếu sáng cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi tảo (Mata và cộng sự, 2010) Ngoài nguồn sáng tự nhiên từ mặt trời, vi tảo sử dụng được các nguồn sáng nhân tạo từ: đèn LED, sợi quang (optical fiber),…Dù là ánh sáng tự nhiên hay nhân tạo cũng cần tránh làm nóng canh trường nuôi tảo quá mức (Chen và cộng sự, 2011)

Hiện tượng quang ức chế (photoinhibition) là hiện tượng do phản ứng quang oxy hóa (photooxidation) bên trong tế bào do dư quá nhiều ánh sáng mà bộ máy quang hợp không thể hấp thụ được (Richmond 1986).Trong một vài thí nghiệm với các loài tảo ở cường độ chiếu sáng khác nhau, tảo sẽ tăng tốc độ tăng trưởng cho đến khi cường độ ánh vừa đủ cung cấp cho nhu cầu trao đổi chất của tảo sau đó sẽ chuyển sang hiện tượng quang ức chế làm hạn chế sản xuất sinh khối tảo (Danesi và cộng sự, 2004; Bouterfas và cộng sự, 2006) Cũng như trong nghiên cứu của Bhola và cộng sự (2010), tác giả cũng đưa ra nhận xét: cường độ chiếu sáng lớn

giảm tốc độ tăng trưởng của tảo

1.4.2 Nhiệt độ

Chlorella khác nhệt độ này lại ở khoảng 30 oC

1.4.3 Mật độ tế bào

Mật độ tế bào trong môi trường là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo, là nhân tố tác động đến khả năng hấp thu ánh sáng, quá trình hô hấp và các hoạt động sinh hóa trong môi trường (Richmond và cộng sự,2013) Trong cùng một điều kiện môi trường, khi mật độ bổ sung giống ban đầu cao, tốc độ sinh trưởng của tảo nhanh,

chia nhiều nên mật độ tăng càng nhanh và ngược lại.Tuy nhiên cùng với sự tăng nhanh về số lượng tế bào tảo, các yếu tố môi trường khác cũng nhanh chóng thay đổi theo như: hàm lượng dinh dưỡng giảm nhanh, pH tăng, khả năng nhận ánh sáng của tế bào giảm (sự tự che khuất) (Nguyễn Văn Công và cộng sự, 2012)

Lượng giống tảo sử dụng ở mức nào là do mục đích của người sử dụng Trong nhân sinh khối tảo để làm thức ăn cho động vật nuôi người ta quan tâm nhất là khối lượng sinh khối tảo đạt được trong thời gian nhất định nên lượng tảo ban đầu thường lớn

1.4.4 Dinh dưỡng

1.4.4.1 Nguồn carbon

Nguồn carbon vô cơ

trọng nhất vì trong điều kiện trao đổi chất tự dưỡng tảo chủ yếu sử dụng nguồn carbon vô cơ

không thể đáp ứng yêu cầu phát triển nhanh của tảo trong trong hệ thống sản xuất theo kiểu tự

Chlorella tốt nhất là 3%, nếu đồng thời cung cấp cả CO2 và HCO3- thì nồng độ sục khí CO2 chỉ cần là 1,5% (Miyachi và cộng sự,1983) Ngoài ra hệ thống bicarbonate-carbonate đệm có thể

-sẽ tích tụ trong môi trường dẫn đến sự gia tăng dần độ pH (Richmond và Grobbelaar,1986)

Nguồn carbon hữu cơ

Chlorella có khả năng sử dụng các nguồn carbon hữu cơ khác như: glucose, glycerol,

acetate, fructose, galactose, malat,…trong môi trường có ánh sáng hoặc thiếu ánh sáng song

tảo, nguồn carbon hữu cơ từ glucose và glycerol thường được sử dụng bởi vì nguồn carbon vô

cơ cho hiệu suất thu hồi sinh khối khá thấp

So với các nguồn carbon khác glucose được tảo hấp thụ dễ dàng và luôn cho hiệu suất sinh khối cao, tuy nhiên giá thành của glucose khá cao gây ảnh hưởng lớn tới chi phí sản xuất Ngoài

ra khi sử dụng glucose để nuôi cấy tảo, khả năng ngoại nhiễm rất cao vì glucose cũng là nguồn carbon dễ dàng hấp thụ đối với các vi sinh vật khác Vì vậy để giảm chi phí sản xuất khi sản

