Tài liệu Báo cáo tốt nghiệp "Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao" pdf

Các enzyme quan trọng trong quá trình lên men của ca cao nhưpectinase, protease, invertase,… Do đó, muốn xác định thời điểm thích hợp bổ sung enzyme để quá trình lên men được tối ưu tôi

Mục lục

Chương 1 3

MỞ ĐẦU 3

Đặt vấn đề 3

Chương 2 5

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

Giới thiệu chung về ca cao 5

Sơ lược về cây ca cao 5

CHƯƠNG 3 22

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

Chương 4 33

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 33

Chương 5 71

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71

Chương 1

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Xã hội càng phát triển thì nhu cầu của con người ngày càng tăng Các sản phẩm cao cấpcũng ngày càng được sử dụng nhiều hơn, trong đó các sản phẩm từ ca cao ngày càng phổbiến hơn

Từ ca cao, người ta có thể chế biến ra rất nhiều loại sản phẩm như: bánh, kẹo nhânchocolate; nước uống hương vị chocolate…Không những thế, cacao khô và một số thànhphần chocolate chứa rất nhiều nhóm chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng trong việcduy trì hệ thống tim mạch hoạt động tốt, ngăn ngừa bệnh tim…(Theo Phạm Hồng ĐứcPhước, 2009)

Tuy nhiên, để tạo ra được những sản phẩm từ ca cao chất lượng cao thì cần quan tâm đếnnhiều vấn đề trong đó cần chú trọng đến quá trình lên men ca cao Quá trình lên men cóvai trò rất quan trọng nhằm tạo ra các hợp chất hóa học tạo nên hương vị đặc trưng chosản phẩm chocolate Trong quá trình lên men có sự tham gia hoạt động của các enzymelàm tăng hiệu quả các phản ứng tạo được nhiều tiền chất đặc trưng cho chocolate, làmtăng chất lượng sản phẩm Các enzyme quan trọng trong quá trình lên men của ca cao nhưpectinase, protease, invertase,…

Do đó, muốn xác định thời điểm thích hợp bổ sung enzyme để quá trình lên men được tối

ưu tôi thực hiện đề tài “Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase,invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao”

3

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu chung về ca cao

Sơ lược về cây ca cao

Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma cacao L., thuộc họ Sterculiaceae, là loài duy nhất trong số 22 loài của chi Theobroma được trồng sản xuất Ca cao có nguồn gốc từ lưu

vực sông Amazon nằm ở Nam, Trung Mỹ và cũng đã được trồng rộng rãi ở đây từ hơn

500 năm trước Sinh thái tự nhiên của cây ca cao là ở tầng thấp trong những cánh rừngmưa nhiệt đới; nơi có cường độ ánh sáng thấp, ẩm độ không khí cao, biên độ nhiệt giữangày và đêm cũng như giữa các tháng trong năm đều hẹp (Theo Phạm Hồng Đức Phước,2009)

Hiện nay, ca cao được chia làm 3 nhóm chính, bao gồm: Criollo, Forastero và Trinitario.

2.1.1 Thành phần hóa học của quả và hạt ca cao

Nước, chất béo (bơ ca cao), carbohydrates, nitrogen, acid hữu cơ, mối khoáng,…Cácthành phần này sẽ có hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và thịt hạt

- Chất nhầy (thịt quả) có hàm lượng nước và đường cao nhất, ngoài ra còn có acidcitric làm cho pH của thịt quả luôn ở 3,5

- Vỏ hạt có hàm lượng carbohydrates cao

- Thịt hạt có hàm lượng bơ ca cao rất cao, vỏ hạt có một ít và chất nhầy không có

5

Hình 2.1 : Thịt quả ca cao Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi

2,70,710,0

0,6 _

9,43,8

13,846,0 _

18,0 0,8

35,031,3

3,24,54,9_1,1

8,42,40,85,2

Acid hữu cơ

Citric & acetic, oxalic

Muối khoáng

Tổng số

0,70,8

100,0

_8,2

100,0

0,62,6

100,0

(Nguồn: F Hardy Trích từ Phạm Chí Thông, 1999)Theo Dr Emile Cros, 1999 thì trong lớp cơm nhầy chứa khoảng 82% – 87% là nước, 10%– 15 % đường, acid citric 1% – 3 %, protein 0,6%, pH ban đầu của lớp cơm nhầy vàokhoảng 3,6 Các thành phần này là cơ chất thích hợp cho hoạt động của các enzymeprotease, invertase và pectinase

Với các thành phần trên thì việc ứng dụng các enzyme (pectinase, protease, invertase) phùhợp với cơ chất có trong thành phần của lớp thịt quả (lớp cơm nhầy) là hướng đi chínhcủa đề tài

2.1.2 Sơ chế hạt ca cao

Trong thu hoạch cần phải hái trái chín, vì nếu chưa chín hạt

trong trái khó bóc ra, khó ủ, tỉ lệ hạt tím và xám cao, năng

xuất cacao thô giảm nhiều Nhưng trái chín lâu trên cây thì

trái dễ bị sâu bệnh, côn trùng phá hoại và bản thân trái cacao

bị chín rục, thối rữa và hạt trong trái sẽ nảy mầm (Theo Phạm

Trí Thông, năm 1999).

