Tổng hợp và thử hoạt tính một số dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dẫn chất acylhydrazon -CONHN= có tác dụng hoạt hóa caspase và kháng tế bào ung thư mạnh do khả năng tạo phức với ion kẽm ở trung tâm hoạt động của casp

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHCN

CẤP CƠ SỞ CHUYÊN SÂU

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

ACYLHYDRAZON MANG KHUNG ISATIN

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Công Huân

Thái Bình - 2021

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHCN

CẤP CƠ SỞ CHUYÊN SÂU

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

ACYLHYDRAZON MANG KHUNG ISATIN

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

13C-NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy 13C

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C) 5-FU 5-Fluoruracil

CDK Cyclin-dependent kinase

(Protein kinase phụ thuộc cyclin) DCM Dicloromethan

DMSO Dimethyl sulfoxid

IC50 The half maximal inhibitory concentration

(Nồng độ ức chế 50%)

IR Infrared spectroscopy

(Phổ hồng ngoại) KLPT Khối lượng phân tử

MeOH

MIC

Methanol Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

(Phổ khối lượng) NCI-H23 Tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ ở người

PAC-1 Procaspase Activating Compound 1

(Hợp chất 1 hoạt hóa procaspase) PC-3 Tế bào ung thư tuyến tiền liệt người

SW620 Tế bào ung thư đại tràng người

Tonc Nhiệt độ nóng chảy

1.3 Tình hình nghiên cứu các dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin kháng tế bào ung thư ở trong nước và quốc tế

24

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.2 Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1.1 Tổng hợp các chất acylhydrazon mang khung isatin 35 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết các chất tổng hợp được 43 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của các chất đã tổng hợp được 44

3.2 Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư trên in vitro 50

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hoá chất chính dùng trong đề tài 28 Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp của 6 chất 4a-f 42 Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của 6 chất 4a-f 43

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của 6 chất 4a-f 44

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ MS của 6 chất 4a-f 45 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của 6 chất 4a-f 46 Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của 6 chất 4a-f 48

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 6 chất 4a-f 49

Bảng 3.8 Đánh giá mức độ giống thuốc 4a-f theo quy tắc Lipinsky 50

Hình 1.2 Hỗ biến amido-iminol của acylhydrazon thế 2 Hình 1.3 Các acylhydrazon gây độc tế bào ung thư 6 Hình 1.4 Công thức cấu tạo các acylhydrazon diarryl urea 7 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học, tác dụng hoạt hóa procaspase-3 PAC-1 8 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của S-PAC-1, WF-208, WF-210, B-PAC-1 9 Hình 1.7 Công thức cấu tạo các acylhydrazon mang khung quinazolin 9 Hình 1.8 Công thức cấu tạo các acylhydrazon mang khung benzoxazin 10

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của 3-(o-nitrophenyl)hydrazonisatin 12 Hình 1.11 Công thức cấu tạo các Mannich isatin dị vòng 13 Hình 1.12 Công thức cấu tạo của base Schiff isatin 13 Hình 1.13 Công thức cấu tạo của 5-(2-oxo-3-indolinyliden)-thiazolidin-2,4-dion-1,3-di-Mannich

13

Hình 1.14 Công thức cấu tạo của indirubin và methylisoindigo 14 Hình 1.15 Công thức cấu tạo các isatin lai hóa quinazolin 15 Hình 1.16 Công thức cấu tạo các hydrazon isatin ức chế Shp2 16 Hình 1.17 Công thức cấu tạo của hydrazon isatin và benzoisatin 16 Hình 1.18 Công thức cấu tạo các isatin-3-thiosemicarbazon 18 Hình 1.19 Công thức cấu tạo của isatin lai hóa với gatifloxacin 19 Hình 1.20 Công thức cấu tạo các isatin khi gắn acid amin 20 Hình 1.21 Công thức cấu tạo các chất N-5,7-dibromoisatin 20 Hình 1.22 Công thức cấu tạo các chất 3-pyrrolo-indolinon thế 21 Hình 1.23 Công thức cấu tạo các chất 5-halogen isatin 22 Hình 1.24 Công thức cấu tạo các isatin ngưng tụ thioxothiazolidin 22 Hình 1.25 Công thức cấu tạo các hydroxamic mang khung isatin 23 Hình 1.26 Công thức cấu tạo các isatin kiểu combretastatin A4 23 Hình 1.27 Công thức cấu tạo các acylhydrazon mang khung isatin 24

Hình 1.30 Công thức cấu tạo các acylhydrazon isatin lai hóa benzoxazin 27

Hình 3.1 Thông số vật lý và sàng lọc ảo của chất 4a 51

Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 4e 60 Hình 4.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất 4e 61

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp acylhydrazon theo El-Emam và cộng sự 3

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các mefenamic acid N-aryl hydrazin 4

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp dẫn chất acylhydrazon thơm 4

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp các dẫn chất hydrazid hydrazon 4

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp các dẫn chất alcylhydrazon trong DMF 4

Sơ đồ 2.1 Tổng hợp các chất acylhydrazon mang khung isatin (4a-f) 31

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng tạo chất trung gian 2 53

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng tạo chất trung gian 3 54

Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng tạo các chất 4a-f 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư hiện là căn bệnh nguy hiểm hàng đầu với tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong ở mức cao và ngày càng gia tăng theo thời gian Nguyên nhân chủ yếu của quá trình diễn biến và phát triển ung thư là rối loạn chu trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) Enzym caspase thuộc họ enzym cystein protease đóng vai trò quan trọng trong duy trì cân bằng nội mô thông qua việc điều tiết chu trình chết tự nhiên của tế bào [1] Vì vậy, các caspase đang là mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hiện nay theo cơ chế hoạt hóa trực tiếp procapsase-3, từ đó tái kích hoạt chương trình apoptosis ở các tế bào ung thư

Trên thế giới, nhiều hợp chất hướng hoạt hóa caspase đã được thử

nghiệm tác dụng kháng ung thư in vivo Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dẫn

chất acylhydrazon (-CONHN=) có tác dụng hoạt hóa caspase và kháng tế bào ung thư mạnh do khả năng tạo phức với ion kẽm ở trung tâm hoạt động của caspase Bên cạnh đó, các chất mang khung isatin được chứng minh là tiềm năng trong điều trị ung thư theo cơ chế ức chế tyrosin kinase - nhóm enzym tham gia vào hầu hết các giai đoạn trong chu trình phát triển tế bào thông qua phản ứng phosphoryl hóa protein [2]

Với mong muốn tìm kiếm các dẫn chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh có tiềm năng trở thành thuốc, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài

“Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin” với 2 mục tiêu:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất acylhydrazon mới mang khung isatin

2 Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư trên in vitro

của các chất acylhydrazon mang khung isatin tổng hợp được

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về acylhydrazon

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Hydrazon là hợp chất có chứa nhóm azomethin (-CH=N-NH-), chúng được tạo thành bởi phản ứng ngưng tụ giữa một nhóm hydrazid với một nhóm carbonyl Việc thêm một nhóm -C=O trong hydrazid làm tăng thêm sự bất định xứ điện tử, dung lượng phối trí của hydrazin và kết quả thu được dẫn chất acylhydrazon [3]

Hình 1.1 Công thức chung của hydrazon thế và acylhydrazon [3]

Acylhydrazon (O=C-NHN=CH) có chứa nhóm azomethin đóng vai trò

quan trọng trong nhiều tác dụng sinh học, tạo thành một “cấu trúc đặc quyền”

trong nghiên cứu phát triển thuốc mới Việc thay đổi của các phần liên kết với các nhóm chức acylimin của nhóm hydrazon và acylhydrazon dẫn đến tạo thành các dẫn chất tương ứng, góp phần đa dạng hóa các mục tiêu phân tử [4]

Acylhydrazon có khả năng hỗ biến, chúng có tương tác hỗ biến amido

và iminol do sự hiện diện nhóm azomethin Ở trạng thái rắn, dạng amido chiếm ưu thế trong khi ở trạng thái dung dịch chủ yếu ở dạng iminol

(hình 1.2) Bên cạnh đó, các acylhydrazon cũng có đồng phân hình học (syn

và anti) do có mặt của liên kết đôi giữa C và N [3]

N NH

R1

R2

R3O

N N

R1

R2

R3O

amido iminol

Hình 1.2 Hỗ biến amido-iminol của acylhydrazon thế [3]

1.1.2 Phương pháp tổng hợp

Phương pháp truyền thống và phổ biến nhất để tổng hợp các dẫn chất

acylhydrazon là cho acid hydrazid thế (1, sơ đồ 1.1) phản ứng với các hợp

chất carbonyl (2) trong dung môi thích hợp [5]

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ tổng quát phản ứng tổng hợp các acylhydrazon [5]

Các phương pháp nghiên cứu tổng hợp acylhydrazon về sau đều dùng phương pháp cổ điển làm nền tảng, chỉ thay đổi kiểu hoặc tính chọn lọc của phản ứng Nhiều loại phương pháp tổng hợp mới đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng, dưới đây mô tả một số phương pháp thường gặp:

El-Emam và các cộng sự đã tổng hợp được hợp chất 3 (sơ đồ 1.2) bằng

cách oxi hóa carbohydrazid 2-indol trong vòng thời gian 3 giờ đồng hồ tại nhiệt độ phòng trong ethanol Hợp chất này cũng thu được bằng cách ngưng

tụ với một aldehyd thơm [6]

NH N NH

N CHO

O2 O2-H2O -N2

-H2O

Sơ đồ 1.2 Phương pháp tổng hợp acylhydrazon thơm [6]

Một dãy các dẫn chất mefenamic acid N-aryl hydrazin mới (sơ đồ 1.3)

được tổng hợp bởi Almasirad và cộng sự bằng cách cho hỗn hợp aldehyd và hydrazid phản ứng trong ethanol ở 30°C với sự có mặt của HCl làm chất xúc tác [7]

N C

+

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các mefenamic acid N-aryl hydrazin [7]

Các dẫn chất acylhydrazon thơm cũng đã được tổng hợp bởi Pandey V.K và cộng sự bằng cách đun hồi lưu các aldehyd thơm thích hợp với acid hydrazid trong acid acetic băng Sản phẩm được kết tủa bằng methanol và được làm sạch bằng ethanol để đạt được độ tinh khiết mong muốn [8]

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp dẫn chất acylhydrazon thơm [8]

Trong một nghiên cứu khác, Dalip Kumar và cộng sự đã điều chế các hydrazid hydrazon bằng cách cho glyoxal phenyl phản ứng với một phenyl hydrazid trong dung môi acetonitril ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ [9]

R1

H O

O

R1

N O

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp các dẫn chất hydrazid hydrazon [9]

Ngoài ra, các hydrazid phản ứng với aldehyd thích hợp trong dung môi dimethylformamid (DMF) ở nhiệt độ phòng cũng thu được các dẫn chất acylhydrazon tương ứng [9]

1.1.3 Tác dụng kháng tế bào ung thư

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy, các acylhydrazon có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, giảm đau, chống viêm, chống co giật, chống kết tập tiểu cầu Đặc biệt, dẫn chất acylhydrazon được phát hiện có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh [10] Năm 2007, Duarte và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất acylhydrazon chứa vòng 5-oxo-[1,2,4] triazol và thăm dò hoạt tính kháng tế bào ung thư người

của chất tổng hợp Kết quả cho thấy, chất 4 và 5 (hình 1.3) ức chế mạnh sự

phát triển của khối u trên dòng tế bào ung thư vú [4]

Các dẫn chất thế N’-benzyliden-3,4,5-trimethoxy benzohydrazid (6,

hình 1.3) đã được tổng hợp và đánh giá tác dụng ức chế ung thư trên nhiều

dòng tế bào ung thư người khác nhau Nhiều hợp chất có chứa nhóm acylhydrazon cho thấy tác dụng kháng khối u tốt Trong đó, các hợp chất với nhóm thế R= 2-F, 3-F, 4-F, 4-CF3 cho hiệu quả tác dụng cao nhất trên dòng tế bào PC3, còn hợp chất với R=2-F, 4-F, 4-CF3 cho tác dụng ức chế trung bình trên tế bào Bcap37 [11]

Trong một nghiên cứu năm 2005 của Gürsoy và Karali, hợp chất cloro-3-phenyl-4(3H)-quinazolinon-2-yl) mercapto acetyl) hydrazono)-5-

3-(((6-fluoro-1H-2-indolinon (7, hình 1.3) cho khả năng gây độc tế bào mạnh trên

dòng tế bào ung thư thận người UO-31 [12] Trong số các dẫn chất

2,6-dimethyl-N’-phenylmethylen-imidazo [2,1-b]-[1,3,4]

thiadiazol-5-carbohydrazid được tổng hợp, hợp chất

2,6-dimethyl-N’-(2-hydroxyl-phenylmethyliden) imidazol [2,1-b]-thiadiazol-5-carbohydrazid (8, hình 1.3)

thể hiện hoạt tính độc tế bào mạnh nhất trên dòng bào MCF-7 và ZR-75-1 [13]

