Nghiên cứ tỉ lệ thiếu enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase và biến thể di truyền của nó trên một số quần thể dân cư tại miền trung tây nguyên

ĐOÀN THỊ YẾN NHI NGHIÊN CỨU TỈ LỆ THIẾU ENZYME GLUCOSE - 6 - PHOSPHATE DEHYDROGENASE VÀ BIẾN THỂ DI TRUYỀN CỦA NÓ TRÊN MỘT SỐ QUẦN THỂ DÂN CƯ TẠI MIỀN TRUNG - TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN

ĐOÀN THỊ YẾN NHI

NGHIÊN CỨU TỈ LỆ THIẾU ENZYME

GLUCOSE - 6 - PHOSPHATE DEHYDROGENASE

VÀ BIẾN THỂ DI TRUYỀN CỦA NÓ TRÊN

MỘT SỐ QUẦN THỂ DÂN CƯ TẠI MIỀN TRUNG - TÂY NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Bình Định – Năm 2019

ĐOÀN THỊ YẾN NHI

NGHIÊN CỨU TỈ LỆ THIẾU ENZYME

GLUCOSE - 6 - PHOSPHATE DEHYDROGENASE

VÀ BIẾN THỂ DI TRUYỀN CỦA NÓ TRÊN

MỘT SỐ QUẦN THỂ DÂN CƯ TẠI MIỀN TRUNG - TÂY NGUYÊN

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Người hướng dẫn : TS HUỲNH HỒNG QUANG (Hướng dẫn 1)

TS TRẦN THANH SƠN (Hướng dẫn 2)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng với các nghiên cứu viên tại Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Quy Nhơn và giảng viên của Đại học Quy Nhơn đồng thực hiện Các số liệu về kết quả nêu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Đoàn Thị Yến Nhi

LỜI CẢM ƠN

Luận văn hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ của Quý thầy cô, các bạn đồng nghiệp và gia đình Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:

TS.BS Huỳnh Hồng Quang và TS Trần Thanh Sơn là hai thầy giáo đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, chỉnh sửa toàn

bộ đề cương và luận văn, cũng như động viên tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Trân trọng cảm ơn đến Trường Đại học Quy Nhơn, Ban Giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo sau đại học giúp cho hoàn thiện hồ ớ dự tuyển chương trình cao học, đồng thời đã dành mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn đến Quý thầy cô, đồng nghiệp đang công tác tại Khoa Sinh-Kỹ thuật Nông nghiệp, Đại học Quy Nhơn và khoa Nghiên cứu và Sinh học phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn đã luôn khuyến khích, tạo điều kiện thực hành tốt nhất, đóng góp ý kiến sâu sắc trong bản thảo luận văn hoàn chỉnh

Chân thành cảm ơn đến các cán bộ y tế từ TTYT huyện đến các Trạm y tế

xã, y tế thôn buôn đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tham gia thực hiện đề tài tại thực địa

Kính trân trọng cảm ơn cha mẹ - người luôn mong muốn các con mình tiến

bộ, là động lực mạnh mẽ, gánh vác việc gia đình cho tôi yên tâm học tập, nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến tất cả bệnh nhân đã chia sẻ thông tin và mẫu bệnh phẩm để số liệu xét nghiệm nghiên cứu một cách đầy đủ nhất

Tác giả luận văn

Đoàn Thị Yến Nhi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIÊT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các lớp thiếu men G6PD và biểu hiện bệnh trên lâm sàng 10