Quả sau khi thu hoạch được trữ khoảng 1 tuần như vậy sẽ

đem lại hiệu quả lên men cao hơn (Sưu tầm và biên dịch Cao

ca cao

7

Thu hoạchTrữ tráiĐập vỏ, lấy hạtLên men

Bảo quảnPhơi, sấy cacao

Hình 2.3: Trữ trái ca cao trong lồng

 Mục đích của quá trình lên men

Ca cao sau khi thu hoạch cần thiết phải lên men Trong quá trình lên men các tiềnchất để tạo hương chocolate được hình thành Do đó ca cao chất lượng chỉ đạt được saukhi lên men đúng kỹ thuật Lên men cũng làm giảm vị đắng và chát và hình thành màunâu đặc trưng của chocolate (khuyennongvn.gov.vn)

 Yêu cầu của quá trình lên men

Nhiệt độ trong quá trình lên men cần phải đạt từ 45 – 50 0C để tiêu diệt sức sốngcủa hạt (tránh hạt nảy mầm), nhiệt độ này sẽ thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa trong tếbào xảy ra nhanh hơn

Thời gian lên men từ 5 – 7 ngày đối với gống Forastero, Trinitario tùy điều kiện

thời tiết của từng vùng Nếu lên men ngắn quá thì quá trình sinh hóa chưa xảy ra hoànthiện, nếu lên men quá dài thì sự phân hủy đối với một số chất hữu cơ trong hạt xảy ramãnh liệt và tạo ra các sản phẩm gây mùi khó chịu như: phân hủy protein thành NH3, ôxyhóa các acid béo không no thành các aldehyt có mùi át mùi đặc trưng của ca cao, các phảnứng tạo ester với các mùi không mong muốn…(Theo Bernard W.Minific, C C., F.R.I.C,năm 1980)

Mức độ thông khí thích hợp: thông thường quá trình lên men yếm khí xảy ra đốivới hạt cacao bình thường (không được lưu quả) là 32 – 48 giờ, và đối với hạt đã làmgiảm hàm lượng nước (lưu quả 9 ngày) thì sau 24 – 32 giờ và tiếp theo sau đó là quá trìnhlên men hiếu khí (là giai đoạn cần không khí) tạo acid acetic Như vậy, thời gian đảo cầnthiết đối với hạt bình thường (không được lưu quả) là 2 ngày 1 lần đối với hạt từ quả đượclưu 9 ngày là một ngày sau 48 giờ (Theo Smilja, L., 2007)

Loại thùng ủ: Thùng ủ phải đảm bảo không có mùi vị lạ (mùi cao su, mùi xốp, ,

…), không bị acid ăn mòn, chất liệu thùng ủ không bị tác động bởi acid và cồn Thùng ủcòn phải có tác dụng dễ thoát dịch nhớt, giữ được nhiệt độ

Khối lượng và độ cao khối hạt: Khối lượng hạt để đạt được kết quả lên men tốt là

từ 50 kg hạt tươi trở lên, độ cao khối hạt trong ủ lên men ở khối lượng vừa và nhỏ làkhông quá 40 cm Với khối lượng và độ vao này thì quá trình sinh hóa trong hạt sẽ xảy ramột cách triệt để và theo xu hướng tốt (Theo Sterling S Thompson, K B M., AlexS.lopez, năm 2001)

9

 Cơ chế của quá trình lên men

- Sự lên men của lớp cơm nhầy ca cao Lớp cơm nhầy chứa một trữ lượngđường cao (khoảng 15 % - 20 %) và do sự có mặt của acid citric tạo nên độ pH của lớpcơm nhầy ban đầu là 3,5 là môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men

- Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, các nấm men như: Candida,

Debaryomyces, Hansenula, Saccharomyces… đã phát triển và chuyển hóa đường trong

chất cơm nhầy thành rượu ethylic và CO2 theo phản ứng: (Theo Phạm Trí Thông, 1999)

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Sự chuyển hóa này xảy ra trong điều kiện khị khí, điều kiện này cho phép sự phát

triển của các vi khuẩn acid lactic _ Lactobacillus, chủ yếu là L.Plantarum, L.Collinoides

và L.Fermentum, cùng với sự sản sinh ra acid lactic Các vi khuẩn này cũng tham gia vào

quá trình phân hủy các chất đường

Khi chất nhầy bị tan vỡ và dịch ca cao chảy ra làm môi trường ủ thông thoáng, độacid giảm, pH đạt khoảng 5 vào cuối giai đoạn lên men do sự mất đi của acid citric Lúcnày phản ứng oxy hóa cồn thành acid acetic diễn ra mạnh do sự xâm nhập của không khí

vào khối ủ tạo điều kiện cho vi khuẩn Acetobacter spp và Gluconobacter khi chất nhầy bị

hủy hoại Các vi khuẩn này hoạt động mạnh làm nhiệt độ khối ủ tăng lên Nhệt độ tăngđều trong 48 giờ đầu đạt 42 – 48 0C, sau khi được đảo trộn nhiệt độ tăng đến 50 0C, sau đógiảm xuống Sau 6 ngày ủ nhiệt độ đạt cỡ 48 0C

Khi ủ một khối lượng lớn, nhiệt độ trong lòng khối ủ tăng chậm hơn và tỉ số hạtcòn sống ở giữa khối còn cao, trong lúc đó ở lớp trên thì coi như không còn nữa Vì vậytrong quá trình ủ cần phải đảo trộn để làm cho khối ủ được thông khí giúp cho các hạt lênmen đều đặn Ngoài ra còn giúp cho nấm mốc không nảy nở trên bề mặt và hạt không bịquá khô

(Theo Wood G.A.R, a R A L., 2001).