Năm 2009, Scanlon K J và cộng sự đã tổng hợp các hợp chất benzo (d) isothiazol hydrazon, trong đó benzo (d) isothiazol-3-carboxylic acid (4-

methoxy-benzyliden)-hydrazid (9, hình 1.3) thể hiện tác dụng ức chế sự tăng

sinh tế bào ung thư rõ rệt nhất Một số dẫn chất thế 3- và

5-methylthiophen-2-carboxaldehyd α-(N)-heterocyclic hydrazon (10, hình 1.3) cho hiệu lực mạnh,

ức chế sự phát triển của khối u với giá trị IC50 từ 1,63-26,5 µM [14]

Hình 1.3 Các acylhydrazon gây độc tế bào ung thư [4], [11], [13], [14]

Năm 2006, Jin L và cộng sự đã tiến hành tổng hợp và đánh giá hoạt

tính ức chế sự phát triển của khối u người của các dẫn chất thế

N'-benzyliden-3,4,5-trimethoxybenzohydrazid (11, hình 1.4) Kết quả cho thấy, việc thay đổi

nhóm thế trên vòng phenyl đã dẫn đến hiệu lực gây độc tế bào ung thư khác nhau của các dẫn chất acylhydrazon này Trong đó, các dẫn chất mang nhóm thế R= 2-F, 3-F, 4-F, 4-CF3 cho hiệu quả tốt nhất trên dòng tế bào PC-3 với giá trị IC50 tương ứng là 0,2 µM, 1,8 µM, 0,2 µM và 1,2 µM, còn dẫn chất với R = 2-F, 4-F, 4-CF3 cho tác dụng ức chế trung bình trên các dòng tế bào Bcap37, BGC-823 [15]

Năm 2010, một số dẫn chất acylhydrazon mang khung furan đã được các nhà khoa học Trung Quốc tổng hợp và thử hoạt tính kháng ung thư trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm: HL-60, BGC-823, Bel-7402, KB Kết quả

nghiên cứu cho thấy hợp chất 12 (hình 1.4) có hiệu quả ức chế đặc biệt tốt

trên dòng tế bào HL-60 với IC50 = 16,4 μM, và mạnh hơn cả chất đối chiếu dương là doxorubicin (IC50 = 53,3 μM) Thử nghiệm in silico dự đoán độc

tính của dẫn chất này cũng đã chỉ ra rằng hợp chất 12 an toàn và có đủ điều

kiện để phát triển thành thuốc trên lâm sàng [16]

Một nghiên cứu của Zhang B và cộng sự đã công bố năm 2012, trong

số các dẫn chất diaryl urea mang nhóm acylhydrazon tổng hợp được, hợp

chất 13 (hình 1.4) có khả năng gây độc tế bào mạnh nhất đối với cả ba dòng

tế bào ung thư thử nghiệm A549, MDA-MB-231, HL-60 với giá trị IC50 tương ứng là 0,41 μM, 0,24 μM và 0,23 μM [17]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo các acylhydrazon diarryl urea [15], [16], [17]

Với vai trò trung tâm hoạt hóa của caspase-3 trong apoptosis, nồng độ procaspase-3 cao hơn trong nhiều loại tế bào ung thư, các nhà khoa học đã chỉ

ra rằng có thể tìm được các phân tử nhỏ đóng vai trò hoạt hóa trực tiếp procaspase-3 và chúng hứa hẹn sẽ là những phân tử có tiềm năng lớn trong liệu pháp điều trị ung thư [18] PAC-1 (Procaspase Activating Compound 1,

hình 1.5) là một dẫn chất acylhydrazon đầu tiên được biết đến có vai trò hoạt

hóa trực tiếp enzym procaspase-3 theo cơ chế tạo phức chelat với ion kim loại kẽm trong procaspase-3 Năm 2006, PAC-1 được báo cáo có tác dụng hoạt

hóa trực tiếp procaspase-3 thành caspase-3 in vitro và gây hiện tượng

apoptosis ở tế bào ung thư đại tràng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, PAC-1 làm ngưng quá trình phát triển khối u ở 3 nhóm chuột mang tế bào ung thư khác nhau, trong đó có 2 nhóm sử dụng PAC-1 qua đường uống Ngoài ra, PAC-1

có hiệu quả tốt trong các mô hình thử nghiệm in vitro, in vivo và đang được

tiếp tục đánh giá để sử dụng như một loại thuốc chống ung thư ở người [18] Năm 2015, công ty Vanquish Oncology Inc đã tiến hành một thử nghiệm lâm sàng pha 1 của PAC-1 trên các bệnh nhân ung thư và đến năm 2016, PAC-1

đã được FDA phê duyệt để điều trị u nguyên bào xốp [19]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học, tác dụng hoạt hóa procaspase-3 của PAC-1 [19]

Kể từ khi hợp chất PAC-1 ra đời, đã có hơn 1000 dẫn chất acyhydrazon của PAC-1 (diaryl urea, các dẫn chất benzothiazol, oxadiazol…) được tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học [40] Trong số đó, bốn hợp chất: S-PAC-1,

WF-210, WF-208 và B-PAC-1 (hình 1.6) cho hoạt tính mạnh nhất, thêm với

việc mang nhóm chức thân dầu trong công thức phân tử giúp cải thiện tính

thấm tế bào đã được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn trên in vivo đã mở ra

nhiều triển vọng có các thuốc ung thư thế hệ mới [20], [21]

Hình 1.6 Công thức cấu tạo S-PAC-1, WF-208, WF-210, B-PAC-1 [20]

Theo xu hướng nghiên cứu trên thế giới, tại Việt Nam nhóm nghiên cứu tổng hợp hóa dược của trường Đại học Dược Hà Nội đã tổng hợp 5 dẫn

chất acylhydrazon mang khung 4(3H)-quinazolin (14a-e, hình 1.7) vào năm

2018 [22] Các chất này đã được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư người

trên in vitro Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 5 chất đều cho tính gây độc tế

bào ung thư mạnh hơn chất đối chiếu dương tính 5-FU trên 3 dòng: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) và ung thư phổi không tế

bào nhỏ (NCI-H23) Đặc biệt, chất 5d cho độc tính mạnh nhất, gấp khoảng 4

lần 5-FU trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc thay các nhóm R bằng nhóm hút điện tử và thay R’ bằng các nhóm đẩy điện làm tăng tác dụng độc tính tế bào của các chất tổng hợp [22]

Hình 1.7 Công thức cấu tạo các acylhydrazon mang khung quinazolin [22]

