Nghiên cứu một số đột biến gen k13 và plasmepsine 23 trên quần thể plasmodium falciparum liên quan đến kháng thuốc dihyrdoartemisinin piperaquin tại huyện tuy đức, tỉnh đăk nông

Định nghĩa mới của kháng artemisinin theo TCYTTG qua thờigian nghiên cứu có cập nhật 2010-2014 như là sự gia tăng thời gian làm sạchKSTSR, tương ứng ≥ 10% số ca theo dõi có KSTSR được ph

Chương 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về ký sinh trùng Plasmodium spp gây bệnh ở người

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng Plasmodium spp gây ra,

thường gặp ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Với hàng trăm ca tử vong mỗinăm, SR gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và thiệt hại nghiêm trọng vềkinh tế-xã hội, khoảng 90% trong số này xảy ra ở châu Phi và châu Á Thái Bình

Dương Bệnh lây lan chủ yếu từ người này sang người khác qua muỗi Anopheles

spp Ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) sống ký sinh chủ yếu trong hồng cầu (HC) vàgây tổn thương nhiều cơ quan khác nhau Biểu hiện cơn sốt rét điển hình, có kèmgan, lách lớn hoặc thiếu máu Ngoài ra, còn có sốt rét ác tính (SRAT) có thể gây

tử vong do thể não, đái huyết cầu tố, suy thận, suy gan, trụy tim mạch Đến nay,

Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận 5 loài Plasmodium spp gây bệnh cho người (P falciparum, P vivax, P malariae, P ovale và P knowlesis [43].

Chu kỳ phát triển KSTSR qua giai đoạn sinh sản hữu tính ở muỗi và giaiđoạn sinh sản vô tính thực hiện ở người Đời sống KSTSR trong người thay đổi

tùy theo loài với thời gian tồn tại dài hay ngắn P falciparum là loài có đặc điểm

bệnh sinh nghiêm trọng nhất so với các loài khác Với các nghiên cứu dựa trên y

học chứng cứ cho thấy nhiễm trùng P falciparum và P knowlesi ở đối tượng

chưa có miễn dịch sẽ có mật độ KSTSR trong HC rất cao và dễ chuyển vào SRAT

và tử vong nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời Chu kỳ vô tính của

P falciparum và P knowlesi có giai đoạn tiền HC duy nhất ở gan và thời gian

24 giờ, mà không có thể ngủ như các loài P vivax và P ovale Mặc dù chu kỳ vô tính HC là 48 giờ, nhưng sự phân chia thể phân liệt P falciparum thường không xảy ra

cùng lúc, nên tính chu kỳ của cơn sốt ở bệnh nhân đôi khi bất thường

1.2 Tổng hợp về tình hình ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

1.2.1.Tình hình kháng thuốc trên thế giới

Theo TCYTTG (WHO, 1981), định nghĩa một chủng KSTSR kháng thuốc

là khả năng một chủng KSTSR có thể sống sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã

được điều trị và hấp thụ một liều lượng thuốc bằng hoặc cao hơn liều thôngthường Kháng thuốc có thể là tương đối nếu như tăng liều trong giới hạn chịuđựng được của con người, có thể diệt được KSTSR [42] Các yếu tố quan trọngliên quan đến kháng thuốc gồm có thời gian bán hủy của thuốc kéo dài, bệnh nhânkhông theo đúng hướng dẫn điều trị, mức độ miễn dịch của bệnh nhân, loại thuốc.

Chủng P falciparum kháng chloroquine (CQ) lần đầu tiên xuất hiện năm

1957 tại biên giới Colombia-Venezuela (Moore và cs., 1961) và lan rộng nhanhhơn sau đó như tại biên giới Colombia-Venezuela (Peters và cs., 1960), biên giớiCampuchia-Thái Lan (Harinasuta và cs., 1961), tại Cam Ranh, Khánh Hòa của

Việt Nam (Powell và Alving., 1963) và từ đó P falciparum tiếp tục kháng cao CQ trên diện rộng hầu hết quốc gia có SRLH Trong vòng 20 năm, P falciparum

kháng CQ đã lan ra nhiều vùng Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Lào Đến năm

1978 xuất hiện kháng ở Kenya, Tanzania, Madagascar (1980), Angola, Rwanda(1984), Cameroon (1985), Nigeria (1987) Do đó, thuốc này nhanh chóng bị loạikhỏi danh mục thuốc thiết yếu và chính sách thuốc quốc gia từ những năm 1990

1.2.2 Kháng các thuốc quinin, proguanil, pyrimethamin và chloroquin

Loài P falciparum kháng quinin (QNN) được phát hiện từ 1910 ở Brazil.

Những năm 1930, mepacrine bắt đầu được dùng cùng với QNN Thời gian

1940-1950, một số thuốc mới đã được ra đời, bổ sung trong điều trị như amodiaquin,

proguanil P falciparum kháng proguanil và pyrimethamin được phát hiện từ đầu

những năm 1950 khi những thuốc này được dùng rộng rãi Đặc biệt, tại Đông

Nam Á, P falciparum kháng CQ gặp ở các nước với mức độ kháng tăng dần ở

châu Phi, đặc biệt vùng Tây Phi, nhưng có thay đổi ở các quốc gia châu Á Khángmefloquin (MQ) tăng nhanh ở Thái Lan

Sulfadoxin-Pyrimethamin (S/P) từ năm 1968 được dùng để điều trị P falciparum kháng CQ Tuy nhiên, phối hợp này không có hiệu lực chữa khỏi 100%, ngay cả những bệnh nhân nhiễm P falciparum nhạy Sự không đáp ứng tự

nhiên chiếm 10-20% Kháng Fansidar được phát hiện năm 1980 ở Thái Lan, năm

1981 ở châu Mỹ, mức độ kháng tăng dần và lan rộng ở nhiều vùng trên thế giới,

đặc biệt các nước Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ Mefloquin đưa vào dùng

năm 1972, đến năm 1986, tại Thái Lan cho thấy bắt đầu P falciparum kháng trên

in vivo và in vitro, nhất là tại một số vùng biên giới Campuchia-Myanmar.

1.2.3 Tình hình P falciparum kháng artermisinin và giảm hiệu lực với ACTs

Thuốc artemisinin và dẫn suất ra đời năm 1972 và đưa vào điều trị chủng

P falciparum kháng CQ và đa kháng ở Trung Quốc, Việt Nam và vài nước Đông

Nam Á Thuốc có tác dụng diệt KSTSR nhanh và cải thiện lâm sàng trong vòng24-48 giờ Tuy nhiên, trong giai đoạn 2006-2007, TCYTTG đã cảnh báo về sự

xuất hiện P falciparum kháng artermisinin ở biên giới Campuchia-Thái Lan, sau

đó là Việt Nam, Myanmar (2010) và Lào (2013) và đến nay đã đến mức báo động

ở Tiểu vùng sông Mê Kông [14],[41] Artemisinin có tiềm năng diệt nhanh thể tưdưỡng trẻ đến thể phân liệt già và có thể ức chế quá trình hình thành giao bào qua trung

gian làm giảm các giai đoạn trước trong chu kỳ Plasmodium spp Hoạt chất

dihydroartemisinin là một chất chuyển hóa chính của artemisinin, về hiệu lực có thểsánh ngang với artemisinin

Quá trình hình thành và phát triển kháng thuốc có thể chia thành hai yếu tốgóp phần: Một là các yếu tố liên quan đến di truyền phát sinh, hình thành các độtbiến kháng và thứ hai là quá trình chọn lọc kháng do lan truyền đột biến, nênkháng sẽ lan rộng Định nghĩa mới của kháng artemisinin theo TCYTTG qua thờigian nghiên cứu có cập nhật (2010-2014) như là sự gia tăng thời gian làm sạchKSTSR, tương ứng ≥ 10% số ca theo dõi có KSTSR được phát hiện vào ngày thứ

3 sau khi điều trị bằng thuốc phối hợp có artemisinins hay dẫn suất (ACTs) (gọi lànghi ngờ kháng); hay thất bại điều trị sau khi điều trị đơn thuần với artemisinins vớinồng độ thích hợp trong máu, bằng chứng là sự tồn tại của KSTSR sau 7 ngày

điều trị, hoặc sự hiện diện của KSTSR vào ngày thứ 3 và tái phát trong vòng28/42 ngày (gọi là xác định kháng) và đến năm 2018, TCYTTG có bổ sung cáctiêu chí về đột biến kháng gen K13

Tình trạng P falciparum kháng thuốc lan rộng nghiêm trọng trên thế giới

là một khó khăn cho việc lựa chọn thuốc điều trị Tại Việt Nam, chủng P falciparum kháng cao với CQ, MQ và giảm đáp ứng với nhiều loại thuốc hiện

dùng, ngay cả artemisinin và dẫn chất được thử nghiệm lâm sàng và chính thức đưa vào dùng ở Việt Nam từ 1997 có vai trò hạ thấp tỷ lệ mắc và tử vong [7],[9].

Các phối hợp ACTs nhằm mục đích đạt được hoạt tính diệt thể phân liệttrong máu nhanh bằng cách lựa chọn phối hợp có artemisinine cùng với mộtthuốc có hiệu lực kéo dài hơn liên quan đến cơ chế tác động khác nhau và thờigian bán hủy cũng khác nhau khi lựa chọn các thuốc đi kèm Phối hợpdihydroartemisinin-piperaquin (DHA-PPQ) là một trong 5 thuốc phối hợp ACTsđược khuyến cáo bởi TCYTTG [42]

DHA có tác dụng rất quan trọng diệt thể phân liệt, DHA là một chấtchuyển hoá chính có hoạt tính sinh học như artesunate và artemether được sửdụng thời gian dài trên toàn cầu Một vài nghiên cứu cho rằng thuốc tập trung có

tính chọn lọc vào tế bào nhiễm trên in vitro, phản ứng này sinh ra các gốc tự do

độc hại có thể phá huỷ các màng KSTSR Thành phần đi cùng là thuốc PPQ, có

cơ chế tác dụng tương tự như các quinolein khác, thay cho CQ và đóng vai tròquan trọng trong những năm 1980 PPQ có tác dụng tốt trên các thể trong HC của

P vivax, P malariae và các thể P falciparum, ngoại trừ giao bào Việc kết hợp

DHA có khả năng tiêu diệt KSTSR nhanh nhưng có thời gian bán hủy ngắn nên PPQ

có thời gian bán hủy dài, có thể ngăn chặn tái phát, nên cần thuốc đi cặp đôi

Phác đồ phối hợp DHA-PPQ khắc phục nhược điểm của từng loại thuốctrên khi dùng đơn trị liệu, cũng như có khả năng làm chậm kháng Các nghiêncứu đã khẳng định DHA-PPQ là một phối hợp ACTs hiệu quả cao và an toàn đối

với các KSTSR, kể cả P falciparum đa kháng Phối hợp ACTs đang được khuyến cáo dùng ưu tiên các ca P falciparum chưa biến chứng vì khi phối hợp

với PPQ có thời gian bán hủy kéo dài và trì hoãn kháng, thuốc tác động nhanh vàdung nạp thuốc tốt [10],[13]

Trong một vài nghiên cứu về DHA-PPQ đều cho kết quả chữa khỏi trên95% với tính dung nạp tốt trong điều trị bệnh nhân người lớn và trẻ em mắc sốt

rét do P falciparum cùng với các tác dụng ngoại ý không đáng kể Đồng thời,

DHA-PPQ có ưu thế hơn các thuốc phối hợp khác (artesunate-amodiaquine hay

artemether-lumefantrine) trong việc chống lại P falciparum khỏi sự tái phát sớm.

