TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CAO NEEM TỪ LÁ CÂY NEEM ẤN ĐỘ BẰNG CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨ
TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
Giới thiệu về cây Neem
Ngành: Angiospermatophyta (ngành thực vật hạt kín)
Azadirachta indica là tên gọi khoa học của cây Neem, có nguồn gốc từ từ Azadarakth‑in Hindi trong tiếng Ba Tư, nghĩa là “Cây tự do của Ấn Độ” Năm 1830, nhà thực vật học Pháp Antoine Laurent de Jussieu đặt tên cây Neem là Melia azadirachta; sau đó ông đổi tên thành Azadirachta indica, phản ánh quá trình điều chỉnh tên gọi trong hệ thống phân loại thực vật.
Azadirachta indica A Juss Trong tiếng Sanskrit cây Neem có tên là Aristha nghĩa là
“Cây làm giảm bệnh tật” [25]
Trên thế giới, tên gọi của cây Neem khác nhau tùy vùng, với các biệt danh tiếng Anh như Neem tree, Indian lilac tree, Paradise tree, White cedar, nhưng "Neem tree" vẫn là tên gọi phổ biến nhất Ở Việt Nam, cây Neem thường được gọi là "xoan chịu hạn" để phân biệt với cây xoan ta (Melia azedarach).
Hình 1 1: Bộ phận của cây Neem
A.Nhánh thân Neem; B Lá Neem; C Hạt Neem chín; D Hạt Neem khô; E Nhân hạt Neem Cây Neem thích hợp với thời tiết nóng (nhiệt độ có thể lên tới 50 o C), mọc tốt ở đất cát cố định, đất cát pha sét
Cây Neem là một loại cây xanh quanh năm, có tán lá rộng và cao trung bình từ 13 đến 20 mét Ở những vùng khô hạn, cây trưởng thành có thể rụng lá trong một khoảng thời gian ngắn nhưng lá non sẽ mọc lại vào khoảng tháng 3–4 Trong điều kiện thuận lợi, cây có thể đạt chiều cao 35–40 mét, đường kính thân lên tới 3,5 mét, và hệ rễ ăn sâu.
1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố.
Nguồn gốc của cây Neem vẫn chưa được xác định chính xác cho đến nay Theo Gamble (1902), Neem có thể bắt nguồn từ các khu rừng ở Karnataka (Nam Ấn Độ) hoặc từ vùng rừng khô hạn nội địa Myanmar Tuy nhiên, nhiều nhà nghiên cứu khác cho rằng Neem bắt nguồn từ các khu rừng ở ngọn đồi Shivalik ở chân phía Tây dãy Himalaya hoặc từ bờ biển phía Đông miền Nam Ấn Độ Sự đa dạng về hình thái lá Neem và các đặc điểm hình thái khác đã dẫn đến thuyết của Schmutterer (1995).
A indica xuất phát từ thượng Myanmar, sau đó lan ra các cánh rừng Trung và Tây Á [35]
Neem phù hợp với khí hậu nóng và đã được di thực vào châu Phi từ đầu thế kỷ 20, nay được trồng rộng rãi ở Senegal, Ghana, Sudan, Mali, Nigeria và nhiều nước khác Trong thế kỷ 20, neem cũng được di thực đến các nước Trung và Nam Mỹ, đặc biệt được trồng nhiều ở Haiti, Cộng hòa Dominica và Nicaragua Ở châu Á, neem được trồng tại nhiều nước như Bangladesh, Myanmar, Cambodia, Ấn Độ, Sri Lanka, Indonesia, Iran, Malaysia, Nepal, Pakistan, Thái Lan, Yemen và Trung Quốc Tại Việt Nam, cây neem được trồng từ năm 1981.
1.1.4 Giá trị và công dụng
Neem được đánh giá cao nhờ các tính chất về sinh khối, dược lý và sát trùng Hàng thế kỷ nay, nông dân Ấn Độ đã dùng mọi bộ phận của cây Neem—quả, lá, dầu, vỏ và gỗ—làm thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu và phân bón Neem cũng có tác dụng cải tạo đất, phủ xanh đất trống và làm trong lành môi trường Ngoài giá trị môi trường, cây Neem mang lại giá trị kinh tế cao nhờ các ứng dụng đa dạng và nguồn nguyên liệu có thể khai thác trong y học cổ truyền, nông nghiệp và các sản phẩm từ cây.
Neem có tính dược liệu được ứng dụng từ lâu và vẫn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới thông qua các nghiên cứu về đặc tính của nó Nhiều báo cáo cho thấy Neem có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và kháng sinh rất tốt, cho thấy tiềm năng của nó trong các ứng dụng y học cổ truyền và hiện đại [37]
Bảng 1.1: Hoạt tính dược liệu các chất trong Neem
STT Tên chất Nguồn Hoạt tính sinh học
Chống viêm, chống viêm khớp, hạ sốt, giảm đường huyết, chống viêm dạ dày, chất diệt tinh trùng, chống nấm, chống khuẩn, lợi tiểu
2 Sodium nimbidate Hạt, dầu Chống viêm
3 Azadirachtin Hạt, dầu Chống vi khuẩn sốt rét
4 Nimbin Hạt, dầu Chất diệt tinh trùng
5 Nimbolide Hạt, dầu Chống sốt rét, chống vi khuẩn
6 Gedunin Hạt, dầu Chống sốt rét, chống nấm
7 Mahmoodin Hạt, dầu Chống vi khuẩn
Gallic acid, (-) epicatrchin và catechin
Vỏ cây Chống viêm, điều hòa hệ miễn dịch
Vỏ cây Chống vi khuẩn
10 Cyclic trisuphide và cyclic tetrasulphide Lá Chống nấm
G1B Vỏ cây Chống ung thư
13 NB-2-Peptidoglucan Vỏ cây Điều hòa hệ miễn dịch
Vỏ và lá Neem được ghi nhận có nhiều công dụng như cầm máu, bổ gan và trị đờm, đồng thời có báo cáo về tác dụng giảm stress và kiểm soát tỷ lệ sinh đẻ; tại Andhra Pradesh, nông dân cho gia súc ăn lá Neem sau sinh để tăng tiết sữa và giúp đàn gia súc khỏe mạnh; lá Neem còn được dùng để phòng trị giun sán cho gia súc và kiểm soát nhiều tác nhân gây bệnh khác; lá non được dùng làm rau ăn để bổ sung khoáng chất và phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột; ở Ấn Độ, dân gian thường dùng lá Neem để gần trẻ em nhằm ngăn ngừa bệnh ho gà.
Dầu Neem có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, giúp tiêu diệt các vi khuẩn gây mụn trong tế bào và ngăn ngừa sự hình thành mụn Vì thế dầu Neem đang được ưa chuộng như một liệu pháp tự nhiên trong chăm sóc da và điều trị mụn trứng cá Bạn có thể pha dầu Neem vào nền mỹ phẩm hoặc thoa trực tiếp lên da để hỗ trợ điều trị mụn trứng cá, mụn nhọt và mang lại làn da khỏe mạnh hơn.
Nhờ hoạt tính của dịch chiết lá Neem, lượng vi khuẩn và mảng bám trên men răng được giảm đi, từ đó giúp ngăn ngừa viêm răng và có thể pha trộn dịch chiết Neem vào kem đánh răng để sử dụng hàng ngày Neem cũng được bổ sung vào nhiều sản phẩm mỹ phẩm khác như dầu gội đầu, sữa tắm và xà phòng nhằm tăng khả năng diệt khuẩn và bảo vệ da, tóc và cơ thể.
Cây Neem không chỉ có hoạt tính sinh học đa dạng mà còn mang lại nhiều lợi ích thiết thực: che bóng mát, làm xanh môi trường, bảo vệ đất và chống xói mòn, đồng thời giảm bụi và cát bay Gỗ Neem có độ bền cao, ít bị mối mọt phá hại và được dùng để chế tác các sản phẩm mỹ nghệ chất lượng Vỏ Neem chứa nhiều tannin, phục vụ cho các ngành công nghiệp thuộc da và nhuộm, trong khi nhựa mủ của cây được dùng để sản xuất kẹo gum.