Từ những kết quả đáng khích lệ thu được, nhóm nghiên cứu tổng hợp hóa dược Đại học Dược Hà Nội tiếp tục tổng hợp và thử hoạt tính gây độc tế

bào ung thư của một số dẫn chất acylhydrazon mang khung benzoxazin

(15a-e, hình 1.8) trên ba dòng tế bào ung thư người: ung thư đại tràng (SW620),

ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) và ung thư phổi không tế bào nhỏ (NCI-H23) [23] Các chất tổng hợp sau đó được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên

5 nồng độ khác nhau để tính ra được IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) với chất đối chiếu dương tính là 5-FU và PAC-1 Kết quả nghiên

cứu cho thấy 15a và 15d có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tương đương với chất đối chiếu dương tính Trong khi đó, chất 5e có hoạt tính mạnh hơn PAC-

1 và mạnh hơn 5-FU là 2 lần [23]

Hình 1.8 Công thức cấu tạo acylhydrazon mang khung benzoxazin [23]

1.2 Tổng quan về isatin

1.2.1 Cấu trúc của isatin

Isatin là hợp chất dị vòng có cấu trúc hóa học như sau:

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của isatin

Isatin còn được gọi là Tribulin, có tên khoa học là indolin-2,3-dion Isatin là một hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ indol Về công thức cấu tạo, isatin là hợp chất thơm gồm 2 vòng benzen và pyrrolidin-2,3-dion, nhiều dây nối đôi liên hợp với nhau nên các dẫn chất isatin hấp thụ tốt các bước sóng vùng nhìn thấy và thường có màu vàng đậm đến màu cam

1.2.2 Cơ chế kháng tế bào ung thư

Về cơ chế tác dụng, các dẫn chất isatin kháng tế bào ung thư thông qua con đường ức chế các protein kinase khác nhau, đặc biệt thụ thể tyrosine kinase (RTKs) và protein đặc hiệu serin/threonin kinase (ví dụ kinase phụ thuộc cyclin (CDK)) Các kinases đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh nhiều con đường kiểm soát sự phát triển, biệt hóa, con đường chết bên trong và ngoài tế bào tế bào Chính những rối loạn điều hòa các enzym này góp phần vào sự hình thành vả phát triển các bệnh ung thư [36] Hiện nay, các chất ức chế kinase phân tử nhỏ được lựa chọn trong các chiến lược mới trong tìm thuốc điều trị ung thư [24] Trong đó, các dẫn chất isatin đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu diệt hoặc làm chậm cũng như ngăn chặn sự gia tăng của các tế bào ung thư thông qua việc ức chế các protein kinase này [2]

Đặc biệt, cấu trúc dị vòng của isatin là một trung tâm hoạt động hấp dẫn với mục tiêu phân tử ức chế trùng hợp tubulin [25] Do isatin bị oxy hóa nên nhiều dẫn chất của isatin được phát hiện có khả năng phá vỡ động lực học

vi ống Ngoài ra, isatin cũng được tìm thấy trong việc xen kẽ giữa các cặp bazơ DNA và ức chế ribonucleoprotein telomerase (enzym chịu trách nhiệm

về duy trì các telomere của nhiễm sắc thể sinh vật nhân thực) Sự biểu hiện quá mức của enzym này thường là nguyên nhân tiềm năng dẫn đến việc sao chép không giới hạn của tế bào ung thư [2] Do đó, nhiều chiến lược phát triển các dẫn chất isatin mới tác động vào các con đường hình thành và phát triển tế bào ung thư được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Trong đó phải kể đến các nghiên cứu mới trên các dẫn chất thiosemicarbazid, thiosemicarbazon, các base Mannich… chứa khung isatin với tác dụng mạnh kháng tế bào ung thư và chống khối u [25] Như vậy có thể thấy, các dẫn chất isatin thể hiện rõ nét với vai trò tích cực là chất kháng ung thư tiềm năng, và cũng là định hướng mới cho các nghiên cứu phát triển thuốc ung thư mới hiện nay

1.2.3 Tác dụng kháng tế bào ung thư

1.2.3.1 Các nghiên cứu tác kháng ung thư của isatin trên thế giới

Các dẫn chất isatin là một trong nhóm những chất hữu cơ được nghiên cứu có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học Nhiều công trình nghiên cứu về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất isatin cho thấy, chúng có tác dụng sinh học khá phong phú và đa dạng như tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao, kháng virus, tiêu diệt vi khuẩn lao, ức chế men Monoamino-oxydase (MAO), [26] Trong các hoạt tính sinh học quý này, các nghiên cứu về tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất isatin được các nhà nghiên cứu phát triển thuốc mới tập trung sâu rộng hơn

Những nghiên cứu về tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất isatin đầu tiên phải kể đến công trình nghiên cứu của nhà khoa học Hoa

Kỳ, F.D Pop đã tổng hợp và công bố tác dụng chống khối u của

3-(o-nitropheyl) hydrazon isatin (hình 1.10) vào năm 1999 Những chất này có

hoạt tính ức chế mạnh trên sự phát triển của dòng tế bào ung thư

Carcinosarcoma walker 256 [27]

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của 3-(o-nitrophenyl)hydrazonisatin [27]

Năm 2005, Varma R.S và cộng sự thử tác dụng đối với tế bào ung thư

của base Mannich của isatin (hình 1.11) và nhận thấy rằng các chất này độc

với tế bào ung thư và có tác dụng chống ung thư mạnh [28]

Hình 1.11 Công thức cấu tạo các Mannich isatin dị vòng [28]

Năm 2008, Maysinger D đã tổng hợp 22 dẫn chất isatin là các base

Shiff của chúng (hình 1.12) Các tác giả đã thử tác dụng kháng tế bào ung thư

của các dẫn chất này, trong số đó có 3 chất (R = H, R’ = morpholino, R’’= C6H4CH3; R = H, R' = H, R'' = C6H4CF3 (m) và R=H, R’ = morpholino, R’’ = C6H4CF3 (m)) có tác dụng ức chế tế bào ung thư ở nồng độ 5x10-4 M [29]

Hình 1.72 Công thức cấu tạo của base Schiff isatin [29]

Năm trong số các dẫn chất base

5-(2-oxo-3-indolinyliden)thiazolidin-2-4-dion-1,3-di Mannich (hình 1.13) được Eshba và cộng sự tổng hợp và thử tác

dụng trên tế bào bạch huyết P388 của chuột Trong số các chất này thì hợp chất có nhóm thế dimethylaminomethyl ở vị trí số 4 của nhân thiazolidinendion có hoạt tính chống ung thư mạnh nhất Kết quả thử cũng cho thấy thế brom vào vị trí số 5 của nhân isatin làm tăng hoạt tính chống ung thư [30]