Bảng 1.2 Phân loại thiếu men G6PD theo Tổ chức Y tế thế giới 13

Bảng 1.3 Phân nhóm các biến thể thiếu men G6PD 19

Bảng 2.1 Giá trị đối chiếu của hoạt độ enzyme G6PD 37

Bảng 2.2 Biến thể và các enzyme phân cắt giới hạn áp dụng phân tích 40

Bảng 2.3 Biến số, chỉ số, định nghĩa biến số và cách thu thập biến số 40

Bảng 3.1 Đặc điểm chung về mẫu nghiên cứu theo giới tính 42

Bảng 3.2 Đặc điểm chung về mẫu nghiên cứu theo nhóm tuổi 42

Bảng 3.3 Đặc điểm chung về mẫu nghiên cứu theo dân tộc 43

Bảng 3.4 Tỷ lệ thiếu G6PD chung theo từng giới nam nữ 44

Bảng 3.5 Tỷ lệ thiếu G6PD theo từng nhóm dân tộc tại 3 điểm nghiên cứu 45

Bảng 3.6 Tỷ lệ thiếu enzyme G6PD theo giới nam ở từng nhóm dân tộc 45

Bảng 3.7 Tỷ lệ thiếu enzyme G6PD theo giới nữ ở từng nhóm dân tộc 46

Bảng 3.8 Phân loại thiếu và bán thiếu enzyme G6PD theo nhóm dân tộc 49

Bảng 3.9 Mức độ thiếu enzyme G6PD phân theo giới tính nam nữ 50

Bảng 3.10 Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng sốt rét qua điều tra cắt ngang 52

Bảng 3.11 Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng sốt rét theo giới tính ở các dân tộc 53

Bảng 3.12 Tỷ lệ nhiễm KSTST theo nhóm tuổi của từng dân tộc 53

Bảng 3.13 Thiếu enzzyme G6PD và nhiễm KSTSR theo từng nhóm dân tộc 54

Bảng 3.14 Các biến thể enzyme G6PD trên tất cả nhóm dân tộc thiếu G6PD 59

Bảng 3.15 Các biến thể thiếu enzyme G6PD phân theo nhóm dân tộc bản địa và dân tộc di cư từ các tỉnh phía bắc vào Tây Nguyên 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp glutathione có sự tham gia enzyme G6PD 6 Hình 1.2 Sơ đồ di truyền về khiếm khuyết thiếu enzyme G6PD 7 Hình 1.3 Sơ đồ di truyền nhiễm sắc thể liên quan đến thiếu enzyme G6PD 9 Hình 1.4 Bản đồ phân bố các alen G6PD liên quan đến thiếu enzyme G6PD 11 Hình 1.5 Cơ chế thiếu enzyme G6PD dẫn đến hồng cầu dễ tan máu cấp 14 Hình 1.6 Tần suất thiếu enzyme G6PD và biến thể đa hình thiếu enzyme G6PD 23 Hình 1.7 Vùng q28 trên nhiễm sắc thể X phân tích biến thể enzyme G6PD 23

Hình 2.2 Đánh giá tình trạng men G6PD tại thời điểm 0 phút, 5 phút, 10 phút 37 Hình 3.1 Các chấm có phát quang là mẫu có hoạt độ enzyme G6PD bình thường

và chấm không phát quang, màu sậm là mẫu thiếu enzyme G6PD 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Lý do chọn đề tài luận văn

Sốt rét vẫn là vấn đề y tế công cộng đang được quan tâm trên toàn cầu, nhất là tại các quốc gia và vùng lãnh thổ châu Phi, Nam Mỹ và châu Á-Thái Bình Dương Trong cơ cấu 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh ở người,

Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax vẫn chiếm tỷ lệ cao Trong khi chủng P falciparum chưa thể loại trừ thì P vivax tăng lên như thế là một

gánh nặng và thách thức trong điều trị tiệt căn vì điểm đặc biệt trong chu kỳ sinh học và phát triển của chúng có thể ngủ trong tế bào gan tồn tại và có thể tái hoạt sau vài tuần đến vài tháng, thậm chí vài năm, tùy thuộc vào từng chủng Việc điều trị thể ngủ hiện nay chỉ có một loại thuốc duy nhất thuộc nhóm 8-aminoquinolein là primaquin phosphate (PQ) dùng liệu trình kéo dài