Hầu hết các bệnh nhân (97%) sạch KSTSR trong vòng 48 giờ, phác đồ PPQ chỉ ra tốc độ làm sạch KSTSR của DHA rất nhanh, và hiệu lực dự phòng sauđiều trị của phối hợp này là do PPQ đóng vai trò là một thuốc đi kèm [16],[17].Trẻ em dưới 5 tuổi có nguy cơ cao hơn về vấn đề tái phát KSTSR, thuốc DHA-

DHA-PPQ chứng minh an toàn, dung nạp tốt, hiệu lực cao trong điều trị ca bệnh P falciparum tại các quốc gia châu Á và châu Phi.

1.2.3.1 Trên thế giới

Đã có nhiều báo cáo về phác đồ đơn trị liệu artesunate trong thời gian 10năm trở lại đây với liệu trình 3 ngày, 4 ngày hoặc 5 ngày được thử nghiệm tạiThái Lan, Tanzania cho tỷ lệ chữa khỏi từ 72-100% Thực tế lâm sàng điều trị sốtrét đến nay chưa báo cáo kháng thuốc artemisinin thật sự, nhưng mô hình kháng

thực nghiệm trên loài gặm nhấm đã khẳng định (P yoelii hoặc P berghei kháng artemisinin và artemether hoặc P chabaudi kháng với artesunate) khoảng 20% số

ca còn tồn tại KSTSR ngày D3 (WHO, 2012) Ngoài ra từ những bằng chứng vềgiảm hiệu lực thuốc ART từ các nghiên cứu đánh giá hiệu lực quy mô đa quốc gia

và từ những báo cáo ca bệnh lâm sàng đơn lẻ cho thấy gia tăng áp lực thuốc là chỉđiểm quan trọng cho lan rộng KSTSR kháng thuốc và liệu trình dùng thuốc ARTkhông đủ liệu trình góp phần phát triển kháng [10],[13]

Phương pháp điều trị ACTs theo khuyến cáo của TCYTTG là liệu pháp

hàng đầu đối với các ca SR do P falciparum Loại thuốc này đem lại thành công

đáng kể trong việc giảm tỷ lệ tử vong do SR trên toàn cầu trong những năm qua

Tuy nhiên, P falciparum có một khả năng đề kháng với thuốc SR bằng sự tiến

hóa thích nghi, do đó hiệu quả ACTs đang bị đe dọa bởi việc xuất hiện KSTSR

kháng artemisinin Sự đề kháng trên lâm sàng của P falciparum với artemisinin

và dẫn xuất hiện nay đã xuất hiện tại phía Campuchia, Thái Lan, Việt Nam,Myanmar và Lào [46],[47] Điều này đe dọa việc kiểm soát SR và các hoạt độngloại trừ SR trên toàn cầu Do đó, vấn đề cấp thiết đặt ra là cần phải tìm ra các yếu

tố di truyền của KSTSR liên quan đến kháng artemisinin và xác định chỉ điểmphân tử để giám sát sự lan rộng kháng artermisinin

Liệu pháp thuốc hiện tại đang dùng đồng thời sử dụng hai hay nhiều thuốc

diệt thể phân liệt trong máu theo các cơ chế tác động riêng biệt Điều này cải thiệnhiệu lực điều trị và cũng làm trị hoãn phát triển kháng với từng thành phần của thuốcphối hợp Để chống lại sự phát triển kháng, TCYTTG khuyến cáo các liệu pháp đơntrị liệu phải được loại bỏ và các trường hợp SR nên điều trị với thuốc phối hợp códẫn xuất artemisinine và một thuốc khác có cơ chế tác động khác, nên ACTs ra đời làvậy Các dẫn xuất artemisinin làm giảm nhanh dung khối KST, trong khi có sự hiệndiện của thuốc thứ hai với cơ chế tác động khác sẽ làm giảm đi khả năng xuất hiệnchủng kháng thuốc TCYTTG khích lệ phát triển các phiên bản thuốc phối hợpACTs, hơn là chế phẩm cùng vỉ vì có thể dẫn đến sử dụng nhầm lẫn dùng để hỗ trợcho các đơn trị liệu của ART [10],[13] Điều đáng chú ý là trong Hướng dẫn chẩnđoán và điều trị sốt rét của TCYTTG đã đề cập DHA-PPQ vào như 1 liệu pháp ACTs

ưu tiên trong điều trị SR do P falciparum trên toàn cầu.

Một trong những vấn đề khó khăn trong sốt rét trên cơ địa phụ nữ mangthai là lựa chọn thuốc điều trị sốt rét [19],[22]

Hình 1.1.a Tình trạng P falciparum Hình 1.1b Tình trạng P falciparum

kháng artemisinine (WHO, 2015) kháng các thuốc ACTs (WHO, 2017)

Một số ít dữ liệu về DHA-PPQ trên PNMT thích hợp trong nghiên cứu đãcho kết quả rất an toàn, dung nạp tốt và hiệu quả trên PNMT Thử nghiệm lâmsàng ngẫu nhiên đối chứng so sánh DHA-PPQ và artesunate + amodiaquine trongđiều trị các PNMT 3 tháng giữa và 3 tháng cuối mắc SR chưa biến chứng để đánhgiá tính an toàn, dung nạp và hiệu lực thuốc DHA-PPQ Hiệu lực được đánh giávào thời điểm D28 và D42, nồng độ hemoglobin của mẹ vào thời điểm ngày D28 và

D42, tỷ lệ bất thường bẩm sinh và sinh non với độ tin cậy 95%

Tại Đông Nam Á, tình trạng chậm làm sạch KSTSR và kháng artermisinineđang phát triển phức tạp Từ năm 2013, TCYTTG đưa ra các khuyến cáo khẩn cấp

về tình hình kháng artemisinin như “một bệnh mới nổi” tại tiểu vùng sông MêKông và tỷ lệ tồn tại KSTSR ngày D3 được ghi nhận trên 10% Đặc biệt, tại

Campuchia, sau khi thực hiện ngăn chặn sốt rét năm 2009, số ca SR P falciparum

đã giảm, nhưng tỷ lệ ca sau khi được điều trị với DHA-PPQ tồn tại KSTSR ngày

D3 tăng từ 26% đến 45%, từ năm 2008-2010; song song với sự gia tăng thất bạitrong điều trị với DHA-PPQ được báo cáo từ 2008-2013 [14]

Tại Lào, thử nghiệm tiến hành tại Champasack (2013) báo cáo rằng 22,2%

số ca sau khi được điều trị bằng artemether-lumefantrine vẫn còn tồn tại KSTSRngày D3 và xuất hiện kháng artemisinin ở Nam Lào với hiện diện đột biến protein

K13 trong quần thể KSTSR đang lưu hành Tại Thái Lan, dùng phác đồ điều trịtrong 3 ngày AS-MQ nhưng thất bại điều trị tăng lên ≥ 10% và với artemether-lumefantrine có tỷ lệ thất bại cũng trên 10%

1.2.3.2 Tại Việt Nam

Miền Trung-Tây Nguyên là khu vực trọng điểm SR với trên 70% số ca mắc

và 80% ca tử vong hàng năm so với cả nước, đặc biệt chủng P falciparum đa

kháng thuốc

Tương tự như các quốc gia có SRLH khác trong khu vực tiểu vùng sông

Mê Kông, cho đến trước 2009, tại Việt Nam kháng thuốc cũng đã được ghi nhậnvới tất cả thuốc SR, ngoại trừ artemisinine và các dẫn suất Phối hợp DHA-PPQ

chứng minh có hiệu lực cao trong điều trị SR do P falciparum và là công cụ hữu

ích tại các vùng SRLH ở Việt Nam Tuy nhiên DHA-PPQ trong nghiên cứu thử

nghiệm lâm sàng tại Việt Nam tại những vùng SRLH nặng, đa kháng thuốc ởQuảng Trị, Ninh Thuận, Bình Phước, Gia Lai, Quảng Nam, Đăk Nông, Đăk Lăktrong thời gian từ năm 2011-2015 [36],[37] cho kết quả đáp ứng lâm sàng và KSTđầy đủ rất cao, song có một tỷ lệ nhỏ thất bại điều trị muộn Bên cạnh đó, tạinhiều tuyến bệnh viện điều trị khu vực miền Trung-Tây Nguyên trong thời gian từ

2007-2011 đã ghi nhận nhiều ca SR do P falciparum và/ hoặc nhiễm phối hợp P falciparum với một loài khác điều trị bằng DHA-PPQ cho kết quả còn tồn tại KST

vào ngày D3 sau khi kết thúc liệu trình 3 ngày [38], bất luận có ghi nhận về dungnạp hoặc không và một số yếu tố có thể ảnh hưởng lên hiệu quả điều trị cho cácBNSR tại hệ điều trị, cho thấy hiệu lực DHA-PPQ phần nào đã giảm, đặc biệt làkhâu làm sạch KST qua các cuộc giám sát đánh giá chất lượng chẩn đoán và điều

trị [4],[5],[6] Việc đánh giá đáp ứng P falciparum với các phác đồ phối hợp ACTs trên BNSR do P falciparum là hết sức cần thiết trước khi kháng thuốc xảy

ra thật sự Dẫn liệu còn cho thấy nhiều thử nghiệm lâm sàng in vivo tại Bình

Phước vào năm 2008-2011 và tại Gia Lai vào 2010-2011 đánh giá phác đồ ASđơn trị liệu và DHA-PPQ, theo dõi 28/ 42 ngày với nhiều cỡ mẫu khác nhau chothấy tỷ lệ D3(+) khoảng 20% [20],[21]

Tình trạng chậm làm sạch KST sau khi điều trị DHA-PPQ tại Việt Nam lầnđầu tiên được phát hiện tại Bình Phước (2009) Giám sát thường quy trong năm

2011 với DHA-PPQ cũng phát hiện hiện giảm nhạy với artemisinin ở Gia Lai (D3

dương tính 18%), tại tỉnh Đắk Nông và Quảng Nam (2012) [40] có tỷ lệ D3 dươngtính lần lượt 23,4% và 21% Tại miền Trung Việt Nam, hiệu quả DHA-PPQ có tỷ

lệ chữa khỏi cao nhưng thời gian và tỷ lệ làm sạch KST được cho là liên quan đếnkháng artemisinin (thời gian làm sạch KSTSR ≥ 72 giờ) Trong khi DHA-PPQ đãcho thấy hiệu quả tuyệt vời trong các thử nghiệm lâm sàng gần đây ở châu Phi vàmột số quốc gia châu Á thì tại Việt Nam, hiệu lực điều trị của phác đồ artesunatđơn thuần tại Gia Lai là 97,4%, tỷ lệ KSTSR còn dương tính ở ngày D3 là 38,5%

và ngày D4 là 23,1% trong năm 2013

Theo một nghiên cứu tổng hợp do Tạ Thị Tĩnh và cộng sự (2011) thựchiện, theo dõi 28 ngày về hiệu lực DHA-PPQ liệu trình 3 ngày và artesunate đơn

trị liệu 7 ngày tại Bình Phước [39], Đăk Nông [6], Ninh Thuận [37],[38], Gia Lai,Quảng Trị và Quảng Bình từ 2005-2010 [6], tổng số 417 ca điều trị bằng DHA-PPQ chỉ ra hiệu lực cao (ACPR = 97,8% ờ Bình Phước và 100% tại các vùng

khác), tỷ lệ sạch P.falciparum vào ngày D3 là 100% tại các nghiên cứu QuảngBình, Quảng Trị, Gia Lai, Ninh Thuận, Đăk Nông, nhưng vẫn còn 15,3% số ca

còn tồn tại P falciparum vào ngày D3 tại Bình Phước Tỷ lệ chữa khỏi của liệupháp artesunate đơn trị liệu từ 96,8-100% ở các vùng nghiên cứu khác nhau,

nhưng ở Bình Phước chỉ có 84,8% (2009) Đặc biệt, KSTSR P.falciparum tồn tại

vào ngày D3 tại Bình Phước tăng theo thời gian (từ 13,2% năm 2009 đến 24%năm 2010), nghiên cứu đã cho thấy có một mối liên quan giữa tồn tại KSTSRngày D3 với tái phát KST, nhưng không có khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mật

