TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN XX: BỆNH DỊCH TẢ VỊT

Bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt, huyết thanh được lấy sau 10 ngày từ khi dịch bệnh xảy ra, hoặc nếuvịt đã tiêm phòng thì lấy sau khi tiêm 1 t

TCVN XXXX: 2018

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN –

PHẦN XX: BỆNH DỊCH TẢ VỊT

Animal disease – Diagnostic procedure Part XX: Duck virus enteritis disease

HÀ NỘI – 2018

Lời nói đầu

TCVN XXXX:2018 do Chi cục Thú y Vùng VI- Cục Thú y

biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề

nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm

định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN XXXX:2018

Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán –

Phần: Bệnh Dịch tả vịt

Animal disease – Diagnostic procedure – Part: Duck virus enteritis disease

CẢNH BÁO  Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng

áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt trong phòng xétnghiệm

2 Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt

2.1 Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh dịch tả vịt (Duck virus enteritis disease)

Bệnh dịch tả vịt (DVE) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính gây tử vong cao cho

vịt, ngỗng và thiên nga Bệnh do một loại Herpesvirus thuộc họ Alpha herpesviridae,

có cấu trúc DNA gây nên Bệnh có triệu chứng chủ yếu là sốt cao, chảy nước mắt,sưng đầu, chân mềm yếu, bại liệt, phân xanh và có biến đổi bệnh lý xuất huyết nộitạng

2.2 Chữ viết tắt

- DVE (Duck Virus Enteritis Disease): Bệnh dịch tả vịt

- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng RT-PCR

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phốt phát

- VNT (Virus Neutralization Test): Phản ứng trung hoà vi rút

- TCID 50 (50% tissue culture infective dose): Liều gây nhiễm 50% tế bào

- CPE (Cytopathic pathogene effect): Bệnh tích tế bào

- RNA (Ribonucleic acid) : Axít ribonucleic

- DNA (Deoxyribonucleic acid): Axít deoxyribonucleic

- SN (Serum Neutralization): Phản ứng trung hòa huyết thanh với vi- rút giống chuẩn

- FCS (Fetal Calf Serum): Huyết thanh bào thai bê

- DEF (Duck Embryo Fibroblast): Tế bào xơ phôi vịt

- NI (Neutralization Index): Chỉ số trung hòa

- EID50 (Embryo Infective Dosage, 50 %): Liều gây nhiễm 50 % phôi trứng

- ELD50 (Embryo Lethal Dosage, 50 %): Liều gây chết 50 % phôi trứng

- TCID50 (Tissue Culture Infective Dosage, 50 %): Liều gây nhiễm 50 % tế bào

3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước

đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác

3.1 Thuốc thử và vật liệu cho lấy mẫu

3.1.1 Ethanol, từ 70% (thể tích) đến ethanol tuyệt đối

3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2±0,2 (Phụ lục A1)

3.1.3 Tăm bông vô trùng

3.1.4 Xy lanh và kim tiêm loại 22G

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR/ realtime PCR

3.2.1 Kít chiết tách RNA/DNA

3.2.2 Kít nhân gen

3.2.3 Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò

3.2.4 Mẫu chuẩn dương được chứng nhận dương tính hoặc DNA chuẩn dương tínhtách chiết từ vi-rút DVE có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng đã biết trước)

3.2.5 Nước tinh khiết, không có Dnase/Rnase

3.2.6 Bột agarose, dung dịch Tris-borate-EDTA (TBE) 10X

3.2.7 GelRed Nucleic Acid stain

3.2.8 Loading dye

3.2.9 Thang chuẩn DNA 100bp

3.3 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phân lập

3.3.1 Phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi

3.3.2 Phôi trứng vịt từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi

3.3.3 Giống vi rút dịch tả vịt

3.3.4 Kháng huyết thanh chuẩn kháng vi rút dịch tả vịt

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh thường duy trì nhiệt độ từ 20C đến 80C, tủ lạnh âm 20

0C, tủ lạnh âm sâu 800C

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2

4.1.3 Máy lắc trộn Vortex có thể hoạt động với tốc độ từ 200 đến 2500 rpm

4.1.4 Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp vô trùng

4.1.5 Dụng cụ tiêu hao như găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân,…

4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR/PCR

4.3.1 Kính hiển vi đảo ngược

4.3.2 Tủ ấp trứng

4.3.3 Đèn soi trứng

4.3.4 Buồng đếm tế bào Neubauer

4.3.5 Lọ nuôi tế bào T25, T75

4.3.6 Đĩa nuôi tế bào 6 giếng, 24 giếng, 96 giếng

Ngoài ra còn có các loại đầu typ, pipet, ống 15ml, 50ml, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này