Hình 2.7: Sự chuyển biến đường của cơm nhầy trong quá trình lên men

 Phơi, sấy ca cao:

Sau khi ủ ẩm độ của hạt ca cao khoảng 55 % (ẩm độ theo cơ sở ướt) và ẩm độ nàyphải giảm xuống đến giá trị 6 – 7 % mới đảm bảo an toàn được, nhưng nếu hạ thấp ẩm độxuống dưới 5 % hạt ca cao sẽ rất giòn và dễ gãy (Theo Phạm Trí Thông, 1999)

Mục đích của việc phơi sấy: Ngoài việc hạ thấp ẩm độ nhằm ngăn ngừa nấm mốcphát triển còn để hoàn tất các biến đổi hóa học xảy ra tiếp tục bên trong hạt sau thời kỳlên men để tạo hương vị đặc biệt cho ca cao (http://www.dost-bentre.gov.vn/chuyen-muc/ung-dung-khoa-hoc-cong-nghe/289-qui-trinh-len-men-ht-ca-cao.html)

Trong giai đoạn phơi (sấy) thì các phản ứng sinh hóa tiếp tục xảy ra (dưới tác độngcủa các enzyme được sinh ra trong quá trình lên men), trong đó đặc biệt là các phản ứngphân hủy protein thành các amino acid, phân hủy tinh bột thành đường và các phản ứng

11

oxy hóa polyphenol tạo màu nâu và các tền hương vị chocolate trong nhân hạt ca cao(Theo Phan Thanh Bình, 2009).

Hạt được ủ và phơi sấy tốt sẽ có màu tím nhạt và màu nâu chocolate Khi bópmạnh bằng tay sẽ nghe âm thanh rắc rắc và dễ nghiền thành bột

Hạt ca cao đã ủ và phơi có thể bảo quản khá tốt ở các vùng ôn đới nhưng lại là mộtthứ nông sản dễ hư hỏng trong các vùng nhiệt đới Cho nên cần chú ý đến các điều kiệntrong bảo quản để phẩm chất của hạt không bị tổn hại và giảm sút (Theo Phạm Trí Thông,1999)

2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống

và sự sinh sản của tế bào diễn ra ở một vận tốc cao và với tính chất đặc thù không tạo racác sản phẩm phụ như ở các phản ứng thông thường Enzyme có mặt trong trong tế bàocủa mọi sinh vật, không những chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống mà cònxúc tác cho cả các phản ứng ngoài tế bào (Theo Nguyễn Phước Nhuận và ctv, năm 2003)

Ngày nay, enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: chăn nuôi, thú y,công nghiệp chế biến thực phẩm…

Bản chất của enzyme là protein cấu trúc bậc I, II, III và đôi khi bậc IV

Về mặt cấu tạo, enzyme được chia làm 2 nhóm:

- Enzyme một cấu tử: Là enzyme trong thành phần cấu tạo của nó chỉ cóprotein Một số enzyme được cấu tạo bằng một chuỗi polypeptide duy nhất, đa số enzymeđược cấu tạo bằng nhiều chuỗi polypeptide giống nhau hoặc khác nhau.

- Enzyme nhị cấu tử: Một vài enzyme cần phải liên kết với một thành phầnphi protein để thực hiện chức năng xúc tác của mình, thành phần phi protein này được gọi

là cofactor Trong trường hợp này, thành phần protein được gọi là apoenzyme và kết hợphai thành phần trên được gọi là holoenzyme, trong đó các cofactor tham gia trực tiếp vàoquá trình xúc tác và ảnh hưởng đến đặc điểm của phản ứng xúc tác (oxy hóa, vậnchuyển…) còn apoenzyme chịu trách nhiệm về tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểmcủa chất xúc tác nói chung

Các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng vachạm với nhau ở vị trí xảy ra phản ứng và phải ở trạng thái hoạt động Muốn hoạt hoá cácphân tử thì cần cung cấp năng lượng cho chúng Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạthóa Chất xúc tác nói chung và xúc tác enzyme đều có khả năng làm giảm năng lượnghoạt hóa mà phản ứng yêu cầu bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian

mà tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng nhỏ hơn trường hợp không có chất xúc tác(Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, năm 1998)

Sự tạo thành phức ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua 3 giai đoạnsau:

E + S  ES  P +E

- Trong giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạothành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi nănglượng hoạt hóa thấp

13

- Trong giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn đến sự kéo căng vàphá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này Kết quả là làm cho cơ chất đượchoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn

- Trong giai đoạn thứ ba: Sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóngdưới dạng tự do

Trong quá trình tác dụng enzyme thể hiện tính đặc hiệu cao

- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng bậc nhấtphụ thuộc vào nồng độ enzyme

Đường biểu diễn có dạng sau: Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng, vậntốc tăng Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vậntốc không thay đổi

(Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, năm 1998)

Hình 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng

V: Vận tốc phản ứngE: Nồng độ enzyme

- Nồng độ cơ chất: trong các phản ứng enzyme xúc tác trước hết tạo thànhphức trung gian giữa enzyme lại tiếp tục kết hợp với phân tử cơ chất khác

Giả sử phản ứng chỉ có một cơ chất S và tạo thành sản phẩm P, phản ứng xảy ranhư sau:

E + S ES P + E

ES là chất trung gian “enzyme – cơ chất” Tốc độ phản ứng tỉ lệ với nồng độ phứcchất trung gian này Nồng độ ES càng cao, tốc độ phản ứng càng lớn, khi toàn bộ lượngenzyme trong phản ứng đều tham gia vào phức chất ES, tốc độ sẽ đạt cực đại

Hình 2.9: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: vì bản chất của enzyme là protein do đó khi tăngnhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tínhcủa protein Trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính thì: khi tăng nhiệt độ lên

10 0C thì vận tốc phản ứng tăng lên từ 1,4 đến 2 lần Khi bắt đầu có biến tính protein thìxảy ra hai hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự tăng nhiệt độ, mặt khácvận tốc biến tính protein xảy ra nhanh hơn Kết quả là vận tốc phản ứng giảm dần tới đìnhchỉ hoàn toàn

Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Nhiệt độ mà tại đóenzyme bị bất hoạt hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ quá thấp cũng làmgiảm mạnh hoạt độ enzyme

15

- Ảnh hưởng của pH môi trường: pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứngenzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH nhất định gọi là pH hoạtđộng tối thích của enzyme.

pH làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức ở trung tâm hoạt độngenzyme làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và cóthể làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme

pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất, tại pH tối thích phân tử cơchất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme

2.2.2 Enzyme chủ yếu trong quá trình lên men ca cao

Chất lượng hạt ca cao được hình thành nên bởi các chất hóa học (tiền chất) để tạothành hương vị đặc trưng cho chocolate Các chất hóa học này sinh ra trong quá trình lênmen, phơi (sấy) và hoàn thiện dần trong quá trình bảo quản hạt Tác động của enzyme vàocác phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men và phơi sấy sẽ làm tăng tốc độ phản ứng,làm tăng hiệu quả của các phản ứng và từ đó tạo ra nhiều tiền chất chocolate và làm tăngchất lượng sản phẩm

Tác động của các enzyme trong quá trình lên men ca cao (Theo Phan Thanh Bình, 2009):

- Giai đoạn đầu, các enzyme pectinase sẽ tác động vào các phân tử pectin làmgãy các liên kết và tạo thành các phân tử nhỏ hơn làm cho lớp dịch nhầy rữa ra và thoátbớt Trong giai đoạn này enzyme cellulase cũng có tác dụng để phân cắt các sợi cellulosenhằm làm cho lớp nhầy nhanh phân hủy

- Giai đoạn tiếp theo, các enzyme phân hủy như: invertase, β – glocodase đểtạo nên nguyên liệu cho phản ứng tạo rượu Enzyme invertase trong phần cơm nhầy hoạtđộng mạnh phân hủy các đường không khử thành đường khử, cơ chất cho phản ứng tạomàu Maillar (phản ứng giữa acid amin và đường khử)

- Giai đoạn tiếp theo, khi có không khí các enzyme protease, amylase,glycosidase và polyphenol oxydase, lactatdehydrogenase, aldehydehydrogenase sẽ hoạtđộng thủy phân các chất tương ứng tạo nên các tiền chất cũng như các chất tạo hương củasản phẩm

Enzyme polyphenol oxydase, peroxidase đã xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử

để tạo nên các tiền hương vị chocolate và tiền chất tạo màu Enzyme carboxypeptide phânhủy peptid thành các oligopeptid và các amino acid tự do

- Giai đoạn cuối quá trình lên men và trong quá trình phơi, các acid hìnhthành sẽ dịch chuyển từ lớp nhớt vào trong nhân và tác động đến các tế bào chứapolyphenol để giải phóng các polyphenol và dưới tác dụng của enzyme polyphenoloxydase sẽ oxy hóa để tạo thành các chất màu có trong hạt ca cao

2.2.3 Giới thiệu về Enzyme Protease

Protease là các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân của liên kết peptide(CO – NH) giữa các L_acidamin và chúng cũng thường tác dụng lên các liên kết este đơngiản, ngoài ra còn có khả năng thủy phân các liên kết ester, liên kết amide và tham giaphản ứng chuyển vị gốc amino acid (Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv, năm 2006)

Có nhiều cách phân loại protease khác nhau theo sự phân bố của chúng, pH hoạtđộng, tính đặc hiệu cơ chất, nguồn thu nhận enzyme (Theo Đinh Ngọc Loan, 2008)

2.2.4 Giới thiệu về enzyme pectinase

Enzyme pectinase là tên gọi chung của một nhóm enzyme có khả năng phân giảipectin là một polysaccharid

Cấu tạo pectin chủ yếu là mạch chính gồm các gốc acid galacturonic liên kết nhaubằng liên kết 1-4 glucosid còn gọi là polygalacturonic hay acid peptic

17

Theo Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1997, các pectinase được chia thành hai nhóm chủyếu:

 Enzyme pectinesterase (PE) hay pectimetylesterase (pectinhydrolase) (EC3.1.1.11) là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết este trong phân tử pectin hoặc acidpectinic khi toàn bộ các nhóm metoxyl đề bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành làmetanol và các acid polygalacturonic Sự thủy phân chỉ xảy ra ở liên kết este kề liền vớinhóm carboxyl tự do

Enzyme pectinesterase chỉ phân cắt các nhóm methoxyl đứng cạnh nhóm COOH

tự do Bắt đầu từ nhóm COOH tự do, Kết quả là tạo thành acid pectic và methanol

(Ashraf F., 1993)

Hình 2.10: Phản ứng được xúc tác bởi enzyme pectinesterase

pH tối ưu là 5,5 – 6; nhiệt độ tối ưu là 55 – 60 0CĐối với enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc, nhiệt độ tối ưu là 30 0C – 40 0C

 Enzyme polygalacturonase (PG)

Enzyme polygalacturonase phân cắt liên kết glucozit 1,4 trong mạch pectin,tạo raacid galacturonic

(Ashraf, F., 1993)

Hình 2.11 Hoạt động thủy phân của enzyme polygalacturonase

Nhiệt độ tối thích của PG là 40 0C – 50 0C, pH tối thích là 4 – 4,5

- Có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau: polymethylgalacturonase tác dụng chủ yếu lên các este metylic của các acid polygalacturonic Cácenzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucozit bị cắt đứt dưới

sự xúc tác của enzyme ở đầu hay giữa mạch

+ Endoglucozidase – polymetylgalacturonase I: xúc tác sự thủy phân các liên kếtglucozit nội mạch ở các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao

+ Exo – glucozidase – polymetylgalacturonase III: xúc tác sự thủy phân các liênkết glucozit ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectin, bắt đầu

19

+ Exo - glucozidase – polygalacturonase IV: xúc tác sự thủy phân các liên kếtglucozit ở đầu mạch của phân tử acid pectic hoặc acid pectinic

Các enzyme thủy phân pectin có tính bền nhiệt và pH hoạt động tối thích khácnhau Các exopolygalacturonase của Asp.awamori 16 hoạt động mạnh ở pH 3,5; các endo

polymetylgalacturonase hoạt động mạnh ở pH 4,2; còn pectinesterase chỉ hoạt động mạnh

ở pH 5 Nhiệt độ hoạt động tối thích của các enzyme này trong khoảng 45 – 52 0C

Trong công nghiệp, pectinase được ứng dụng để phân giải pectin nhằm nâng caohiệu suất ép, lọc nước quả, chiết dược liệu, làm trong rượu vang và nước quả

2.2.5 Giới thiệu về enzyme invertase

Invertase, tên khoa học là -fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26), làenzyme thuộc nhóm enzyme saccharase, là enzyme xúc tác phản ứng thủy phânsaccharose thành glucose và fructose (tỉ lệ mol 1:1), còn được gọi là đường nghịch đảo.Đường nghịch đảo được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt làtrong công nghệ sản xuất bánh kẹo và nước giải khát do đặc tính hút ẩm cao, tác dụng ổnđịnh, tránh hiện tượng khô cứng (Theo Đinh Ngọc Loan, năm 2008)

Invertase có trong động thực vật, vi sinh vật và đặc biệt là nấm men có khả năng

tổng hợp invertase cao Saccharomyces hiện là vi sinh vật được quan tâm nhiều nhất trong lĩnh vực lên men tạo invertase, invertase của Saccharomyces gồm hai loại như sau :

invertase nội bào và invertase ngoại bào ( Theo Nam Sun Wang, 2003)

Theo R.Bergamasco, F.J.Bassetti, F.F.de Moraes and G.M.Zanin, 2000, phản ứngthủy phân saccharose do invertase xúc tác như sau:

InvertaseSaccharose (đường không khử) α-Glucose + β-Fructose (đường khử)

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm đã được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh hóa phòng sinh hóa vàcông nghệ sinh học Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Đaklak

Thời gian tiến hành thí nghiệm: từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2010

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu là dịch cơm nhầy của quả ca cao giống forastero hái từ vườn kinh

doanh của Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Daklak

Độ chín của quả ban đầu dùng cho các thí nghiệm là quả có màu sắc vàng trên toàn

bộ đường rãnh quả hoặc trên cả bề mặt quả từ 1/2 trở xuống

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Thí nghiệm của đề tài gồm 3 nội dung chính, mỗi nội dung có vật liệu nghiên cứuriêng:

3.2.1 Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

Nội dung 1: sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L (Novozyme)

Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme chứa enzyme pectinase, enzymepectolytic, protease, cellulase (chủ yếu là polygalacturonase) được chiết xuất từ 3 vi

khuẩn chủ yếu là Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei và Aspergillus niger.

Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme dạng lỏng, có màu nâu, mùi nhẹ của sản phẩmlên men, dễ tan trong nước, pH hoạt động từ 3 – 6, pH tối ưu là 4,7 – 5,2 Bảo quản ở 0 –

10 0C (32 0F – 50 0F), nhiệt độ hoạt động là 10 0C (50 0F) – 57 0C (135 0 F), nhiệt độ tốithích là 40 – 45 0C (Theo Lê Mỹ Hồng, 2005)

3.2.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

Nội dung 2: Sử dụng chế phẩm enzyme flavourzyme TM 500L (Novozyme)

Chế phẩm enzyme protease flavourzyme (Novozyme) được chiết xuất từ

Aspergillus oryzae.Nhiệt độ thích hợp cho enzyme flavourzyme hoạt động là 40 – 55 0C,nhiệt độ tối thích là 50 – 55 0C (Đề tài khoa học Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản

cố 03/2007 ĐH Nha trang) pH thích hợp là 5 – 7, pH tối ưu là 6 ( Theo Rasa và ctv,2005) Chế phẩm enzyme flavourzyme có dạng bột, màu nâu

3.2.3 Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

Nội dung 3: Sử dụng chế phẩm enzyme invertase (Novozyme)

Chế phẩm enzyme invertase có dạng bột, màu vàng nhạt, nên bảo quản ở

5 – 10 0C trong môi trường lạnh và khô hoạt tính của enzyme có thể giữ được trong 1năm pH hoạt động của chế phẩm enzyme này là 3 – 5, pH tối thích là 4,5 Nhiệt độ tốithích của enzyme là 60 0C

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

Trong nội dung 1 ta có 2 thí nghiệm:

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện pH:

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 1

Côngthức

pH Tỉ lệ enzyme

sử dụng

Thể tích dịchcơm nhầy

Thể tíchenzymeCT1

CT2CT3CT4

3,54,55,56,5

23

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (35 0C, 40 0C, 45 0C, 50

0C), 2 lần lặp lại

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 2

Côngthức

Nhiệt độ Tỉ lệ enzyme

sử dụng

Thể tích dịchcơm nhầy

Thể tíchenzymeCT1

CT2CT3CT4

Tỉ lệ enzyme sử dụng (30 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối vớimỗi mẫu thí nghiệm cần 19,5 µml enzyme

3.3.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

Trong nội dung 2 ta cũng có 2 thí nghiệm:

3.3.2.1 Thí nghiệm 3: Xác định điều kiện pH

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại

Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm 3

Côngthức

pH Tỉ lệ enzyme

sử dụng

Thể tích dịchcơm nhầy

Thể tíchenzymeCT1

CT2CT3CT4

3,54,55,56,5

3.3.2.2 Thí nghiệm 4: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (350C, 400C, 450C, 500C),

2 lần lặp lại

Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm 4

Côngthức

Nhiệt độ Tỉ lệ enzyme

sử dụng

Thể tích dịchcơm nhầy

Thể tíchenzymeCT1

CT2CT3CT4

Tỉ lệ enzyme sử dụng (5 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối vớimỗi mẫu thí nghiệm cần 0,1 µml enzyme

3.3.3 Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao:

3.3.3.1 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện pH

25

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại.