độ KSTSR ngày D0 với sự tái phát [6],[20],[21]

Một nghiên cứu khác từ 2012-2013 tại Quảng Nam theo dõi 42 ngày trên

95 ca SR do P falciparum, có 93.7% ca điều trị đầy đủ trong 3 ngày bằng

DHA-PPQ và có 92.6% ca được theo dõi đến ngày 42, tỷ lệ tồn tại KST dương tínhngày D3 là khoảng 30% và thời gian làm sạch ½ số lượng KST là 6,2 giờ, tăng sovới nghiên cứu trước đây tại miền Trung Việt Nam chỉ 2,9 giờ [40]

Thêm vào đó, liên quan giữa đột biến gen K13 propeller đối với khángartemisinin đang được các nhà khoa học quan tâm Đột biến gen K13 được xácđịnh tại nhiều vùng ở Campuchia và gần đây được báo cáo tại các quốc gia Tiểuvùng sông Mê Kông (Myanmar, Thái Lan, Việt Nam) Sự liên quan giữa alen đột

biến với tỷ lệ sống sót của KSTSR trong thử nghiệm in vitro và hiện tượng chậm làm sạch KSTSR trên in vivo, cho thấy chỉ điểm đột biến K13 propeller hiện là mộtchỉ điểm quan trọng trong kháng artemisinin [41],[47]

Tuy nhiên, nhiều đột biến K13 tồn tại, song không phải luôn luôn tỷ lệ thuậnvới sự làm sạch chậm KSTSR sau điều trị bằng ACTs như một chỉ điểm khángthuốc artemisinin và lan rộng, dường như độc lập với nhau Do đó, cần thiết phảihiểu và làm rõ vai trò tính đa hình đột biến K13 trong vấn đề kháng artemisinin đểgiám sát kháng thích hợp và tin cậy (Elizabeth A.W và cs., 2014)

Hiện tượng kéo dài thời gian sạch KSTSR so với số liệu trước đây tại châuPhi và châu Á như một chỉ điểm lâm sàng gián tiếp của thất bại điều trị hoặckháng với DHA-PPQ Việc phát hiện hiệu lực thuốc giảm không chỉ là bước đầutiên phổ cập các thông tin hữu ích cho công tác kiểm soát SR, mà còn đưa ra cácbằng chứng để xây dựng kế hoạch và chính sách thuốc với sự phối hợp toàn cầu

để ngăn chặn và loại trừ SR trên toàn thế giới [46]

Tại Việt Nam, ngay từ đầu những năm 1990 đã thử nghiệm lâm sàng cácthuốc artemisinin và dẫn xuất (artesunate, dihydroartemisinin) và đầu năm 2000,các thử nghiệm đầu tiên với thuốc ACTs như CV-8 và 5 năm trở lại đây với cácthuốc DHA-PPQ và phối hợp artemisinin + piperaquine, hoặc artesunate +amodiaquin, hay artesunate + mefloquin bước đầu cho hiệu lực rất cao, nhiềuphác đồ thử nghiệm nhiều vùng cho hiệu lực lên đến 100% [93] Nhìn chung, vớicác liệu trình ngắn ngày (2 hoặc 3 ngày), các phác đồ thuốc ACTs trên đều chohiệu lực cao từ 97-100%, một số ít có tỷ lệ thất bại điều trị vì nhiều lý do khoảng1-3%, song nhìn chung các phác đồ được dùng phổ biến và rộng rãi tại các quốcgia hiện nay và chỉ tập trung vào DHA-PPQ, A/L, artesunate + amodiaquine, thực

tế hiện trên phạm vi toàn cầu có đến ít nhất 90 quốc gia đang dùng các phác đồphối hợp thuốc này

Một nghiên cứu đánh giá và giám sát P falciparum kháng thuốc ART và

AS tại tỉnh Bình Phước, Việt Nam từ 1998 - 2009 Đây là một công trình phối hợpgiữa khoa y, đại học Melbourne, bệnh viện Royal Melbourne, Victoria, Úc vàViện Sốt rét-KST-CT TƯ, Việt Nam tiến hành Các dẫn chất của ART đã đượcdùng tại Việt Nam từ 1989, đã làm giảm số ca SR và từ vong SR đáng kể từ năm1991-2006 Hướng dẫn cũng như chính sách hiện tại của quốc gia đang khuyếncáo dùng các liệu pháp thuốc sốt rét phối hợp ACTs, dù AS vẫn đang còn có sẵntại hệ thống y tế tư nhân Các báo cáo gần đây cho thấy hiệu quả của ACTs và liệupháp AS đơn trị liệu có giảm tại phía tây Campuchia Nghiên cứu này nhằm đánh

giá mô hình kháng do P falciparum qua 10 năm tại một tỉnh phía nam Việt Nam

với BNSR được điều trị bằng các thuốc phối hợp có artemisinine [39]

Nghiên cứu được tiến hành tại hai xã của huyện Phước Long, tỉnh BìnhPhước, cách biên giới Campuchia về phía tây khoảng 100km, nên khả năng xảy rasốt rét kháng thuốc trên nhóm dân di biến động Thái Lan và Myanmar như đãtừng xảy ra với các vùng khác trên thế giới Lựa chọn này như một vùng có khả

năng xuất hiện kháng artemisinine vì tỷ lệ SR do P falciparum cao ở đây, thời

gian dùng thuốc ART và dẫn xuất tại đây cũng rất lâu Các giám sát dựa vào kỹ

thuật in vivo và in vitro đối với tính nhạy của P falciparum với các TSR qua thời gian năm 1998-2009 Các ca xác định nhiễm P falciparum được đưa vào điều trị

ART 5 ngày hoặc 7 ngày AS Tổng số 270 ca đưa vào nghiên cứu, kết quả thấythời gian làm sạch KST khác nhau giữa các năm 1998, 2001 và 2004/2005 (1,8;2,3 và 2,1 ngày nhưng giữa 1998 và 2008/2009 Thời gian làm sạch KSTSR trungbình có có liên quan đến mật độ KSTSR ngày D0 (r = 0,4; p < 0,001) Tỷ lệ thấtbại điều trị sau khi hiệu chỉnh PCR lần lượt là 13,8%, 2,9%, 1,2%, và 0% Độ

nhạy của P falciparum với ART trên in vitro ổn định trong thời gian theo dõi,

ngoại trừ có tăng EC90 và EC99 vào năm 2001 Nghiên cứu này chỉ ra mức độ

nhạy của P falciparum ổn định đối với hợp chất ART tại 2 vùng nghiên cứu qua

thời gian theo dõi là 10 năm [20],[21],[32]

Việc áp dụng các ACTs trong vùng năm 2003 có thể bảo vệ chống lại hìnhthành và phát sinh kháng ART Sự phối kết hợp giữa hướng dẫn của Việt Nam vàphiên bản mới nhất của TCYTTG khuyến cáo ACTs như liệu pháp đầu tay tại tất

cả các vùng SRLH và giám sát liên tục dọc theo biên giới Việt Nam-Campuchia

là cần thiết để ngăn ngừa lan tràn kháng thuốc ART tại Việt Nam Nhìn chung,thuốc phối hợp DHA-PPQ là thuốc hiệu lực cao đa chống kháng Tuy nhiên, DHAkhông thể là một dẫn xuất phù hợp nhất của dẫn xuất artemisinin trong các phốihợp ACTs vì tính ổn định với nhiệt kém khi công thức phối hợp Phối hợpartesunate-piperaquin có thể là một thay thế tốt hơn do lợi điểm tăng ổn định vớinhiệt độ hơn DHA Phối hợp nên có hiệu lực tương đương vì AS là chuyển hóanhanh thành DHA sau uống Điểm tồn tại trong nghiên cứu về cung cấp thông tin

mới đặc tính dược động học PPQ, bao gồm cả các nghiên cứu in vivo lâm sàng và

phi lâm sàng và cung cấp thêm cho vấn đề sử dụng PPQ như một thuốc đi

cùng trong ACTs tại các vùng SRLH Có thể nói rằng liệu pháp phối hợp PPQ như 1 công cụ sống còn trong nổ lực loại trừ SR Các ACTs làm tăng tỷ lệchữa khỏi lâm sàng và sạch KSTSR cũng như giúp giảm quá trình lựa chọn áp lựcthuốc để xuất hiện kháng với các thuốc.

DHA-Tỷ lệ D3 thay đổi ở tỉnh Gia Lai này cũng phù hợp với một số nghiên cứu

đa trung tâm ở Việt Nam trong thời gian 5 năm gần đây, chẳng hạn ở Bình Phướcđánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ tại nhiều điểm đã cho thấy thuốc giảm hiệu lực

và dần dần xác định kháng thuốc thật sự biểu hiện qua tỷ lệ thất bại đơn phầndihydroartemisinin hay cả thuốc đi kèm piperaquin tại huyện Bù Gia Mập, BùĐăng năm 2007, số ca theo dõi là 25 ca, hiệu lực đáp ứng lâm sàng và ký sinhtrùng đầy đủ (ACPR) là 100% và tỷ lệ ký sinh trùng ngày D3 là 4% (n = 25; 100%

và D3 = 4%), sau đó hai năm thì hiệu lực thuốc bắt đầu thay đổi ở năm 2009 (n =46; 97,8 và D3 = 15,3%), tiếp đó năm 2010 (n = 55; 100% và D3 = 22%), năm

2012 (n = 53; 100% và D3 = 30,6%), năm 2013 (n = 50; 100% và D3 = 36%) vàđến năm 2015 thì hiệu lực giảm rõ ràng với tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinhtrùng đầy đủ chỉ là 68,2%, kèm theo tỷ lệ thất bại điều trị cao gần 50%, kèm theo90% số ca có đột biến gen K13 propeller xác định C580Y và có cả đột biếnPlasmepsin 2/3 có liên quan đến kháng thuốc đi kèm PPQ (n = 44; 68,2% và D3

(+) 50%) Tuy nhiên, đến năm 2016, sau khi phác đồ điều trị bằng DHA-PPQ mới

ra có điều chỉnh liều dùng cao hơn so với phác đồ năm 2013 thì nghiên cứu cũngcho thấy kết cục không khả quan khi hiệu lực chỉ còn 37% nhưng tỷ lệ KST thể

vô tính ngày D3 giảm từ 36% còn 19,4% (n = 48; 37,0% và D3 = 19,4%), hay nhưnghiên cứu ở xã Ma Nới, huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận từ năm 2015 có tỷ lệKST thể vô tính ngày D3 là 10,9% thì năm 2017 chỉ còn D3 (+) là 3%, hay nghiêncứu ở huyện Tuy Đức, Đăk Nông năm 2014 có 60 ca, đáp ứng lâm sàng vàKSTSR đầy đủ là 100% và tỷ lệ KSTSR ngày D3 là 26,7% nhưng đến năm 2016với số cs nghiên cứu là 13, đáp ứng ACPR là 84,6% và tỷ lệ D3 dương tính cũngchỉ còn 23,1% [3],[4],[5],[6],[7]