xuất sinh khối C.vulgaris trong nuôi cấy hỗn hợp, một giải pháp khả thi đang được các nhà

khoa học nghiên cứu khảo sát rộng rãi là thay thế glucose bằng các nguồn carbon rẻ tiền hơn Glycerol là một trong những nguồn carbon thay thế thích hợp vì giá thành của vì glycerol rẻ hơn so với nguồn carbon glucose và chúng ta có thể tận dụng glycerol từ chế phẩm trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học Ngoài ra nghiên cứu của các nhóm nghiên cứu khác nhau

trên thế giới cũng cho thấy C vulgaris có khả năng sử dụng glycerol (Liang và cộng sự, 2009;

Kong và cộng sự, 2011; Gupta và cộng sự,2015; Grady, 2010; Ma và cộng sự, 2016)

1.4.4.2 Nguồn nitơ

Sau cacbon, nitơ là chất dinh dưỡng quan trọng nhất góp phần vào sự sản xuất sinh khối Nitơ thường chiếm khoảng 7-10% trọng lượng khô tế bào, là một thành phần cơ bản của tất cả các protein cấu trúc và protein chức năng trong tế bào tảo Khi vi tảo phát triển trong điều kiện nitơ hạn chế, ảnh hưởng nổi bật nhất là sự giảm phycobilisomes (Collier và cộng sự, 1992).Phản ứng điển hình khi thiếu hụt nguồnnitơ là sự chuyển đổi sắc tố của tế bào (giảm chlorophyll và gia tăng các carotenoid) và sự tích lũy các hợp chất carbon hữu cơ như polysaccharides và các chất béo trong tế bào (Becker, 1994)

sự, 1986) Amoniac thường là nguồn nitơ ưa thích cho vi sinh vật Khi amoniac được sử dụng

khi sử dụng nitrate là nguồn carbon duy nhất sẽ xảy ra sự gia tăng pH Lưu ý khi sử dụng ammonia là nguồn nitơ trong môi trường có thể bị mất do bay hơi, đặc biệt là khi pH tăng (Grobbelaar, 2004)

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các sinh vật tăng cường tổng hợp và tích tụchất béo trong điều kiện nitơ hạn chế Tuy nhiên, một số loài tảo tăng hàm lượng carbohydrate hơn là lipid trong điều kiện cạn kiệt nitrogen (Borowitzka và Borowitzka, 1988) Tích lũy carotenoid thứ cấp là một đặc tính chính của nhiều tảo khi phát triển dưới điều kiện nitơ thiếu hụt, đi kèm đó

nồng độ nitơ thấp là một yếu tố quan trọng trong việc kích thích sự tổng hợp và tích lũy

astaxanthin và acylesters trong Haematococcus pluvialis

1.4.4.3 Nguồn phospho

Mặc dù sinh khối tảo chứa ít hơn 1% phospho nhưng phospho là một trong những nguồn

cơ chất quan trọng trong sự phát triển của tảo và phospho là một thành phần dinh dưỡng chính đóng vai trò quan trọng trong các quá trình trao đổi chất của tế bào bằng cách hình thành nhiều thành phần cấu trúc và chức năng cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển bình thường của vi tảo như sự vận chuyển năng lượng, tổng hợp sinh học của các acid nucleic, DNA… Phospho

thể hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết này.Dù được yêu cầu với số lượng rất nhỏ trong chu

kỳ tăng trưởng của tảo, nhưng phospho phải được cung cấp nhiều hơn yêu cầu cơ bản bởi vì các ion phosphate liên kết với các ion kim loại, do đó không phải tất cả các phospho được thêm vào là hữu hiệu.Tảo cũng có thể lưu trữ phospho dư thừa trong tế bào trong điều kiện nuôi cấy

có hàm lượng phosphorus cao (Richmond, 2004) Dạng phospho chính mà tảo thu nhận là từ

Cạn kiệt phospho dẫn đến sự tích tụ của β-carotene trong các tế bào Dunaliella Amotz và cộng sự, 1982) và tích lũy astaxanthin trong các tế bào Haematococcus (Boussiba và

(Ben-cộng sự, 1992), nhưng không rõ rệt như khi cạn kiệt nitơ

1.4.4.4 Khoáng chất

Ngoài các nguồn dinh dưỡng chính là carbon, nitơ và phospho tảo cũng cần cung cấp khoáng chất để duy trì các hoạt động sống trong tế bào và một số khoáng chất cần thiết cho sự phát triển của tảo là: S, K, Na, Fe, Mg, Ca ,B, Cu, Mn, Zn, Mo và Co (Vonshak ,1986)

Trong số các nguyên tố vi lượng khoáng chất thiết yếu, sắt (Fe) đóng một vai trò quan trọng trong thành phần sinh hóa của tế bào do các tính chất oxi hóa khử và nó có ý nghĩa trong quá trình cơ bản như quang hợp, hô hấp, cố định đạm và sự tổng hợp DNA Mặt khác, c-phycocyanin và chlorophyll a thể bị suy giảm khi Fe trở nên hạn chế (Hardie và cộng sự, 1983).Kobayashi và cộng sự (1993) báo cáo rằng sự hình thành astaxanthin acetate trong

Haematococcus pluvialis được nâng cao rõ rệt bằng việc bổ sung sắt

Molybdenum (Mo) tham gia quá trình cố định nitơ và là thành phần của enzyme nitrat

sung EDTA giúp hòa tan tốt các khoáng chất trong nước.Đồng (Cu) và mangan (Mn) là một

thành phần quan trọng trong quá trình quang hợp và cần cho tất cả các loài tảo Các nguyên tố này cũng tham gia vào hoạt động tế bào với tư cách là thành phần hoặc cofactor của enzyme

1.5 Ứng dụng

1.5.1 Sử dụng vi tảo làm thức ăn cho động vật

Các loài tảo thường được sử dụng nhất cho nuôi trồng thủy sản là Chlorella, Tetraselmis,

Isochrysis, Pavlova, Phaeodactylum, Chaetoceros, Nannochloropsis, Skeletonema và Thalassiosira (Yamaguchi, 1997; Borowitzka, 1997; Behrens, 1999)

C.vulgaris là thành viên của chuỗi thức ăn thủy sản, và nó đóng vai trò quan trọng trong

nuôi trồng thủy sản là một sự thay thế nguồn protein cho các mục đích thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Richmond, 2004)

Vi tảo biển cần thiết cho dinh dưỡng của ấu trùng, là nguồn thức ăn trực tiếp cho các loài nhuyễn thể hoặc tôm he, hoặc gián tiếp cho các loài cá biển (Brown và cộng sự, 1997; Feuga, 2000)

Một số loại tảo nhưIsochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Chaetoceros

muellerđược sử dụng để nuôi một số thủy hải sản như: tôm, cua, điệp quạt, điệp seo, bào ngư,

trai ngọc, ốc hương, tu hài, sò huyết, hải sâm…đồng thời tạo môi trường nước xanh, cân bằng

độ đục cần thiết và ổn định pH của môi trường nuôi (Adarme-Vega, 2012)

1.5.2 Sử dụng vi tảo trong sản xuất thực phẩm cho con người

Các sắc tố trong tảo như chlorophylls, carotenoids và phycobilins là những hợp chất có giá trị cao và có thể được sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và bổ sung thêm vào thực phẩm để nâng cao sức khỏe con người (Spolaore và cộng sự, 2006)

Hàm lượng protein và các acid béo không no như axít eicosapentaenoic (EPA), axít arachidonic (AA) và axít docosahexaenoic (DHA) là yếu tố chính quyết định giá trị dinh dưỡng của tảo (Reitan và cộng sự, 1997) Một số vi tảo cũng chứa hàm lượng vitamin rất cao (Brown

và cộng sự, 1999; Yamaguchi, 1997) Vi tảo cũng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để cải thiện màu sắc của thịt cá hồi (Spolaore và cộng sự, 2006)

Carotenoid hiển thị các thuộc tính chống oxy hóa rất cao và có thể áp dụng như thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi và chất phụ gia như chất bổ sung sức khỏe Do màu sắc nổi bật carotenoid được sử dụng như chất màu tự nhiên Các carotenoid chính của tảo là astaxanthin, β-carotene

và lutein được chiết xuất từ Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis, Chlorella zofingiensis