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5

Côngthức

pH Tỉ lệ enzyme

sử dụng

Thể tích dịchcơm nhầy

Thể tíchenzymeCT1

CT2CT3CT4

3,54,55,56,5

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện nhiệt độ

Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức nhiệt độ (350C, 400C, 45 0C, 50 0C),

2 lần lặp lại

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm 6

Côngthức

Nhiệt độ Tỉ lệ enzyme

sử dụng

Thể tích dịchcơm nhầy

Thể tíchenzymeCT1

CT2CT3CT4

Tỉ lệ enzyme sử dụng (20 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối vớimỗi mẫu thí nghiệm cần 1 µml enzyme

3.4 Chỉ tiêu và phương pháp xác định

3.4.1 Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

- Chỉ tiêu khảo sát: độ nhớt của dịch cơm nhầy.

- Ph ươ ng pháp nghiên c ứu: để xác định điều kiện nhiệt độ và pH để hoạt hóaenzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ta sử dụng phương pháp đo

độ nhớt

Theo dõi sự thay đổi độ nhớt của dịch cơm nhầy ca cao trong 60 phút Sau 5 phút

đo độ nhớt của dịch cơm nhầy một lần

Sử dụng máy Viscotester VF03 để đo độ nhớt của dịch cơm nhầy

- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm:

Quả ca cao sau khi thu hoạch từ vườn thực nghiệm của Viện KHKT Nông LâmNghiệp Tây Nguyên về sẽ tiến hành đập quả lấy hạt Để lấy được dịch nhớt thì ta tách hạtlấy phần cơm nhầy bên ngoài hạt, sau đó cho nước vào và xay hỗn hợp bằng máy xay sinh

tố (tỉ lệ nước/ cơm nhầy: 1 lít nước/200g cơm nhầy) Hỗn hợp sau khi xay được lọc qua 2sàng có đường kính lỗ 1,4 mm và 800 µm Sau đó tiến hành đảo trộn hỗn hợp dịch nhớt

và lấy dịch nhớt cho mỗi mẫu thí nghiệm Tùy vào mỗi công thức thí nghiệm mà ta điềuchỉnh pH và nhiệt độ

Sau khi điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ thí nghiệm ta lại tiếp tục đảo trỗnhỗn hợp dịch nhớt lần nữa và chia hỗn hợp này ra làm 2 (ứng với mẫu đối chứng và mẫuthí nghiệm) cho vào 2 cốc thủy tinh 1 lít Trước khi tiến hành thí nghiệm ta kiểm tra độnhớt ban đầu của mẫu thí nghiệm ở mỗi công thức sao cho độ nhớt ban đầu của các côngthức bằng nhau

Trong quá trình thí nghiệm phải thường xuyên kiểm tra nhiệt độ của dịch mẫu để

có biện pháp điều chỉnh nhiệt độ khi nhiệt độ cao quá hoặc thấp dưới nhệt độ khảo sát

- Để điều chỉnh nhiệt độ và pH của mẫu thí nghiệm ta làm như sau:

Điều chỉnh pH: sử dụng acid citric 0,1 N (nếu pH của dịch nhớt lớn hơn pH cầnkhảo sát) hoặc NaOH 0,1 N (nếu pH của dịch nhớt nhỏ hơn pH cần khảo sát)

27

Điều chỉnh nhiệt độ: dùng tủ sấy để nâng nhiệt độ của dịch nhớt đến nhiệt độ khảosát rồi dùng tủ định ôn để ổn định nhiệt độ của dịch nhớt trong suốt thời gian thí nghiệm.

3.4.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme flavourzyme trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

- Chỉ tiêu khảo sát : sự thay đổi hàm lượng amino acid thông qua giá trị OD

đo được bằng máy đo quang phổ

- Ph ươ ng pháp nghiên c ứu: xác định hàm lượng amino acid bằng thuốc thửhiện màu ninhydrin Dựa trên nguyên tắc sau (Theo Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường,2003):

Khi cho chế phẩm enzyme vào dịch lọc trên thì enzyme protease sẽ thủy phân cácliên kết peptid của protein tạo ra các amino acid Dưới tác động của ninhydrin, amino acid

bị oxy hóa chuyển thành amino acid rồi đến amoniac và carbonic Amino acid bị giảm bớtmột nguyên tử C, nó trở thành dạng aldehyd Như vậy amino acid có khối lượng phân tửnhỏ hơn và amoniac tạo thành sẽ oxy hóa ninhydrin tạo nên phức hợp có màu xanh tím,cường độ màu tương ứng với giá trị nito amin của amino acid

Phản ứng màu ninhydrin cũng xảy ra với amino acid mạch bên của peptid vàprotein cũng như đối với muối amoni, glucosamin và amoniac Để định lượng chính xácamino acid, dung dịch nghiên cứu phải không có hợp chất trên

Trong thí nghiệm này, ta không cần phải xác định chính xác hàm lượng aminoacid, mà chỉ cần xác định sự thay đổi hàm lượng amino acid sau khi bổ sung chế phẩmenzyme Hàm lượng amino acid tỉ lệ thuận với giá trị OD đo được bằng máy quang phổ

- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

Quả ca cao sau khi thu hoạch từ vườn thực nghiệm của Viện KHKT Nông LâmNghiệp Tây Nguyên về sẽ tiến hành đập quả lấy hạt Phần hạt này ta cho thêm nước và

ngâm trong vòng 2 tiếng (tỉ lệ nước/hạt: 3 lít nước/10 kg hạt) Sau đó ta tiến hành lọc lấyphần dịch nước và tiếp tục lọc qua giấy lọc để thu được dung dịch trong

Trước khi lấy mẫu ta phải đảo trộn hỗn hợp dịch nhớt Ở mỗi công thức thí nghiệm

ta lấy ra 20 ml, sau khi điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ thí nghiệm ta lại tiếp tụcđảo trỗn hỗn hợp dịch lọc lần nữa Vì ninhydrin rất nhạy với amino acid nên phải phaloãng thêm dịch lọc này Trong thí nghiệm này, ta pha loãng làm 2 lần (lượng acid citric0,1 N hay NaOH 0,1 N thêm vào + 1 lượng nước cất = 20 ml) Chia hỗn hợp vừa phaloãng làm 1 cho vào 2 cốc thủy tinh (mỗi cốc 20 ml): một cốc có bổ sung enzyme (mẫuthí nghiệm) và một cốc không cho enzyme (mẫu đối chứng)

Để điều chỉnh nhiệt độ và pH ta cũng làm tương tự như thí nghiệm 1

- Tiến hành thí nghiệm

Sau khi chuẩn bị mẫu xong, ta lấy 0,5 ml dung dịch lọc, cho thêm 1,5 ml dung dịchđệm citrat Ở mỗi cốc, lấy 0,5 ml dịch cho vào mỗi ống nghiệm, cho thêm 1,5 ml dungdịch đệm citrat 0,1 M; pH = 5 và 2 ml dung dịch ninhydrin Lắc đều ống nghiệm và đặtvào nồi cách thủy đun sôi 30 phút Cứ sau 5 phút ta lại lấy dịch lọc một lần, tất cả hút 10lần (50 phút)

Cho thêm etanol 50 % V vào đến 10 ml Đo giá trị hấp thu OD ở bước sóng λ =

540 nm Chỉnh máy về 0 với ống kiểm tra có đủ hóa chất nhưng thay dung dịch có aminoacid bằng nước cất cùng thể tích

Trong quá trình thí nghiệm phải thường xuyên kiểm tra nhiệt độ của dịch mẫu để

có biện pháp điều chỉnh nhiệt độ khi nhiệt độ cao quá hoặc thấp dưới nhệt độ khảo sát

29

3.4.3 Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao

- Chỉ tiêu theo dõi: Sự thay đổi hàm lượng dường khử sinh ra thông qua giátrị OD đo được bằng máy đo quang phổ

- Phương pháp nghiên cứu: Xác định hàm lượng đường khử bằng 3,5 –dinitrosalicylic acic Dựa trên nguyên tắc sau (Theo Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường,2003):

Dưới tác dụng của enzyme invertase thì sucrose trong lớp cơm nhầy của ca cao sẽ

bị thủy phân tạo thành đường khử Lượng đường khử sinh ra phản ánh mức độ hoạt hóacủa ezyme invertase

Có một vài tác nhân được sử dụng để định lượng đường khử nhờ các đặc tính khửcủa đường 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khửthành acid 3 – amino – 5 – nitrosalicylic có màu đỏ cam

Trong thí nghiệm này, ta không cần phải xác định chính xác hàm lượng đườngkhử, mà chỉ cần xác định sự thay đổi hàm lượng đường khử sau khi bổ sung chế phẩmenzyme Hàm lượng đường khử tỉ lệ với giá trị OD đo được bằng máy quang phổ

- Chuẩn bị mẫu thí nghiệm:

Thí nghiệm cũng được chuẩn bị như ở nội dung 2 Nhưng ở mỗi công thức thínghiệm ta lấy ra 100 ml, sau khi điều chỉnh dịch nhớt về pH và nhiệt độ thí nghiệm ta lạitiếp tục đảo trộn hỗn hợp dịch lọc lần nữa Sau đó chia hỗn hợp cho vào 2 cốc thủy tinh(mỗi cốc 50 ml): một cốc có bổ sung enzyme (mẫu thí nghiệm) và một cốc không choenzyme (mẫu đối chứng) Vì khi điều chỉnh pH của dịch lọc thì ở các công thức khácnhau (ứng với các pH khác nhau) sẽ có độ loãng khác nhau, nên sau khi điều chỉnh pH ta

sẽ lấy một thể tích V chung = lượng acid citric 0,1 N hay NaOH 0,1 N thêm vào + 1

lượng nước cất thêm vào Như vậy sẽ đảm bảo sau khi điều chỉnh pH thì thể tích dịch mẫu

ở các công thức bằng nhau do đó sẽ có độ loãng bằng nhau

- Tiến hành thí nghiệm

Sau khi chuẩn bị mẫu ta lấy 3 ml dung dịch mẫu ở mỗi cốc vào mỗi ống nghiệm,thêm vào 1 ml thuốc thử DNS Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1 ml thuốc thửDNS vào 3 ml nước cất Dùng bông gòn hoặc miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm,đặt vào nồi nước đang sôi trong 5 phút

Sau 5 phút thì tiến hành hút dịch mẫu 1 lần, tất cả hút 10 lần

Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540 nm Dùng ốngthử không để chuẩn độ truyền suốt về 0 Chú ý là tất cả các ống nghiệm phải được làmlạnh về nhiệt độ phòng trước khi đo vì độ hấp thu rất nhạy với nhiệt độ

3.5 Thiết bị và hóa chất sử dụng

- Thiết bị:

 Máy đo độ nhớt Viscotester VF03, máy đo quang phổ Thermospecial

 Máy đo pH Hanna điện cực thủy tinh

 Tủ định ôn, tủ sấy, cân điện tử, nồi cách thủy

- Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan và định mứcđến 1000 ml.

- Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan vàthêm nước đến 1000 ml

- Để pha dung dịch đệm citrat 0,1 M, pH = 5 Lấy 20,5 ml dung dịch a và29,5 ml b

- Sodium potassium tartrate: hòa tan 300 g muối này vào 500 ml nước cất (1)

- 3,5 – dinitrosalicylic acid: hòa tan 10 g DNS vào 200 ml dung dịch NaOH 2M (2)

- Dinitrosalicylic dùng cho phản ứng: trộn (1) vào (2), thêm nước cất cho đủ 1 lít.Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, dungdịch này cần phải được giữ trong chai nâu và tránh CO2

 Dung dịch NaOH 2M : để pha 200 ml NaOH 2M ta dựa vào công thức:

Ch ương 4 ng 4

K T QU VÀ TH O LU N ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ả VÀ THẢO LUẬN Ả VÀ THẢO LUẬN ẬN

N i dung 1: Xác đ nh đi u ki n pH và nhi t đ đ ho t hóa ội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa ịnh điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa ều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa ện pH và nhiệt độ để hoạt hóa ện pH và nhiệt độ để hoạt hóa ội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa ể hoạt hóa ạt hóa enzyme pectinase trên c ch t d ch c m nh y c a h t ca caoơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ịch cơm nhầy của hạt ca cao ơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ầy của hạt ca cao ủa hạt ca cao ạt ca cao

Trong quá trình lên men, sự biến đổi của độ nhớt của lớp cơm nhầy giảm đi làmtăng độ thoáng khí tạo điều kiện cho các vi sinh vật lên men hiếu khí trong giai đoạn tiếptheo hoạt động mạnh

Tốc độ giảm độ nhớt phụ thuộc vào các phản ứng sinh hóa ở lớp cơm nhầy như:phản ứng oxy hóa, phản ứng thủy phân và đặc biệt là phản ứng phân hủy pectin Sau khiquá trình lên men kết thúc, hàm lượng lớp cơm nhầy càng thấp thì chứng tỏ khối hạt lênmen tốt

Trong thí nghiệm này ta sử dụng chế phẩm enzyme pectinex ultra SP-L, cũng nhưcác enzyme khác mức độ hoạt hóa của enzyme này phụ thuộc vào nhiệt độ và pH Ở cácnhiệt độ và pH khác nhau thì hoạt động của enzyme sẽ làm mức độ giảm của độ nhớtdịch cơm nhầy của hạt ca cao khác nhau Ở nhiệt độ và pH nào mà mức độ giảm của độnhớt cao nhất thì đó là điều kiện tối thích của enzyme

33

Dựa vào kết quả lên men thực nghiệm tại Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp TâyNguyên ta có đồ thị biến đổi giá trị pH và nhiệt độ của lớp cơm nhầy ca cao trong quátrình lên men như sau:

Đồ thị 4.1: Sự biến đổi pH lớp cơm nhầy ca cao trong quá trình lên men

Đồ thị 4.2: Sự biến đổi nhiệt độ lớp cơm nhầy ca cao trong quá trình lên men 4.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định điều kiện pH:

Để xác định sự giảm độ nhớt của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm và giữa các mẫu thí nghiệm với nhau khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không, ta dựa vào giá trị FTN

và F tra bảng Ta có 4 trường hợp sau:

 FTN< F0,05: Sự khác biệt là không có ý nghĩa với p > 0,05

 FTN ≥ F0,05: Sự khác biệt là có ý nghĩa với p ≤ 0,05

Trong thí nghiệm này ta có giá trị F bảng như sau: Fbảng = 4,26.

Độ nhớt (mPa.s)

Enzyme

Đối chứng

dụng enzyme) nhanh hơn mẫu đối chứng và giảm thấp nhất ở mức 124,5 mPa.s sau 60phút nhưng mẫu đối chứng chỉ giảm tới 142,5 mPa.s Sự khác nhau này có ý nghĩa thống

kê ở mức p ≤ 0,05 (do FTN = 5,01 > Fbảng = 4,26), (xem thêm đồ thị 4.3 và phụ lục 2.1)

Nguyên nhân sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm có thể do ở pHnày thích hợp cho hoạt động của enzyme pectinase, do đó khi bổ sung enzyme vào mẫuthí nghiệm thì enzyme sẽ phân hủy pectin của dịch cơm nhầy làm cho độ nhớt giảm

> Fbảng= 4,26), điều này có nghĩa là có sự tác động của enzyme pectinase đến độ giảmnhớt dịch cơm nhầy ca cao (xem thêm đồ thị 4.4 và phụ lục 2.2) Như vậy, việc bổ sungenzyme pectinase vào lớp cơm nhầy của hạt ca cao khi khối ủ đạt pH = 4,5 thì làm độnhớt của lớp cơm nhầy giảm nhanh hơn so với khi không bổ sung enzyme

Thời gian (phút)

Độ nhớt (mPa.s) Enzyme

Đối chứng

= 4,26) (xem đồ thị 4.5 và phụ lục 2.3) Như vậy đã có sự tác động của enzyme đến mức

độ giảm nhớt của dịch cơm nhầy của hạt ca cao Ta có thể kết luận pH = 5,5 thích hợp chohoạt động của enzyme pectinase

37

Thời gian (phút)

Độ nhớt (mPa.s) Enzyme

Đối chứng

Đồ thị 4.6: Sự biến đổi của độ nhớt ở

ý nghĩa với p > 0,05 ( do FTN = 0,90 < Fbảng = 4,26). Như vậy, tại pH này không thích hợpcho hoạt động của enzyme

Thời gian (phút)

Độ nhớt (mPa.s) Enzyme

Đối chứng