Với hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong nghiên cứu này trình bày ở trên chothấy với phác đồ mới DHA-PPQ theo hướng dẫn mới của Bộ Y tế (2016) với tổng

liều 9 viên hoặc 12 viên tùy theo cân nặng của bệnh nhân như hiện nay, có thể

hiệu lực cao hơn so với nhóm bệnh nhân thử nghiệm in vivo với thuốc DHA-PPQ

liệu trình tổng liều 8 viên của Hướng dẫn phác đồ chẩn đoán và điều trị của Bộ Y

tế (2013) vì nghiên cứu năm 2014 đó có tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùngđầy đủ (ACPR) là 100% và tỷ lệ tồn tại KSTSR thể vô tính ngày D3 hay sau 72giờ là 11,5% nhưng nghiên cứu năm nay lại không thấy tồn tại D3 Số liệu này

tương tự như nghiên cứu in vivo đánh giá hiệu lực thuốc artesunate hay

DHA-PPQ tại huyện Thuận Bắc, Ninh Sơn tỉnh Ninh Thuận từ năm 2008, 2009, 2010,

2011 cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ là 100%, chưa có ca nào D3

dương tính, song đến năm 2013 cho tỷ lệ chữa khỏi dưới 100% và D3 (+) là 8% (n

= 51; ACPR = 100% và D3 là 8%) và đến năm 2015 cho tỷ lệ chữa khỏi cũng là100% nhưng tỷ lệ làm sạch ký sinh trùng có tăng lên thông qua tỷ lệ D3 (n = 40;ACPR = 100% và D3 là 11%) Tuy nhiên, ở điểm Ninh Thuận cũng cho thấy có tỷ

lệ đột biến gen đa hình K13 propeller với tỷ lệ dao động 20%, trên nhóm bệnhnhân người Răglay, đặc biệt có đột biến C580Y khá phổ biến ở khu vực tiểu vùngsông Mê Kông [27],[28]

So sánh với một số nghiên cứu khác gần đây thực hiện tại khu vực miềnTrung-Tây Nguyên, chẳng hạn nghiên cứu đánh giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ đối

với P falciparum tại huyện Cư Jut, tỉnh Đăk Nông cho thấy dù tỷ lệ đáp ứng lâm

sàng và ký sinh trùng đầy đủ là 100%, hiệu lực rất cao trong điều trị, song đáng

chú ý sự tồn tại ký sinh trùng P falciparum thể vô tính được đánh giá sau mỗi 12

giờ sau khi dùng thuốc DHA-PPQ, cho thấy tỷ lệ tồn tại ngày D3 là 15,5% và sau

D3 còn là 7,04% - như một chỉ điểm lâm sàng nghi ngờ kháng thuốc tại vùng này,trước khi khẳng định có kháng thuốc thì cần có phân tích thêm về mặt gen học,phát hiện đột biến đơn điểm K13 propeller theo quy định và định nghĩa khángthuốc của TCYTTG (WHO, 2015)

Đối chiếu với các nghiên cứu in vivo gần đây, như ở Phú Yên cho hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong điều trị sốt rét do P falciparum chưa biến chứng cho

thấp đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR) là 100%, không có trườnghợp thất bại điều trị, tổng số ca mất theo dõi do nhiều lý do là 3 (8,11%) và đặc

biệt chưa có ca nào còn tồn tại KSTSR ngày D3 sau điều trị Một số nghiên cứukhác thực hiện tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên, chẳng hạn nghiên cứu đánh

giá hiệu lực thuốc DHA-PPQ đối với P falciparum tại huyện Cư Jut, tỉnh Đăk

Nông cho thấy dù tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ là 100%, hiệu

lực rất cao trong điều trị, song đáng chú ý sự tồn tại ký sinh trùng P falciparum

thể vô tính được đánh giá sau mỗi 12 giờ sau khi dùng thuốc DHA-PPQ, cho thấy

tỷ lệ tồn tại ngày D3 là 15,5% và sau D3 còn là 7,04% - như một chỉ điểm lâmsàng nghi ngờ kháng thuốc tại vùng này, trước khi khẳng định có kháng thuốc thìcần có phân tích thêm về mặt gen học, phát hiện đột biến đơn điểm K13 propellertheo quy định và định nghĩa kháng thuốc của TCYTTG năm 2014 Theo dõi đầy

đủ trong 7 ngày đầu với 71 ca sốt rét do P falciaprum cho thấy có 11 ca (15,5%)

còn tồn tại thể vô tính trong máu với tốc độ giảm ký sinh trùng khác nhau trêntừng ca bệnh [8],[37],[38] Song, tính trung bình mật độ KST của toàn bộ 11 canày từ ngày D0, D1, đến D5 cho thấy mật độ đã giảm đi đáng kể từ D0 sang D1

(bằng chứng góc alpha-slope) và từ D1 sang D2, D3 giảm chậm hơn và từ D3 sang

D5 giảm dần tương ứng với thời gian bán hủy thuốc DHA-PPQ Phân tích tổng số

71 ca sốt rét do P falciparum, với mật độ ký sinh trùng ban đầu 35.295/l vào

ngày D0, sau khi dùng DHA-PPQ cho thấy thời gian làm sạch ký sinh trùng trungbình khoảng 60 giờ và thời gian cắt sốt là 18 giờ Số liệu này cho thấy tương tựnhư một số nghiên cứu trước đây tại Bình Phước, Gia Lai, Đăk Nông, QuảngNam

Số liệu trên cũng tương tự như nghiên cứu của Huỳnh Hồng Quang và cộng

sự tiến hành tại các điểm xã Hàm Cần, huyện Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận hayhuyện Buôn Đôn, tỉnh Đăk Lăk từ năm 2014-2016 đều cho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng

và KST đầy đủ là 100% và chưa có tình trạng chậm làm sạch KST hay D3 dươngtính [2],[3] Tuy nhiên, trên thực hành lâm sàng tại bệnh viện đa khoa Buôn Đôncho thấy nhiều ca bệnh biểu hiện còn tồn tại KSTSR ngày D3 dương tính và cáclam máu được kiểm định lại bởi Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn thẩm định lại làđúng, số liệu này như một cảnh báo là một cảnh báo sớm như một chỉ điểm lâmsàng nghi ngờ kháng thuốc xảy ra tại vùng huyện Buôn Đôn này

Nhiều nghiên cứu của tác giả Tạ Thị Tĩnh và cộng sự (2011) hay của BùiQuang Phúc và cộng sự (2014) và Trần Tịnh Hiền và cộng sự (2014) tại Bù Đăng(Bình Phước) và Huỳnh Hồng Quang và cộng sự (2014) Tuy Đức (Đăk Nông),Phú Thiện (Gia Lai), Nam Trà My (Quảng Nam) với hiệu lực đáp ứng lâm sàng

và ký sinh trùng đầy đủ từ 91,2-100%, song tỷ lệ tồn tại KST thể vô tính ngày D3

dao động 14,7-44% qua các nghiên cứu hiệu lực trên in vivo và in vivo cải tiến

[24], rút ngắn ngày theo dõi, đánh giá giám sát chỉ điểm K13 có liên quan đếnkháng thuốc [4],[7],[40] Song song, các nghiên cứu tại các điểm ở Gia Lai cũngcho diễn tiến tương tự như hai tỉnh Bình Phước và Đăk Nông nhưng tại các vùngkhông có đường biên giới và nhóm bệnh nhân không có giao lưu biên giớiCampuchia, có xu hướng đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ giảm và tỷ lệKSTSR ngày D3 dương tính tăng dần như năm 2007-2008 cho thấy tỷ lệ đáp ứngACPR là 100%, không có D3 dương tính, sang năm 2010 tại các điểm Phú Thiệncho tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và KST giảm còn 94,8% và D3 (+) là 11,7%, năm

2010 với 34 ca tại điểm Konch’ro cho đáp ứng lâm sàng và KST đầy đủ là 100%

và D3 (+) là 3% Đặc biệt, trong thời gian từ 2012-2016 tại huyện Phú Thiện, đặcbiệt tại Krông Pa cho tỷ lệ đáp ứng ACPR giảm và tỷ lệ D3 tăng lần lượt 23%;26,4%, 44,2% và 29,4% [4],[5],[6]

Một số nghiên cứu trong các tỉnh khác dọc theo các tỉnh ven biển miền

Trung như tại huyện Nam Trà My, Quảng Nam với 89 ca nhiễm đơn thuần P falciparum chưa biến chứng theo dõi liên tục cũng cho thấy đáp ứng ACPR là

97,7% và tỷ lệ D3 (+) là 29,2% [40] hay tại huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa

từ năm 2011 trên 30 ca cho thấy đáp ứng ACPR là 100% và không có D3, đếnnăm 2014 nghiên cứu trên 46 ca cho tỷ lệ ACPR là 100% nhưng có tỷ lệ D3 là17,4%

1.3 Các phương pháp nghiên cứu và đánh giá mức độ kháng [23],[29]

Các kỹ thuật nghiên cứu KSTSR kháng thuốc được nhiều tác giả trên thế

giới xây dựng và áp dụng rộng rãi, trong đó quan trọng phải kể đến kỹ thuật in vivo, in vitro và sinh học phân tử như (PCR, Nested PCR và giải trình tự gen) Về nguyên tắc, giám sát đáp ứng KSTSR với thuốc chống SR theo phương pháp in

vivo và in vitro cần làm thường xuyên Trong đó, giám sát in vivo là phương pháp

quan trọng nhất trong quyết định phác đồ điều trị, phát triển chính sách thuốc sốt

rét thiết yếu quốc gia theo từng giai đoạn Việc giám sát trên in vitro đánh giá độ

nhạy cảm của KSTSR với thuốc sẽ cung cấp những dấu hiệu dự báo sớm khángthuốc và bổ sung dữ liệu cho thay đổi chiến lược thuốc trên địa bàn

1.3.1 Kỹ thuật nghiên cứu in vivo

Với mục đích đánh giá hiệu lực thuốc, xác định hiệu quả thực tế từng phác

đồ thuốc, giám sát đáp ứng với thuốc và xây dựng chính sách quốc gia, TCYTTG

đã đưa ra một số thử nghiệm phù hợp trong nghiên cứu kháng:

 Thử nghiệm in vivo 7, 14 hay 28 ngày để đánh giá hiệu lực thuốc điều trị:

+ Nhạy (Sensitivity_S): sạch KSTSR thể vô tính máu ngoại vi trong 7 ngày đầu (kể từ ngày uống thuốc) và không tái phát trong 28 ngày tiếp theo;

+ Kháng độ 1 (Resistance I_RI): KSTSR tái phát trong phạm vi 3 tuần sau;

+ Kháng độ 2 (RII): mật độ KSTSR ngày thứ 7 (D7) giảm so với ngày D0;

+ Kháng độ 3 (RIII): mật độ KSTSR không giảm mà tăng so với ngày D0

 Đánh giá đáp ứng điều trị theo 3 loại: thất bại điều trị sớm, thất bại điều trị muộn và đáp ứng lâm sàng đầy đủ (WHO, 2005)

- Thất bại điều trị sớm (Early Treatment Failure_ETF)

+ Phát triển các dấu chứng nguy hiểm hoặc SR nặng vào ngày D1, D2 hoặc D3

kèm theo có KSTSR trong máu;

+ Mật độ KSTSR trong máu vào ngày D2 cao hơn ngày D0 không tính đến hay bất luận nhiệt độ cơ thể như thế nào;

+ Có KSTSR trong máu vào ngày D3 và nhiệt độ nách ≥ 37,5°C;

+ Mật độ KSTSR trong máu vào ngày D3 ≥ 25% mật độ ngày D0

- Thất bại điều trị muộn (Late Treatment Failure_LTF), gồm có:

+ Thất bại lâm sàng muộn (Late Clinical Failure_LCF) gồm có (i) Phát triển

các dấu hiệu nguy hiễm hoặc sốt rét ác tính vào bất kỳ ngày nào từ D4 đến D28 kèmtheo có KSTSR trong máu mà trước đó không có bất kỳ tiêu chuẩn thất bại điều trị sớmnào; (ii) Có KSTSR trong máu và nhiệt độ nách ≥ 37,5°C vào

bất kỳ ngày nào từ D4 đến D28 mà trước đó không có bất kỳ tiêu chuẩn thất bạiđiều trị sớm nào;

+ Thất bại KSTSR muộn (Late Parasitological Failure_LPF): Có KSTSR trong

máu vào bất kỳ ngày nào từ D7 đến D28 và nhiệt độ nách < 37,5°C mà trước đó không

có tiêu chuẩn thất bại điều trị sớm hoặc thất bại điều trị muộn

- Đáp ứng lâm sàng và KSTSR đầy đủ (Adequate Clinical & Parasitological Respone_ACPR): Không có KSTSR trong máu vào D28 không tính đến nhiệt độ nách,trước đó không có bất kì tiêu chuẩn nào về thất bại điều trị sớm hoặc

thất bại lâm sàng muộn hoặc thất bại KSTSR muộn

1.3.2 Kỹ thuật in vitro: đây là thử nghiệm đánh giá ngưỡng nồng độ thuốc ức

chế sự trưởng thành của thể nhẫn thành schizonte trong môi trường nuôi cấy

24-30 giờ có các nồng độ thuốc khác nhau:

- Macrotest (hay kỹ thuật Rieckman macro test, 1968)

Kỹ thuật này dựa trên đánh giá sự ức chế tư dưỡng P falciparum phát triển

thành thể schizonte trong môi trường nuôi cấy có glucose của ống chứng (không

có thuốc) so với các ống chloroquin có nồng độ thấp tăng lên cao dần 3nmol/ml) Bộ thử Macrotest do TCYTTG cung cấp Kết quả của kỹ thuật nàyphụ thuộc nhiều yếu tố (hấp thu thuốc, miễn dịch bệnh nhân

(0,25 Micro test (hay kỹ thuật Rieckmamm micro test, 1978)

Dựa trên kết quả nuôi cấy liên tục P falciparum bằng môi trường RPMI

1640 của W.Trager và B Jensen (1976), thay vì việc lấy l0 ml máu tĩnh mạch ở

kỹ thuật Microtest, kỹ thuật Microtest chỉ lấy máu ở đầu ngón tay, có thể thửđược nhiều loại thuốc cùng lúc Đánh giá kết quả dựa vào sự ức chế hoàn toàn thể

tư dưỡng thành schizonte so với giếng chứng

Hiện nay, TCYTTG đã lưu hành rộng rãi bộ microtest với hầu hết thuốc sốtrét đang sử dụng như chloroquin, amodiaquin, mefloquin, artemisinin Ưu điểm

của macrotest và microtest là đánh giá chủng P falciparum nhạy/ kháng thuốc ở điều kiện thực địa, giám sát sự nhạy cảm P falciparum nhằm phát hiện sự xuất

hiện của kháng thuốc Nhược điểm Macrotest và microtest là thử nghiệm khi ápdụng rộng rãi tại vùng SRLH, trang thiết bị phức tạp, cán bộ thực hiện phải thành

thạo về kỹ năng.

- Test 48 giờ: Kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật microtest, trong microtest sử

dụng 10% hồng cầu (HC) trong môi trường nuôỉ cấy P falciparum RPMI 1640,

trong kỹ thuật 48 giờ chỉ dùng 4% HC Vì vậy, không cần thay môi trường, mà

nuôi KSTSR trong 48 giờ Phương pháp này rất có ích để đánh giá nhạy, khángvới CQ so sánh với các thuốc khác, kể cả thuốc mới (artemisinin và các dẫn chất).Tuy nhiên, có nhược điểm trong 48 giờ thể schizonte vỡ ra, xâm nhập HC mới,nên phải đếm lượng KSTSR trên 10.000 HC;

- Test 72 giờ: P falciparum nuôi cấy 3-4 ngày và được thích nghi ở điều kiện

labo Dịch treo HC 5% hồng cầu nhiễm KSTSR 3-15% pha loãng với HC lành để cómật độ KSTSR 0,3-0,5 HC nhiễm Các đĩa nuôi cấy bao gồm các đĩa có nồng độ thuốckhác nhau Hàng ngày thay môi trường không thuốc (chứng), đĩa có thuốc, sau 72 giờlấy mẫu máu nuôi cấy làm tiêu bản giọt mỏng, nhuộm giemsa đếm mật độ KSTSR/10.000 HC

Phương pháp này đánh giá tính nhạy cảm của KSTSR với thuốc, xác địnhnồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ ức chế có hiệu quả (EIC) của thuốcvới KSTSR Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là đòi hỏi phải trong điềukiện trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật phức tạp, thao tác thuần thục chuẩn xác.Thay môi trường hàng ngày, giá thành thử nghiệm cao

- In-vitro RSA test (RSA 0-3h Witkowski B., 2013): Phương pháp này dùng để

đánh giá độ nhạy của P falciparum với thuốc mới artemisinin Kỹ thuật thử nghiệm

RSA0-3h được thực hiện trong môi trường nuôi cấy KST đồng bộ cao KSTSR dạng thểnhẫn sau khi xâm nhiễm 0-3 giờ được cho tiếp xúc với 700nM dihydroartenisinin hoặcdung dịch DMSO (dimethyl sulfoxide) trong 6 giờ, sau đó rửa và nuôi cấy KSTSRtrong 6 giờ tiếp theo trong môi trường không có thuốc Tỷ lệ KSTSR sống sót sẽ đượctính toán bằng cách đếm dưới giọt mỏng nhuộm giêm sa

1.3.3 Chỉ điểm phân tử xác định P falciparum kháng artemisinin [15],[18]

Ký sinh trùng P falciaprum kháng với artemisinin và các dẫn suất tại

nhiều vùng trong khu vực Đông Nam Á đe dọa các thành quả của chương trình

phòng chống và loại trừ SR Để giám sát hiệu lực thuốc và thực trạng khángthuốc diễn ra quy mô nào thì việc phát hiện các chỉ điểm phân tử rất cần thiết.Liên quan giữa đột biến gen K13 đối với kháng artemisinin đang được các nhàkhoa học quan tâm nghiên cứu Tính đa hình các đột biến gen K13 được xác định

có mặt tại nhiều tỉnh của Campuchia và gần đây được báo cáo tại nhiều nơi trênthế giới, đặc biệt khu vực tiểu vùng sông Mê Kông (Myanmar, Thái Lan, ViệtNam, Bangladesh, Lào) [22]

Nghiên cứu của Frederic Ariey và cộng sự (2014) nhằm phát hiện một chỉ

điểm (marker) phân tử kháng artemisinin, dòng P falciparum F32-ART5 kháng

artemisinin đã được chọn lọc bằng phương pháp nuôi cấy liên tục từ dòngKSTSR nhạy cảm với artermisinin F32-Tanzania dưới áp lực thuốc artemisinintrong 125 chu kỳ trong 5 năm với liều tăng dần thuốc artemisinin Giải trình trình

tự toàn bộ gen F32-TEM, F32-Tanzania hoặc 3D7 (dòng KST nhạy cảm vớiartermisinin), nhóm nghiên cứu đã phát hiện dòng KSTSR kháng ART F32-ART5 có 07 gen [24], mà mỗi gen chứa đựng một mã codon đột biến so với cácdòng KSTSR còn lại, trong khi dòng KSTSR nhạy không tìm thấy các đột biếnnày [26]

Trong số những gen này, chỉ có PF3D7-1343700 cho thấy mối liên quanquan trọng với tỷ lệ sống sót của KSTSR trong thử nghiệm RSA0-3h Gen PF3D7-

1343700 nằm ở vị trí 5,9 kb ở phần đầu locus có trọng lượng phân tử 35kb vànằm trong vùng dấu hiệu ưu tiên để chọn lọc [25] Ngoài ra trong nghiên cứu này

đã có sự kết hợp các đột biến trên domain PF3D7 Kelch propeller (K13) với kháng

thuốc artemisinin trên nghiên cứu thử nghiệm in vivo và in vitro Do vậy đa hình

đột biến gen K13 được dùng để tạo ra chỉ thị phân tử xác định kháng artemisinin

vì một số lý do:

- Có sự mất liên tiếp những chủng KSTSR kiểu hoang dại ở phía tây Campuchiasuốt giai đoạn bắt đầu có sự kháng artemisinin;

- Kiểu KSTSR đột biến tăng lên về tần số tại các vùng kháng thuốc của

Campuchia và xuất hiện rất ít ở những nơi kháng ART là không phổ biến;

- Gen PF3D7_1343700 nằm trong vùng dấu hiệu ưu tiên để chọn lọc;

- Những đột biến đa dạng trên K13-propeller phản ánh chọn lọc dương;

- Những đột biến xảy ra trên vùng gen có tính bảo tồn cao của P falciparum, chỉ

có một đột biến đa hình đơn nucleotide dạng SNPs (single nucleotide polymorphism)được ghi nhận từ một phân lập ở châu Phi;

- Tất cả các kiểu đa hình được quan sát là khác thường (trừ kiểu V568G);

- 3 đột biến có tần số cao nhất trong gen K13 có mối liên quan chặt chẽ với tỷ lệRSA0-3h trong nghiên cứu in vitro trên các mẫu phân lập và thời gian làm sạch 50% số

lượng KSTSR trên bệnh nhân;

- Tần xuất xuất hiện của những allen đột biến tương quan mạnh với tỷ lệ

KSTSR dương tính ngày D3 sau khi điều trị bằng thuốc ACTs[15],[18]

1.4 Nghiên cứu về đa hình đột biến gen K 13 và plasmepsine trên thế giới 1.4.1 Gen K 13 propeller và cơ chế kháng artemisinin trên góc độ sinh học phân tử

Gen Kelch 13 propeller gồm có 3 domain với 225 acid amin:

 Một domain có đầu N có tính chất bảo tồn đặc trưng cho Plasmodium spp.

 Một domain BTB/POZ và Phía đầu C với 6 domain hình cánh quạt điển hìnhcho motif Kelch Motif Kelch chứa protein được bảo tồn qua tiến hóa giữa các loàikhác nhau và nhóm lại thành loại protein KLHL Vật chủ là người chứa 42 proteintrong protein KLHL Đa hình các điểm đột biến gen K13, còn được gọi là “vùng cánhquạt” của protein K13 đã được chứng minh có liên quan đến tỷ lệ sống còn của KSTSRtrong thử nghiệm RSA0–3h, đồng thời có liên quan đến hiện tượng chậm làm sạchKSTSR hay giảm sự nhạy cảm của KSTSR với thuốc ở giai đoạn tư dưỡng và tỷ lệ

KSTSR dương tính vào ngày thứ 3 (giờ thứ 72) ở bệnh nhân điều trị SR do P falciparum với ACTs.

