TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN: BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN XX: BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI

Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn Châu Phi trong phòng xét nghiệm 2.. Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt 2.1 Thuật ngữ, định nghĩa Tron

TCVN XXXX: 2018

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN –

PHẦN XX: BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI

Animal disease – Diagnostic procedure Part XX: African Swine Fever

HÀ NỘI – 2018

Lời nói đầu

TCVN XXXX:2018 do Chi cục Thú y Vùng VI- Cục

Thú y biên soạn , Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường

Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ

công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN XXXX:2018

Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán –

Phần: Bệnh Dịch tả lợn Châu Phi

Animal disease – Diagnostic procedure – Part: African Swine Fever

CẢNH BÁO  Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng

áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn Châu Phi trong phòng xét nghiệm

2 Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt

2.1 Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever) Bệnh dịch tả lợn Châu Phi là

bệnh gây ra bởi vi rút DNA sợi đôi thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus Thời gian ủ

bệnh trong tự nhiên thường 4-19 ngày Các chủng vi-rút độc lực gây xuất huyết bán cấp tính và cấp tính với các đặc điểm sốt cao, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4-10 ngày, đôi khi chết ngay cả trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100% Các chủng độc lực thấp hơn có triệu chứng lâm sàng nhẹ như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mỏi – dễ bị nhầm lẫn với một

số tình trạng bệnh lý khác ở lợn

2.2 Chữ viết tắt

- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng RT-PCR

- ELISA (The enzyme – linked immunosorbent assay): Phản ứng miễn dịch liên kết enzyme

- IFA (Indirect fluorescent antibody): Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

- FAT (Fluorescent antibody test): Phản ứng miễn dịch huỳnh quang

- TPB (Tryptose Phosphate Broth): Môi trường nuôi cấy

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phốt phát

- VNT (Virus Neutralization Test): Phản ứng trung hoà vi rút

- TCID 50 (50% tissue culture infective dose): Liều gây nhiễm 50% tế bào

- FCS (Fetal calf serum): Huyết thanh thai bê

- CPE (Cytopathic pathogene effect): Bệnh tích tế bào

- RNA (Ribonucleic acid) : Axít ribonucleic

- DNA (Deoxyribonucleic acid): Axít deoxyribonucleic

3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác

3.1 Thuốc thử và vật liệu cho lấy mẫu

3.1.1 Ethanol, từ 70% (thể tích) đến ethanol tuyệt đối

3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2±0,2 (Phụ lục A1)

3.1.3 Tăm bông vô trùng

3.1.4 Xy lanh và kim tiêm loại 22G

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho Realtime PCR

3.2.1 Kít chiết tách RNA/DNA

3.2.2 Kít nhân gen

3.2.3 Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò

3.2.4 Mẫu chuẩn dương được chứng nhận dương tính hoặc DNA chuẩn dương tính tách chiết từ vi rút ASF có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng đã biết trước)

3.2.5 Nước tinh khiết, không có DNase/RNase

3.2.6 Ethanol tuyệt đối

3.3 Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA

3.3.1 Kít ELISA Sử dụng kít thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể ASFV, khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

3.3.2 Nước cất khử ion

3.4 Nguyên liệu và thuốc thử dùng cho phản ứng miễn dịch huỳnh quang/ miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

3.4.1 Dung dịch aceton dùng cố định mô

3.4.2 Thuốc nhuộm fluorescein isothiocyanate (FITC) có gắn kháng miễn dịch globulin lợn

3.4.3 Mẫu mô và huyết thanh đối chứng dương chuẩn

3.4.4 Tế bào thận lợn (5x105 tế bào/ml)

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh thường duy trì nhiệt độ từ 20C đến 80C, tủ lạnh âm 20

0C, tủ lạnh âm sâu 800C

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2

4.1.3 Máy lắc trộn Vortex có thể hoạt động với tốc độ từ 200 đến 2500 rpm

4.1.4 Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp vô trùng

4.1.5 Dụng cụ tiêu hao như găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân,…

4.2 Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp realtime PCR

4.2.1 Máy Realtime PCR

4.2.2 Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g/min đến 2500 g/min, 10.000 g/min và 12.000 g/min

4.2.3 Máy lắc ủ nhiệt

4.2.4 Máy spindown

4.2.5 Máy tách chiết tự động Thermo Scientific KingFisher ML

4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

4.3.1 Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng 450 nm

4.3.2 Thiết bị ủ mẫu có thể duy trì ở nhiệt độ 370C

4.4 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

4.4.1 Kính hiển vi đảo ngược

4.4.2 Máy cắt mô lạnh

Ngoài ra còn có các loại đầu typ, pipet, ống 15 ml, 50 ml, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này

5 Chẩn đoán lâm sàng

5.1 Đặc điểm dịch tễ

Montgomery là người đầu tiên mô tả dịch tả lợn Châu Phi ở Kenya vào năm

1921 Vi-rút lây lan từ lợn rừng sang lợn nhà với tỷ lệ chết lên đến 100% Kể từ đó, bệnh dịch tả lợn Châu Phi được công nhận như một bệnh dịch địa phương ở nhiều nước Châu Phi như: Angola, Mozambique, Nam Phi, Senegal, São Tomé và

Príncipe Sudan, Uganda và Zimbabwe

Năm 1957, bệnh dịch tả lợn Châu Phi lần đầu tiên được phát hiện bên ngoài Châu Phi Nó xuất hiện ở Lisbon (Bồ Đào Nha) với hình thức bán cấp tính với tỷ lệ tử vong 100% Sau đó bệnh xuất hiện ở Malta, Sardinia (Ý), Brazil, Cộng hòa

Dominicavi, Haiti và Cuba Ngày nay ASF chỉ có ở Châu Phi, chủ yếu các quốc gia vùng hạ Sahara và Sardinia (Ý)

Lợn nhà là loài động vật duy nhất bị nhiễm tự nhiên bởi vi rút dịch tả lợn Châu Phi Lợn rừng Châu Âu cũng dễ bị nhiễm ASFV với triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ chết cao Bệnh dịch tả lợn Châu Phi được lưu hành ở Châu Phi bởi vòng truyền lây

giữa các loài lợn hoang dã và ve mềm Một số loài ve mềm như Orithodoros

moubata ở Châu Phi và O Erraticus ở bán đảo Iberia là nguồn chứa và vector sinh

học vi rút ASF

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi thường lây lan giữa các lợn nhà thông qua tiếp xúc đường miệng hoặc mũi Lợn cũng có thể nhiễm bằng các đường khác như vết cắn

Động vật hết bệnh sau khi nhiễm bệnh cấp tính và mãn tính có thể bị nhiễm bệnh trở lại, và trở thành vật mang vi rút

Vi rút dịch tả lợn Châu Phi đề kháng mạnh với môi trường đặc biệt nhiệt độ và

pH Vi rút phân lập từ huyết thanh và máu lưu trữ nhiệt độ phòng trong vòng 18 tháng Tuy nhiên nó bị bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 60oC/30 phút, các dung môi lipid và thuốc khử trùng thương mại Trong các sản phẩm thịt, vi rút ASFV có thể tồn tại trong vài tuần hoặc và tháng đối với thịt đông lạnh hoặc chưa nấu chín Không tìm thấy vi rút ASFV ở thịt heo nấu hoặc đóng hộp làm nóng đến 70oC

5.2 Triệu chứng

Thời gian vi rút dịch tả lợn Châu Phi ủ bệnh trong tự nhiên thường 4-19 ngày Các chủng vi rút độc lực cao gây xuất huyết bán cấp tính và cấp tính với các đặc điểm sốt cao 40-410C, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4-10 ngày, đôi khi chết ngay cả trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên

Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100% Các dòng vi rút độc lực thấp hơn có triệu chứng lâm sàng nhẹ như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mỏi – dễ bị nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh lý khác ở lợn và có thể không nghi ngờ đến ASFV Các dòng vi rút độc lực thấp chủ yếu nhiễm trùng không xuất huyết và gây chuyển hóa huyết thanh, nhưng cũng có một vài con bệnh tích rời rạc trên phổi hoặc trên da ở những vùng xương nhô ra và các vùng bị chấn thương

Thể bán cấp tính và mãn tính thường gặp hơn thể cấp tính Bán cấp tính được đặc trưng bởi giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu và xuất huyết Mãn tính được đặc trưng bởi hô hấp thay đổi, sảy thai và tỷ lệ tử vong thấp

5.3 Giải phẫu bệnh học

Có nhiều bệnh tích khác nhau được quan sát tùy thuộc vào chủng độc lực của

vi rút Các dạng cấp tính và bán cấp tính được đặc trưng bởi xuất huyết lan rộng và phá hủy mô lympho Ngược lại, các dạng mãn tính bệnh tích ít hoặc không xuất hiện

Cấp tính: Bệnh tích đại thể chính được quan sát ở lách, hạch lympho, thận và tim Lá lách có thể bị sậm màu, sưng to, nhồi huyết Các hạch lympho xuất huyết, phù Thận xuất huyết kim châm ở vỏ thận Xuất hiện dịch trong các xoang, xuất huyết đốm trên niêm mạc bàng quang, phổi Trong một số trường hợp thấy xuất huyết ở màng ngoài tim

Bán cấp tính: được đặc trưng bởi xuất huyết mảng rộng trên hạch lympho và thận, lách sưng to và xuất huyết, sung huyết và phù nề ở phổi, viêm phổi kẽ

6 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

6.1 Lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm: máu kháng đông, lách, hạch bạch huyết, hạch amydal, thận, dịch nổi tế bào sau khi phân lập vi rút để phát hiện vi rút Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dịch tả lợn Châu Phi

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 20C đến 80C Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt

độ đông băng Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 40C đến 80C tối đa trong 7 ngày Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ -200C đến -800C

6.2 Xử lý mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm từ lách, hạch amydal, hạch bạch huyết, thận từ lợn được nghiền thành huyễn dịch 10% với dung dịch nước sinh lý hoặc PBS vô trùng Sau đó

ly tâm 1500 g trong 10 phút Thu dịch nổi có thể dùng để chẩn đoán phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu phi bằng phản ứng real-time PCR, PCR hoặc phân lập vi rút

6.3 Phát hiện vi rút Dịch tả lợn Châu Phi

6.3.1 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (FAT)

- Chuẩn bị mẫu: Dùng máy cắt lạnh hoặc dao mỏng cắt các mô bệnh phẩm (lách, hạch, thận…) thành những lát mỏng từ 5 mm đến 7 mm hoặc phết cặn tế bào từ môi trường ủ bạch cầu lên lam kính, để khô tự nhiên và cố định bằng acetone trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Nhuộm với thuốc nhuộm fluorescein isothiocyanate (FITC) được gắn kháng miễn dịch globulin ASFV ở nồng độ khuyến cáo hoặc đã được chuẩn độ trước với thời gian 1 giờ/ 370C trong tủ ấm

- Cố định và nhuộm tương tự như trên với mẫu mô đối chứng âm, đối chứng dương

- Sau đó rửa sạch bằng cách ngâm 4 lần trong PBS, gắn kết mô đã nhuộm trong PBS/glycerol, sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng thích hợp

- Đọc kết quả:

+ Dùng kính hiển vi huỳnh quang lần lượt đọc các mẫu từ đối chứng trước, các mẫu bệnh phẩm sau

+ Mô dương tính nếu huỳnh quang đặc hiệu tế bào chất dạng hạt được quan sát thấy bắt màu xanh

6.3.2 Phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu phi bằng kỹ thuật realtime PCR

6.3.2.1 Tách chiết DNA

- Sử dụng kít chiết tách DNA cho vi-rút dịch tả lợn Châu phi theo hướng dẫn của nhà

sản xuất theo kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 Hoặc có thể sử

dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách DNA vi rút (Tham khảo Phụ lục B)

- Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi được thực hiện tách chiết DNA bằng các kít thương mại và bảo quản mẫu DNA ở 40C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản -200C trong thời gian dài

6.3.2.2 Chuẩn bị mồi

- Phản ứng realtime PCR sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò được nêu trong Bảng C1, phụ lục Cvới nồng độ thích hợp

+ Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM

+ Đoạn dò sử dụng ở nồng độ 5 µM

6.3.2.3 Tiến hành phản ứng realtime PCR

- Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.3.2.2) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất Có thể

áp dụng kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi công thức master mix) - Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng được nếu trong Bảng C2, phụ lục C

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml

+ Cho 5 µl DNA dương chuẩn của vi rút ASF có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương

+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm

+ Cho 5 µl DNA của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR

+ Đặt ống PCR vào máy realtime PCR

Lưu ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương

và mẫu đối chứng âm

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng được nêu trong Bảng C3, phụ lục C

Chú thích: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.3.2.4 Đọc kết quả

- Kết quả của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct)

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct

- Với điều kiện phản ứng:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả lợn Châu phi khi kết quả real-time PCR dương tính Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả

6.4 Phát hiện kháng thể vi rút Dịch tả lợn Châu Phi

6.4.1 Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể ASFV bán sẵn trên thị trường Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

6.4.2 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)

- Chuẩn bị huyễn dịch tế bào thận heo hoặc khỉ đã nhiễm vi rút ASF ở nồng độ 5x105

tế bào/ml, dàn những giọt nhỏ huyễn dịch trên lam kính, để khô tự nhiên và cố định với acetone tại nhiệt độ phòng trong 10 phút Chú ý các lam kính được cất giữ ở

-200C cho đến khi tiến hành

- Bất hoạt huyết thanh ở 560C/ 30 phút

- Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra và huyết thanh đối chứng dương, đối chứng

âm trong PBS trên lam kính có phết tế bào đã nhiễm vi rút và tế bào chưa nhiễm vi rút, sau đó ủ trong 370C/ 60 phút trong tủ ấm

- Rửa sạch lam kính bằng cách ngâm 4 lần trong PBS và sau đó với nước cất

-Thêm thuốc nhuộm FITC có gắn kháng globulin miễn dịch lợn hoặc FITC gắn protein A ở nồng độ khuyến cáo hoặc đã được chuẩn độ trước vào tất cả các lam kính, sau đó ủ 1 giờ/370C trong tủ ấm

- Rửa sạch lam kính bằng cách ngâm 4 lần trong PBS và sau đó với nước cất, gắn kết mô đã nhuộm trong PBS/glycerol, sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng thích hợp

- Đọc kết quả: đối chứng huyết thanh dương tính trên tế bào nhiễm vi rút phải dương tính và đối chứng còn lại phải âm tính Huyết thanh dương tính nếu môi trường nhiễm có huỳnh quang đặc hiệu