Tảo spirulina có hàm lượng protein chiếm 60 – 70 % trọng lượng khô là loại thực phẩm chức năng (Philippis và cộng sự,1992)

Vi tảo dị dưỡng đã được sử dụng cho việc sản xuất omega-3 axit béo, đặc biệt là DHA Các acid béo omega-3 có thể tách ra từ dầu tảo và được sử dụng rộng rãi để sản xuất nhiên liệu sinh học và sử bổ sung vào thực phẩm làm thực phẩm chức năng Omega-3 là một trong những sản phẩm rất có giá trị từ tảo, nên cần thúc đẩy sự phát triển nuôi trồng tảo để cung cấp nguồn lipid có hoạt tính sinh học cao với giá thành rẻ và thúc đẩy sản xuất các chế phẩm sinh học có giá trị quan trọng khác (Richmond, 2004)

1.5.3 Vi tảo sử dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm

Chiết xuất tảo có thể được tìm thấy trong nhiều trong sản phẩm chăm sóc da, ví dụ kem chống lão hóa, sản phẩm chăm sóc tái tạo da,kem chống nắng, làm mềm da và kem chống kích

ứng Dermochlorella chiết xuất từ tảo Chlorella vulgaris, có thể kích thích tổng hợp collagen

trong hỗ trợ tái tạo mô da và giảm nếp nhăn (Markou, 2013)

Dùng tảo spirulina làm mặt nạ chăm sóc da (Monaco, 2012)

1.5.4 Vi tảo ứng dụng trong xử lý môi trường

Tảo có thể tận dụng nitrogen và phospho trong nước thải của nông nghiệp, công nghiệp

sự, 2013)

Một số tảo như Chlorella có khả năng sản sinh ra được chất ngăn chặn sự phát triển của

vi khuẩn Vibrio Ngoài ra tảo còn góp phần bảo vệ môi trường thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vi tảo

Loài tảo nước ngọt Chlorella vulgaris mua từ Viện Nghiên Cứu cứu và Nuôi Trồng trồng

Thủy sản 2 (Tp.HCM) được sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu

Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng để nuôi tảo như: Môi trường BBM, môi trường Walne, Guillard, Ryther, Tamya, Ito và môi trường phân vô cơ Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng môi trường Bold’s Basal (BBM) để lưu trữ giống trên đĩa petri, nhân giống và khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác nhau Thành phần của môi trường BBM được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2 1: Thành phần trong môi trường BBM(Bold 1949, Bischoff và Bold 1963)

Dung dịch

lưu trữ Các thành phần

Thể tích

Hàm lượng trong dung dịch lưu trữ (g/mL)

Hàm lượng trong môi trường cuối (M)

Dung dịch 9 EDTA Na2

0.05 30.031

 Phương pháp nhân giống

Môi trường nhân giống vi tảo được sử dụng là môi trường BBM có bổ sung thêm 5 g/L

nhân giống, khuẩn lạc C vulgaris từ BBM agar sẽ được chuyển sang bình tam giác đựng 200

mL BBM lỏng có bổ sung 5 g/L đường glucose trong điều kiện vô trùng Bình tam giác sau đó được đậy bằng nút bông và được lắc ở 240 rpm (sử dụng máy lắc IKA – KS 130 BASIC xuất

xứ từ Đức) và chiếu sáng liên tục bằng đèn LED (Light Emitting Diodes) ở cường độ ánh sáng

như mong muốn Tất cả các bình tam giác (có đậy nút bông) đựng môi trường, pipette tip,…

 Phương pháp bổ sung giống

Giống sau khi được xác định số lượng bằng buồng đếm hồng cầu sẽ được tính toán lượng thể tích cần bổ sung cho phù hợp với mật độ giống ban đầu Bổ sung lượng thể tích dung dịch giống đã xác đinh vào ống ly tâm đã tiệt trùng Ly tâm và rửa bằng nước cất ba lần để loại bỏ môi trường nuôi cấy với tốc độ ly tâm là 2500 rpm (máy ly tâm Hermle Z300 xuất xứ từ Đức) trong 7 phút mỗi lần quay (Ranklin và cộng sự, 2001) Sau đó lấy giống trong ống ly tâm bổ sung vào môi trường khảo sát trong điều kiện vô trùng

Tất cả các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm được mua ở Công ty Hóa Nam, độ tinh khiết

là 99 %