Hình 1.2 Một số loại đột biến gen K13 liên quan kháng trên P falciparum

Theo Frederic Ariey (2014), đa hình đột biến trên protein vùng cánh quạt K13

tập trung tại các tỉnh Campuchia, nơi hiện tình trạng kháng artermisinin diễn raphổ biến và các tần số alen đột biến ngày càng tăng có liên quan đến sự lan củakháng artemisinin ở Campuchia[15],[18]

Nghiên cứu cũng cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa sự hiện diện của

alen đột biến, tỷ lệ KSTSR sống sót trong thử nghiệm in vitro, giống nghiên cứu thử nghiệm ex vivo (Witkowski B và cs., 2013) và tỷ lệ làm sạch KSTSR trong thử nghiệm in vivo Mối tương quan này đã chỉ ra rằng đột biến K13-cánh quạt làyếu tố quyết định quan trọng của cơ chế kháng artermisinin và nghiên cứu củaFrederic Ariey và cộng sự (2014) cũng đã xác định đa hình các đột biến trênprotein K13 như một marker phân tử kháng arermisinin của P falciparum và xác

định được 17 alen đột biến trên protein K13 ở Campuchia [29]

Mặc dù đã xác định được lượng lớn đột biến, chỉ có một số alen đột biến cótần số cao (> 5%), có chứa đột biến SNPs, cụ thể là Y493H, R539T và C580Ynằm tương ứng ở vị trí cánh quạt 2, 3 và 4 Nghiên cứu này đã lập bản đồ các

điểm đột biến xác định tỷ lệ KSTSR có chứa các đột biến có nghĩa và sự phân bốđịa lý của chúng [30] Quan trọng hơn, phân bố tần số của alen đột biến tại cáctỉnh khác nhau cũng phù hợp với tỷ lệ tồn tại KSTSR ở ngày D3 ở bệnh nhân sau

khi được điều trị bệnh SR do P falciparum với thuốc phối hợp ACTs Hiện tượng

này được xem là chỉ điểm gợi ý cho kháng artemisinin trong điều trị lâm sàng

Ngoài ra, nghiên cứu của Ashley và cộng sự (2014) tại các nước Đông Nam

Á và một số nước châu Phi như Nigeria, Congo, Kenya đã chỉ ra tình trạng chậmlàm sạch KSTSR (thời gian làm sạch ½ KST > 5 giờ), cũng liên quan chặt chẽ vớicác đột biến điểm trên K13-propeller Trong nghiên cứu này, các đột biến cánhquạt K13 có 91,8% độ nhạy và độ đặc hiệu 88,4% với thời gian làm sạch 50%dung khối KSTSR > 5 giờ Tuy nhiên, việc kháng thuốc artemisinin lây lan chủyếu là tại các nước Đông Nam Á

Nghiên cứu từ 2007 đến 2012 tại biên giới Trung Quốc và Myanmar cũng

đã xác định được 17 đột biến gen K13 với 7 loại đột biến mới Đột biến F446Ichiếm ưu thế với 27,2%, C580Y xuất hiện với tần số thấp 1,6% và có sự gia tăng

về tần số KSTSR mang gen đột biến theo từng năm Tuy nhiên, lại không tìm thấycác đột biến I543T, R539T và Y493H liên quan đến tình trạng chậm làm sạchKSTSR như ở Campuchia, kể cà M476I Đi kèm là tỷ lệ tồn tại KSTSR ngày D3

tại khu vực này là > 10%, cần có những nghiên cứu tiếp theo về khả năng khángartemisinin lan rộng sang các nước thuộc tiểu vùng Mê Kông [11],[12]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Kamala Thriemer và cộng sự (2015) tạiQuảng Nam, từ 2012-2013, trong 83 mẫu phân lập được phân tích về mặt phân tử

có 67 mẫu có mang đột biến gen K13 tại vị trí 543 và 493, không tìm thấy đột biếntại vị trí 539 và 580 [40] Mẫu phân lập mang đột biến tại vị trí 543 có thời gianlàm sạch KSTSR cao hơn đáng kể so với mẫu mang đột biến hoang dại Độ nhạy,

độ đặc hiệu của đột biến SNPs 543 với tình trạng chậm làm sạch KSTSR lần lượt

là 91,4% và 27,1% Với tỷ lệ tồn tại KSTSR ngày D3 gần 30%, điểm theo dõi củaNam Trà My (Quảng Nam) cùng với điểm Phú Thiện (Gia Lai) được TCYTTGđánh giá là khu vực đầu tiên của Việt Nam không có giao lưu biên giới nghi ngờxuất hiện kháng thuốc ART [8],[27],[28],[44]

Mặt khác, theo nghiên cứu tiến hành tại Bangladesh, Abu Naser Mohon(2014) đã phát hiện đột biến A578S nằm gần vị trí với đột biến C580Y ở ĐôngNam Á Theo tác giả, đột biến này gây ra sự thay đổi cấu trúc không gian củaprotein bằng cách thay đổi bề mặt tương tác với protein khác dẫn đến biến đổichức năng sinh học của protein, làm ảnh hưởng đến hoạt động của ART, kết quả

là thời gian làm sạch KSTSR bị kéo dài Tuy nhiên, đột biến này không liên quanđến việc tăng thời gian làm sạch ½ KSTSR hay nói cách khác là không liên quanđến kháng ART Dẫn liệu đã chứng minh rằng đột biến liên quan chặt chẽ vớikháng ART là không có mặt ở Bangladesh Việc xác định liệu kháng ART gây ra

sự lây lan hay là độc lập với sự nổi lên do sốt rét tại khu vực biên giớiCampuchia-Thái Lan là cần thiết Nếu kháng thuốc tồn tại ở một khu vực nhỏ, nó

có thể được kiểm soát và loại trừ, ngược lại kháng thuốc có thể lây lan sang cácnước lân cận khi đó sẽ là thảm họa phức tạp [44]

Theo Rie Isozumi và cộng sự (2015) tại Kenya, đã xác định được 4 độtbiến có ý nghĩa và 5 đột biến “im lặng” ở vùng bảo tồn cao của gen K13 trên P falciparum và các đột biến này có tính chất xuất hiện theo mùa (?) Tuy nhiên,

những đột biến này không giống với công bố của Ariey và cộng sự năm 2014.Tác giả đã tìm ra đột biến A78S tại quần đảo Mfangano Cũng tương tự nhưnghiên cứu của Abu Naser Mohon tại Bangladesh, tác giả cũng cho rằng đột biếnnày làm biến đổi acid amin, nằm gần vị trí với đột biến C580Y (được xác định tạiCampuchia), ảnh hưởng đến tương tác protein-protein, điều này làm ảnh hưởngđến tính nhạy của KSTSR với artemisinin [29]

Tại Myanmar, P falciparum kháng artemisinin được được báo cáo tại khu

vực biên giới Myanmar- Thái Lan từ nhiều năm trước và gây chậm làm sạchKSTSR sau điều trị ACTs cũng được xác định ở Myanmar [44]

Trong 2011-2012, dẫn liệu cho thấy tỷ lệ chậm làm sạch KSTSR là 15%,với thời gian làm sạch ½ số lượng KST là > 5 giờ và khoảng 25% số ca có mangcác đột biến gen K13(Ashley EA và cs., 2014) Nghiên cứu đánh giá sự hiện diệntính đa hình các đột biến trên protein K13 hiện nay tiếp tục được thực hiện với cácmẫu giấy thấm thu thập tại Myanmar trong suốt nghiên cứu về hiệu quả phương

pháp điều trị trong thời gian 2012-2013 nhằm mục đích lập bản đồ mức độ khángartemisinin và đáp ứng khẩn cấp các hoạt động ngăn chặn phù hợp Nghiên cứutrong năm 2013-2014, đã xác định được 29 đột biến khác nhau tại vị trí sau acidamin 210, với 26 đột biến trong số đó nằm sau vị trí acid amin 440 (cho thấy hầuhết các đột biến này nằm tập trung tại cánh quạt đầu tiên, từ acid amin 441-475)với 3 đột biến có tần số cao nhất lần lượt là C580Y , F446I và P574L và nhiều độtbiến khác, phần lớn các đột biến này đã được xác định trong các nghiên cứu tạiCampuchia Đặc biệt là sự có mặt của đột biến M476I do quá trình chọn lọc trongthời gian dài với áp lực thuốc artemisinin [25],[26] Đột biến C580Y được cho làliên quan đến tình trạng chậm làm sạch KSTSR có mặt ở khu vực biên giới củaMyanmar-Thái Lan [30] với tần số cao nhất, tiếp theo đó là F446I ở khu vực gầnbiên giới Ấn Độ Trong khi sự phân bố khác nhau của các đột biến tại các vùngđịa lý khác nhau chưa được làm rõ nhưng có thể giải thích rằng Myanmar đang ởgiai đoạn đầu của quá trình tiến hóa (so với các điểm ở Campuchia) Những độtbiến ở Myanmar cho thấy sự giảm mức độ kháng artemisinin, có thể là do có sựchọn lọc đặc biệt từ việc sử dụng thuốc SR, tính di truyền của vật chủ hoặc muỗisinh học có thể dẫn đến sự phân bố khác nhau về các đột biến ở 2 vùng phía Nam

và bắc Myanmar

Nghiên cứu tại Uganda đánh giá sự liên quan giữa đột biến gen K13 vàFalcipain-2 với tình trạng kháng artemisinin Loại Falcipain-2 hay cysteineprotease falcipain-2 (FP2; PF3D7_1115700) là một enzym protease thủy phânhemoglobine của hồng cầu vật chủ Đột biến tại codon 69 dẫn đến gián đoạn genFalcipain-2 có thể “khóa lại” quá trình thủy phân hemoglobin, dẫn đến KSTSRtăng nhạy cảm với các chất ức chế protease và kết quả là làm giảm hoạt động củaartemisinin (Rosenthal PJ và cs., 2011) Phân tích về mặt phân tử, ngoài sự có mặtmột số đột biến không liên quan đến kháng artemisinin, không thấy có mặt cácđột biến C580Y, R539T hay Y493H, là những đột biến liên quan chặt chẽ với tìnhtrạng chậm làm sạch KSTSR tại các nước Đông Nam Á, kể cả đột biến M476I.Như vậy, sự hạn chế về đa hình các đột biến gen K13 và đa dạng trong cấu trúcgen Falcipain-2 không thay đổi trước và sau khi sử dụng ACTs một cách rộng rãi

để điều trị SR do P falciparum cho thấy đột biến gen K13 không ảnh hưởng đến

việc điều trị bằng ACTs và ACTs vẫn là thuốc điều trị sốt rét P falciparum hiệu

quả tại quốc gia này [44]

Tất cả kết quả trên cho thấy mối quan tâm đến kháng thuốc artemisinin trởthành vấn đề cấp bách tại Việt Nam, một quốc gia chia sẻ với dải biên giới dài vớiCampuchia, Lào, Trung Quốc, đặc biệt là các tỉnh miền Trung-Tây Nguyên - nơi

có tỷ lệ mắc và tử vong cao do sốt rét hàng năm và các nguy cơ giảm hiệu lựcDHA-PPQ, thậm chí thất bại điều trị hoặc kháng là có thể rất cao Vấn đề cầnthiết hiện nay vẫn đang thiếu một marker phân tử có ý nghĩa trong việc kiểm soát

sự lây lan của P falciparum kháng với artermisinin trong điều trị lâm sàng, điều

này đã cản trở việc tập trung ngăn chặn KSTSR kháng artemisinin tại các khu vực

đã được ghi nhận là có tình trạng kháng artemisinin và gây ảnh hưởng đến việcphát hiện nhanh KSTSR ở những nơi khác, nơi ACTs vẫn là thuốc chống sốt réthiệu quả và giá hợp lý [28],[44]

Nhìn chung, đột biến K13 cung cấp một công cụ phân tử mới tiềm năng đốivới kháng artemisinin, có liên quan đến quá trình làm sạch KSTSR thể vô tính tạicác điểm kháng thuốc Nhiều đột biến K13 tồn tại, song không phải luôn luôn tỷ lệthuận với sự làm sạch chậm KSTSR sau điều trị artesunate hoặc dẫn suất Xuấthiện kháng artemisinin và lan rộng dường như độc lập, do đó cần phải hiểu vàlàm rõ vai trò chỉ điểm phân tử K13 để giám sát kháng artemisinin