Các chất có hoạt tính sinh học trong cây Neem
Từ trước tới nay, các nhà khoa học đã khảo sát tính sát trùng ở hơn 2000 loài cây, và Neem nổi lên với kết quả đầy hứa hẹn Điều này xuất phát từ các hoạt chất trong Neem không chỉ tác động hiệu quả lên côn trùng mà còn tương đối an toàn với con người và động vật máu nóng Tính đến năm 2000, đã xác định được hơn 100 hoạt chất có hoạt tính sinh học từ Neem, và công thức cùng cấu tạo của chúng được làm rõ Những hoạt chất này chủ yếu thuộc hai nhóm chính là isoprenoid và các hợp chất không phải isoprenoid.
Isoprenoids (terpenes) include diterpenoids and triterpenoids and encompass compounds such as protomeliacin, limonoids, azadirone and its derivatives, gedunin and its derivatives, vilasinin-type compounds, and C-seco-meliacins—nimbin, salanin, and azadirachtin.
Non-isoprenoid: Gồm protein, amino acid, carbohydrate, hợp chất của lưu huỳnh, hợp chất polyphenolic như flavonoid, glycoside của chúng, dihydrochalcone, coumarin, tannins, chất béo,…
Trong các loại terpene thì tricyclic diterpene được tìm thấy nhiều nhất, đặc biệt là những chất có vòng C với nhóm chức của oxygen tại C-3 và C-7
Neem chứa các diterpene tricyclic với hoạt tính sinh học cao Đa số các tricyclic diterpene trong Neem được báo cáo có khả năng chống tế bào ung thư, đồng thời thể hiện kháng sinh và trừ sâu đáng kể Những đặc tính này làm nổi bật tiềm năng của Neem trong y học và nông nghiệp, được ghi nhận tại nguồn [26].
1.2.2 Triterpenoid (limonvgoid) Đây là những chất đắng trong Neem, thuộc dạng tetranortriterpenoid có khung apo-euphol (hoặc apo-tirucallol) Người ta đã tìm thấy khoảng 300 limonoid trong thực vật, 1/3 số đó có trong Azadirachta indica và Melia azedarach Nhóm triterpenoid này có thể phân thành 8 nhóm nhỏ: protomeliacin, limonoid với chuỗi bên xác định, azadirone và dẫn xuất, gedunin và dẫn xuất, vilasinin và 3 nhóm C- seco-meliacin là azadirachtin, nimbin, và salannin
Neem-derived protolimonoids feature an eight-carbon side chain at C-17, sometimes described as protolimonoid, protomelicin, or meliane The first compound melantriol was isolated from the fruit and Neem oil Nimbocinone, nimolinone, kulactone, limocinol, and limocinone are derivatives of euphol and tirucallol Azadirachtol, azadirachnol, and azaditol belong to the apo-chain Limocin A and Limocin B are limocinin, tetranortriterpenoids with a tetrahydrofuran side chain that is partly acetylated, and beta forms are noted.
Hình 1.3: Nhóm protomelicin Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ- hydroxybutenolid Đặc điểm của nhóm này là có chuỗi bên γ - hydroxybutenolid tại vị trí của vòng furan và 4 vòng furan còn nguyên vẹn.
Hình 1.4: Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ – hydroxybutenolid Nhóm azadirone và các hợp chất tương tự
Nhóm này bao gồm tất cả các hợp chất có khung triterpenoid nguyên, có cầu oxy tại vị trí C - 3 và C - 7
Hình 1.5: Azadirone Gedunin và các dẫn xuất
Hình 1.6: Gedunin và dẫn xuất Nhóm C- Secomeliacin Đây là một nhóm lớn chứa hầu hết các hợp chất quan trọng, chia làm 4 nhóm nhỏ hơn nữa là nimbin, salannin, C - Secomeliacin với chuỗi bên γ - hydroxybutenolid và azadirachtin
Nhóm azadirachtin là nhóm chính có hoạt tính gây ngán ăn cho côn trùng Morgan và Butterworth đã cô lập azadirachtin vào năm 1968, mở đường cho các nghiên cứu sau này Các đồng phân khác của azadirachtin sau đó được xác định bởi Siddiqui, Kraus, Ley và các cộng sự.
Bên cạnh các hợp chất isoprenoid, trong cây Neem còn chứa nhóm hợp chất không phải isoprenoid gồm các polyphenolic (flavonoid, flavonoglycoside, dihydrochalcone, tannin, coumarin), các hợp chất carbohydrate và protein, cùng với các hợp chất sulfur dễ bay hơi có hoạt tính mạnh đối với côn trùng.
Tác động của các hoạt chất trong cây Neem đối với các loài dịch hại
Các hoạt chất trong Neem tác động đến nhiều loài dịch hại theo những phương thức sau:
Neem chứa các hợp chất ngán ăn, khiến sâu ăn ít hoặc bỏ ăn đến chết Saxena (1986) nhận thấy mùi vị dầu Neem ở nồng độ 6% và 12% làm sâu N viresen bỏ ăn ngay lập tức Dịch chiết Neem chứa azadirachtin cũng gây bỏ ăn cho N viresen và thúc đẩy các hoạt động khác của sâu Khả năng ngán ăn do Neem gây liên quan tới một cơ quan cảm giác gây ức chế quá trình hấp thụ thức ăn Tác dụng ngán ăn của Neem phụ thuộc vào giống và tuổi của sâu bọ.
Xua đuổi: Theo Saxena (1995), tác dụng xua đuổi côn trùng của Neem đến từ sự có mặt của các hợp chất chứa lưu huỳnh dễ bay hơi trong Neem Dầu Neem và dịch chiết từ Neem thể hiện khả năng xua đuổi côn trùng rất mạnh, trong khi azadirachtin tinh khiết lại không có tác động này [13].
Diệt côn trùng: Hoạt chất trong Neem có tác dụng diệt côn trùng qua tiếp xúc và đường miệng Tuy tác động diệt côn trùng của các chất trong Neem không mạnh và nhanh như các thuốc hóa học khác, nhưng hiệu quả của Neem kéo dài Ức chế sự sinh trưởng và gây biến thái: Biểu hiện của tác động này là làm cho côn trùng giảm kích thước và trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển hoặc ngừng phát triển được Năm 1984, Heyde và cộng sự nhận thấy khi phun dịch chiết từ Neem ở nồng độ nhất định.
Ở nồng độ 500 ppm, trùng non rầy xanh (Cicadellidae) chỉ có khoảng 10%–28% chuyển sang giai đoạn trưởng thành, trong khi ở nồng độ cao hơn tất cả trùng non này chết trước khi trưởng thành [39] Các hợp chất trong dầu Neem ảnh hưởng đến quá trình sản xuất hormone giới tính và sự dẫn dụ, từ đó làm giảm quá trình ghép đôi giao phối của côn trùng Saxena (1995) nhận thấy dầu Neem ở các nồng độ 1, 2 và 5 μg có tác động lên hệ sinh sản và hành vi giao phối của côn trùng.