5 Chẩn đoán lâm sàng

5.1 Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh dịch tả vịt xuất hiện lần tiên vào năm 1923 tại Hà Lan ở một đàn vịt nhàvới triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thếgiới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng vi rút doBoss (1943) phân lập được, Jansen và Kunst đã đề nghị gọi tên bệnh là Duck virusenteritis – DVE Bệnh dịch tả vịt còn có các tên gọi khác như: Endenpest (Hà Lan),Pest du canard (Pháp), Enteupest (Đức) (OIE, 2012) Bệnh được ghi nhận ở nhiềunước trên thế giới như Pháp (1949); Trung Quốc (1958); Ấn Độ (1963); các nướcchâu Âu đều thông báo có dịch như Bỉ (1964) ; Anh (1972); Đức, Hungari và Italia(1973); Đan Mạch (1983); Áo (1985); Tây Ban Nha (1998); các nước khu vực châu Ánhư Việt Nam (1969); Thái Lan (1976); Đài Loan và Bangladesh (1978); Indonesia,Malaysia cũng có dịch xảy ra; chưa có thông báo dịch xảy ra ở châu Úc và châu Phi

- Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện trên các đàn vịt nuôi ở Hà Nội vào năm

1969, từ đó xuất hiện rộng rãi ở nhiều tỉnh thuộc đồng bằng Bắc bộ và các tỉnh Nam bộ.Năm 2012, bệnh đã xảy ra ở 554 xã, 123 huyện, 14 tỉnh, thành phố Số thủy cầm mắcbệnh là 41.753 con, trong đó 11.276 con chết và xử lý Năm 2015, bệnh xảy ra tại 6 tỉnhlàm 48.107 con vịt mắc bệnh, số vịt chết tiêu hủy là hơn 14.187 con

- Bệnh dịch tả vịt lây lan cho vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi từ 7 ngày tuổi đếntrưởng thành Ở những đàn nhạy cảm, bệnh lây lan nhanh và trầm trọng với dấuhiệu tử vong cao, đột ngột (xảy ra từ 1-5 ngày sau khi bắt đầu có triệu chứng lâmsàng) và dai dẳng, sụt giảm đáng kể trứng trong những đàn lấy trứng Tỷ lệ chết cóthể từ 70% đến 80% nếu bị nhiễm lần đầu ở trại không tiêm phòng vắc xin dịch tả vịtthường xuyên, kết hợp với vệ sinh không đảm bảo

- Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp giữa các vịt khỏe mạnh và vịt bịnhiễm bệnh Bệnh truyền qua phân gia cầm mắc bệnh và các dịch tiết từ mũi, miệng

và mắt

Bệnh lây lan nhanh và có thể lây lan dễ dàng bằng phương tiện cơ học nhưgiày dép và quần áo mang từ một đàn bị nhiễm đến

5.2 Triệu chứng

- Thời gian ủ bệnh thường từ 3 ngày đến 7 ngày tùy theo độc lực của vi rút

- Vịt, ngan, ngỗng bị bệnh có hiện tượng giảm ăn, mất thăng bằng, phânloãng, xù lông, chảy nước mũi, mắt có dử, mí mắt sưng Con vật sợ ánh sáng

5.3 Bệnh tích

Tuỳ theo trường hợp có thể thấy một hoặc nhiều trong những bệnh tích sau:

- Ở vịt trưởng thành có hiện tượng gan bị bạc màu hoặc xuất huyết điểm Concái có thể thấy các nang trứng bị xuất huyết

- Mạch máu bị tổn thương Hệ bạch huyết bị tổn thương và thoái hóa nhu mô

- Đường tiêu hóa bị viêm, ruột xuất huyết thành từng mảng, có nhiều chấtnhờn Đây là bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả vịt

- Kiểm tra vi thể thấy tổn thương mạch máu và các cơ quan phủ tạng Xuấthiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các tể bào biểu mô của hệ thốngtiêu hóa Đây là biến đổi vi thể điển hình của bệnh