1.4.2. Gen plasmepsin 2-3 và cơ chế kháng piperaquine trên góc độ

sinh học phân tử

Gen plasmepsin là một họ gen gồm 4 gen plasmepsin I, II, III, IW (Amato

và cs, 2017) Đây là gen nằm trên nhiễm sắc thể số 14 Trong nhóm 4 gen ở trên,chỉ có gen plasmepsin 2,3 liên quan đến sự gia tăng tỷ lệ IC50 trong thử nghiệmvới piperaquine Dạng hoang dại của KST chỉ mang 1 bản sao của gen plasmepsin2,3; dạng đột biến mang 2 bản sao của gen plasmepsin 2,3 được mô tả rõ tronghình dưới đây

Hình 1.3: Mô hình khuếch đại gen plasmepsin 2,3; 4 gen plasmepsin được biểu thị

bằng 4 màu khác nhau và được đánh số I-IV

Nhóm nghiên cứu Benoit Witkowski và cộng sự (2016) đã xác định được

sự khuếch đại của gen plasmepsin 2-3, mã hoá các enzyme proteaza liên quan đến

suy thoái hemoglobin như là một dấu hiệu phân tử quan trọng nhất liên quan đếnkhả năng đề kháng piperaquine in-vitro và được đánh giá bằng cách sử dụngphương pháp PSA Bằng phương pháp sử dụng một mẫu lớn các mẫu thu thậpđược trong các nghiên cứu về hiệu quả lâm sàng của dihydroartemisinin-piperaquine được thực hiện ở Campuchia từ năm 2009, Benoit Witkowski và cộng

sự (2016) đã kiểm tra 725 phân lập P falciparum và phát hiện ra rằng số lượng genplasmepsin 2 tăng lên liên quan chặt chẽ đến thất bại điều trị dihydroartemisinin-piperaquine Các bệnh nhân nhiễm ký sinh trùng có biển thể đa hình plasmepsin 2

có nguy cơ tái phát lại cao gấp 20 lần trong thời gian 42 ngày sau điều trị (độ nhạy94% và độ đặc hiệu 77%) Trong kết quả nghiên cứu này về các mẫu thu thậpđược ở Cam-pu-chia trong suốt thập kỷ qua cho thấy tỉ lệ ký sinh trùng có biểnthể đa hình plasmepsin 2 tương quan với sự gia tăng tỷ lệ thất bại điều trịdihydroartemisinin-piperaquine, từ năm 2009 đến năm 2015 ở phía tây Cam-pu-chia và trong năm 2014-2015 ở phía đông Campuchia Trong những khu vực xuấthiện kháng artemisinin, hiệu quả điều trị của DHA-PPQ vào ngày 42 giảm xuốngdưới 90% trong khi đó tỉ lệ ký sinh trùng đa bào plasmepsin 2 tăng trên 22%

Hình 1.4 Giả thuyết về cơ chế kháng của ký sinh trùng P falciparum với

piperaquine

Trong giai đoạn KSTSR xâm nhập vào hồng cầu, sự phân hủyHemoglobin cần thiết cho sự tổng hợp vật chất di truyền của KSTSR giúp cho quátrình tăng trưởng trong giai đoạn hồng cầu Quá trình này xảy ra trong không bàotiêu hóa giàu acid, việc này được xem là liên quan đến hoạt động của 4 emzyme

protease do nhóm gen plasmepsin quy định được đặt tên là plasmepsin 1-4 Các

emzyme này giúp phân hủy Hemoglobin thành các aciamin cần thiết cho quá trìnhtăng trưởng của KSTSR Do đó, các emzyme này được xem là điểm đích của quátrình kháng thuốc piperaquine (Pedro et al, 2009)

Trong trường hợp ký sinh trùng nhạy cảm với piperaquine, piperaquinetích lũy trong không bào dinh dưỡng của ký sinh trùng qua cầu nối base yếu, kênhvận chuyển PfMDR1 có thể giúp tích lũy piperaquine vào không bào tiêu hóa,giải thích lựa chọn đối với đa hình Pfmdr1 Piperaquine cản trở quá trình tiêu hóahemoglobin của ký sinh trùng trong hồng cầu nhờ vào quá trình gắn vào cácemzyme plasmepsin, dẫn đến cản trở sự tổng hợp nucleoprotein của ký sinh trùngdẫn đến ký sinh trùng bị tiêu diệt (Withnoski et al, 2017)

1.5 Nguyên nhân phát sinh, phát triển KSTSR kháng thuốc

Ký sinh trùng P falciparum có nhiều yếu tố thuận lợi để hình thành kháng

thuốc có thể do các nguyên nhân sau:

- Áp lực thuốc: khi dùng một loại thuốc trong một thời gian dài và phạm virộng trong quần thể, nhất là vùng bệnh lan truyền cao, sẽ tạo điều kiện thuận lợi chochủng biến dị, kháng tự nhiên dần nhân lên, thay thế chủng nhạy bị “tiêu diệt” từ từ

(hay sàng lọc cạnh tranh) Gen nhạy và kháng thuốc của P falciparum là một phức hợp đã được chứng minh rằng đơn dòng có đáp ứng khác nhau với thuốc (nghĩa là sẽ

có dòng nhạy và dòng kháng) Khi dùng một loại thuốc thời gian dài ngoài sự kiểmsoát, không đủ liều mà mật độ KSTSR cao sẽ khó diệt tận gốc, thì chủng KSTSR dễthích nghi với thuốc;

- Sinh thái người di biến động: KSTSR thường phát sinh và phát triển ở nhữngnơi có nhiều nguồn bệnh, mật độ KSTSR cao ở quần thể chưa có miễn dịch mới vàovùng SRLH nặng có thể làm KSTSR kháng lan rộng do dịch chuyển;

- Quá trình đột biến gen, đột biến phân tử KSTSR cũng gây ra kháng thuốc;

- Tần suất thay đổi nội sinh về mặt di truyền xảy ra khi phát triển KSTSR Mức

độ kháng thay đổi do đột biến di truyền cũng như thay đổi cơ chế kháng;

- Tỷ lệ KST phơi nhiễm cũng như nồng độ thuốc mà KST phơi nhiễm;

- Đặc tính về dược học và chất lượng thuốc, về mặt bệnh nhân (liều lượng, thờigian, tuân thủ điều trị) cũng như mô hình dùng thuốc tại các CSYT trong vùng Đặcbiệt dùng PQ diệt giao bào chống lây lan chủng kháng;

- Đặc tính miễn dịch của cộng đồng đang sống trong các vùng lan truyền;

- Sự xuất hiện đồng thời các thuốc khác có hay không có đặc tính chốngKSTSR và sự tương tác qua lại giữa các thuốc đó khi dùng trên bệnh nhân

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu gồm bệnh nhân sốt rét nhiễm đơn thuần ký sinh trùng

P falciparum

- Tiêu chuẩn chọn bệnh:

+ Tuổi từ 3 tuổi trở lên đến dưới 70 tuổi;

+ Nhiễm đơn thuần loại KSTSR P falciparum;

+ Mật độ KSTSR thể vô tính P falciparum trong máu từ 500-200.000/µL máu;

+ Nhiệt độ nách hoặc tai > 37,5°C hoặc nhiệt độ dưới lưỡi/ đại tràng > 38°C;

+ Chưa dùng một loại thuốc SR nào trước đó;

+ Bệnh nhân, hoặc người thân, hoặc giám hộ đồng ý hợp tác nghiên cứu

- Tiêu chuẩn loại trừ:

+ Nhỏ hơn 3 tuổi hoặc lớn hơn 70 tuổi;

+ Phụ nữ đang có thai, hoặc đang cho con bú;

+ Người đang có bệnh rối loạn tâm thần kinh, động kinh;

+ Nôn mửa, tiêu chảy trầm trọng hoặc thể trạng không hấp thu được thuốc;+ Sốt rét có biến chứng hoặc mắc các bệnh nhiễm trùng phối hợp;

+ Nhiễm sốt rét phối họp P falciparum với loài Plasmodium spp khác;

+ Bệnh nhân đã dùng thuốc có hoạt tính thuốc trong 48 giờ trước nghiên cứu.+ Bệnh nhân trong độ tuổi sinh sản cần phải thử test thai âm tính

- Thuốc hạ sốt acetaminophen dùng liều 15mg/kg/ ngày, khoảng cách chia ra các lần dùng là mỗi 4-6 giờ khi có sốt từ ≥ 38,50C;

Bảng 2.1 Liều dùng viên thuốc sốt rét phối hợp DHA-PPQ (Arterakine®)

Tại địa bàn hai xã Đăk Ngo và Quảng Trực, thuộc huyện Tuy Đức, tỉnh

Đăk Nông Đây là các vùng SRLH nặng với tỷ lệ P falciparum và P vivax chiếm

cao trong cơ cấu, đồng thời là điểm nóng sốt rét của tỉnh Đăk Nông có chungđường biên giới với các tỉnh Campuchia;

+ Đây là 2 trong số các xã biên giới giữa 2 nước Việt Nam-Campuchia với địabàn xã cách thị trấn khoảng 22 km và 70 km lần lượt từ hai xã Quảng Trực và

Đăk Ngo và về phía thị xã Gia Nghĩa là 76 km Điểm đặc biệt là nhiều hộ giađình xây cất nhà cạnh rừng nên dễ lây truyền sốt rét;

+ Đa số dân là người đồng bào M'Nông và một số dân tộc thiểu số khác, điềukiện kinh tế còn nhiều khó khăn, phong tục tập quán còn lạc hậu, nhiều nhóm người đilàm trong rừng thường xuyên và ở lại rừng, khai thác lâm thổ sản, lấy măng rừng, vậnchuyển gỗ thuê hoặc giao lưu biên giới, qua lại tỉnh Bình Phước dài ngày;

+ Mùa sốt rét chủ yếu là từ cuối tháng 5 kéo dài đến hết tháng 10 hằng năm với

cơ cấu loài P falciparum và P vivax chiếm ưu thế.

Hình 2.1 Điểm nghiên cứu Đăk Ngo & Quảng Trực, huyện Tuy Đức (Đăk Nông)

- Thời gian:

Nghiên cứu tiến hành từ tháng 9/2018-7/2019

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Mục tiêu 1: Thiết kế nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng không đối chứng với đề

cương Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2009) và theo dõi bệnh nhân trong 42 ngày;

- Mục tiêu 2: Thiết kế theo kỹ thuật phòng thí nghiệm để phân tích các đột biến

gen K13 tại la bô bằng kỹ thuật qPCR và giải trình tự xác định đột biến gen K13 và

Plasmepsine 2/3.