14 ngày nên có khả năng gây tán huyết cấp trên các ca thiếu men G6PD Các

ca thiếu G6PD thường ít có biểu hiện lâm sàng, nên người thiếu G6PD không biết mình mắc bệnh, trừ khi phơi nhiễm tác nhân oxy hóa cao như nhiễm trùng, thực phẩm, thuốc và hóa chất gây tán huyết cấp có thể dẫn đến tử vong Trong số các loại thuốc gây tán huyết trên người thiếu G6PD,

primaquin phosphate (PQ) dùng 14 ngày trong điều trị P vivax là loại thuốc

hay được đề cập

Do đó, nghiên cứu tìm ra loại thuốc thay thế PQ dùng ngắn ngày là cần thiết và tafenoquine là một trong các ứng viên, nhưng cần đánh giá hiệu lực và tính an toàn, nhất là trên các bệnh nhân thiếu G6PD, nên việc điều tra và đánh giá tình trạng thiếu G6PD tại các vùng sốt rét lưu hành rất cần thiết Glucose-6-Phosphate-Dehydrogenase (G6PD) là một enzyme oxy hóa khử, nằm ở trên bề mặt hồng cầu Các đột biến trên gen mã hóa G6PD tạo nên các kiểu hình G6PD khác nhau tương ứng với mức độ thiếu và bán thiếu men G6PD

Nhằm đánh giá tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trên quần thể dân cư tại các

vùng sốt rét lưu hành và có tỷ lệ P vivax tương đối cao trong cơ cấu trước khi

thử nghiệm lâm sàng thuốc mới tafenoquin chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Nghiên cứu tỉ lệ thiếu enzyme glucose-6-phosphat dehydrogenase và biến thể di truyền của nó trên một số quần thể dân cư tại miền Trung- Tây Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Xác định tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trên quần thể dân cư đang sống trong một số vùng sốt rét lưu hành tại tỉnh Gia Lai, Ninh Thuận và Đăk Nông;

2 Xác định các biến thể di truyền trên enzym G6PD tại điểm nghiên

Qua tham gia nghiên cứu sẽ giúp nâng cao kỹ năng chuyên môn cho cán

bộ về kỹ năng nghiên cứu thực địa, chuyển giao kỹ thuật tách chiết bệnh phẩm, chạy mẫu, phân tích kết quả enzyme G6PD trên bệnh nhân

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Góp phần định hướng sử dụng thuốc primaquine phosphate (PQ) liệu trình dài ngày (14 ngày) an toàn và hiệu quả hơn, đồng thời trong thời gian đến nếu Chương trình Sốt rét Quốc gia có thay thuốc mới loại Tafenoquine (dùng 1 ngày) để đạt được sự chấp thuận của bệnh nhân khi dùng thuốc đơn giản, hiệu quả và tránh các tác dụng ngoại ý nghiêm trọng xảy ra trên bệnh nhân

- Phát hiện những cá thể thiếu G6PD hiện đang sống trong vùng SRLH

rất ý nghĩa, từ đó có những biện pháp phòng tránh biến chứng trong điều trị Điều này có ý nghĩa về mặt dùng thuốc an toàn, hợp lý, không riêng thuốc sốt rét, thuốc điều trị bệnh khác và thực phẩm có tính chống oxy hóa cho an toàn

4 Bố cục của luận văn

- Đặt vấn đề

- Chương 1 Tổng quan tài liệu

- Chương 2 Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

- Chương 3 Kết quả nghiên cứu và Bàn luận

- Kết luận và Kiến nghị

- Tài liệu tham khảo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu vai trò glucose 6 phosphat dehydrogenase

Gen mã mã hóa cho enzyme glucose 6 phosphat dehydrogenase (G6PD) nằm trên vai dài đầu mút của nhiễm sắc thể giới tính X ở vị trí P28, do vậy gen G6PD là một gen di truyền liên kết giới tính Gen mã hóa G6PD bao gồm