6 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu

- Lấy mẫu vào thời kỳ đầu của ổ dịch Lấy ngay sau khi con vật ốm, chết hoặc

mổ khám Lấy mẫu theo quy trình tại TCVN 8402:2010 Chẩn đoán bệnh độngvật - Quy trình mổ khám

- Mẫu bệnh phẩm là gan, lách, thận Nếu là con vật bệnh hoặc xác mới chếtphải lấy từ 3 con đến 5 con Bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng

vi rút dịch tả vịt, huyết thanh được lấy sau 10 ngày từ khi dịch bệnh xảy ra, hoặc nếuvịt đã tiêm phòng thì lấy sau khi tiêm 1 tháng để kiểm tra kháng thể bảo hộ

- Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cảđược đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2oC đến 8oC

Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng xét nghiệm trong vòng 24 h, kèm theo phiếu gửibệnh phẩm.

6.2 Xử lý mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm là phủ tạng lấy từ gia cầm chết, bệnh nghi nhiễm dịch tả vịt đượcnghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch nước sinh lý hoặc PBS Sau đó ly tâmvới gia tốc 1000g trong 10 min Thu lấy dịch nổi, xử lý vô trùng bằng kháng sinh(2000 UI/ml) hoặc lọc qua màng cỡ 0,45 µm Huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý có thểdùng để chẩn đoán phát hiện vi rút dịch tả vịt bằng phản ứng Realtime PCRhoặc phân lập vi rút trên phôi trứng vịt

- Bệnh phẩm là máu được giữ ở 4oC đến 8oC chờ đông rồi chắt lấy huyết thanh

để chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt

6.3 Phát hiện vi-rút Dịch tả vịt

6.3.1 Phân lập và giám định vi-rút trên phôi trứng vịt

Sử dụng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi để tiêm truyền huyễndịch bệnh phẩm đã xử lý theo 6.2 Thu hoạch dịch niệu mô để giám định vi rút bằngphương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn trên phôi trứng vịt theo quy định tại Phụlục B

6.3.2 Phân lập và giám định vi-rút trên tế bào xơ phôi vịt

Sử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF) để gây nhiễm bằng huyễn dịch bệnh phẩm.Thu hoạch dịch nuôi tế bào và giám định vi rút bằng phương pháp trung hòa vớikháng thể chuẩn trên môi trường tế bào DEF theo quy định tại Phụ lục C

6.3.3 Phát hiện vi-rút gây bệnh dịch tả vịt bằng phương pháp Realtime PCR 6.3.3.1 Tách chiết DNA

- Sử dụng kít chiết tách DNA cho vi rút dịch tả vịt theo hướng dẫn của nhà sản

xuất theo kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 Hoặc có thể sử dụng

các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách DNA vi rút (Tham khảoPhụ lục D)

- Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi được thực hiện tách chiết DNA bằng các kítthương mại và bảo quản mẫu DNA ở 40C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản -

200C trong thời gian dài

6.3.3.2 Chuẩn bị mồi

- Phản ứng realtime PCR sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò được nêu trong Bảng E1, phụ lục E với nồng độ:

+ Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM

+ Đoạn dò sử dụng ở nồng độ 5 µM

6.3.3.3 Tiến hành phản ứng realtime PCR

- Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.3.2.2) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phảnứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất Có thể

áp dụng kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat No.:11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi công thứcmaster mix) - Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng được nếu trong BảngE2, phụ lục E

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:

+ Cho 20µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml

+ Cho 5 µl DNA dương chuẩn của vi rút DVE có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCRđối chứng dương

+ Cho 5 µl DNA của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR

Lưu ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương

và mẫu đối chứng âm

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng được nêu trong Bảng E3, phụ lục E

Chú thích: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá

lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

- Với điều kiện phản ứng:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi-rút gây bệnh dịch tả vịt khi kết quả real-time PCRdương tính Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sửdụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả

6.3.4 Phát hiện vi-rút gây bệnh dịch tả vịt bằng phương pháp PCR

6.3.4.1 Tách chiết DNA

Tiến hành giống mục 6.3.3.1

6.3.4.2 Chuẩn bị mồi

- Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược được nêu trong Bảng F1, phụlục F với nồng độ theo hướng dẫn của bộ kit PCR

6.3.4.3 Thực hiện phản ứng

- Pha hỗn hợp Master mix theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kit nhân gen PCR

- Sau đó, thêm mẫu DNA vào hỗn hợp Master mix và ly tâm bằng máy Quick spin đểkéo toàn bộ dung dịch phản ứng xuống đáy ống