N lugens cái sản xuất ra tín hiệu sai lạc làm cho con đực không nhận ra nó vì vậy không ghép đôi giao phối được [39] Ảnh hưởng đến khả năng đẻ trứng và làm thối trứng: Các hoạt chất trong Neem tác động lên hệ nội tiết của côn trùng làm phân hủy các tế bào nuôi dưỡng phôi tạo tế bào trứng làm côn trùng không đẻ trứng hoặc khả năng đẻ trứng giảm Larew và Knodel
- Montz khi phun 0,4% dịch chiết nhân hạt Neem lên Trialeurodes vaporamorum thấy số lượng trứng giảm đi một phần tư [13; 39]
Cơ sở hóa học thuốc bảo vệ thực vật và công nghệ sản xuất thuốc bảo vệ thực vật
Thuốc bảo vệ thực vật là những hợp chất độc có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học được dùng để phòng trừ sâu bệnh, cỏ dại, chuột, nấm bệnh v.v… hại cây trồng
[9; 10; 17] Thuốc bảo vệ thực vật thường gồm những thành phần sau:
Hoạt chất là những chất có tác dụng diệt dịch hại Hoạt chất, còn gọi là sản phẩm kĩ thuật có nhiều dạng như dạng bột, kết tinh, lỏng nhão, khí, có các hàm lượng và độ tinh khiết khác nhau tùy thuộc vào công nghệ sản xuất.[9; 12; 14]
Chất mang hay chất làm loãng là các chất ở dạng rắn hoặc lỏng được thêm vào công thức thuốc để làm loãng hoạt chất chính mà không làm giảm hoạt tính sinh học của dược chất, từ đó hình thành dạng thuốc an toàn và tiện lợi cho người dùng Chúng đóng vai trò ổn định và phân tán hoạt chất, tối ưu tính chất vật lý và tương thích với các hệ thống bào chế, giúp cải thiện độ hấp thu và hiệu quả điều trị Việc lựa chọn chất mang phù hợp giúp đảm bảo an toàn, đồng nhất và thuận tiện khi sử dụng, đồng thời đáp ứng các yêu cầu sản xuất và quản lý chất lượng thuốc.
1.4.3 Chất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặt là nhóm hợp chất hóa học đặc biệt, khi hòa với nước sẽ hình thành một dung dịch không đồng nhất và đồng thời làm giảm sức căng bề mặt, tăng khả năng lan rộng, dính và thấm ướt của dung dịch phun [11; 29; 31].
Hàm lượng chất hoạt động bề mặt hoặc hỗn hợp của chúng trong các dạng thuốc từ 1 – 10%
1.4.4 Các chất phù trợ Đây là những chất phù trợ khi thêm vào để nâng cao hiệu lực của các chất độc (hoạt chất) Vai trò của chúng là cải thiện lí tính của các hoạt chất và các hợp chất hoạt động, bao gồm:
- Chất hợp lực làm tăng độ độc của thuốc
- Chất thấm ướt tăng sự phân tán
- Chất phân tán hấp phụ trên bề mặt của phân tử thuốc
- Chất hóa sữa tạo độ bền nhũ tương
- Chất nâng cao hoạt tính sinh học
- Chất chống lắng ngăn cản sự tách lớp và lắng đọng của các phần tử và giọt
- Chất tạo bọt và chất chống bọt
- Chất bảo quản ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật vào dạng gia công
- Chất tác động phối hợp có tác dụng gia tăng tác dụng của thuốc
- Các chất màu dùng để cảnh báo, ngăn ngừa ngộ độc thuốc hoặc để kiểm tra độ đồng đều của thuốc trước khi xử lí [5; 11]
1.4.5 Các dạng thuốc bảo vệ thực vật Đối với thuốc tổng hợp hóa học, hợp chất độc được tổng hợp ra còn chứa các phụ chất gọi là thuốc kĩ thuật Trong đó, thành phần thuốc nguyên chất hay hoạt chất là thành phần gây hiệu lực chính đối với sâu hại
Thuốc kỹ thuật, hay còn gọi là thuốc nguyên chất, cần được gia công thành các dạng thành phẩm (chế phẩm) khác nhau để sử dụng trong nông nghiệp Quá trình này cho phép thuốc bảo vệ thực vật được tối ưu hóa tính năng, dễ phân phối và ứng dụng ở các dạng bào chế như bột, dung dịch hoặc hạt Từ năm 1984, Hiệp hội CIPAC (Collaborative International Pesticides Analytical Council) đã đóng vai trò là diễn đàn hợp tác quốc tế về phân tích thuốc trừ sâu, thiết lập tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp phân tích nhằm bảo đảm an toàn và hiệu quả cho người dùng và môi trường.
Quy định thống nhất tên dạng thuốc bảo vệ thực vật gồm hai chữ cái biểu thị trạng thái vật lý và hướng sử dụng nhằm chuẩn hóa cách nhận diện và so sánh các chế phẩm trên thị trường [13] Các dạng chế phẩm phổ biến được dùng là dung dịch (lỏng), nhũ tương hoặc dung dịch cô đặc, bột (khô) và dạng hạt hoặc viên có thể áp dụng tùy mục đích bảo vệ thực vật.
- Thuốc dạng bột thấm nước
- Thuốc dạng dung dịch đậm đặc
1.4.6 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật
Dựa vào một số đặc điểm, thuốc bảo vệ thực vật được chia ra các nhóm sau:
- Theo con đường tác động
- Theo phương pháp xử lí
- Theo nguồn gốc hóa học
- Thuốc trừ sâu gốc thảo mộc.
Bảng 1.2: Các thương phẩm thuốc trừsâu từ Neem đang lưu hành trên thịtrường Việt
Tên thương phẩm Đối tượng phòng trừ Tổ chức xin đăng kí
Aza 0.15 % Sâu tơ hại cải bắp Magrow Pte Ltd
Rầy nâu, sâu cuốn lá hại lúa, sâu tơ, hại bắp cải, bọ cánh tơ hại chè
Trong nông nghiệp Việt Nam, các sâu hại chính tác động lên từng loại cây trồng gồm sâu cuốn lá hại lúa, sâu tơ hại rau họ thập tự, nhện đỏ hại cây có mùi, rầy bông hại nho, rệp hại thuốc lá và rầy xanh hại chè, gây thiệt hại về năng suất và chất lượng Việc nhận diện đúng từng loài sâu hại và hiểu đặc điểm sinh học của chúng là bước đầu để lên phương án phòng trừ hiệu quả Áp dụng quản lý dịch hại tổng hợp IPM, từ giám sát mật độ, dùng thiên địch, luân canh cây trồng cho đến phun thuốc bảo vệ thực vật đúng thời điểm, sẽ giúp bảo vệ lúa, rau, nho, thuốc lá và chè một cách bền vững Bài viết tóm tắt danh sách sâu hại chính và tác động của chúng lên các cây trồng phổ biến, cung cấp thông tin tham khảo hữu ích cho người trồng và nhà sản xuất để tối ưu chiến lược quản lý sâu hại.
Công ty TNHH nông dược Điện Bàn
EC (1000ppm) Sâu tơ hại bắp cải Rangsit Agri –
Neem Nim, Xoan, Xanh Green 0.15EC;
0.15EC: Ruồi đục lá cây bó xôi, rệp sáp hại cà phê, bọ cánh tơ hại chè, sâu tơ hại bắp cải, sâu xanh da láng hại cải bông
Doanh nghiệp tư nhân TM Tân Quy
0.03EC Sâu tơ hại rau
Rầy xanh hại chè, rệp hại rau
Công ty thuốc sát trùng Việt Nam
Công trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách và phối phẩm
Năm 1985, Robert O Larson cùng các cộng sự đã làm bền dịch chiết Neem để làm thuốc trừ sâu Hạt Neem khô xay nhuyễn có kích thước từ 350 micron đến 2 mm Dùng ethanol chiết ở vùng nhiệt độ từ 60 đến 90 o C, tách thu được dịch chiết ethanol chứa các hợp chất hoạt tính từ hạt Neem có khả năng diệt côn trùng và bảo vệ cây trồng.
Để tạo dạng nhũ chứa azadirachtin, bắt đầu từ dịch chiết có nồng độ 5–10 ppm, pha loãng bằng nước và thêm chất nhũ hóa để đạt nồng độ azadirachtin 2–4 ppm Kiểm tra và điều chỉnh độ pH về khoảng 3,5–6 Sản phẩm ở dạng nhũ được duy trì 80% chất lượng trong 8 tuần và vẫn giữ được hơn 50% hiệu quả sau 2 năm.