Hình 1.13 Công thức cấu tạo của

5-(2-oxo-3-indolinyliden)-thiazolidin-2,4-dion-1,3-di-Mannich [30]

Năm 2002, tác giả Tang W và Eisenbrand G đã tổng hợp và thử tác dụng của indirubin và dẫn chất (hợp chất được ngưng tụ bởi 2 phân tử isatin,

hình 1.14) Nghiên cứu cho thấy, indirubin có khả năng ức chế tế bào ung thư Carcinocarcoma walker 256 trên chuột Thử nghiệm lâm sàng khi dùng chất

indirubin điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu tủy sống mãn ở liều 300 – 450mg/ngày cho kết quả là: 26% bệnh nhân khỏi hẳn và 33,4% bệnh nhân giảm bệnh Đối với bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu tủy xương mãn tính khi điều trị với indirubin trong thời gian từ 1,5 – 6 tháng đã làm tăng rõ rệt hoạt tính 5’-nucleotidase của bạch cầu và trong số các ca bệnh có sự thuyên giảm

bệnh Khi thử hoạt tính chống u với tế bào Carcinosarcoma walker 256, một

số dẫn chất của indirubin như N, N’-dimethylindirubin, N-methyl indirubin monooxim, N-acetylindirubin, N-methylindirubin mono methyl oxim cho hoạt

tính tương đương hoặc cao hơn [31]

Hình 1.14 Công thức cấu tạo của indirubin và methylisoindigo [31]

Đặc biệt, khi nghiên cứu cơ chế kháng tế bào ung thư các dẫn chất hydrazon của isatin cũng được nghiên cứu hoạt tính còn được thông qua con đường ức chế enzym kinase phụ thuộc cyclin 2 (CDK2) Trong nghiên cứu về mối liên quan cấu trúc và tác dụng các dẫn chất của isatin, nhóm nghiên cứu của Bramson đã phát hiện một hợp chất hydrazon của isatin khi được brom

hóa trên nhóm p-sulfonamid thể hiện giá trị ức chế enzym CDK2 với IC50 =

60 nM [32] Nhóm nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, các nhóm thế thân dầu ở vị trí C4 hoặc nhóm thế oxazolyl ở C5 của isatin làm tăng mạnh hoạt tính ức chế

CDK2 Các chất dị vòng mang nhóm thế kỵ nước tại vị trí C4/C5 của isatin cũng cho hoạt tính ức chế CDK2 mạnh tương tự Những chất này cùng với dẫn chất amid của 5- (2,6-dimethoxyphenyl) thể hiện hiệu lực đáng chú ý chống lại một loạt các dòng tế bào ung thư ở người, với hầu hết các giá trị IC50 ở mức nồng độ cỡ vài nM [32]

Ngoài vị trí C5 của isatin, một loạt các isatin dẫn chất hydrazon ở vị trí C3 cũng được phát triển bởi Gursoy A khi nghiên cứu các isatin thông qua việc lai hóa C3 của isatin với quinazolinon (một hợp chất tiềm năng về hoạt tính sinh học, đặc biệt khả năng kháng tế bào ung thư) được tổng hợp và đánh

giá về hoạt tính gây độc tế bào của chúng [33] Trong đó, 3 hợp chất (16a,

16c và 16d, hình 1.15) đã được chứng minh lâm sàng, thể hiện độc tính tế bào

tương đương với 2 đối chiếu dương tính là thioguanin và 5-fluorouracil Đáng

chú ý nhất, một dẫn chất chứa dihalogen (16c) cho hoạt tính gây độc tế bào

mạnh trên các dòng tế bào ung thư thận (UO-31, RXF 393) và thần kinh

(U251) So với với các dẫn chất dihalogen đã nói ở trên (16c), 2 hợp chất đơn chức halogen (16a và 16d) có hoạt tính kém hơn một chút, trong khi hợp chất tương tự không chứa halogen (16b) hoạt động kém nhất trong số các hợp chất

được thử nghiệm Điều này cho thấy vai trò tích cực của các nhóm thế halogen đối với hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất thế istain [33]

Hình 1.15 Công thức cấu tạo các isatin lai hóa quinazolin [33]

Ngoài con đường ức chế enzym CDK2, những nghiên cứu về cơ chế gây độc tế bào ung thư của dẫn chất hydrazon của isatin cho thấy, một số hợp chất

kháng tế bào ung thư người còn thông qua ức chế protein tyrosin phosphatase Shp2 (một mục tiêu phân tử của các thuốc điều trị ung thư, đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu, tăng sinh và biệt hóa tế bào) [34] Trong đó, vai trò nhóm acid cacboxylic trên vòng thơm chứa hydrazon và một hợp phần

p-halosulfonamid ở vị trí C5 (17a và 17b, hình 1.16) có khả năng ức chế chọn

lọc Shp2 ở mức độ µM Điều này được thể hiện rõ nhất thông qua 17c, chất

có hoạt tính ức chế ức chế protein tyrosin phosphatase Shp2 mạnh nhất với IC50 = 0,8M [34]

Hình 1.16 Công thức cấu tạo các hydrazon isatin ức chế Shp2 [34]

Một nghiên cứu của Abele E đối với các aminoacetylhydrazon của

isatin (16) và các dẫn chất benzoisatin của chúng (18, hình 1.17) được tổng

hợp và được dự đoán có tác dụng trên các gen sinh ung thư [35] Nghiên cứu chỉ ra rằng, các chất này đều gây độc tế bào và một dẫn chất p-

methylpiperazinyl (19, hình 1.16) dẫn đến chết 100% tế bào ở nồng độ từ

120-250 µg/ml [35]

Hình 1.17 Công thức cấu tạo của hydrazon isatin và benzoisatin [35]

Năm 2009, Juranic và cộng sự báo cáo tác dụng gây độc tế bào của

isatin-thiocarbohydrazon (20a, hình 1.18) và N-ethylisatin-thio carbo hydrazon (20b, hình 1.18) trên tế bào ung thư B16 (u hắc tố ở murin), HeLa

(ung thư biểu mô cổ tử cung), các dòng tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi

ở người Hợp chất N-ethylisatin –thiocarbohydrazon (20b) có hoạt tính

mạnh hơn ba lần so với 20a (IC50 = 10,4M và 34,2M trên dòng B16; IC50 = 21,9M và 61,7M với dòng HeLa, tương ứng) Đặc biệt, 20a thể hiện độc tính

tế bào mạnh hơn 20b trên dòng tế bào đơn nhân trong máu (IC50 tương ứng

17,6 M và 47,0 M) [26]

Một đẳng cấu sinh học của hydrazon là thiosemicarbazon (nhóm hydrazon có chứa S) khi kết hợp với isatin đem lại nhiều hoạt tính sinh học

mới ngoài dự kiến Một trong số đó phải kể đến thiosemicarbazon của

N-methylisatin đóng vai trò là thuốc dự phòng điều trị bệnh đậu mùa, đây cũng

là một trong những tác nhân kháng virus đầu tiên được sử dụng trên lâm sàng [36] Các nghiên cứu về dẫn chất thiosemicarbazon của isatin trong những năm gần đây cũng chỉ ra tác dụng kháng tế bào ung thư người trên nhiều dòng

tế bào Pervez và cộng sự đã sàng lọc khả năng gây độc tế bào ung thư của 15

hợp chất isatin-3-thiosemicarbazon [36] Chỉ có 2-methylphenyl (20c, hình 1.18), 2-methoxyphenyl (20d) và 3-nitrophenyl (20e) thể hiện hoạt tính gây

độc tế bào đáng kể Đáng chú ý nhất là 18d có hoạt tính kháng tế bào ung thư

mạnh nhất với IC50 = 11M [36]

Nhiều dẫn chất 5-nitroisatin và 1-morpholino/piperidinomethyl-5-nitro

isatin chứa nhóm thiosemicarbazon (20g-k) được tổng hợp và báo cáo bởi

Karali và cộng sự [37] 8 chất tương tự đã được chọn đánh giá tác dụng kháng

tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào của NCI Tất cả các hợp chất được thử nghiệm đều có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tương đương với với các thuốc đối chiếu dương tính thioguanin và 5-fluorouracil Trong số các dẫn

chất 5-nitroisatin, phenyl (20g) và 4-nitrophenyl (20h) được thế

thiosemicarbazon mạnh hơn các chất alkyl hóa của chúng (20i-j, hình 1.18)

Ngoài ra, các hợp chất 1-morpholinomethyl thường biểu hiện độc tính tế bào lớn hơn các hợp chất không được thay thế Phức hợp thiosemicarbazon được

thay thế 4-clorophenyl (20k, 20v) hoạt động kháng tế bào ung thư ung thư

phổi không phải tế bào nhỏ và các dòng tế bào bệnh bạch cầu mạnh hơn đáng

kể so với thioguanin và 5-fluorouracil [37]

Các nghiên cứu sâu hơn về thiosemicarbazon có hoạt tính sinh học trên dòng tế tế bào ung thư người đã dẫn đến việc tổng hợp một loạt các isatin 5-

bromo-3-thiosemicarbazon (20l và 20m) bao gồm dị vòng thiazolidinon và

imidazolidindion Việc đưa nguyên tử brom vào vị trí C5 của vòng isatin được biết là làm tăng hoạt tính chống ung thư so với phân tử ban đầu [38] Bốn hợp chất điển hình được chọn sau khi sàng lọc sơ bộ để được đánh giá thêm dòng

tế bào khối u đầy đủ các của NCI Tất cả các hợp chất được báo cáo ở đây đều

có độc tính tế bào ít nhất tương đương với các thuốc điều trị ung thư đã dùng như thioguanin và 5-fluorouracil Đặc biệt, với các dẫn chất 4-fluorophenyl và

4-nitrophenyl thiosemicarbazon (20l và 20m, hình 1.18) cho thấy mức độ

kháng tế bào thậm chí còn cao hơn so với các thuốc đối chiếu [38]

Hình 1.18 Công thức cấu tạo isatin-3-thiosemicarbazon [26], [37], [38]

Khi nghiên cứu hợp chất lai isatin kết hợp 2 hợp phần bao gồm: thay thế nhóm carbonyl ở vị trí C3 của isatin bằng nhóm chức imin có liên kết dị

vòng p-sulfamid pyrimidin và hợp phần thứ hai được N-alkyl hóa tại vị trí N1

của isatin bằng gatifloxacin (một fluoroquinolon kháng khuẩn mạnh) (21a,

hình 1.19) cho hoạt tính kháng tế bào mạnh trên ung thư biểu mô đại tràng

người (Colo205) với giá trị IC50 = 0,269 M [39]

Hình 1.19 Công thức cấu tạo các isatin lai hóa với gatifloxacin [39] Đáng chú ý nhất, chất 21a (hình 1.19) có hoạt tính kháng ung thư mạnh

gấp 20 lần so với thuốc hóa trị liệu ung thư etoposid trên dòng tế bào ung thư biểu mô thận A498 ở người Một dẫn chất khác khi kết hợp 4,5-dimethoxy

pyrimidin (21b, hình 1.19) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô

phổi tế bào không nhỏ HOP-92 với giá trị IC50 = 0,176M sau 48 giờ và mạnh hơn thuốc đối chiếu dương tính etoposid là 85 lần [40]

Các acid amin mang khung isatin được thay thế 3-imino đã được nghiên cứu như chất ức chế kinase và cytotoxin Tuy nhiên, khi thay bằng các

nhóm imino kết hợp với valin và threonin (22a và 22b, hình 1.20) thì lại

không có hoạt tính trên CDK1/cyclin B, CDK5/p25 và GSK-3/protein kinase

[40] Ngược lại, các nhóm imino histidin (23a và 23b, hình 1.20) làm tăng

hoạt tính kinase và quá trình halogen hóa tiếp theo ở C5 trên khung isatin tạo

ra chất ức chế kinase mạnh, điều này thể hiện rõ trên 24b (mang nhóm thế

5-brom) ức chế CDK5/p25 kinase với IC50= 0,37 M đối với ung thư biểu mô vú

và dòng tế bào u nguyên bào thần kinh đệm người (SF-268) [40]

Hình 1.20 Công thức cấu tạo các isatin gắn acid amin [40]

Năm 2007, Vine và cộng sự đã tổng hợp một loạt các dẫn chất thế dibromoisatin (hình 1.21) Các nghiên cứu về mối liên quan cấu trúc - tác

N-5,7-dụng chỉ ra rằng sự thay thế một vòng thơm liên kết với một hoặc ba nguyên

tử carbon tại N1 tăng tương đối hoạt động của các dẫn chất này Trong số 24 chất được sàng lọc, 9 chất đã chứng minh tính chọn lọc cao đối với bệnh bạch cầu và tế bào lympho tuyến trên dòng tế bào ung thư biểu mô được thử

nghiệm Chất 5,7-dibromo -N- (p-methylbenzyl) isatin là hợp chất hoạt động

mạnh nhất, ức chế 50% các hoạt động trao đổi chất của hai dòng tế bào ung thư máu tại 0,49 µM Thời gian ủ được tăng từ 24h đến 72h làm cho các hợp chất này hoạt động mạnh hơn 10 lần so với các thuốc hóa trị liệu thông thường 5-fluorouracil (5 FU), paclitaxel và vinblastin trên tế bào ung thư U937 [41]

Hình 1.21 Công thức cấu tạo các chất N-5,7-dibromoisatin [41]

Năm 2011, tác giả Luo và cộng sự đã tổng hợp các 3-pyrrolo-indolin thế

và so sánh khả năng gây độc của chúng với sunitinib 5-Vinylsulfonyl indolin

như 25a-c (hình 1.22) đã được tìm thấy với các giá trị IC50 <10 mM chống lại

các tế bào A549, SQC-7901, ECA-109 và HCT-116 Trong đó chất 25b và 25e có tác dụng mạnh hơn chất đối chiếu dương tính sunitinib [42]

Hình 1.22 Công thức cấu tạo các chất 3-pyrrolo-indolinon thế [42]

1.2.3.2 Các nghiên cứu tác kháng ung thư của isatin ở trong nước

Hội nhập xu hướng nghiên cứu trên thế giới về khả năng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất isatin Năm 2008, Nguyễn Lê Hiên và cộng sự đã tổng hợp 10 dẫn chất 5-halogen isatin và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

trên in vitro với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư gan (Hep-2) và

tế bào ung thư màng tim (RD) Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 6 chất tổng

hợp (hình 1.23) đều gây độc cả 2 dòng tế bào ung thư thử nghiệm [43]

Hình 1.23 Công thức cấu tạo các chất 5-halogen isatin [43]

Từ những kết quả trên, Lê Đình Mạnh đã tổng hợp ba dẫn chất của

isatin ngưng tụ với thioxothiazolidin (32-34, hình 1.24) Các chất tổng hợp

được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên tế bào ung thư gan người 2) Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 3 hợp chất đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư thử nghiệm với nồng độ là 50µg/ml [44]

(Hep-Hình 1.24 Công thức cấu tạo các isatin ngưng tụ thioxothiazolidin [44]

Năm 2016, tác giả Nguyễn Thị Hồng Hạnh đã tổng hợp 8 chất

hydroxamic mang khung isatin (35a-h, hình 1.25) và đánh giá hoạt tính kháng

tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào ung thư người baogồm: SW620 (tế bào ung

thư đại tràng), PC-3 (tế bào ung thư tiền liệt tuyến), AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ) và NCI-H23 (tế bào ung thư phổi tế bào không nhỏ) Kết quả nghiên cứu cho thấy, 8 hợp chất này đều cho hoạt tính mạnh trên các tế bào ung thư thử nghiệm với IC50 dao động từ 1,15 đến 10,31µM Đặc biệt, dẫn chất 35d có tác dụng mạnh trên cả 4 dòng tế bào (IC50 = 1,33-1,61 µM), mạnh nhất trên 2

dòng tế bào ung thư SW620 và PC-3 Chất 35c tác dụng tốt nhất trên dòng ASPC-1, trong khi đó chất 35f tác dụng mạnh nhất trên NCI-H23 Các chất này

đều có hoạt tính mạnh gấp 3-4 lần so với chất đối chiếu dương tính SAHA Nghiên cứu về cơ chế tác dụng, các chất này được chứng minh gây độc tế bào ung thư với cơ chế ức chế enzym HDAC (histone deacetylase) [45]

Hình 1.25 Công thức cấu tạo các hydroxamic mang khung isatin [45]

Cũng trong thời gian này, nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Công Huân

và cộng sự tiến hành tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất isatin kiểu CA-4 (combrestastatin A4) đã phát hiện nhiều hợp chất có khả năng kháng tế bào ung thư người với hoạt tính mạnh Các chất 1-(3,4,5-

trimethoxybenzyl)indolin-2,3-dion (36a-g, 37a-c, hình 1.26) được tổng hợp

và đã tiến hành thử hoạt tính gây độc bào trên dòng tế bào 4 ung thư người:

SW620, PC-3, AsPC-1 và NCI-H23 [46] Trong số đó, chất có cấu trúc

5-bromo-1-(3,4,5-trimethoxybenzyl) indolin-2,3-dion] cho hoạt tính gây độc tế bào cao nhất (IC50 = 0,63-2,94 µg/ml) trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm Phân

tích chu trình tế bào và thử nghiệm in vitro đã phát hiện cơ chế kháng tế bào

ung thư được biết đến là ức chế trùng hợp tubulin [46], [47]

Hình 1.26 Công thức cấu tạo các isatin kiểu combretastatin A4 [45], [46]

1.3 Tình hình nghiên cứu các dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin kháng tế bào ung thư ở trong nước và quốc tế

1.3.1 Các nghiên cứu quốc tế

Các nghiên cứu về tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin chưa nhiều Đây cũng là hướng tiếp cận mới cho các nhà nghiên cứu phát triển thuốc ung thư hiện nay

Năm 2015, tám dẫn chất mới acylhydrazon mang khung isatin (38a–h,

hình 1.27) được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu của Ayman E và cộng sự [48]. Các chất này được đánh giá độc tính tế bào ung thư in vitro trên hai

dòng tế bào khối u người bao gồm tế bào ung thư gan người (HepG2) và tế bào ung thư bạch cầu (Jurkat) Nghiên cứu cho thấy, các chất 38a, 38c và 38e

có khả năng chống ung thư đầy hứa hẹn trên hai dòng tế bào khối u với giát trị

IC50 = 3-7μM, mạnh hơn 10-17 lần so với thuốc chống ung thư đối chiếu

5-FU (IC50 = 32–50μM) Trong số tám chất được thử nghiệm, chất 38a gây độc

mạnh tế bào ung thư bạch cầu (Jurkat) với giá trị IC50 = 3,14 μM, nhưng lại không có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư gan người [48]

Hình 1.27 Công thức cấu tạo các acylhydrazon mang khung isatin [48]

Hai năm sau đó, nhà khoa học Adel S và cộng sự đã thiết kế một loạt dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin lai hóa quinazolin và thử sàng lọc

ảo (hình 1.28) Kết quả nghiên cứu docking cho thấy, các dẫn chất thiết kế có tiềm năng kháng tế bào ung thư chọn lọc trên thụ thể tyrosin kinase [49]

Hình 1.28 Hướng thiết kế các acylhydrazon isatin lai hóa quinazolin [49]