13 exon xen kẽ là các intron có chiều dài khoảng 16 Kb, trong đó exon-1 không mã hóa G6PD được hai tác giả Otto Warburg và Christan phát hiện lần đầu tiên vào năm 1930 ở trên hồng cầu ngựa và sau đó là hồng cầu của một số động vật, vi sinh vật, men bia và hồng cầu người Khi đó, những nghiên cứu về G6PD thường là những điều tra cơ bản về các thể loại, chủ yếu

là dựa vào hoạt độ xúc tác, độ di chuyển điện di và một số đặc tính của enzyme [1],[6]

Quá trình tinh khiết của G6PD được bắt đầu từ năm 1936, nhưng

25 năm sau nó mới được phân lập và tinh khiết thành công từ dịch đồng thể của men bia Năm 1966, Yoshida lần đầu tiên mới tách chiết được G6PD từ hồng cầu người Từ những thông tin về cấu trúc ban đầu, trọng lượng phân tử

và các thông số động học của G6PD mới dần được thu thập G6PD thuộc loại enzym oxy hóa khử, với ký hiệu quốc tế là 1.1.1.49, nằm trong hệ thống oxy hóa, nó xúc tác phản ứng oxy hóa G6P Enzym G6PD là một enzym quan trọng, xúc tác phản ứng đầu tiên của chu trình pentose phosphate – một con đường oxy hóa trực tiếp ở hồng cầu Về mặt năng lượng con đường này cung cấp không đáng kể vì chỉ có 10% glucose được thoái hóa ở đây, nhưng về mặt sinh lý nó lại tạo ra NADPH, một chất khử mạnh liên quan mật thiết với các quá trình chuyển hóa và sự toàn vẹn của hồng cầu

Quá trình tách chiết enzyme ra khỏi hồng cầu cũng ngày càng đạt được

độ tinh sạch cao hơn Cùng với sự phát triển của chuyên ngành sinh học phân

tử, các dạng đột biến của G6PD ngày càng được phát hiện nhiều [2] Các phương pháp phát hiện thiếu hụt từ định tính, bán định lượng, định lượng, test nhanh và bộ cảm biến phát hiện chính xác và được áp dụng rộng rãi hơn trong cộng đồng

1.1.1 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzyme G6PD

1.1.1.1 Cấu trúc của enzyme

G6PD là một enzyme polymer được tạo thành từ nhiều monomer Một monomer G6PD bao gồm 515 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 59.256 dalton Enzyme hoạt động tồn tại dưới dạng chính là dimer (chuỗi kép) và chứa cầu nối NADP Sự biến đổi từ các monomer không hoạt động sang dạng hoạt động dimer, tetramer đòi hỏi phải có sự hiện diện của NADP Cấu trúc bậc 2 của men G6PD có dạng xoắn a G6PD có thể tồn tại dưới nhiều dạng như monomer, dimer, trimer, tetramer và hexamer, nghĩa là có các olygomer bao gồm 1,2,3,4 hoặc 6 chuỗi polypeptide [3],[4] Như vậy trong enzyme hoạt động, NADP vừa là phần cấu trúc nối hai monomer vừa là chất tham gia phản ứng Vị trí kết nối coenzym này chưa được xác định song kiểm tra các đột biến đã chỉ ra đó là điểm amino acide 386 và 387, tương ứng với lysine và arginine [5]

1.1.1.2 Cơ chế hoạt động của G6PD

G6PD xúc tác phản ứng thứ nhất của con đường hexose monophosphate (HMP), nó oxy hoá G6P thành 6 phospho gluconolactone và chuyển NADP thành NADPH HMP là đường duy nhất tạo NADPH trong HC, NADPH là một coenzym quan trọng giúp bảo vệ HC chống lại chất oxy hoá [41],[42] Glutathion peroxidase (GSHPX) là một phức hợp gồm 3 enzyme G6PD, GR glutathion reductase (GR) và glutathion oxidase(GPx) GSHPx loại bỏ các chất oxy hoá ra khỏi HC theo chu trình:

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp glutathione có sự tham gia enzyme G6PD

Ba enzyme trên hoạt động theo chu trình: Tiêu hủy ROOH nhằm tránh gốc tự do, giảm G6PD sẽ làm giảm yếu tố bảo vệ HC Đặc biệt, HC giàu catalase mà catalase là một enzyme oxy hóa phản ứng: Km của G6PD dành cho NADP là rất thấp (khoảng 2-4 mcmol/L và enzyme này bị ức chế bởi

gần như bị ức chế hoàn toàn Khi NADPH bị oxy hoá, lúc đó oxidic glutathion bị giảm xuống trong phản ứng làm giảm glutathion NADPH sẽ chuyển thành NADP+ và G6PD trở nên xúc tác phản ứng chuyển NADP+thành NADPH làm chất gây ra oxy hoá bị đào thải [3],[5],[6] Trường hợp giảm G6PD cơ thể sẽ mất khả năng đáp ứng với các tác nhân oxy hoá

1.1.2 Đặc điểm di truyền, cấu trúc và đột biến trên G6PD

1.1.2.1 Đặc điểm di truyền

Thiếu hụt G6PD là một bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể (NST) X không có alen tương ứng trên Y Trước khi những nghiên cứu cơ bản về di truyền của G6PD được biết, bằng xét nghiệm thử độ ổn định của glutathion

Hình 1.2 Sơ đồ di truyền về khiếm khuyết thiếu enzyme G6PD

Nghiên cứu phả hệ của Afro- về các gia đình người Mỹ cho thấy sự bất thường glutathion là di truyền từ mẹ sang con trai dù ở những trường hợp đó những biến đổi của glutathion không được phát hiện ở mẹ Bằng những kỹ thuật phù hợp người ta đã xác định được nguyên nhân của bất thường di truyền đó là ở những bà mẹ có đột biến trên gen mã hoá G6PD dạng dị hợp tử [40] Sau này với nhiều phát hiện cơ bản về G6PD, thiếu G6PD có di truyền liên kết với NST X đã được khẳng định bằng cách đánh giá hoạt độ enzym, nghiên cứu về sự di chuyển điện di, nghiên cứu di truyền của bệnh mù màu Cho đến nay có nhiều gia đình mà sự bất thường trong di truyền liên kết NST

X vẫn được thu thập và ghi nhận Những bất thường này đưa đến kết luận là 1 trong 2 quy định cấu trúc G6PD nằm trên NST X có thể đã bị đột biến ở mẹ Gần đây, người ta đã phát hiện ra trên gen mã hóa cho G6PD là một trong những gen nằm trên cánh dài NST X (q28) Đó là tập hợp những gen fragile X, Hemophilia A, đen quy định màu sắc khi nhìn mà khi đột biến gây bệnh mù màu [44] Như vậy, tình trạng thiếu G6PD là bệnh di truyền liên kết

NST X do mẹ truyền cho con trai

1.1.2.2 Đặc điếm về gen liên quan G6PD

Locus liên quan đến quy định cấu trúc G6PD nằm trên nhánh dài vùng 2 băng 8 của NST X (X.q28) Gen được tách và giải trình tự bởi Persico [44] Gen có 13 exon, dài 20kb, exon đầu tiên không được mã hoá và intron giữa exon 2 và 3 dài hơn mức bình thường, khoảng 9.857 bit Trình tự của gen G6PD đã được biết toàn bộ Vị trí 5’ của gen là một vùng giàu 2 nucleotide: Cytidine và Guanidine (CpG) Vùng CpG này được bảo tồn giữa người và chuột Một số ARNm đã được phát hiện nhưng chức năng của nó chưa hiểu hết ARNm chứa 138 nucleotide nằm trên intron 7 của đầu 3’ Trên thử

nghiệm in vitro người ta đã tạo ra được G6PD từ loại vi khuẩn E Coli

1.1.2.3 Đột biến trên G6PD và biếu hiện bệnh thiếu G6PD

Khi gen cấu trúc bị đột biến sẽ gây nên thiếu G6PD về mặt chất lượng Còn khi gen điều hoà hoặc gen khởi động bị đột biến sẽ gây ra thiếu G6PD về

số lượng Sự biến đổi về mặt số lượng và chất lượng của phân tử enzym đều dẫn đến thay đổi hoạt độ của enzym Trong nữ giới, mỗi tế bào đều có hai gen mã hóa cho G6PD (một gen nhận từ bố, một gen nhận từ mẹ) Những người nữ dị hợp tử vì mang gen đột biến là lặn nên có thể có kiểu hình bình thường, tuy nhiên có thể có các biểu hiện bệnh lý ở mức độ nhẹ hoặc vừa, một số lại biểu hiện rất nặng Nguyên nhân là do một trong hai nhiễm sắc thể trong tế bào nữ đã bị bất hoạt từ giai đoạn sớm của thời kỳ phôi thai, sau đó theo sự phân bào nó được nhân lên tạo thành cơ thể ở dạng khảm giữa những

tế bào có nhiễm sắc thể lành và mang đến bệnh với các tỷ lệ khác nhau Vì vậy, những người này có hai quần thể hồng cầu:

Hình 1.3 Sơ đồ di truyền nhiễm sắc thể liên quan đến thiếu enzyme G6PD

Một nhóm hồng cầu bình thường và một thiếu hụt G6PD Tỷ lệ của chúng thay đổi trong phạm vi rộng 50:50 ở một số ít trường hợp các hồng cầu bất thường chỉ chiếm 1%, nhưng cũng có khi lên đến 99% Nam giới chỉ

có một NST X di truyền từ mẹ nên nếu thừa hưởng đến bị đột biến họ sẽ có kiểu trên bán hợp tử và biểu hiện sự thiếu hụt G6PD

Năm 1993, Beutler cho biết đã tìm thấy 58 dạng đột biến tương ứng 97 biến thể Năm 2002, người ta đã tìm ra được hơn 140 đột biến hay phức hợp đột biến tương ứng trên 442 biến thể của G6PD, 299 biến thể trong đó được phân loại bởi Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) Họ mô tả một biến thể mới phải hoàn toàn khác với những biến thể đã từng được biết và công bố dựa trên các chỉ số như hoạt độ enzym, di chuyển điện di, hằng số cho G6PD và NADP Bởi vì hầu hết đột biến về G6PD đều có bất thường về điện di, động học hoặc cả hai nên người ta cho rằng đột biến tác động đến enzym này phải được tìm thấy trên vùng mã hoá

Ngày nay, nhờ có sự tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt phân tích chuỗi trùng hợp (PCR) mà sự xác định ra đột biến trở nên chính xác và

có thể phát hiện nhiều đột biến trên một cá thể Trong điều kiện sống bình thường, sự thiếu hụt G6PD ít có biểu hiện lâm sàng vì quá trình khử được bảo đảm nhờ hệ thống enzym phụ thuộc NAD+, do vậy hàm lượng glutathion dạng khử chỉ giảm nhẹ, tỷ lệ methaemoglobin (MetHb) thấp Ở những người thiếu hụt G6PD sự già hóa theo tuổi thọ của hồng cầu thường sớm hơn bình thường, đời sống của HC giảm 20% do có hiện tượng tan máu nhẹ ngay cả khi không dùng một thuốc nào Bù lại cơ thể tăng cường sản xuất HC non trong tuỷ xương

Dưới tác dụng của các thuốc hoặc các chất gây oxy hoá dẫn đến hệ thống enzym khử phụ thuộc NAD+ không còn đáp ứng đủ nhu cầu của quá trình khử, lúc này các enzym thuộc NADP trở nên quan trọng Hai hệ thống này tăng cường hoạt động để bảo vệ HC Những người thiếu hụt G6PD cơ chế bảo vệ HC chống lại tác nhân oxy hoá bị giảm nên hay xảy ra tan huyết