Trong nghiên cứu năm 1990, Lidert và cộng sự cho thấy dịch chiết từ hạt Neem sau quá trình hydrogenation có hoạt tính chống sâu bọ cao hơn so với dịch chiết không hydrogenation [43] Phương pháp chiết được tiến hành như sau: loại bỏ dầu Neem và các axit béo bằng dung môi không phân cực (petroleum ether, hexane hoặc heptane); sau đó chiết bằng dung môi phân cực hơn (ethanol, methanol hoặc hỗn hợp nước với các rượu này) để thu được dịch chiết có hoạt tính sinh học; cho dung môi ethyl acetate vào dịch chiết để loại bỏ đường và protein; cuối cùng thực hiện hydrogenation để thu được sản phẩm diệt côn trùng có hiệu quả và tác động lâu dài.
Trong chiết xuất trước khi hydrat hóa, hàm lượng azadirachtin thường ở mức 15–50% Khi áp dụng phương pháp hydrat hóa xúc tác, quá trình này được giám sát và tiếp tục cho đến khi nồng độ azadirachtin giảm xuống và chuyển thành dihydroazadirachtin hoặc tetrahydroazadirachtin Tỷ lệ phản ứng được sử dụng là 1–5 mol hydro cho mỗi mol azadirachtin [43].
Dung môi tối ưu cho chiết có thể là methanol, hoặc hỗn hợp methanol với nước, hoặc ethyl acetate; xúc tác tối ưu gồm palladium trên carbon (Pd/C), platinum oxide, nickel boride và Raney nickel Sự hydrat hóa nên được thực hiện ở áp suất hidro từ 1–60 atm và nhiệt độ 10–50°C Dịch chiết sau khi hydrat hóa ở điều kiện tối ưu chứa từ 15–50% dihydroazadirachtin, và dịch chiết hydrat hóa trong phát minh này cho thấy hoạt động trừ sâu tốt hơn so với dịch chiết thu được từ quá trình chiết ban đầu Thuốc trừ sâu này có phổ tác dụng rộng trên nhiều loài côn trùng thuộc Lepidoptera như Plutella, sâu bắp cải (loại nhập khẩu), cải bắp looper, budworm thuốc lá; Coleoptera như Colorado khoai bọ cánh cứng; Homoptera như rệp táo xanh, rệp màu xanh lá cây; và Homoptera như phễu lá khoai.
Liều lượng chiết xuất được tính dựa trên nồng độ của dihydroazadirachtin trong dịch chiết, thường ở mức 5–200 g/ha Công thức thuốc trừ sâu được xây dựng từ các thành phần như nước, chất phân tán, dung dịch tạo độ nhờn (oil-based solutions), chất phân tán dầu, bột nhão, bột khô, bột ướt, chất làm đặc nhũ, dạng flowables, nhũ tương và các phụ gia khác Với thành phần dihydroazadirachtin hoặc tetrahydroazadiractin, liều lượng sử dụng dao động từ 0.0001% đến 5%, tối ưu nên ở khoảng 0.001% đến 3%.
Vào năm 1995, Lidert và các cộng sự đã điều chế các chiết xuất có độ tinh khiết cao từ hạt Neem Ban đầu, hạt Neem được xay thành bột hoặc bánh dầu Neem được khuấy với nước, tạo hệ dung dịch hai pha và tách lấy pha nước Chất hấp thụ macroporous polymeric được dùng để thu được một phân đoạn giàu azadirachtin Giải hấp bằng dung môi cho azadirachtin thu được, cho ra một chiết xuất chứa trên 15% azadirachtin Chất hấp thụ macroporous polymeric có thể là một polymer của divinylbenzene, một copolymer của divinylbenzene/styrene, một polymer acrylic hoặc một copolymer phenol/formaldehyde Chất được chọn là polymer của divinylbenzene và dung môi giải hấp được chọn là ethyl acetate.
Năm 1998, ông Panchapagesa Muthuswamy Murali cùng các cộng sự đã xây dựng quá trình tạo ra một lượng giàu azadirachtin trong thành phần thuốc trừ sâu và làm bền sản phẩm Nhân hạt Neem đã được xay nhuyễn được chiết ngâm tối thiểu 3 lần với dung môi phân cực acetone/nước tỷ lệ 90:10 ở nhiệt độ tối ưu 80 o C Thu được dịch chiết qua lọc mà không có cặn bùn của hạt Neem Cho dichloromethane với lượng tương đương thể tích dịch chiết, chiết 3 lần và gom lấy dịch chiết dichloromethane Cho Na2SO4 vào để làm khan nước còn lẫn trong dịch chiết dichloromethane Sau đó, chưng cất dịch chiết trên để thu hồi dichloromethane, AZ thu được dùng cho phối chế sản phẩm [33] [34]
- Sau quá trình tinh chế để thu được azadirachtin với nồng độ cao, hòa tan nó trong hỗn hợp 2 dung môi ethanol: nước với các tỷ lệ 100 – 70 : 0 – 30 (v/v), để pha loãng nồng độ từ 20 – 40 ppm xuống 1 – 20 ppm azadirachtin ( m/v) Tạo nhũ của azadirachtin 0.2% tới 30% (v/v) với chất nhũ hóa ion và không độc - Tween 20 Thêm
20 – 50% dầu Neem vào hỗn hợp Điều chỉnh pH của dung dịch từ 3.5 đến 6 bằng dung dịch kiềm ammonia hydroxide [33] [34]
Thêm 1 - 2.5% tác nhân chống nắng của para-amino benzoic acid (PABA) hay ester của nó và 1% oleic acid Sau đó điều chỉnh lại pH để tạo ra sản phẩm bền vững Sản phẩm thu được duy trì được 65% hoạt tính sau hơn 2 năm [33] [34]
Năm 1991, Giáo sư Lâm Công Định đã viết một cuốn sách về cây Neem được nhập nội vào Việt Nam và công bố các nghiên cứu về điều kiện khí hậu, canh tác để phát triển loài cây này trên vùng đất cát nóng Tuy Phong – Bình Thuận [8].
Trong giai đoạn 1999 – 2000, Viện sinh học Nhiệt dới Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm dầu Neem lên sự phát triển của bọ hà khoai lang và kết quả cho thấy có hiệu lực phòng trừ tốt Bên cạnh đó viện đã nhân giống cây Neem bằng nuôi cấy mô [8].
Vào năm 2001, Dương Anh Tuấn và các cộng sự thuộc Viện Hóa Học - Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã nghiên cứu thành công quy trình chiết tách và tinh sạch azadirachtin từ nhân hạt Neem đồng thời thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn trên sâu khoang Kết quả cho thấy azadirachtin đạt độ tinh khiết 92%, hiệu suất chiết tách 0.054%, với liều 7.89 mg/cm^3 cho chỉ số gây ngán ăn trung bình 71.54%, và đạt 87% ở liều 15.6 mg/cm^3 [3].
Năm 2003, Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng đã chiết xuất, tinh sạch và xác định hàm lượng azadirachtin và salanin trong nhân hạt Neem
Vào năm 2003, Vũ Đăng Khánh đã khảo sát hoạt tính kháng nấm của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem trồng ở Việt Nam đối với một số loài nấm gây bệnh và nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxins.
Trong năm 2004, ThS Lê Thị Thanh Phượng đã chiết xuất các hoạt chất sinh học từ hạt Neem và khảo sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephalonica St.) Nghiên cứu này nhằm làm rõ khả năng ứng dụng của các hợp chất Neem trong quản lý sinh học sâu hại ngài gạo, từ đó mở rộng các phương án kiểm soát dịch hại an toàn và hiệu quả.
Phương pháp thử hoạt tính khuẩn
Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn theo Hadacek et al (2000) là một chuẩn mực đánh giá khả năng kháng khuẩn của một mẫu bằng hệ thống đĩa thí nghiệm Chủng vi khuẩn được kích hoạt và nuôi cấy trên môi trường phù hợp để đảm bảo sinh trưởng và nhạy cảm với chất thử Một mẫu vi sinh được chuẩn bị và đặt lên bề mặt đĩa nuôi cấy chứa môi trường chuẩn, nhằm quan sát sự phát triển của vi khuẩn quanh mẫu để xác định mức độ ức chế Kết quả được diễn giải dựa trên sự hiện diện của vùng ức chế hoặc sự giảm tăng trưởng quanh khu vực tiếp xúc với chất thử, từ đó đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của thành phần được khảo sát.