- Đặt ống PCR dạng trip vào máy PCR và tiến hành cài đặt chương trình nhiệt độ vàthời gian phù hợp theo bộ kit (tham khảo Bảng F2, phụ lục F)

- Sau khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếchđại ra khỏi máy và giữ ở 250C để chuẩn bị cho quá trình điện di

- Thực hiện điện di sản phẩm tham khảo phụ lục F

6.3.4.4 Đọc kết quả

- Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng âm và đối chứng dương: Đối chứng âm phải chokết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại), đối chứng dương có kết quảdương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 446 bp so với thang chuẩnDNA (thang chuẩn DNA phải phân vạch rõ ràng) Nếu hệ thống đối chứng dương vàđối chứng âm không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm

- Mẫu dương tính khi có sản phẩm khuếch đại được thể hiện bằng vệt sáng, có kíchthước bằng với kích thước của sản phẩm đối chứng dương 446 bp

- Mẫu âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại

PHỤ LỤC A (Quy định) THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ DUNG DỊCH THUỐC THỬ A.1 Dung dịch PBS

Pha loãng với 1000 ml nước, điều chỉnh pH 7,2 Hấp tiệt trùng Bảo quản ở 4oC

A.2 Dung dịch NaHCO 3 7 %

Thành phần:

Hấp tiệt trùng Bảo quản ở 4oC

A.3 Dung dịch L-glutamine 3 %

Thành phần:

Dung dịch đã pha được lọc vô trùng Bảo quản ở -20oC

A.4 Canh thang TPB (tryptose phosphate broth)

A.5 Trypsin 2,5 % (10x)

Thành phần:

Lắc qua đêm ở 4oC, lọc vô trùng và bảo quản ở -20oC

A.6 Môi trường nuôi cấy tế bào MEM

PHỤ LỤC B (Quy định)

PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI RÚT DỊCH TẢ VỊT TRÊN PHÔI TRỨNG VỊT

B.1 Phân lập vi rút

a) Tiêm bệnh phẩm vào phôi trứng vịt:

- Dùng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi (không có kháng thể khángdịch tả vịt), lấy từ trại vịt sạch bệnh

- Soi trứng, chọn phôi khoẻ Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ 3 phôi đến 5 phôi

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70% Dùi vị trí tiêm ở phía trên buồng hơi

- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm đã xử lý vô trùng (bằng kháng sinh hoặc quamàng lọc 0,45µm) rồi tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mô

- Sau 10 ngày, các trứng không chết được giữ ở 4oC để giết phôi

b) Thu hoạch nước trứng

- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70%

- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô

- Hút nước trứng vào ống Eppendorf vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 4oC để kiểm tra

B.2 Giám định vi rút

Dùng phương pháp trung hòa vi rút trên phôi trứng vịt

- Pha loãng dịch niệu mô thu hoạch ở trên thành các nồng độ 10-1 đến 10-9 với dungdịch PBS

- Lô đối chứng dương: trộn huyết thanh chuẩn kháng dịch tả vịt với dịch niệu mô đãpha loãng thành các nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1

- Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với dịch niệu mô đã pha loãng thànhcác nồng độ trên theo tỷ lệ 1:1.

- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 h

- Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi,liều 0,2 ml/phôi; mỗi nồng độ tiêm 5 trứng

- Ấp trứng trong tủ ấm 37oC theo dõi trong 10 ngày Loại bỏ trứng chết trong vòng 24

h Ghi chép số phôi chết

- Nếu có vi rút dịch tả vịt lô đối chứng dương phôi sẽ sống, lô đối chứng âm phôi sẽchết trong khoảng 3 ngày đến 8 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng

- Dựa vào tỷ lệ sống chết của phôi để tính toán liều ELD50 (hoặc EID50) và chỉ sốtrung hòa NI theo công thức Reed & Muench để đánh giá kết quả

- Chỉ số trung hòa NI là chênh lệch giữa ELD50 (hoặc EID50) của lô đối chứng dươngtính và lô đối chứng âm tính

- Kết quả dương tính khi NI ≥ 2

VÍ DỤ: Thí nghiệm có kết quả chuẩn độ liều ELD50 của vi rút dịch tả vịt như sau: Nồng độ vi rút

pha loãng

Số trứngchết/Số trứng tiêm

Công thức Reed & Muench:

Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng là 10 -7,7

Tính chỉ số trung hòa: