Nghiên cứu sự biến động các chất chống oxy hóa của một số giống đậu tương (glycine max l ) trong điều kiện nhiễm chì

Ngày nay, ô nhiễm kim loại nặng trong môi trường đất ngày càng tăng do sự thải ra hóa chất không được xử lý bởi các ngành công nghiệp khác nhau và các nguồn nhân tạo, khi cây trồng lấy v

TRẦN THỊ BÍCH LIÊN

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG CÁC CHẤT CHỐNG

OXY HÓA CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

(Glycine max L.) TRONG ĐIỀU KIỆN NHIỄM CHÌ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số

Người hướng dẫn: TS TRƯƠNG THỊ HUỆ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà tôi đã thực hiện dưới

sự hướng dẫn khoa học của TS Trương Thị Huệ Các số liệu, kết quả nêutrong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ côngtrình khác

Bình Định, tháng 08 năm 2019

Học viên

Trần Thị Bích Liên

Phó trưởng khoa Sinh – KTNN, đã tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ vàtạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài để tôi cóthể hoàn thành đúng tiến độ và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyênhải Nam Trung Bộ đã cung cấp hạt gống để tạo điều kiện cho chúng tôi thựchiện đề tài.

Đồng thời, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến phòng Sau đại học vàBan chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN, các thầy cô giáo bộ môn đã giảng dạy,truyền đạt cho tôi kiến thức nền tảng để tôi có thể hoàn thành đề tài này

Trân trọng cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên,giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng quan trọng được

trồng phổ biến trên thế giới như là nguồn thực phẩm của con người và độngvật nuôi Đậu tương chứa trên 40% protein chất lượng cao và các axit aminthiết yếu đặc biệt là glycine, tryptophan và lysine, tương tự như sữa bò vàprotein động vật; nó cũng chứa khoảng 20% lipid với các axit béo quan trọng,lecithin, vitamin A và D Đậu tương được dùng chế biến thực phẩm giàu dinhdưỡng cho con người như bột ngũ cốc, tương, bột đậu, giá đỗ Cây đậutương dễ trồng, có khả năng thích nghi tương đối rộng với các loại đất trồngnhờ khả năng cố định đạm của các vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây.Nên ngoài ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, kinh tế, đậu tương còn được sử dụngtrong việc cải tạo đất

Ở Việt Nam diện tích và sản lượng đậu tương trong những năm gần đâyliên tục tăng Đến nay cây đậu tương đã trở thành cây trồng chính trong cơcấu cây trồng của nhiều vùng sản xuất ở nước ta Mặc dù diện tích gieo trồngđậu tương có tăng hàng năm nhưng năng suất thấp và sản lượng đạt đượckhông ổn định, do đó nước ta nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn, hàngtriệu tấn khô dầu đậu tương hằng năm Nguyên nhân gây hạn chế năng suấtđậu tương của Việt Nam là cây trồng gặp nhiều yếu tố bất lợi của môi trường(hạn hán, mặn, nóng, lạnh, nấm bệnh hay có mặt các kim loại nặng với hàmlượng cao…)

Ngày nay, ô nhiễm kim loại nặng trong môi trường đất ngày càng tăng

do sự thải ra hóa chất không được xử lý bởi các ngành công nghiệp khác nhau

và các nguồn nhân tạo, khi cây trồng lấy vào một số lượng lớn kim loại nặng

ở nồng độ cao, chúng không chỉ gây ra vấn đề trong cơ thể thực vật và giảmsản lượng cây trồng mà còn xâm nhập vào chuỗi thức ăn có khả năng gây ra

rối loạn gan và não của con người Hơn nữa, các kim loại nặng cũng làm giảm

độ phì của đất, ảnh hưởng đến vi khuẩn đất và tổn thất năng suất

Chì (Pb) là kim loại nặng phổ biến trong đất, không phải là yếu tố thiếtyếu cho sự phát triển của thực vật Chì không bị phân hủy mà có xu hướngtích lũy, xâm nhập và gây độc cho thực vật Nồng độ chì cao ức chế sự pháttriển của rễ do ức chế sự phân chia tế bào của đầu rễ, ức chế sự phát triển củathực vật, làm thay đổi quá trình phiên mã, làm giảm các protein và gây rốiloạn quang hợp…

Một trong những tác động điển hình của chì đối với cây trồng là gâystress “oxy hóa” với sự hình thành mạnh mẽ các dạng oxy hoạt hóa (reactiveoxygen species - ROS) Hàm lượng ROS cao thường làm rối loạn tính thấmcủa màng, đồng thời gây nên những biến đổi khó phục hồi đối với các thànhphần quan trọng như lipid, protein, acid nucleic , thậm chí gây chết tế bào

Để hạn chế những thiệt hại do stress “oxy hóa”, thực vật có những cơchế kiểm soát, điều chỉnh hàm lượng ROS phù hợp, trong đó có sự tham giacủa các chất chống oxy hóa Các enzyme này vừa duy trì sinh tổng hợp ROS

để tăng cường khả năng chống chịu trước tác động từ môi trường ngoài, đồngthời kiểm soát, giảm thiểu độc tính của ROS đối với các yếu tố cấu trúc vàquá trình sống diễn ra bên trong tế bào Các loài thực vật khác nhau có những

cơ chế bảo vệ không giống nhau sau khi kim loại nặng này gây bùng nổ sinhtổng hợp ROS

Việc đi sâu tìm hiểu sự hình thành và biến động các hợp chất chống oxyhóa của cây đậu tương trong quá trình nhiễm kim loại nặng nhằm làm rõ hơnbản chất phản ứng của đậu tương, để từ đó tìm kiếm các giải pháp nâng caokhả năng chống chịu kim loại nặng của đậu tương là vấn đề quan trọng đangcần được nghiên cứu Theo hướng này chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu sự biến động các chất chống oxy hóa của một số giống đậu tương (Glycine max L.) trong điều kiện nhiễm chì”.

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Đánh giá được sự biến động hàm lượng của một số chất chống oxyhóa của cây đậu tương qua các giai đoạn phát triển trong môi trường nhiễm kim loại chì

- Phân tích được sự biến động về hoạt độ một số enzyme chống oxyhóa của cây đậu tương qua từng giai đoạn phát triển trong điều kiện nhiễmchì

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Dữ liệu thu được góp phần bổ sung nguồn tài liệu nghiên cứu về các chất chống oxy hóa của cây đậu tương trong điều kiện nhiễm chì

- Kết quả nghiên cứu giúp đánh giá rõ hơn phản ứng của đậu tươngtrong quá trình nhiễm kim loại chì, làm cơ sở khoa học cho việc chọn cácgiống đậu tương có khả năng chống chịu trước điều kiện sống bất lợi, gópphần làm tăng năng suất đậu tương

4 Cấu trúc của luận văn

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu (từ trang 4 đến trang 20)

Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu (từ trang

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại đậu tương

Cây đậu tương thuộc họ Đậu (Fabaceae), bộ Fabales là một trong

những cây trồng xuất hiện sớm nhấtcùng với nền văn minh của nhân loại, đậu

tương có tên khoa học là Glycine Max (L) Merrill Cây đậu tương có nguồn

gốc từ Đông Bắc Trung Quốc vào khoảng thế kỷ thứ XI trước công nguyên

Từ Trung Quốc cây đậu tương được phân bố đến nhiều nước trên thế giới nhưTriều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Mỹ, Brazin, Acgentina… ở Việt Nam cây đậutương được du nhập từ Trung Quốc rất sớm

Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ và tiêu chí phân loại khác nhaunên cũng có nhiều cách phân loại Nhưng đến nay, hệ thống phân loại căn cứvào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể đượcnhiều người sử dụng Theo hệ thống này, ngoài chi Glycine còn có thêm chiphụ Soja Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ

Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng trọt Glycine (L.) Merrill và

loài hoang dại hàng năm G Soja SiebetZucc [7]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của đậu tương

Rễ đậu tương (đậu nành) là rễ cọc có rễ chính và rễ phụ Trên rễ chínhmọc ra nhiều rễ phụ Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần cố định đạm do

vi khuẩn cộng sinh Rhizobium japonicum, có khả năng cố định nitơ cung cấp đạm cho cây và có vai trò trong việc cải tạo đất

Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiềulông nhỏ Màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc củahoa sau này Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi cònnon thân có màu tím thì hoa có màu tím đỏ Thân cây trung bình 14-15 lóng

Đậu tương là loại cây trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoạicảnh Trong tập đoàn đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ hè, cónhững giống chỉ trồng vào vụ đông Trong quá trình sinh trưởng của đậutương chịu tác động bởi nhiều yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, đất, độ ẩm….

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng của cây đậu tương

1.1.3.1 Thành phần dinh dưỡng của đậu tương

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng tương đối cao, gồm cóprotein, lipid, hydratcacbon và các chất khoáng Trong hạt đậu tương, hàmlượng protein chiếm khoảng 36-44%, nhiều hơn bất cứ các loại thực phẩmnào, kể cả thịt động vật Protein của đậu tương là loại protein dễ tiêu và phẩmchất tốt nhất trong số các protein của thực vật Protein đậu tương hội tụ đủ cácthành phần axit amin thiết yếu với hàm lượng cao, đậu tương được coi là mộtnguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các axit amincần thiết cho cơ thể Đậu tương là loại thực phẩm nhiều protein nhưng lại ítchất béo bão hòa và hoàn toàn không có cholesterol Các thực phẩm làm từđậu tương được xem là một loại “thịt không xương” vì chứa tỉ lệ đạm thực vậtdồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật

Hạt đậu tương cũng rất giàu vitamin như vitamin B1, B2, B3, B6, A, E,D,… và các chất khoáng như canxi, sắt, kẽm,… hàm lượng chất xơ trong hạtđậu tương cũng khá cao [4].

1.1.3.2 Giá trị sử dụng

Đậu tương có nhiều giá trị sử dụng khác nhau, từ hạt đậu tương người

ta đã chế biến được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loạilàm thực phẩm được chế biến bằng cả phương pháp cổ truyền, thủ công vàhiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men như làm giá, đậu phụ, tương, xìdầu đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, bánh kẹo và thịtnhân tạo Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạtđen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột Đậu tương là thức ăntốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược vàsuy dinh dưỡng

Ngoài ra, đậu tương còn là loại thức ăn tốt cho gia súc, cứ 1 kg hạt đậutương là tương ứng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Không chỉ hạt của đậutương mà thân, lá và quả cũng có hàm lượng đạm khá cao nên thân, lá tươicủa đậu tượng có thể làm thức ăn cho gia súc đem lại giá trị năng suất rất cao

Đậu tương còn được sử dụng trong việc cải tạo đất vì nhờ vào các nốtsần trên rễ cây Nếu bố trí việc trồng cây đậu tương hợp lý thì sẽ có tác dụngđối với việc trồng cây đợt sau, trong việc góp phần tăng năng suất cho câytrồng và giảm chi phí cho bón phân đạm [13]

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng bậc nhất trongcác cây lấy dầu Ngoài ra trồng đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất vì vậyđậu tương được trồng ở khắp các châu lục

Trên thế giới, diện tích đậu tương ngày càng được mở rộng, năng suất

ngày càng tăng Đậu tương có mặt ở khắp các châu lục, tập trung nhiều nhất ởchâu Mỹ, tiếp đến là châu Á và một số nơi khác trên thế giới Hiện nay Mỹvẫn là quốc gia có sản lượng đậu tương cao nhất trên thế giới, chiếm 31,9%tổng sản lượng toàn thế giới

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới năm 2015

(Nguồn: Theo USDA của Bộ Nông nghiệp Mỹ năm 2015)

Hàng năm trên thế giới trồng thêm khoảng hơn 3 triệu ha với năng suấtbình quân khá cao 22-25 tạ/ha đã tạo ra một sản lượng đậu tương gấp hơn 2lần so với 20 năm về trước Các nước trồng đậu tương đứng hàng đầu trên thếgiới về diện tích gieo trồng và sản lượng là Mỹ, Braxin, Acgentina và TrungQuốc [4]

1.1.4.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng tương đối sớm và chủ yếumang tính tự cung tự cấp Những năm gần đây, diện tích đất trồng và năngsuất của đậu tương tăng khá nhanh Diện tích đất gieo trồng được mở rộng vàđược chia thành 6 vùng sản xuất chính: vùng Đông Nam Bộ có diện tích lớnnhất chiếm 26,2% diện tích đậu tương cả nước, miền núi Bắc Bộ 24,7%; đồngbằng sông Hồng 17,5%; đồng bằng sông Cửu Long 12,4%; còn lại là vùng

chiếm 63% sản lượng đậu tương cả nước Đặc biệt vùng đồng bằng sông CửuLong với 12,4% diện tích nhưng lại chiếm 20,9% sản lượng đậu tương cảnước, năng suất bình quân đạt 16 tạ/ha [13]

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương Việt Nam từ 2015–2018

Chỉ tiêu Diện tích (nghìn/ha)

Sản lượng (tấn/ha)

Tổng sản lượng (nghìn tấn/ha)

(Nguồn: Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)

Tại Bình Định, đậu tương là cây trồng truyền thống và có đầu ra kháthuận lợi, đặc biệt đối với những vùng ít nước vì có một số giống đậu tương

có khả năng chịu hạn rất tốt Nhưng năng suất của đậu tương vẫn chưa cao vàhiệu quả thấp, thường nhiễm nhiều sâu bệnh Vì vậy, năm 2010, Viện KHKTNông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ tiếp tục tổ chức khảo nghiệm 20giống đậu tương để chọn tạo các giống đậu tương mới vừa có tiềm năng năngsuất cao, vừa có hàm lượng protein cao để bổ sung vào bộ giống của tỉnh, đápứng nhu cầu sản xuất của nông dân địa phương

1.2 Tình hình ô nhiễm kim loại nặng trong đất và ô nhiễm chì trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình ô nhiễm kim loại nặng trong đất và ô nhiễm kim loại chì trên thế giới

Theo Liên hiệp Hóa học và ứng dụng (IUPAC), kim loại nặng là nhữngnguyên tố kim loại có tỷ trọng lớn hơn 5 mg/cm3 Một số nguyên tố kim loạinặng thường gặp như chì (Pb), sắt (Fe), đồng (Cu), kẽm (Zn), thủy ngân (Hg),crôm (Cr), cadimi (Cd)…(Lê Huy Bá, 2008) [1]

Đất ô nhiễm kim loại nặng (KLN) là mối quan tâm ở hầu hết các quốcgia Phục hồi sinh thái đất bị ô nhiễm do các hoạt động của con người đang là

một thách thức lớn trong những thập kỷ gần đây Khoảng 1/6 tổng diện tíchđất nông nghiệp ở Trung Quốc bị ô nhiễm KLN, hàm lượng KLN trong đấtcanh tác nông nghiệp vượt tiêu chuẩn chiếm 16,1% Khoảng 3,5 triệu địađiểm ở Châu Âu được ước tính có khả năng bị ô nhiễm với 0,5 triệu địa điểm

bị ô nhiễm cao và cần được khắc phục Có 400.000 điểm ô nhiễm đất ở cácnước châu Âu Tại Mỹ, khoảng 600.000 ha đất đã bị ô nhiễm KLN Trên43.000 vùng công nghiệp ở Mỹ trong tình trạng ô nhiễm, trong đó trên 40% là

ô nhiễm KLN như Pb, Cd, Cr, As [9]

Ở Phần Lan, hầu hết ô nhiễm KLN trong đất là do nước thải từ chế biếnthực vật, nhà máy cưa, chế biến gỗ, khu vực săn bắn, gara ô tô và kho phếliệu Trong năm 2001, 20.000 vùng đất đã bị nhiễm bẩn KLN, 38% những khuvực này bị đóng cửa để xử lý, trong đó nhiễm bẩn KLN là mối quan tâm lớnnhất [9]

Ở các khu vực luyện kim, hàm lượng chì trong đất khoảng 1500 µg/g,cao gấp 15 lần so với mức độ bình thường như khu vực xung quanh nhà máyluyện kim ở Galena, Kansas (Mỹ), hàm lượng chì trong đất 7600 µg/g Hàmlượng chì trong bùn, cống rãnh ở một số thành phố công nghiệp ở Anh daođộng từ 120 µg/g - 3000 µg/g, trong khi tiêu chuẩn cho phép tại đây là khôngquá 1000 µg/g Còn ở Kabwe (Zambia) các mỏ khai thác và lò nấu chì đãngừng hoạt động từ lâu, nhưng nồng độ chì ở đây vẫn ở mức rất cao [2]

Tại Norilsk (Nga), các cơ sở khai thác và chế biến kim loại đã thải ramôi trường một lượng lớn các kim loại nặng vượt giới hạn cho phép, khu vựcnày là nơi có các tổ hợp luyện kim lớn nhất thế giới với hơn 4 triệu tấn Cd,

Cu, Pb, Ni, As, Se và Sn được khai thác mỗi năm [2]

Ở Thiên Anh, Trung Quốc, lúa mỳ trồng ở đây chứa hàm lượng chì cao gấp 24 lần chuẩn của Trung Quốc [5]

Châu Á là một trong những nơi có tình trạng ô nhiễm kim loại nặng caotrên thế giới, trong đó đặc biệt là Trung Quốc với hơn 10% đất bị ô nhiễm chì,theo Viện Quốc tế quản lý nước thì tại Thái Lan 154 ruộng lúa thuộc tỉnh Tak

đã nhiễm chì cao gấp 94 lần so với tiêu chuẩn cho phép [9]

1.2.2 Tình hình nhiễm kim loại nặng trong đất và ô nhiễm chì ở Việt Nam

Ở Việt Nam, môi trường đất đang có dấu hiệu ô nhiễm Những năm 90trở lại đây, quá trình công nghiệp hóa và cơ giới hóa nhanh cùng với sự pháttriển của nền kinh tế của Việt Nam đã có bước nhảy vọt đáng kể, đi kèm với

sự phát triển kinh tế đó là nguy cơ ô nhiễm môi trường, đặc biệt tại các thànhphố lớn

Nguồn phát thải các KLN trước hết phải kể đến các ngành sản xuấtcông nghiệp hay ngành công nghiệp than đá và dầu mỏ; việc sử dụng bùn thảilàm phân bón; rác sinh hoạt, đặc biệt rác thải đô thị Ngoài ra, việc lạm dụngcác loại phân bón hóa học, hóa chất bảo vệ thực vật đã làm gia tăng lượng tồn

dư các kim loại như asen, cadimi, thủy ngân và kẽm trong đất Các làng nghềthủ công sử dụng ngày càng nhiều hóa chất song hầu hết các làng nghề ở nước

ta hiện nay đều không có biện pháp xử lý chất thải, gây ô nhiễm môi trường,trong đó có môi trường đất [2]

Tại Tp.HCM, kết quả phân tích hiện trạng ô nhiễm KLN trong đất vùngtrồng lúa khu vực phía Nam thành phố cho thấy hàm lượng Cu, Zn, Pb, Hg,

Cr trong đất trồng lúa chịu ảnh hưởng trực tiếp của nước thải công nghiệpphía Nam đều tương đương hoặc cao hơn ngưỡng cho phép (TCVN7209:2002 thuộc QCVN 03-MT:2015/BTNMT) đối với đất sử dụng cho mụcđích nông nghiệp Trong đó hàm lượng cadimi vượt quá tiêu chuẩn cho phép2,3 lần; kẽm vượt quá 1,76 lần [9]

Hà Nội, một trong những đô thị có tỉ lệ thu gom rác cao nhất, cũng chỉđạt tỉ lệ dao động khoảng 70-80%/năm Lượng rác thải còn lại tồn đọng ở các

nước ao hồ, ngõ xóm, kênh mương, theo dòng nước mưa chảy tràn gây ônhiễm môi trường.

Đất ở khu bãi thải của làng Hích, Thái Nguyên có hàm lượng chì vàcadimi cao hơn tiêu chuẩn; đất ở làng nghề đúc nhôm, đồng tại Văn Môn -Yên Phong - Bắc Ninh, hàm lượng KLN trong đất nông nghiệp của làng nghềnày khá cao: trung bình hàm lượng Cd là 1 mg/kg; Cu là 41,4 mg/kg; Pb là39,7 mg/kg và Zn là 100,3 mg/kg Đất nông nghiệp của huyện Văn Lâm -Hưng Yên được cảnh báo nguy cơ ô nhiễm đồng, kẽm [9]

Kết quả nghiên cứu của Lê Đức và cộng sự (2003) về môi trường đấtvùng đồng bằng sông Hồng, ở khu vực nhà máy Pin Văn Điển hàm lượng Pbtrong các nguồn nước thải là 0,012 mg/lít, trong đất là 30,737 mg/kg so vớiđối chứng là 18,240 mg/kg; khu vực nhà máy Phả Lại, Pb trong nước thải là0,013 mg/lít, trong đất là 2,320 mg/kg và đối chứng là 2 mg/kg [10]

Theo nghiên cứu của Phạm Văn Khang và cộng sự (2004), hàm lượngchì trong đất nông nghiệp tại khu vực tái chế chì ở thôn Đông Mai, huyện VănLâm, tỉnh Hưng Yên như sau: 14,29% số mẫu nghiên cứu có hàm lượng chì là100-200 mg/kg; 9,25% số mẫu đất có hàm lượng chì từ 200-300 mg/kg;18,5% số mẫu đất có hàm lượng Pb từ 300-400 mg/kg; 9,25% số mẫu có hàmlượng Pb từ 400-500 mg/kg; 9,25% số mẫu có hàm lượng Pb từ 500-600mg/kg; 18,05% số mẫu có hàm lượng Pb từ 600 - 700 mg/kg; 4,76% có hàmlượng chì từ 900 - 1000 mg/kg và 4,76% số mẫu có hàm lượng Pb lớn hơn

1000 mg/kg (trong tổng số 21 mẫu phân tích) Như vậy, 100% số mẫu phântích có hàm lượng Pb vượt quá tiêu chuẩn cho phép [9]

Nghiên cứu của Hồ Thị Lam Trà (2005) cho thấy hàm lượng Pb tổng sốtrong đất phục vụ nông nghiệp chịu ảnh hưởng của các làng nghề đúc đồng vàtái chế kẽm tại xã Đại Đồng, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên rất cao, daođộng từ 51,2 - 313,0 mg/kg, trong đó có nhiều mẫu >200 mg/kg

Kết quả nghiên cứu của Ngô Đức Minh và cộng sự (2009) tại ThạchSơn, Lâm Thao, Phú Thọ cho thấy phần lớn đất trồng lúa ở xã Thạch Sơn cóhàm lượng Cu vượt quá TCVN 7209-2002; đặc biệt nghiêm trọng tại hai khuđồng vàn trũng, hàm lượng Cu vượt 2,5-3 lần, hàm lượng Zn vượt 4-10 lần[10].

Ở tỉnh Bình Định, theo Tổng cục môi trường, trong năm 2018 các công

ty trong cụm công nghiệp Gò Đá Trắng tại phường Đập Đá, thị xã An Nhơn,tỉnh Bình Định đã tiến hành nấu tái chế nhựa mùi hôi, thối, nước thải từ cáckim loại nặng như chì, gang, nhôm chảy ra ngoài cũng gây ô nhiễm môitrường

Vì vậy, tình trạng ô nhiễm đất do kim loại nặng nói chung và chì nóiriêng ngày càng gia tăng, nên việc nghiên cứu các giống cây trồng phản ứngvới môi trường đất bị ô nhiễm là một trong những vấn đề quan trọng và cấpthiết

1.3 Đặc tính chống chịu kim loại chì ở cây trồng

1.3.1 Tác động của kim loại chì đến cây trồng và hiện tượng oxy hóa

ở thực vật

Chì (Pb) là kim loại có màu xanh xám, rất mềm Chì là nguyên tố nhóm

IV, số thứ tự 82 trong bảng hệ thống tuần hoàn, khối lượng nguyên tử 207,21;khối lượng riêng d= 11,34 g/cm3; thường tồn tại ở dạng hóa trị 2+ Nguồn thải

Pb nhân tạo chủ yếu là quá trình khai khoáng, nấu quặng, chế tạo pin, chất

dẻo tổng hợp, sơn và khói bụi động cơ, các vật liệu đánh bắt hải sản… Chì vàcác hợp chất của chì được xếp vào nhóm độc tố đối với cơ thể con người [1].

Chì không phải là yếu tố cần thiết đối với thực vật nhưng lại dễ dànghấp thụ và tích lũy trong các bộ phận khác nhau của cây Sự hấp thụ Pb củathực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ pH, đặc tính của đất, khả năngtrao đổi các các cation trong đất cũng nhưng các thông số lý hóa khác Khilượng Pb dư thừa trong đất vượt quá ngưỡng “chịu đựng” của cây sẽ gây ramột số triệu chứng ngộ độc đối với thực vật như cây phát triển còi cọc, lá úavàng, ức chế quá trình quang hợp, quá trình trao đổi khoáng và cân bằng nước

bị rối loạn

Chì ảnh hưởng tới hoạt tính của các enzyme bằng con đường chuyểnhóa khác nhau Pb ở nồng độ cao sẽ ức chế hoạt động của các enzyme, chìtương tác với các nhóm tự do –SH có mặt trong trung tâm hoạt động củaenzyme Ngoài ra, Pb thúc đẩy sự hình thành các phản ứng oxi hóa trong thựcvật làm cho thực vật bị stress “oxi hóa”, dẫn đến sự gia tăng hoạt động củacác enzyme chống oxi hóa [39]

Đa số chì có ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình quang hợp của cây,nguyên nhân là do các ion Pb2+ làm thay đổi cấu trúc lục lạp, hạn chế quátrình tổng hợp các chất diệp lục, caroten; cản trở quá trình vận chuyển điện tử,

ức chế sự hoạt động của các enzyme trong chu trình Canvil…Chì ức chế quátrình tổng hợp chất diệp lục bằng cách làm suy giảm khả năng hấp thu cácnguyên tố cần thiết như sắt, magie Nó làm tổn hại bộ máy quang hợp do mốiquan hệ của Pb với protein [35]

Sự suy giảm trong tỉ lệ thoát hơi nước và hàm lượng nước ở các môtrong lá tăng khi tiếp xúc với chì Vì khi Pb xâm nhập vào tế bào thực vật thì

Pb tồn tại chủ yếu ở vách tế bào và gian bào, khi có hàm lượng lớn Pb ở tếbào thì làm giảm kích cỡ của khí khổng, làm cho quá trình thoát hơi nước của

cây giảm

Một trong những tác động điển hình của nhiễm kim loại nặng trong đó

có kim loại chì đối với cây trồng là gây stress oxy hóa với sự hình thành mạnh

mẽ các dạng ôxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS) nội sinh bao gồm

loạn tính thấm của màng, đồng thời gây nên những biến đổi khó phục hồi đốivới các thành phần quan trọng như lipid, protein, acid nucleic , làm thay đổi

sự lưu chuyển các ion, ức chế hoạt tính bơm proton H+, tăng độ thấm củamàng, thậm chí gây chết tế bào [5]

1.3.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh của tính chống chịu kim loại chì của cây trồng

Để đối phó với môi trường sống nhiễm kim loại chì, cây trồng sẽ khởiđộng cơ chế phòng vệ, hạn chế những thiệt hại do stress “oxy hóa” Cây cómức độ chống oxy hóa cao thì khả năng chịu đựng tốt hơn và đề kháng vớitổn thương oxy hóa nhiều hơn Cơ chế nhặt ROS là một trong những điểmchung của phản ứng phòng vệ chống lại stress phi sinh học Để giải độc ROS,

chống oxy hóa tồn tại trong các bào quan Các chất này bao gồm các enzymechống oxy hóa và các hợp chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme[32]

Các enzyme chống ôxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase(CAT), peroxidase (POX) và ascorbate peroxidase (APX) (Maffei et al., 2007;Ahmad et al., 2008) Các enzyme này vừa duy trì sinh tổng hợp ROS để tăngcường khả năng chống chịu trước tác động từ môi trường ngoài, đồng thờikiểm soát, giảm thiểu độc tính của ROS đối với các yếu tố cấu trúc và

quá trình sống diễn ra bên trong tế bào (Zhu-Salzman et al., 2004) Phản ứngbảo vệ của thực vật đối với stress “oxy hóa” do kim loại nặng gây nên đãđược ghi nhận ở đậu Hà Lan khi chịu tác động của Cd (Rodriguez-Serrano etal., 2009) hay ở cà chua dưới ảnh hưởng của Cu (Rueda et al., 2011) Đối với

Pb, một số thực nghiệm trên đậu Hà Lan (Malecka et al., 2001), đậu xanh(Hassan and Mansoor, 2014) hay lúa mỳ (Dey et al., 2007), đậu tương DT 84khi chịu tác động của Pb (Mai Văn Chung, Trần Ngọc Toàn.,2015) đều đã ghinhận, các loài thực vật khác nhau có những cơ chế bảo vệ không giống nhausau khi kim loại nặng này gây bùng nổ sinh tổng hợp ROS [5], [6]

Ngoài ra, để chống lại sự tác động của Pb, thực vật còn thực hiện phảnứng siêu nhạy cảm (Hypersensitive response-HR) Sau khi có cảm ứng tácđộng, HR được khởi động dẫn đến sự thay đổi các dòng ion vào - ra tế bào,tiếp đó, kích thích bùng nổ ôxy hóa đặc trưng bởi sự sinh tổng hợp mạnh mẽcác dạng ôxy hoạt hóa, làm thay đổi căn bản tính thấm của màng tế bào, tiếp

đó là gây chết tế bào (Pontier et al., 1998)

Cơ chế bảo vệ của thực vật đối với kim loại nặng, vai trò của HR được

ghi nhận ở đậu Hà Lan (Pisum sativum L.) dưới tác động của Cd Serrano et al., 2009) hay ở cà chua (Lycopersiconlycopersicum (L.) H Karst.)

(Rodriguez-chịu ảnh hưởng của Cu (Rueda et al., 2011) hoặc một số cây bị gây độc bởichì, một kim loại nặng điển hình trong đất, không bị phân hủy mà có xuhướng tích lũy, xâm nhập vào cây trồng Một số nghiên cứu khác trên đậu Hà

Lan (P sativum), đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) hay lúa mỳ (Triticum aestivum L.), đậu tương Nam Đàn chịu ảnh hưởng của Pb (Mai Văn Chung.,

2014) đã ghi nhận, các thực vật khác nhau có những phản ứng bảo vệ khácnhau sau khi kim loại nặng này gây bùng nổ oxy hóa (Hassan, Mansoor,2014) [29]

1.3.3 Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của kim loại nặng

1.3.3.1.Vai trò của một số chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme

Ascorbic (vitamin C) có trong tế bào thực vật là một trong những chất

cần thiết cho quá trình trao đổi chất của tế bào Ascorbic còn loại các gốc tự do,

là một trong những thành phần chính của chu trình ascorbate-glutathion trong tếbào để thực hiện chức năng này Không có sự tham gia của các enzyme, ascorbicvẫn có thể trực tiếp tác động (giống như SOD) lên superoxide

Ngoài ra, ascorbic còn có vai trò giúp điều chỉnh stress oxy hóa ở thực vật qua

cơ chế tự kiểm soát ROS thông qua hợp tác với glutathione Ngoài ra, bằngcách gián tiếp, ascorbic phục hồi các gốc tự do trên màng như gốc tocopherol

tự do Gốc này được hình thành sau khi khử các gốc tự do khác trên màng tếbào [11], [38]

Proline là một axit amin ưa nước,được tổng hợp từ glutamin nhờ sự

xúc tác của enzyme delta-1-pyrroline-5-carboxylate sythetase (P5CS), có khốilượng phân tử nhỏ Nó được tích lũy nhiều ở mô lá, mô phân sinh chóp rễ và

ở hạt phấn khi thực vật bị mất nước [36]

Trong điều kiện stress phi sinh học, thực vật có xu hướng sản sinh

proline, proline đóng vai trò như một chất điều hòa thẩm thấu, một chất chống

oxy hóa và là một phân tử tín hiệu (Yaish MW (2015) [44]

Proline tự do có hiệu lực sinh học đa năng trong điều kiện stress môitrường Chúng không chỉ có vai trò điều chỉnh áp suất thẩm thấu mà cònchống oxy hóa, tạo năng lượng để đảm bảo sự ổn định của tế bào giúp cơ thểthích nghi với môi trường mới

Tác động chống oxy hóa của proline thể hiển ở khả năng chúng bảo vệprotein và màng khỏi tổn thương do chúng làm bất hoạt các nhóm hydroxyl

và các chất phản ứng mạnh khác sinh ra khi cây gặp các stress trong ty thể và

lục lạp.

Proline ngoài vai trò quan trọng là điều hòa áp suất thẩm thấu trong tếbào, axit amin này còn giúp giữ nước, lấy nước cho tế bào và ngăn chặn sựxâm nhập của ion Na+ tương tác với protein màng, ngăn chặn sự phá hủy củamàng và các phức protein khác [43]

1.3.3.2 Vai trò của các enzyme chống oxy hóa

Một trong những tác động điển hình của Pb đối với cây trồng là gâystress “oxy hóa” với sự hình thành mạnh mẽ các dạng oxy hoạt hóa (reactiveoxygen species - ROS) nội sinh như hydrogen peroxide - H2O2, các gốc tự dosuperoxide - O2•- và hydroxyl - HO- (Wojtaszek, 1997; Bhattacharjee, 2005;Malecka et al., 2009) Sinh tổng hợp ROS thường gắn liền với các cơ chế cảmứng kích thích những phản ứng của thực vật như: nhận diện yếu tố tác động,tăng cường độ bền của vách tế bào, khởi động các con đường tín hiệu, kíchhoạt biểu hiện của gen và protein có chức năng bảo vệ, (Mittler et al., 2004;Maffei et al., 2007; Radville et al., 2011) Tuy nhiên, ROS cũng gây độc đốivới tế bào sống Hàm lượng ROS cao thường làm rối loạn tính thấm củamàng, đồng thời gây nên những biến đổi khó phục hồi đối với các thành phầnquan trọng như lipid, protein, acid nucleic , thậm chí gây chết tế bào (Ahmad

et al., 2008) [21]

Để hạn chế những thiệt hại do stress “oxy hóa”, thực vật có những cơchế kiểm soát, điều chỉnh hàm lượng ROS phù hợp, trong đó có sự tham giacủa các enzyme chống ôxy hóa như superoxide dismutase, catalase,peroxidase và ascorbate peroxidase (Maffei et al., 2007; Ahmad et al., 2008).Các enzyme này vừa duy trì sinh tổng hợp ROS để tăng cường khả năngchống chịu trước tác động từ môi trường ngoài, đồng thời kiểm soát, giảmthiểu độc tính của ROS đối với các yếu tố cấu trúc và quá trình sống diễn rabên trong tế bào [21], [33]

Superoxide dimutase (SOD) và vai trò của SOD: H2O và O2 là

những yếu tố cần thiết để duy trì sự sống trong cơ thể Nhưng dưới sự tácđộng của môi trường bất lợi, trong các hệ thống chuyển năng lượng vàelectron của tế bào thường tạo ra các gốc tự do Các gốc tự do có khả năngoxy hóa rất mạnh, tác động lên protein, lipid…Vì vậy vấn đề loại bỏ gốc tự

do trong tế bào là cơ chế bảo vệ có tính quyết định sự sống còn của tế bào.Một trong những enzyme tham gia vào quá trình đó là superoxide dimutase(SOD) [27]

Mc Cord và Fridovitch đã phát hiện SOD năm 1969 Họ đã nhận thấyđây chính là enzyme chủ chốt bảo vệ tế bào khỏi oxy hóa SOD xúc tác phảnứng loại bỏ superoxide anion: 2 H++ O2-= H2O2 + O2

Ở thực vật bậc cao, SOD hoạt động như chất chống oxy hóa và bảo vệcác thành phần tế bào khỏi bị oxy hóa bởi các loại oxy phản ứng ROS Cụ thể,phân tử O2 bị khử thành O2 - (một loại ROS gọi là superoxide) khi nó hấp thụmột electron kích thích được giải phóng từ các hợp chất của chuỗi vận chuyểnđiện tử SOD xúc tác tạo thành O2 và H2O2 từ superoxide (O2 - ), dẫn đến cácchất phản ứng ít gây hại hơn H2O2 tạo thành được biến đổi tiếp tục nhờcatalase và peroxidase Hoạt tính của SOD tăng lên khi phản ứng với điềukiện bất lợi của môi trườngvà tăng theo mức độ stress [42]

Catalase (CAT) và vai trò của catalase: Catalase là “hem-enzyme”,

trong cùng một loài Các izozyme đều là tetramer có MW 220 kDa Catalase

là một enzyme quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hóa bới các

Peroxidase (POD) và vai trò của peroxidase: là tập hợp gồm nhiều

enzyme chống oxy hóa, có chức năng giải độc peroxide Peroxidase đã đượcphân loại thành 3 loại (loại I, loại II và loại III) Enzyme peroxidase rất phổbiến trong cơ thể thực vật, có vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa

Peroxidase xúc tác cho phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ khi có mặt của

H2O2 và loại khả năng gây độc của H2O2, bảo vệ tế bào và cơ thể thực vậttrước tác động của điều kiện bất lợi [11]

Ascorbate peroxydase (APX) và vai trò của APX ở thực vật: là một

thành viên của gia đình peroxidase có nhân heme Peroxidase xúc tác quátrình oxy hóa các chất hữu cơ phụ thuộc H2O2 APX là enzyme peroxidaseloại I, xúc tác quá trình oxy hóa phụ thuộc H2O2 của ascorbate trong thực vật,tảo và một số vi khuẩn lam

peroxide trong tế bào thực vật là chu trình ascorbate-glutathione Trong đó,

Sự biểu hiện của các gen mã hóa cho APX được điều hòa bởi các nhân

tố môi trường khắc nghiệt chẳng hạn như hạn hán, mặn muối, nhiệt độ quácao, quá thấp, acid abscisic…Các phản ứng xúc tác bởi APX liên quan trựctiếp đến việc bảo vệ tế bào thực vật chống lại các điều kiện môi trường bất lợi[22]

1.4 Tình hình nghiên cứu tính chống chịu kim loại Pb của cây đậu tương

1.4.1 Nghiên cứu khả năng chống chịu kim loại Pb của cây đậu tương trên thế giới

Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã thành công khi nghiêncứu sâu hơn về tác động của kim loại chì và khả năng chống chịu kim loại Pb

ở cây đậu tương Nồng độ kim loại chì cao có tác dụng ức chế tỷ lệ nảy mầmhạt, chiều dài rễ, chiều dài chồi, chỉ số dung nạp, trọng lượng tươi khô của câyđậu tương

Nồng độ kẽm và chì càng cao trong môi trường đất đã làm giảm mạnhnăng suất cây trồng Nghiên cứu này còn cho thấy dưới tác động của kim loạichì đã tạo ra nhiều oxy hoạt hóa, làm tăng hoạt độ của các enzyme chống oxyhóa [21]

1.4.2 Nghiên cứu tính chống chịu kim loại chì của cây đậu tương ở Việt Nam

Đã có một số nghiên cứu về khả năng chống chịu kim loại chì ở một sốgiống đậu tương Năm 2014, Mai Văn Chung và cộng sự đã nghiên cứuvềphản ứng siêu nhạy cảm của rễ cây đậu tương Nam Đàn dưới ảnh hưởng củaion chì (Pb2+) ở các nồng độ 0,1 mM, 0,5 mM và 1,0 mM sau 6 giờ Kết quảcho thấy đậu tương đã tổng hợp mạnh mẽ dạng ôxy hoạt hóa hydrogenperoxide, tăng phân giải lipid màng tế bào, tỷ lệ thương tổn tế bào cao Cácenzyme SOD và CAT duy trì độ hoạt động cao trong khoảng thời gian 6-48giờ góp phần kiểm soát hàm lượng H2O2 và O2.- nội sinh trong phản ứng siêunhạy cảm [5]

Mai Văn Chung, Trần Ngọc Toàn (2015) [6] đã nghiên cứu về stress

“oxy hóa” và phản ứng bảo vệ của cây đậu tương DT84 đối với chì cho thấyion Pb2+ đã gây stress “oxy hóa” ở rễ cây đậu tương DT84 với sự cảm ứngtổng hợp sớm và mạnh mẽ các dạng ôxy hoạt hóa nội sinh sau khi Pb2+ tácđộng 6 - 12 giờ Sự tăng lên về hàm lượng các dẫn xuất của axit thiobarbituric

- sản phẩm của quá trình peroxide hóa lipid màng, cùng với tỷ lệ tổn thương

tế bào lớn (13,89-25,03%) là hậu quả của stress “ôxy hóa” Các enzyme

chống ôxy hóa superoxide dismutase và catalase có hoạt độ cao đã làm giảmlượng H2O2 và O2.- sau 24 giờ chịu tác động của Pb2+, góp phần kiểm soátstress “ôxy hóa” ở rễ đậu tương DT84

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Các giống đậu tương được dùng trong nghiên cứu bao gồm ĐTDH.10 doViện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ nghiên cứu

và chọn tạo; giống ĐTDH.04 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyênhải Nam Trung bộ và Trung tâm Nghiên cứu và Phát Triển đậu đỗ phối hợpchọn lọc và giống MTĐ 176 do Trường Đại học Cần Thơ chọn lọc

Kim loại chì (Pb) dùng để tác động đến cây đậu tương ở dạng ion

Pb2+của muối chì nitrat -Pb(NO3)2

Bảng 2.1 Đặc điểm nông học của các giống đậu tương nghiên cứu

Đặc điểm Thời gian sinh trưởng Chiều cao cây Khối lượng

1000 hạt Năng suất

Khả năng chống chịu

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2018

đến tháng 7 năm 2019

- Địa điểm: Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinhlý-Hóa sinh và vườn Sinh học thuộc khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học QuyNhơn

2.3 Hóa chất và thiết bị

2.3.1 Hóa chất và nguyên liệu khác

Ninhydrin, guaiacol được mua từ Merck (Đức); proline chuẩn, methionin, riboflavin, EDTA, acid ascorbic, chì –Pb(NO3)2, toluen được mua

L-từ Biobasic (Canada); NBT được mua L-từ Sigma (Mỹ) và một số hóa chấtkhác…

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Một số thiết bị chính dùng trong thí nghiệm gồm máy ly tâm lạnh(Mikro 22R- Hattich, Đức), máy đo quang phổ (Pharmacia LKB – Ultraspec,Denmark), máy đo pH (Orion, USA), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), pipetmancác loại (Gilso, Pháp), tủ sấy (Anh)

Một số dụng cụ khác như ống eppendof, bếp điện, bình tam giác, ốngfalcon 50 ml, 150 ml, ống đong 10 ml và 100 ml, bình tam giác, bình địnhmức, chày, cối, găng tay, khẩu trang, …

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định sự biến động hàm lượng proline và hàm lượng ascorbic của

lá đậu tương trong quá trình gây nhiễm kim loại chì ở thời kỳ cây non, ra hoa

và tạo quả

- Xác định hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa bao gồm catalase,superoxide dismutase, peroxidase, ascorbate peroxidase của lá đậu tươngtrong quá trình gây nhiễm chì với các nồng độ khác nhau ở thời kỳ cây non, rahoa và tạo quả

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

(1) Thời kỳ cây non:

Hạt giống được khử trùng bởi etanol 70o, rồi ủ trong các đĩa petri có đủ

độ ẩm, đặt trong tối ở nhiệt độ thích hợp Sau 48 giờ, những hạt nảy mầm tốtđược lựa chọn trồng trong chậu chứa cát sạch, chia các chậu thành các lô đốichứng và thí nghiệm Số lượng cây/chậu là 15 cây, mỗi công thức lặp lại 3lần

Cây được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường, đến ngày thứ 7 saukhi gieo, cây có 2 lá thật thì lô thí nghiệm được bổ sung vào môi trường nuôicây (dung dịch dinh dưỡng Hoagland) muối chì Pb(NO3)2 ở các nồng độ ion

Pb2+: 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM Công thức đối chứng không bổ sung Pb2+.Sau 1 tuần xử lý chì, thu mẫu lá và xác định hàm lượng proline, hàm lượngascorbic; xác định hoạt độ superoxide dimutase, catalase, peroxidase vàascorbate peroxidase

(2) Thời kỳ cây ra hoa, tạo quả:

Cây được chăm sóc bình thường đến thời điểm cây đậu tương bắt đầu rahoa đầu tiên thì lô thí nghiệm sẽ tiến hành gây nhiễm chì với các nồng độ ion

Pb2+: 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM; thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêunghiên cứu sau 1 tuần gây nhiễm chì Ở giai đoạn cây tạo quả, cách thức gâynhiễm chì cũng tương tự như giai đoạn ra hoa Thời điểm bắt đầu gây nhiễmchì là giai đoạn chuẩn bị hình thành quả non

2.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định

2.5.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng proline

Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [23].+ Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độcao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden

Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợpchất có màu vàng da cam Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịchtoluen, so màu ở bước sóng 520 nm Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xácđịnh được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọnglượng tươi như sau:

V : Thể tích dung môi chiết (ml)

P : Trọng lượng mẫu phân tích (g)

2.5.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid ascorbic

Hàm lượng ascorbic được xác định theo phương pháp chuẩn độ [3]+ Nguyên tắc: Ascorbic có thể khử dung dịch iot Dựa vào lượng iot bị khử bởi ascorbic có trong mẫu, suy ra hàm lượng ascorbic

+ Tiến hành: Cân 5g lá tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml HCl 5%,nghiền kỹ, cho vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn đến vạch 50ml bằngnước cất Khuấy đều, lấy 20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích 100

ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh

và xác định hàm lượng ascorbic trong mẫu

2.5.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme catalase

Hoạt độ enzyme catalase được xác định theo phương pháp dựa vàolượng peroxit bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme bằng cách chuẩn độ vớidung dịch KMnO4 theo phương pháp Bakh - Oparin [3]

A - Số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 của bình đối chứng

B - Số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm

V1 - Tổng thể tích dung dịch enzyme

V2 - ml dung dịch enzyme lấy đi phân tích

a - Số gam lá lấy đi nghiên cứu

Số đơn vị catalase trong 1g lá (micromol H2O2 bị phân giải sau 1 phút)

30 - Thời gian enzyme tác dụng tính bằng phút

0,034 – Micromol H2O2 (mg)

2.5.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme peroxidase

Hoạt độ enzyme peroxidase được xác định theo phương pháp của Malik

và Singh (1980)

+ Nguyên tắc: POD sẽ xúc tác và oxi hóa hợp chất hữu cơ như phenol,amin có nhân thơm Hoạt độ được xác định dựa trên sự oxi hóa guaiacol vàguaiacol chính là cơ chất

+ Tiến hành: Nghiền 1 g mẫu lá đậu tương trong 3 ml đệm photphat 0,1

M, pH 7,0 Ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút ở 4°C Lấy dịch trong làmnguồn enzyme Hút 3 ml dung dịch đệm photphat, thêm vào 0,05 ml dungdịch guaiacol có nồng độ 20 mM; thêm 0,1 ml dịch chiết enzyme, sau đó cho0,03 ml H2O2 0,042% Lắc kỹ hỗn hợp, đo quang phổ ở bước sóng 436 nm

2.5.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme superoxide dismutase

Hoạt độ enzyme superoxide dismutase được phân tích bằng phươngpháp Dhindsa (1981) [27]

+ Nguyên tắc: Nitroblue tetrazolium (NBT) bị khử khi tiếp xúc ánhsáng bởi các gốc superoxide, NBT cạnh tranh với SOD về anion superoxide

Sự có mặt của SOD trong hỗn hợp phản ứng NBT sẽ tạo ra lượng phức chấtmàu ít hơn đối chứng 1 đơn vị hoạt độ SOD được xác định là lượng enzyme

cần thiết ức chế 50% NBT khử ở 560 nm

+ Tiến hành: Nghiền lạnh 0,5 g lá đậu tương trong 1,5 ml đệm photphat0,2 M, pH 7,0 Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 4°C Hỗn hợp phản ứnggồm 0,05 ml dịch enzyme, 0,2 ml methionine 200 mM; 0,1 ml EDTA 3 mM;0,1 ml NBT 2,25 mM; 1,5 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,5; 1 ml nước cất; 0,1

ml Na2CO3 1,5 M; 0,1ml riboflavin 60 µM Hỗn hợp tiếp xúc với ánh sángđèn huỳnh quang 15W trong 15 phút, xuất hiện phức chất màu xanh Đo độhấp thụ ở bước sóng 560 nm

2.5.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ascorbate peroxidase

Hoạt độ enzyme ascorbate peroxidase được xác định theo phương phápcủa Nakano và Asada (1981)

+ Nguyên tắc: Ascorbate peroxidase xúc tác cho phản ứng khử H2O2,

sử dụng cơ chất là acid ascorbic 1 mol H2O2 oxy hóa 1 mol ascorbic thành 1mol dehydro ascorbic Tốc độ oxy hóa ascorbic được tính dựa vào việc giảm

độ hấp thụ ở 290 nm 1 đơn vị APX được xác định là lượng enzyme cần thiếtoxi hóa 1 µmol acid ascorbic trong 1 phút

+ Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1,5 ml đệm photphat 0,1 M,

pH 7,5; 0,3 ml acid ascorbic 0,5 mM; 0,6 ml dịch enzyme; 0,6 ml H2O2 0,2

mM Độ giảm hấp thụ được đo trong 3 phút với khoảng cách thời gian 30giây

2.5.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học quacác thông số: giá trị trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, sai số trung bình Sử dụngphần mềm MS Excel và Statistix Các công thức toán thống kê được sử dụng:

+ Giá trị trung bình mẫu X : X = 1 ∑n x

x i: giá trị đo đếm ở mỗi lần nhắc lại

+ Phương sai mẫu S x 2: S

Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các nghiệm thức được đánh

giá theo phân tích ANOVA với mức ý nghĩa p <0,05.

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì

3.1.1 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì

ở giai đoạn cây non

Acid ascorbic là một trong những hợp chất chống oxy hóa có trong các

mô thực vật, tan trong nước Acid ascorbic có khả năng khử các gốc tự do tạo

ra dưới áp lực stress Vì vậy acid ascorbic có vai trò quan trọng trong quátrình sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương trong điều kiện nhiễm kim loạinặng

Hàm lượng acid ascorbic của 3 giống đậu tương trong quá trình gâynhiễm chì ở giai đoạn cây non được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương ở giai

đoạn cây non trong môi trường nhiễm chì

Kết quả bảng 3.1 cho thấy nồng độ chì đã tác động đến hàm lượng acidascorbic của lá đậu tương ở giai đoạn cây non Cụ thể như sau, trong cùngmột giống ĐTDH.10 ở nồng độ gây nhiễm chì là 0,1 mM thì hàm lượng acidascorbic tăng 2,47%, ở nồng độ chì là 0,5 mM thì hàm lượng acid ascorbictăng 9,88%, ở nồng độ chì 1,0 mM thì hàm lượng acid ascorbic tăng 12,35%

so với đối chứng Đối với giống MTĐ 176 thì hàm lương acid ascorbic cũngtăng dần theo nồng độ nhiễm chì, ở nồng độ 0,1 mM thì hàm lượng acidascorbic là 1,27%, ở nồng độ chì 0,5 mM thì hàm lượng acid ascorbic tăng đạtđược là 7,6%, ở nồng độ 1,0 mM thì hàm lượng ascorbic tăng đạt được là8,86% Giống ĐTDH.04 có hàm lượng acid ascorbic cũng tăng theo từngnồng độ nhiễm chì 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM lần lượt là 1,33%;5,33% và6,67% so với đối chứng Trong điều kiện nghiên cứu, nồng độ chì tăng dần thìhàm lượng acid ascorbic cũng tăng dần theo nồng độ và cao nhất ở nồng độchì 1 mM Tuy nhiên, không có sai khác nhiều về hàm lượng ascorbic ở giốngĐTDH.10 và ĐTDH.04 khi xử lý chì 0,5 mM và 1 mM (thể hiện qua xử lýthống kê)

Yếu tố giống cũng ảnh hưởng đến hàm lượng acid ascorbic Sau khinhiễm chì, tại nồng độ 0,1 mM thì giống ĐTĐH.10 có hàm lượng tăng 2,47%,giống MTĐ 176 tăng 1,27%, còn giống ĐTDH.04 tăng 1,33% Ở nồng độ 0,5

mM, các giống ĐTDH.10, MTĐ 176, ĐTDH.04 có hàm lượng acid ascorbictăng lần lượt theo thứ tự là 9,88%; 7,6% và 5,33% so với đối chứng Ở nồng

độ 1,0 mM, các giống cũng tăng hàm lượng acid ascorbic theo thứ tựĐTDH.10, MTĐ 176, ĐTDH.04 là 12,35%; 8,86% và 6,67% so với đốichứng Chúng tôi nhận thấy ở từng nồng độ chì nghiên cứu, hàm lượng acidascorbic tăng so với đối chứng, cao nhất là ĐTDH.10, tiếp theo là MTĐ 176

và tăng ít nhất là ĐTDH.04

Đồ thi 3.1 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương

ở giai đoạn cây non trong môi trường nhiễm chì

3.1.2 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì

ở giai đoạn ra hoa

Bảng 3.2 Hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương ở giai đoạn ra

hoa trong môi trường nhiễm chì

Giống

ĐTDH.10

MTĐ 176

ĐTDH.04 CV(%) LSD 0,05

Ghi chú: Trong cùng một cột những số khác mẫu tự theo sau khác biệt ở mức

ý nghĩa 5%

Qua kết quả phân tích số liệu, hàm lượng acid ascorbic của lá đậutương ở giai đoạn ra hoa cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố giống và nồng độ chì.Hàm lượng acid ascorbic của 3 giống nghiên cứu ở giai đoạn này đều tăng saumột tuần nhiễm chì so với đối chứng.

Trong điều kiện nghiên cứu, nồng độ chì tăng dần thì hàm lượng acidascorbic cũng tăng dần Tuy nhiên ở nồng độ chì 0,1 mM thì sự biến động nàykhông đáng kể Ở nồng độ 0,5 mM, giống ĐTDH.10 tăng 9,76% so với đốichứng, tiếp đến giống MTĐ 176 tăng 7,5% so với đối chứng, giống ĐTDH.04tăng 6,58% so với đối chứng Ở nồng độ 1 mM, giống ĐTDH.10 tăng caonhất, tăng 10,98% so với đối chứng, tiếp đến giống MTĐ 176 tăng ít hơn là8,75% so với đối chứng, giống ĐTDH.04 tăng ít nhất, tăng 7,89% so với đốichứng Từ nồng độ 0,5 mM đến 1,0 mM, không có sự sai khác về hàm lượngascorbic giữa các công thức thí nghiệm của cùng 1 giống (khác biệt không có

Đồ thị 3.2 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương ở giai đoạn ra

hoa trong môi trường nhiễm chì

3.1.3 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì

ở giai đoạn cây tạo quả

Hàm lượng acid ascorbic trong giai đoạn tạo quả được trình bày trongbảng 3.3 và đồ thị 3.3

Bảng 3.3 Hàm lượng acid ascorbic trong lá cây đậu tương ở giai đoạn tạo quả trong

Ghi chú: Trong cùng một cột những số khác mẫu tự theo sau khác biệt nhau

ở mức ý nghĩa 5%

Kết quả phân tích cho thấy rằng, nồng độ chì trong nghiên cứu củachúng tôi đã ảnh hưởng đến hàm lượng acid ascorbic theo quy luật tương tựnhư giai đoạn cây non và ra hoa Ở nồng độ chì 0,1 mM, không có sự biếnđộng nhiều giữa công thức thí nghiệm và đối chứng Ở nồng độ 0,5 mM thìgiống ĐTDH.10 tăng 7,41% so với đối chứng, giống MTĐ 176 tăng 6,41% sovới đối chứng, giống ĐTDH.04 tăng ít hơn là 5,48% so với đối chứng Ở nồng

Sự biến động hàm lượng acid ascorbic của đậu tương ở giai đoạn tạoquả trong môi trường nhiễm chì thể hiện qua đồ thị 3.3.

Đồ thị 3.3 Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương ở giai đoạn tạo

quả trong môi trường nhiễm chì

Sự tăng hàm lượng acid ascosbic trong môi trường nhiễm chì cho thấyđậu tương phản ứng mạnh mẽ trước điều kiện bất lợi của môi trường Kimloại chì ảnh hưởng rất lớn đến sự tổng hợp acid ascorbic ở các giống đậutương và mức độ ảnh hưởng phụ thuộc vào đặc điểm của từng giống Giốngnào có khả năng chống chịu tốt với môi trường nhiễm kim loại nặng thì hàmlượng acid ascorbic tăng mạnh hơn so với các giống chống chịu kém hơn