Trong nghiên cứu này, chất thử được chuẩn bị ở các nồng độ yêu cầu bằng cách hòa tan trong một dung môi phù hợp Đối chứng dương là các dung dịch kháng sinh tiêu biểu và đối chứng âm là dung môi Hoạt tính ức chế vi khuẩn được đánh giá bằng bán kính vòng ức chế (BK) theo phương pháp khuếch tán vòng trên thạch, BK được tính bằng BK = D − d, với D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính lỗ khoan Thí nghiệm được lặp lại ba lần và giá trị bán kính trung bình được báo cáo.
Staphylococcus aureus là một tụ cầu khuẩn gây mủ nhọt và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác, được phát hiện và phân lập từ mủ ung nhọt vào cuối thế kỷ 19 Các nhà khoa học nổi tiếng như Robert Koch và Louis Pasteur đã tham gia nghiên cứu về tụ cầu khuẩn và các vi khuẩn khác từ thời kỳ đầu của vi sinh vật học, đánh dấu những bước đi quan trọng cho sự hình thành của ngành vi sinh vật học hiện đại.
Staphylococcus là nhóm cầu khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào, thường không có vỏ và có hình cầu; tên gọi bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho, phản ánh đặc điểm tập hợp thành cụm như chùm nho khi vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm, các vi khuẩn này có thể đứng lẻ, ghép thành đôi hoặc thành đám nhỏ, với đường kính khoảng 0,8–1 µm.
Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người
Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò trong y học:
- Staphylococcus aureus (S aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh
- Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da)
Staphylococcus aureus phát triển ở môi trường thông thường và có thể không chịu được nhiệt độ quá thấp; nhiệt độ sinh trưởng tối ưu được xác định từ 18–40°C với pH khoảng 7,2, và nó cho thấy sự phát triển tốt nhất quanh 25°C Vi khuẩn có thể phát triển ở cả điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, và thường gây đục môi trường ở môi trường lỏng Trên môi trường đặc, khuẩn lạc có hình tròn, lồi, bóng láng và óng ánh, màu vàng đậm, vàng cam hoặc trắng, kích thước tương đối lớn Ngoài ra, S aureus có thể sinh trưởng ở những môi trường có độ hoạt động nước thấp hoặc ở nồng độ muối cao, vượt trội so với nhiều vi khuẩn khác.
Khi được nuôi cấy trong môi trường, vi khuẩn có thể hình thành sắc tố vàng sau 1–2 ngày ở nhiệt độ phòng và đồng thời tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15°C, với mức tăng trưởng tối đa ở 35–37°C.
Staphylococcus aureus có mặt ở nhiều môi trường sống và thường tồn tại ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh khi xâm nhập hoặc xuyên qua da Khi Staphylococcus aureus xâm nhập vào cơ thể, nó có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, từ nhiễm trùng da, loét và phỏng da đến nhiễm trùng nghiêm trọng ở máu, phổi hoặc các mô khác.
Tính chất sinh hoá và đề kháng
Staphylococcus aureus, hay tụ cầu vàng, có khả năng tương đối chịu nhiệt và kháng lại nhiều thuốc sát khuẩn hơn các vi khuẩn khác Tụ cầu vàng chịu được khô hạn và có thể tồn tại ở môi trường có nồng độ NaCl cao, lên tới 9% Nhiều chủng tụ cầu vàng còn kháng penicillin và nhiều kháng sinh khác, tạo thách thức lớn trong việc điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn.
S aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA Tất cả các dòng S aureus đều mẫn cảm với novobiocine
Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở vách tế bào
Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide và kháng nguyên protein A ở bề mặt, cho phép phân loại tụ cầu thành các nhóm dựa trên kháng nguyên Tuy nhiên, phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn, nên các xét nghiệm huyết thanh ít được áp dụng cho mục đích này Độc tố và enzym do tụ cầu sản xuất là các yếu tố liên quan đến cơ chế gây bệnh và độc lực, được xem xét trong nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng.
Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng nằm ở sự phát triển nhanh và lan rộng của vi khuẩn trong mô, đồng thời sản sinh nhiều độc tố và enzyme Một số chủng của S aureus có khả năng tổng hợp enterotoxin khi nhiễm vào thực phẩm Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15 ℃, cho thấy nguy cơ ngộ độc thực phẩm ở nhiệt độ phòng và điều kiện bảo quản Độc tố ruột (enterotoxin) do S aureus sản xuất là một protein ổn định với nhiệt, sản xuất nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35–37 ℃ và có thể tồn tại ở nhiệt độ lên tới 100 ℃ trong vòng 30–700 phút.
- Protease phân giải protein của tế bào chủ
- Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME)
Theo phân loại của Bergey D.G (1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống Pseudomonas và họ Pseudomonadaceae; dựa vào sự tương đồng rARN/ADN và những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92 loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong 12 loài có liên quan nhiều đến y học.
Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực
Có pili, không bào tử
Hình 1.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi
Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá
Có khả năng đề kháng kháng sinh cao
Kháng nguyên liên kết với tế bào:
- Protein màng ngoài: Các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh
- Polysaccharide ngoại tiết: cCó 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những chủng P aeruginosacó khuẩn lạc dạng M và dạng R
Kháng nguyên ngoại bào của vi khuẩn là tập hợp các chất chuyển hoá được tiết vào môi trường, bao gồm protease, elastase, exotoxin A, glycocalyx và hemolysin, vừa là yếu tố độc lực vừa là kháng nguyên được nghiên cứu để chế tạo vaccine kích thích miễn dịch Việc khai thác các kháng nguyên này không chỉ giúp hiểu rõ cơ chế gây độc mà còn mở đường cho phát triển các vaccine hiệu quả nhằm bảo vệ cơ thể trước các tác nhân gây bệnh Nhờ đó, các kháng nguyên ngoại bào trở thành nền tảng cho chiến lược miễn dịch và các công nghệ tiêm chủng hiện đại.
Phân loại trực khuẩn mủ xanh
Việc xác định type của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa có ý nghĩa quan trọng trong phân loại, đánh giá tính phổ biến và sự phân bố theo địa dư và loại bệnh, từ đó làm cơ sở nghiên cứu chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị nhiễm khuẩn do P aeruginosa Mặt khác, các phương pháp xác định type còn đóng vai trò thiết yếu trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm của vi khuẩn này Những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90–95% số chủng P aeruginosa Theo Ủy ban Phân loại Quốc tế, việc định kháng nguyên O (serotype) chia P aeruginosa thành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16).
Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết
Ho ạ t tính kháng oxi hóa c ủ a cao Neem [21]
Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity) khác dựa theo mô hình phospho molybdenum bằng phép đo quang phổ trên cơ sở việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức chất atacidic photphat/Mo (V) màu xanh lá cây Phương pháp này đã được tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa
Phương pháp được chọn phù hợp với quy mô và trang thiết bị của phòng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa–Vũng Tàu, nên chúng tôi quyết định áp dụng phương pháp này để xác định lực kháng oxy hóa của cao Neem Việc sử dụng phương pháp tương thích với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm giúp đảm bảo độ chính xác và tính lặp lại của kết quả, từ đó cung cấp đánh giá đáng tin cậy về khả năng chống oxi hóa của cao Neem và hỗ trợ các phân tích liên quan đến thành phần hoạt chất.
Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem
1.9.1 Phương pháp định tính bằng các phản ứng và thuốc thử
1.9.1.2 Định tính Steroid – triterpenoid Đặc điểm:Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat Sterol thuộc nhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β – sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…) Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp vớ i lipid, carotene, lecitin Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn
Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:
Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính
Thuốc thử Salkowski: H 2 SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính
Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:
- Vanilin 1% ethanol 2 giọt, 10 mlnước cất
- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất
Nếu có Alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt
1.9.1.3 Định tính Alkaloid Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform,… Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine) Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…)
Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc
Một số thuốc thử Alkaloid:
- Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nước cất
- Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất
- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu
1.9.1.4 Định tính Flavonoid Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều màu cho rau, quả, hoa, Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6 Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng
A, còn vòng B đánh số phụ.