Từ những kết quả docking khả quan, 19 hợp dẫn chất acylhydazon

mang khung isatin lai hóa (hình 1.29) đã được tổng hợp và thử hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và dòng tế bào ung thư đại tràng (LOVO) với 2 chất đối chiếu dương tính là 5-

FU và erlotinib Từ kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư, các

chất 39-43 và 47-52 thể hiện hoạt tính mạnh trên các tế bào ung thư vú người

(MDA-MB-231) và tế bào ung thư đại tràng (LOVO) với các giá trị

IC 50 tương ứng là 10,38–38,67 μM và 9,91–15,77 μM) Các chất này có hoạt

tính mạnh hơn nhiều lần so với chất đối chiếu dương tính 5-FU và erlotinib trên các tế bào được thử nghiệm (IC50 của 5-FU và erlotinib tương ứng trên 2 dòng tế bào thử nghiệm là 70,28 μM, 22,24 μM và 15,23 μM, 25,31 μM) Các

tác giả cũng đã chọn lọc chất 51 đem thử hoạt tính ức chế enzym EGFR-TK

và hoạt tính hoạt hóa quá trình apoptosis của tế bào Nhóm nghiên cứu thấy

rằng, ở nồng độ 10 μM, chất 51 thể hiện tác dụng ức chế hiệu quả đối với

EGFR-TK và gây ra quá trình apoptosis trong tế bào ung thư vú MDA-MB

-231 [49]

Hình 1.29 Công thức cấu tạo acylhydrazon isatin lai hóa quinazolin [49]

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc dựa trên mục tiêu phân tử vẫn là một mảng được khá ít nhóm nghiên cứu theo đuổi Nguyên nhân là việc thử nghiệm hoạt tính hoạt hóa hay kích hoạt các mục tiêu phân tử hầu hết vẫn chưa thể thực hiện trong nước mà phải dựa vào hợp tác quốc tế Theo chúng tôi được biết, với hướng nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thư của các dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin, chỉ có nhóm nghiên cứu của Trần Phương Thảo, Nguyễn Hải Nam thực hiện tại Việt Nam thu được một số kết quả khả quan Theo báo cáo của nhóm nghiên cứu năm

2019, bốn dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin đã được tổng hợp và thử

hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên ba dòng tế bào ung thư người: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) và ung thư phổi không tế bào nhỏ (NCI-H23) [50]

Hình 1.30 Công thức cấu tạo acylhydrazon isatin lai hóa benzoxazin [50]

Kết quả đánh giá khả năng ức chế sự phát triển trên 3 dòng tế bào ung

thư cho thấy hai chất 58a và 58b (hình 1.30) có khả năng ức chế sự phát triển

tế bào ở nồng độ 30 µg/mL và gây độc tế bào ung thư ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trên cả 3 dòng tế bào ung thư từ 14,84 µM đến 31,92 µM [50] Điều này càng củng cố vững chắc sự thành công trong định hướng những nghiên cứu về các dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin kháng tế bào ung

thư

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Sáu dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin được tổng hợp có công thức cấu tạo:

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Tổng hợp hóa học được thực hiện tại Bộ môn Hoá Dược - Kiểm nghiệm, Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Thái Bình

- Phổ IR, MS các chất được thực hiện tại Khoa Hóa - Trường Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Phổ 1H-NMR, 13C-NMR các mẫu chất được thực hiện tại Viện Hóa - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro được thực hiện tại

Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 01/2021 đến tháng 7/2021

2.2 Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu, hóa chất

Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong đề tài được nhập từ công ty Merk hoặc Trung Quốc đủ tinh khiết không phải tinh chế gì thêm Các

nguyên liệu và hóa chất chính dùng trong đề tài được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các nguyên liệu và hoá chất chính dùng trong đề tài

11 Natri hydrocacbonat (NaHCO3) Trung Quốc

13 Dicloromethan (CH2Cl2 – DCM) Trung Quốc

Các dòng tế bào ung thư người: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), PC-3 (tế bào ung thư tiền liệt tuyến), NCI-H23 (tế bào ung thư phổi) lấy từ từ ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc

2.2.2 Trang thiết bị

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 - 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, sinh hàn hồi lưu, ống đong, pipet, phễu thủy tinh, cốc có

mỏ các loại

- Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Camag bước sóng 254 nm và 366

nm, bản mỏng silicagel GF254 (Merck), pipet Gilson các loại 1000; 200; 20; 10; 2-20 µl

1 Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu Tủ lạnh, tủ sấy Memmert

- Máy cất quay Buchi R-210, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy: Melting point apparatus Smp3

- Máy đo phổ hồng ngoại: Agilent 660 FTIR, khoa Hóa học - Trường Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy sắc ký khối phổ: LC-MSD-Trap-SL, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific), khoa Hóa học - Trường Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia

Tổng hợp các chất 4a-f được dựa trên những nguyên tắc, phương pháp

cơ bản trong tổng hợp hữu cơ Các chất thiết kế trong đề tài được thực hiện tổng hợp qua 3 bước với sơ đồ phản ứng như sau:

Sơ đồ 2.1 Tổng hợp các dẫn chất acylhydrazon mang khung isatin (4a-f)

Các chất nghiên cứu được tổng hợp theo thứ tự các bước như sau:

Bước 1: Tổng hợp ethyl 1-(4-clorobenzyl)-1H-indol-3-carboxylat (2)

- Hòa tan chất 1 (ethyl 1H-indol-3-carboxylat) vào DMF trong bình cầu

đáy tròn dung tích 100 ml NaH vào dung dịch trên

- Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ 70°C hoặc nhiệt độ phòng trong 1 - 2 giờ

- Thêm KI rồi nhỏ từ từ dung dịch 1-(bromomethyl)-4-clorobenzen đã được hòa tan trong 1 ml DMF vào hỗn hợp phản ứng Khuấy trong 2-5 giờ ở nhiệt độ 80°C

- Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) với pha động là DCM : MeOH (20:1) (hoặc khảo sát hệ dung môi khác)

- Phản ứng xong, tiến hành xử lý phản ứng, tách sản phẩm ra khỏi hỗn hợp (Khảo sát theo tính chất của sản phẩm)

Bước 2: Tổng hợp các dẫn chất 1-(4-clorobenzyl)-1H-indol-3-carbohydrazid

- Hòa tan chất 2 vào trong 10 ml ethanol có sẵn trong bình cầu đáy tròn

dung tích 100 ml Thêm NH2OH vào dung dịch trên Hỗn hợp được khuấy đều và đun hồi lưu trong 40 phút

- Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động là DCM:MeOH = 20:1 (hoặc khảo sát hệ dung môi khác)