2.4 Cỡ mẫu nghiên cứu

- Mục tiêu 1: Trong nghiên cứu, chọn tỷ lệ thất bại của thuốc DHA-PPQ tại Bình

Phước trước đó khoảng 10%, nên tỷ lệ được chọn để ước tính p = 10%, độ tin cậy

95%, độ chính xác d = 10%

Bảng 2.2 Cỡ mẫu tối thiểu dựa trên tỷ lệ thất bại lâm sàng

Tỷ lệ ước tính trong quần thể (p), độ tin cậy 95%

d 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50

Dựa trên bảng 2.1, khi đó cỡ mẫu tối thiểu cần đánh giá hiệu lực thuốc là n

= 35 ca Để tránh số ca mất mẫu, mất theo dõi trong quá trình nghiên cứu dài

ngày, nên cộng thêm 10%, nên cỡ mẫu cuối cùng là n ≈ 39 Số mẫu này cũng được

dùng phân tích đột biến gen K13 và Plasmepsine 2/3 liên quan kháng thuốc

- Mục tiêu 2: Cỡ mẫu là toàn bộ số bệnh nhân sốt rét do P falciparum đủ tiêu

chuẩn tham gia nghiên cứu ở mục tiêu 1 trong suốt thời gian nghiên cứu;

2.5 Quy trình theo dõi bệnh nhân trước, trong và sau khi uống thuốc

- Những bệnh nhân (BN) đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu sẽ cho một mã số

riêng và chỉ định điều trị sau khi được giải thích đầy đủ về nghiên cứu và cam kết Bất

kỳ một BN nào quyết định không tham gia nghiên cứu sẽ được khám và điều trị SR

như thường quy hướng dẫn của Bộ Y tế

- Lịch trình theo dõi được chuẩn bị rõ ràng cho BN, ngày BN bắt đầu đưa vào

nghiên cứu và cho uống thuốc liều đầu tiên gọi là ngày đầu tiên hoặc D0

- Tất cả BN sau khi uống thuốc được nghiên cứu viên giám sát trong 30 phút về

hay uống thuốc có giám sát trực tiếp; nếu BN nôn mửa trong vòng 30 phút đầu sẽ được

điều trị lại với liều tương tự và theo dõi tiếp 30 phút nữa, nếu nôn trở

lại sẽ loại khỏi ra sau khi đã điều trị thay thế bằng artesunate tiêm hoặc quinine+ clindamycine;

2.6 Một số kỹ thuật nghiên cứu

2.6.1 Đánh giá thông số lâm sàng

- Ghi lại chi tiết bệnh sử, số ngày có sốt và biểu hiện triệu chứng lâm sàng, loại thuốc đã sủ dụng trước khi tiếp cận và đưa vào nhóm nghiên cứu;

- Tiến hành cân nặng, tuổi, giới tính, địa chỉ liên hệ và số điện thoại (nếu có);

- Đánh giá lâm sàng sẽ thực hiện trên tất cả đối tượng và khám thực thể vào thời

điểm bắt đầu (D0) cũng như vào các ngày D1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, hoặc D 42.

2.6.2 Đo nhiệt độ cơ thể

- Đo nhiệt độ cơ thể bệnh nhân thực hiện vào thời điểm bắt đầu nghiên cứu (D0)

cũng như vào các ngày từ D1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42;

- Nếu nhiệt độ < 360C, sẽ lấy lại nhiệt độ thêm lần nữa theo quy trình Quy trìnhnhư trên sẽ thực hiện trong suốt quá trình nghiên cứu

2.6.4 Xét nghiệm nước tiểu tìm thuốc sốt rét hoặc tình trạng mang thai

- Mẫu nước tiểu sẽ được lấy vào ngày D0 để tìm xem có sự có mặt của các loạithuốc hoặc chất chuyển hóa của thuốc SR khác nhau bệnh nhân đã dùng trước

đó theo các phương pháp phát hiện màu như kỹ thuật Dill và Glazko;

- Đối với các phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ mắc sốt rét mà đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiêncứu, cần lấy mẫu nước tiểu đánh giá tình trạng mang thai

2.6.5 Xét nghiệm lam máu và đếm mật độ ký sinh trùng

- Xét nghiệm lam máu giọt dày và mỏng, đếm KSTSR để sàng lọc vào ngày D0

và xác định tiêu chuẩn chọn bệnh hoặc tiêu chuẩn loại trừ Lam giọt dày cũng sẽ kiểmtra vào các ngày tiếp theo từ D1, 2, 3, 4, 5 và D7

- Những lam máu sẽ được đánh dấu, dán nhãn cẩn thận theo quy đinh trước (sốsàng lọc, số nghiên cứu, ngày theo dõi và lấy máu) Cả 3 lam máu (2 lam giọt dày và 1lam giọt mỏng/ bệnh nhân), trong đó 1 lam sẽ nhuộm nhanh (giêm sa 10% trong 10-15phút) để sàng lọc ban đầu, trong khi các lam khác chúng ta vẫn nhuộm theo quy trìnhthường quy;

- Vì khi đủ tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu, chúng ta sẽ nhuộm lam thứ 2 cẩn thận hơn (nồng độ giêm sa 2,5-3% trong 45-60 phút);

- Phương pháp nhuộm chậm sẽ sử dụng cho các lam máu khác trong quá trìnhtheo dõi Lam máu giọt dày cho sàng lọc ban đầu được kiểm tra và đếm thể vô tính của

Plasmodium spp MĐKSTSR được tính như sau:

Số lượng KSTSR đếm được x 8.000Mật độ ĐKSTSR/µl =

Số lượng bạch cầu đếm được

- Hai kỹ thuật viên chuyên về KHV sẽ soi độc lập tất cả lam máu và đếm mật độKSTSR bằng số trung bình của 2 kỹ thuật viên;

- Các lam máu có kết quả không tương ứng (khác nhau giữa hai XNV về chủngloại KSTSR hoặc khác nhau về MĐKSTSR hơn 50%) sẽ được kiểm tra lại lần thứ 3bởi một XNV độc lập và MĐKSTSR sẽ được tính số trung bình của hai người có giátrị gần tương đương nhau

2.6.6 Phân tích sinh học phân tử đánh giá tái phát và tái nhiễm

Phân tích PCR để phân biệt giữa tái phát (cùng dòng KSTSR) và tái nhiễm(khác dòng KSTSR) Phát hiện và xác định loài KSTSR bằng kỹ thuật nested-PCR, phân tích kiểu gen dựa trên tính đa dạng di truyền của những kiểu gen

KSTSR loài P falciparum như SMP1 (merozoite surface protein 1), SMP2 (merozoite surface protein 2) và GLURP (glutamate-rich protein) hay viết tắt là msp1, msp2 và glurp Dữ liệu kiểu gen KSTSR trước-sau được so sánh theo cặp.

Giấy thấm Whatman (Whatman®cellulose chromatography papers 3MM,

mã số Z270849) được dùng để thu mẫu máu bệnh nhân tại các thời điểm D0 và Dngày xuất hiện lại KST hay thời điểm nghi thất bại điều trị

Đệm TBE 1X là một dung dịch đệm chứa hợp chất (tris base, boric acid vàEDTA) thường dùng trong quy trình liên quan đến acid nucleic Agarose gel vàethidium bromide dùng để điện di sản phẩm DNA Một số thiết bị chuyên dụngnhư máy PCR, bộ điện di gel agarose 2%, máy ly tâm siêu tốc, cân phân tích và

hệ thống chụp kết quả điện di gel SDS-8000 Phần mềm Labwork 3.0 dùng đểphân tích ảnh kết quả điện di

Bảng 2.3 Các gen đa hình và trình tự mồi phân tích tái phát và tái nhiễm

KS TS R Fal1 5’-TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT-3’

205bpFal2 5’-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3’

hiệ i

Viv1 5’-CGC TTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3’

120bpViv2 5’-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA-3’

M1-2MR 5-ATCTGAAGGATTTGTACGTCTTGAATTACC-3

M1-2RF 5-TAAAGGATGGAGCAAATACTCAAGTTGTTG-3 M1-2RR 5-CATCTGAAGGATTTGCAGCACCTGGAGATC-3 M2-0F 5-ATGAAGGTAATTAAAACATTGTCTATTATA-3 M2-0R 5-CTTTGTTACCATCGGTACATTCTT-3

M2-ICF 5-AGAAGTATGGCAGAAAGTAAkCCTYCTACT-3 M2-ICF 5-GATTGTAATTCGGGGGATTCAGTTTGTTCG-3 M2-FCF 5-AATACTAAGAGTGTAGGTGCARATGCTCCA-3 M2-FCR 5-TTTTATTTGGTGCATTGCCAGAACTTGAAC-3 G-OF 5-TGAATTTGAAGATGTTCACACTGAAC-3 G-OR 5-GTGGAATTGCTTTTTCTTCAACACTAA-3 G-FN 5-GTGTCACACTGAACAATTAGATTTAGATCA-3

Xác định và phân loại Plasmodium spp bằng kỹ thuật PCR, với P falciparum có băng điện di kích thước 205bp, P vivax 120bp, P malariae 144bp

và P ovale 786 bp.

Phân tích so sánh kiểu gen và alen giữa các mẫu máu thu nhận vào ngày D0

với ngày mà xuất hiện lại KSTSR trong quá trình theo dõi 42 ngày

Xác định tái phát khi kiểu gen và alen ở ngày D0 giống hệt kiểu gen ngày

có KST tái xuất hiện và tái nhiễm khi kiểu gen và alen ở D0 khác ngày D xuấthiện lại KST Xác định dạng phối hợp tái phát cùng với tái nhiễm khi Dtái phát vừa

có kiểu gen hoặc alen mới và cũ giống nhau ngày D0

2.6.7 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của KSTSR được tách chiết bằng phương pháp tách muối(salting out- NUREX) Quy trình tách chiết tóm tắt như sau:

- Mỗi mẫu máu được bảo quản trong microvette ở -20 0 C;

- Sau rã đông, thêm dd RCLB với tỷ lệ 4:1, trộn đều rồi đem đi ly tâm nhẹ trongvòng 1 phút, rửa lại với dung dịch RCLB 3 lần, thu cặn và thêm 340µl dd WCLB, 15µlproteinase K và 15µl SDS 10%, ủ ở nhiệt độ 550C trong 20 phút;

- Thêm 250µl dd NaCl và trộn đều, ly tâm 13.000 vòng/phút (5 phút);

- Chuyển dịch nổi vào tube eppendorf mới, thêm isopropanol với tỷ lệ 1:1 hoặc ethanol với tỷ lệ 1:2, bảo quản ở -200C trong 120 phút;

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút và loại bỏ dịch nổi;

- Rửa pellet DNA 2 lần với 1ml ethanol Ly tâm 13.000 vòng/phút (1 phút);

- Loại bỏ dịch nổi, làm khô pellet ở nhiệt độ phòng 5-10 phút;

- Huyền phù pellet DNA bằng cách thêm 50µl nước cất vô trùng (chú ý thêm từng giọt), bảo quản ở nhiệt độ 40C trong 12 giờ Ủ ở nhiệt độ 550C/10 phút;

- Đo nồng độ DNA ở bước sóng 260/280nm và cuối cùng bảo quản DNA ở -

200C hoặc -800C cho đến khi sử dụng

2.6.8 Giải trình tự và đánh giá đột biến đơn Kelch 13 propeller

Đánh giá thông qua khâu giải trình tự đối với SNPs PF3D7-1343700 Kelch

protein propeller domain theo quy trình (Frederic Ariey, 2013) Quy trình này

được thiết kế để phát hiện các đột biến điểm dựa trên genotype trên NST số 13

(PF3D7-1343700) trên protein Kelch của P Falciparum

Mẫu giấy thấm có máu bệnh nhân hoặc tube chứa máu toàn phần

- Các đối tượng có sốt, lấy máu đầu ngón tay bằng microvette có chứa EDTA(qua Accu check) Mẫu nghiên cứu được lấy vào ngày D0 và D3 Các mẫu ngày D0 sau

đó được tách chiết DNA và tiến hành kỹ thuật khác Mẫu D3 được tách chiết DNA vàlàm qPCR để đánh giá tình trạng chậm làm sạch KSTSR

- Mỗi mẫu máu bệnh nhân đươc bảo quản, chuyển về labo để phân tích;

- Lam máu bệnh nhân sẽ được lấy mỗi 12 giờ/1 lần và đếm mật độ KSTSR cho đến khi sạch KSTSR trong máu (âm tính 2 lần liên tiếp);

- Bảo quản trong một hộp lạnh tối đa là 6 giờ và giữ ống microvette ở -20°C chođến khi tách chiết DNA

2.6.9 Kỹ thuật qPCR sử dụng trong nghiên cứu P falciparum