Nếu dây C 3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A
Một số thuốc thử Flavnoid:
Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính
Với dung dịch H2SO4 đậm đặc, màu sắc có thể xuất hiện từ vàng đậm đến cam hoặc từ đỏ đến xanh dương, tùy thuộc vào loại hợp chất đi kèm và mức độ tương tác của chúng với axit; sự thay đổi màu sắc này phản ánh tính chất của hợp chất và được sử dụng trong nhận diện, phân tích hóa học.
1.9.1.5 Định tính saponin Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid
Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin
Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao
Để xác định độ tạo bọt, bài viết trình bày quy trình chuẩn sau: cân 1 g bột nguyên liệu cho vào Erlenmeyer 500 mL có sẵn 100 mL nước sôi, đun sôi thêm 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cất đổ đến 100 mL Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm, cho lần lượt 1–10 mL dịch lọc vào từng ống, rồi thêm nước cất vào mỗi ống để đủ 10 mL Bịt miệng ống nghiệm và lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, mỗi giây 2 lần Để yên 15 phút, sau đó xác định ống nghiệm có chiều cao 1 cm Chỉ số tạo bọt được tính theo công thức đã cho.
CSB: Chỉ số tạo bọt i: Ống nhiệm thứ i có bọt cao trên 1 cm
Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1 cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin
Lấy 2 ml dịch chiết được xử lý bằng 2 giọt dung dịch α – Naphthol có cồn trong ống nghiệm và sau đó 1 ml axit sunfuric đậm đặc được thêm cẩn thận dọc theo hai bên thành ống nghiệm
Nếu lớp giữa xuất hiện màu tím cho thấy có sự hiện diện của Cacbonhyđrat.
1.9.2 Phương pháp phân tích trọnglượng
Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hoặc ở dạng đơn chất có trong mẫu cần phân tích Qua quá trình tách, tinh sạch và cân chính xác chất thu được, kỹ thuật này cho phép xác định khối lượng của chất phân tích và từ đó suy ra hàm lượng hay nồng độ của nó trong mẫu Đây là kỹ thuật có độ chính xác cao, thường được ứng dụng trong hóa phân tích và luyện kim khi cần kết quả tuyệt đối dựa trên cân đo trọng lượng cuối cùng.
Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng bao gồm các giai đoạn sau:
- Chọn mẫu và gia công mẫu
Trong phân tích hóa học, việc tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các hợp phần của nó khỏi sản phẩm phân tích ở trạng thái tinh khiết thường gặp khó khăn và đôi khi không thể thực hiện được Vì vậy chất cần xác định thường được tách ra thành kết tủa dưới dạng hợp chất có thành phần xác định Đây được thực hiện bằng cách đưa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm cách tách chất nghiên cứu khỏi dung dịch.
- Xử lý sản phẩm đã tách bằng biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy,…) rồi đem cân để tính kết quả
Dù mất nhiều thời gian thực hiện, phương pháp này có độ chính xác cao và được dùng để xác định hàm lượng của các chất như kim loại, phi kim, thành phần của quặng, silicat và hợp chất hữu cơ Nhờ độ nhạy và ổn định cao, nó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích chất lượng và nghiên cứu vật liệu, giúp xác định thành phần và hàm lượng một cách đáng tin cậy.
1.9.3 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Phương pháp GC-MS (gas chromatography–mass spectrometry) là một trong những kỹ thuật sắc ký hiện đại nhất hiện nay, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Bản chất của GC-MS là sự kết hợp của sắc ký khí và khối phổ, cho phép tách, nhận diện và định lượng các hợp chất phức tạp trong mẫu một cách chính xác.
Sắc ký khí (GC) là kỹ thuật phân tích các hỗn hợp chất để nhận diện chất cần phân tích Trong GC, thành phần hỗn hợp tương tác với pha động và pha tĩnh theo các mức độ khác nhau, khiến quá trình phân tách diễn ra với hiệu quả cao Các hợp chất có tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước, còn các hợp chất tương tác chậm hơn sẽ ra khỏi cột sau; đây là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh Quá trình phân tách có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc áp suất của pha động.
Khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích của các ion, được thực hiện bằng thiết bị khối phổ kế Ưu điểm của GC–MS là yêu cầu lượng mẫu rất nhỏ (khoảng 1–5 µL), ngưỡng phát hiện tới 1 picogram và cho kết quả nhanh chóng, thường từ 1–100 phút Nhờ đó GC–MS được ứng dụng rộng rãi để phân tách, định lượng và nhận dạng các chất trong mẫu.
Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động
Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống ở cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí
Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt nhiệt độ của lò này dao động từ 40 – 320 o C
Trong hệ thống GC, một cuộn ống hình trụ nhỏ dài khoảng 30 mét được lắp đặt và bề mặt bên trong của ống được tráng bằng một lớp polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách khi chúng di chuyển dọc theo cột nhờ sự tương tác khác nhau với lớp phủ polymer, giúp các thành phần riêng biệt được phát hiện và phân tích Hiệu quả phân tách phụ thuộc vào đặc tính của cột và điều kiện vận hành như nhiệt độ và tốc độ lưu của khí mang mẫu, cho phép GC phân tích nhanh và nhạy các hợp chất hữu cơ.
Quá trình phân tích bắt đầu bằng việc mẫu đi qua cột sắc ký khí, các hợp chất tiếp tục vào pha khối phổ và được ion hóa Sau khi ion hóa, các ion đi qua bộ lọc dựa trên khối lượng, nơi chỉ những ion có khối lượng nằm trong giới hạn cho phép mới được truyền qua Cảm biến đếm số lượng ion có cùng khối lượng và dữ liệu này được chuyển về máy tính để tạo ra kết quả gọi là khối phổ Khối phổ là một đồ thị phản ánh số lượng ion ở các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc, cung cấp thông tin định lượng và định tính cho phân tích hóa học.
THỰC NGHIỆM
Địa điểm và nguyên vật liệu
Phòng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu (cơ sở 3), 951 Bình Giã, phường Rạch Dừa, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu
Trong nghiên cứu này, nguyên liệu chủ lực để chiết là lá Neem (Azadirachta indica) có nguồn gốc từ Ấn Độ Lá Neem được mua từ Công ty Thảo dược An Quốc Thái, địa chỉ phường 11, quận Tân Bình, thành phố Hồ Chí Minh, đảm bảo nguồn gốc và chất lượng phục vụ cho quá trình chiết và phân tích.
Hình 2 1: Lá Neem tươi Hình 2.2: Lá Neem khô
2.1.3 Dụng cụ - thiết bị và hóa chất
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ và hóa chất được liệt kê như sau:
- Bình cầu 1 cổ, 2 cổ (250ml, 500ml)
- Ống đong (5ml, 10ml, 250ml, 500ml)
- Máy chiết cô chân không tuần hoàn
- Cân phân tích, cân kĩ thuật
- Máy quang phổ UV - Vis Perkin Elmer
- Máy sắc khí phổ GC/MS
- Máy sắc khí phổ LC/MS
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Lý thuyết Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau:
Quá trình quan sát và thu thập thông tin, dữ liệu liên quan đến cách mô tả hình thái của cây Neem được thực hiện nhằm làm căn cứ nhận diện chính xác Dựa trên các tài liệu tham khảo, các đặc điểm hình thái như lá, hoa, quả, cành và vỏ được phân tích để bước đầu xác định tên khoa học của cây Neem là Azadirachta indica.
Tiến hành chiết xuất cao Neem bằng phương pháp Soxhlet và ngâm dầm với hai điều kiện khảo sát chính là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết Nguyên liệu Neem được làm sạch và chuẩn bị, sau đó tiến hành chiết bằng Soxhlet với các mức tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khác nhau để khảo sát ảnh hưởng lên nồng độ hoạt chất và chất lượng cao Neem thu được, đồng thời quá trình ngâm dầm được thực hiện ở các thời gian khác nhau nhằm tối ưu hoá khả năng giải phóng các thành phần sinh học từ mẫu Kết quả cho thấy cả tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết tác động đáng kể đến hiệu quả chiết và chất lượng sản phẩm, từ đó xác định được điều kiện tối ưu cho quy trình nhằm đảm bảo cao Neem có hàm lượng hoạt chất cao và chi phí sản xuất hợp lý.
- Tiến hành định tính thành phần hóa học chính trong cao Neem dựa trên kết quả các bài nghiên cứu khoa học khác, nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS, LC/MS
Lá Neem sau khi mua chúng tôi cắt nhỏ (kích thước 1 x 2 cm), sau đó tiến hành chiết tách dịch chiết bằng hai phương pháp sau:
- Ngâm dầm với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian
- Chiết tách bằng Soxhlet với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian
Sau khi chiết tách theo hai phương pháp trên thì thu được dung dịch chiết, đem dịch chiết đi cô quay chân không đến khi đuổi hết dung môi sẽ thu được sản phẩm ở dạng cao
Gửi mẫu cao Neem đi phân tích bằng GC-MS và LC-MS để xác định thành phần và cấu trúc hợp chất; thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao Neem, thực hiện thử nghiệm trên sâu để đánh giá tác động sinh học; đồng thời thực hiện định tính các hợp chất và đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao Neem.
2.2.3 Quy trình chiết tách dịch chiết lá Neem
Từ các công trình nghiên cứu trước đây chúng tôi tiến hành chiết tách cao lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp chiết tách bằng hệ thống soxhlet với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau
Bảng 2 1: Độ phân cực và nhiệt độ sôi của các hệ dung môi khác nhau Độ phân cực (δP) Nhiệt độ sôi ( o C)
2.2.3.1 Quy trình chiết tách lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm
Sơ đồ 2 1: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm
- Bước 1: Lá Neem cắt nhỏ rồi cân chính xác 15 g (± 0,1g) Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm)
- Bước 2: Lấy 300 ml dung môi (Hexan, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol 96 o , Methanol, Nước) cho vào bình 1000 ml và ngâm trong 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày
- Bước 3: Lọc và thu được dịch chiết đem cô quay đến khi cạn hết dung môi Sau đó đem bảo quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút cao su, bảo quản trong tủ lạnh.
- Bước 4: Lấy mẫu cao chiết đi phân tích GC/MS, LC/MS để xác định thành phần
Dung môi Thời gian (1, 3, 5, 7 ngày)
Gửi mẫu phân tích LC/MS – GC/MS Định tính Hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng chống oxi hóa
Xử lý nguyên liệu hóa học và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa
2.2.3.2 Quy trình chiết xuất lá Neem bằng hệ thống Soxhlet
Sơ đồ 2.2: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng Soxhlet Thuyết minh quy trình
- Bước 1: Lá Neem cắt nhỏ rồi cân chính xác 15 g (± 0,1g) Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm)
Bước 3: Thu được dịch chiết và cô quay cho đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn Lưu trữ cao chiết trong lọ có dung tích khoảng 5–10 ml, đậy kín bằng nút cao su và bảo quản trong tủ lạnh.
- Bước 4: Lấy mẫu cao chiết đi phân tích GC/MS, LC/MS để xác định thành phần
Dịch lá Neem Cao lá Neem
Gửi mẫu phân tích LC/MS – GC/MS Định tính Hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng chống oxi hóa hóa học và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.
Mô hình chi ế t tách th ự c nghi ệ m t ạ i phòng thí nghi ệ m
Hình 2.3: Mô hình ngâm dầm
Phương pháp cô quay chân không tuần hoàn
Máy cô quay chân không hoạt động dựa trên nguyên tắc nhiệt độ sôi thay đổi theo áp suất: khi giảm áp suất thì nhiệt độ sôi của chất lỏng cũng giảm, do đó dung dịch sẽ bắt đầu sôi khi nhiệt độ sôi xuống dưới nhiệt độ của bể gia nhiệt Bình chứa mẫu dung dịch được ngập trong bể gia nhiệt và nước trong bể được gia nhiệt đến nhiệt độ xác định Bơm chân không hút không khí khỏi bình chứa mẫu để làm áp suất bên trong giảm; khi áp suất giảm, nhiệt độ sôi của dung dịch sẽ giảm xuống và tới khi thấp hơn nhiệt độ của bể thì dung dịch sẽ sôi Trong suốt quá trình, bình chứa dung dịch được quay tròn liên tục nhằm tăng diện tích tiếp xúc với nguồn nhiệt và phân bố nhiệt đều, tránh hiện tượng quá nhiệt cục bộ Hơi dung môi thoát ra khỏi bình cầu được làm lạnh trong hệ thống làm lạnh và thu hồi về bình thu dung môi.
Xác định thành phần hóa học từ cao lá Neem bằng phương pháp GC/MS, LC/MS
Dịch chiết lá Neem được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được chất rắn dạng cao Gửi mẫu rắn này đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp Hồ Chí Minh).
Kh ảo sát các điề u ki ệ n ảnh hưởng đế n quá trình chi ế t
2.6.1 Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết
Thời gian chiết có vai trò quyết định lượng cao Neem thu hồi Nếu thời gian quá ngắn thì lượng cao Neem thu được chưa hoàn toàn, ngược lại khi chiết quá lâu vừa tốn thời gian, tổn hao năng lượng và nghiêm trọng hơn là chất lượng cao Neem bị ảnh hưởng
- Các dung môi: Cồn 96 o , methanol, ethyl axetate, chloroform, hexan, nước.
- Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 15:1
- Khảo sát các thông số thời gian ngâm 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày Khảo sát thời gian chiết tách bằng soxhlet 4 giờ, 6 giờ, 10 giờ, 12 giờ
2.6.2 Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu
Nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu không phù hợp thì lượng cao Neem thu được chưa hoàn toàn hoặc gây tổn hao năng lượng vì dung môi quá nhiều
Khảo sát các thông số tỉ lệ dung môi/nguyên liệu gồm 10:1; 15:1; 20:1; 25:1.
Đị nh tính m ộ t s ố h ợ p ch ấ t có trong lá Neem
Theo Puri H S (1999) trong cây Neem còn chứa các hợp chất khác như: flavonoid, coumarin saponin flavonoglycoside, dihydrochalcon, cacbonhydrat, triterpenoid và steroid, tannin, alkaloid [39]
Với dung dịch FeCl 3 bão hòa: nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá Neem, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Với dung dịch axit sulfuric đặc, các hợp chất khác nhau khi được thử nghiệm sẽ cho ra màu sắc khác nhau Màu có thể biến đổi từ vàng đậm đến cam hoặc từ đỏ đến xanh dương, tùy thuộc vào đặc tính của từng chất tham gia phản ứng Do đó, sự biến đổi màu sắc này có thể giúp nhận diện và phân tích nhanh các loại hợp chất trong thí nghiệm hóa học.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá Neem, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút
Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl 2 trong 60 mL nước cất
Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 mL nước cất
Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 mL nước cất
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết lá Neem sau đó cho từ từ thuốc thử theo thành ống nghiệm để yên, quan sát
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết lá Neem, nghiên ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát
2.7.3 Định tính saponin Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
- Ống 1: 5 mL HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dịch chiết lá Neem
Trong ống 2, trộn 5 mL NaOH 0,1 N (pH 13) với 3 giọt dịch chiết lá Neem Bịt kín miệng ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 60 giây và để yên, sau đó quan sát chiều cao của cột bọt ở cả hai ống nghiệm.
- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid
- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid
Lấy 2 ml dịch chiết lá Neem được xử lý bằng 2 giọt dung dịch α – Naphthol có cồn trong ống nghiệm và sau đó 1 ml axit sunfuricđậm đặc được thêm cẩn thận dọc theo hai bên thành ống nghiệm
Nếu lớp giữa xuất hiện màu tím cho thấy có sự hiện diện của Cacbonhyđrat
Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính
Thực nghiệm: Lấy 1 mL dịch chiết lá Neem cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm
Nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính
Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:
Thực nghiệm: Lấy 1 mL dịch dịch chiết lá Neem, thêm 2 giọt vaninlin 1% ethanol,
Phản ứng dương tính khi dung dịch đổi sang màu xanh tím hoặc xanh lục.
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Neem
Khuẩn gốc được cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh trường Đại học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh
Kỹ thuật pha chếmôi trường nuôi cấy
- Cách pha chế: đun trong bể điều nhiệt trong 2 giờ, ở 50 o C, lọc Sau đó hấp 15 phút ở 121 o C
Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)
Cách pha chế dung dịch: Cân đo đúng khối lượng các thành phần đã cho và làm đầy thể tích lên 500 ml Sau đó đun sôi để hòa tan hoàn toàn các chất, điều chỉnh pH ở mức 7,4–7,6 và tiến hành hấp để hoàn tất quá trình.
121 o C/15 phút, sau đó để nguội 45 – 50 o C đổ 20 ml/đĩa
Môi trường thạch dinh dưỡng
Đoạn này trình bày nguyên lý nền tảng cho pha chế môi trường nuôi cấy và chuẩn bị mẫu vi sinh, nhấn mạnh việc hòa tan đầy đủ các thành phần và điều chỉnh độ pH ở mức gần trung tính để đảm bảo hoạt tính của môi trường Quy trình được thực hiện bằng cách phân phối dung dịch vào các ống chứa và tiệt trùng ở điều kiện phù hợp để đảm bảo an toàn và tính lặp lại của kết quả Độ đục chuẩn (Farland) được dùng làm tham chiếu để hiệu chuẩn các phép đo khi pha loãng dịch vi khuẩn, giúp kiểm soát độ đặc và độ ổn định của mẫu Bài viết cũng đề cập đến cách pha các dung dịch chuẩn và vai trò của các chất hoá học trong quá trình chuẩn hóa, đồng thời nhấn mạnh yếu tố an toàn và quản trị phòng thí nghiệm trong nghiên cứu vi sinh.
Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:
Cao lá Neem được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với:
- 800 mg/ml: 0.8 g cao lá Neem + 1 ml DMSO 5%;
- 400 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 800 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;
- 200 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 400 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;
- 100 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 200 mg/ml + 1 ml DMSO 5%
Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng dương là Ampiciline và Tetracycline
(1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng
Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn được thu nhận sẽ được cấy ria lên môi trường thạch dinh dưỡng MHA và ủ ở 37 o C từ 16 đến 24 giờ để xác định các khuẩn lạc đặc trưng Sau khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm, chúng được nuôi tăng sinh trong môi trường lỏng TSB, ủ ở 37 o C và khuấy ở 100 rpm trong 10–12 giờ Quá trình nuôi khiến môi trường trở nên đục do sự tăng sinh của vi sinh vật.
Vi khuẩn sau khi nuôi được tách khỏi môi trường nuôi bằng ly tâm, sau đó được rửa bằng nước cất vô trùng để loại bỏ phần môi trường sống Huyền phù vi khuẩn được chuẩn hóa về độ đục theo chuẩn McFarland để đảm bảo tính đồng nhất của mẫu trước khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Huyền phù chuẩn này được sử dụng để đánh giá khả năng kháng khuẩn của các tác nhân thử nghiệm.
Dựng micropipet hỳt 100 àl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 10 8 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt Đánh số cho đĩa petri từ 1 đến 7 Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào cao Neem đã được pha theo từng nồng độ lần lượt là 800, 400, 200, 100 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 800 mg/ml; số 2: 400 mg/ml; số 3: 200 mg/ml; số 4: 100 mg/ml), đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline và Ampiciline được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6: Ampiciline) Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7)
Tiến hành nuôi ủ mẫu ở 37 °C trong 16–18 giờ, riêng với Staphylococcus aureus ủ 24 giờ; sau đó đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D − d) được xác định bằng hiệu giữa đường kính vòng kháng ngoài và đường kính đĩa giấy Mỗi nồng độ được lặp lại ba lần Đường kính vòng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm.
Hình 2.6 Mô tả vòng kháng khuẩn
Trong đó: d : đường kính lỗ khoan thạch D: đường kính vòng vô khuẩn
Xác đị nh ho ạ t tính kháng oxi hóa c ủ a cao Neem
Lực kháng oxy hoá tổng của các mẫu khảo sát dịch chiết lá chè được đánh giá theo phương pháp phosphomolybdenum của Prieto [11], được hiệu chỉnh cho phù hợp với mục tiêu nghiên cứu Quy trình phân tích bao gồm trộn mẫu với dung dịch phosphomolybdenum, ủ ở nhiệt độ cao (thường 95°C) khoảng 90 phút để hình thành phức màu xanh và đo hấp thụ tại λ695 nm Kết quả được biểu diễn dưới dạng đơn vị tương đương Trolox hoặc axit ascorbic (ví dụ mg TE/g hoặc mg AAE/g), dựa trên chuẩn tham chiếu phù hợp và được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại Phương pháp này cho phép so sánh mức độ chống oxy hóa giữa các mẫu dịch chiết lá chè và hỗ trợ đánh giá tiềm năng dinh dưỡng của cây chè.
Một mẫu dung dịch 1 ml chứa nồng độ 10 μg/ml của một chất khử, được hòa tan trong nước, metanol, ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) hoặc hexane, đã được kết hợp với 3 ml dung dịch thuốc thử gồm axit sulfuric 0,6 M và natri phosphat 28 mM trong một ống Eppendorf.
Phương pháp này xác định lực kháng oxy hóa tổng bằng cách ủ các ống chứa dung dịch 4 mM ammonium molybdate ở bể điều nhiệt 95 °C trong 90 phút; sau đó, các mẫu được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và độ hấp thụ của dung dịch nước chứa từng mẫu được đo ở bước sóng 695 nm so với mẫu trắng (mẫu trắng được thay bằng nước cất); lực kháng oxy hóa tổng được biểu diễn thông qua độ hấp thụ của mẫu, và axit gallic được dùng làm chất so sánh.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số sau:
- Nồng độ dịch chiết tăng dần 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đến khảnăng kháng oxy hóa.
- Ảnh hưởng của quá trình tách béo bằng hexan đến khả năng kháng oxy hóa
- Ảnh hưởng của quá trình tinh chế và thời gian lưu mẫu đến khả năng kháng oxy hóa.
Cách pha thu ố c tr ừ sâu
Năm 1998, nhóm tác giả Panchapagesa Muthuswamy Murali và các đồng sự đã xây dựng quy trình tạo ra lượng azadirachtin cao trong thành phần thuốc trừ sâu và làm bền sản phẩm bằng cách nhũ hóa dầu Neem ở mức 0.2%–30% (v/v) với chất nhũ hóa Tween 20, sau đó bổ sung 1%–2.5% tác nhân chống nắng para-aminobenzoic acid (PABA) và 1% oleic acid, nhằm tối ưu hiệu quả và ổn định hệ nhũ tương [33, 34]
Năm 2017, Tác giả Chu Thị Hà và Trương Thị Dung đã tối ưu tỉ lệ phối trộn giữa dầu Neem và nước là 7 : 3, tương ứng với 3 ml Tween 80
Do thời gian làm nghiên cứu trái mùa so với mùa Neem ra quả, chúng tôi dùng cao chiết lá Neem để khảo sát và thử nghiệm trên sâu hại Sau khi tham khảo hai tài liệu liên quan, chúng tôi tiến hành pha chế thuốc trừ sâu có hiệu chỉnh phù hợp với thí nghiệm, dựa trên các khuyến nghị từ tài liệu để tối ưu hiệu quả kiểm soát sâu hại và bảo đảm tính khả thi của công thức.
1 g cao lá Neem chiết với Methanol+ 100 ml nước + 3 ml Tween 80
Sau khi pha thuốc theo 2 cách trên, chúng tôi tiến hành xịt trên lá và nhúng trực tiếp lá cho sâu ăn.