HC già thường bị huỷ hoại rất nhiều với biểu hiện là tán huyết, HC non ít bị

vỡ hơn vì nó giàu enzyme và ít nhạy cảm với chất oxy hoá

Bảng 1.1 Các lớp thiếu men G6PD và biểu hiện bệnh trên lâm sàng

Lớp Biểu hiện bệnh lý

mạn tính

Với những trường hợp thiếu G6PD mức độ nhẹ thì việc huy động HC non là một giải pháp nhằm tự hạn chế cơn tan máu Sự tăng tạm thời về hoạt tính xúc tác G6PD dẫn đến việc ổn định hàm lượng glutathion dạng khử (GSH) dù chất oxy hoá vẫn tiếp tục được dùng Bình thường GSH được phục hồi khoảng 90% trong vòng 1 giờ Nếu GSH phục hồi thấp hơn 30% thì các

ca tan máu trở nên nguy kịch Thời gian bán huỷ của HC bình thường là 60 ngày và tuổi thọ khoảng 120 ngày, nhưng thời gian bán huỷ của HC thiếu hụt G6PD là 48 ngày

Hình 1.4 Bản đồ phân bố các alen G6PD liên quan đến thiếu enzyme G6PD

Dựa vào hoạt độ G6PD trong HC và biểu hiện lâm sàng khi thiếu enzyme, chia biến thể thiếu hụt G6PD ra thành lớp Song, sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn rõ ràng Chẳng hạn, G6PD Med được chia vào lớp II, nhưng đã được mô tả là thiếu máu tan máu bẩm sinh HC không tròn Vài biến thể được liệt kê trong lớp I do chúng gây rối loạn chức năng nghiêm trọng, nhưng về mặt hoạt độ enzyme thì cao hơn một số biến thể được xếp vào lớp III [23],[24]

1.2 Phát hiện, chẩn đoán và điều trị thiếu hụt G6PD

1.2.1 Phát hiện, chẩn đoán

Những người bị thiếu hụt G6PD thường không biểu hiện triệu chứng Khi tiếp xúc với tác nhân oxy hoá mới biểu hiện triệu chứng chủ yếu là cơn tan máu:

- Thuốc: Người thiếu G6PD dễ bị tán huyết khi dùng các thuốc có tính

oxy hóa cao như primaquine (PQ) Thuốc PQ là một trong những thuốc làm giảm tuổi thọ HC ở người thiếu G6PD Sau khi cho bệnh nhân dùng thuốc 1-2 ngày hàm lượng hemoglobin (Hb) đã giảm xuống Những ca tan máu nặng, nước tiểu trở nên đen thẩm, hoặc triệu chứng lâm sàng nặng như sốt cao, vàng

da Với những ca thiếu G6PD mức độ vừa như lớp 3 thì tan máu cũng chỉ ở mức độ vừa phải vì chỉ có những HC già bị phá hủy còn những HC non có hoạt tính enzyme bình thường thì không Ngoài ra, vài thuốc khi dùng cho bệnh nhân phải thận trọng như acetaminophen, ascorbic acid;

- Thức ăn: Một số người khi ăn đậu Hà Lan có thể xuất hiện tình trạng

tan máu, đôi khi nghiêm trọng Đa số ca như thế là những người thiếu G6PD Đậu fava chứa divicine có thể oxy hoá mạnh, khi vào cơ thể thì hai chất này gây giảm glutathion khử nhanh, nên ca thiếu hụt G6PD type Địa Trung Hải khi ăn đậu này sẽ xảy ra cơn tan máu cấp;

- Vàng da kéo dài ở trẻ sơ sinh: Vàng da nhẹ là một hiện tượng hay gặp

ở trẻ sơ sinh do vỡ HC trong những ngày đầu Những ca vàng da kéo dài có thể do nhiều nguyên nhân và một trong số đó là do thiếu G6PD, có thể ảnh hưởng đến tính mạng và sức khỏe của trẻ

Bảng 1.2 Phân loại thiếu men G6PD theo Tổ chức Y tế thế giới

Phân loại theo

TCYTTG

G6PD Địa Trung Hải (G6PD B)

G6PD Asahi (G6PD A-)

G6PD-Canton (G6PD A)

Loại đột biến

CT ở vị trí 563 trên exon 6 làm acid amin ở vị trí

188 là serin  phenylalanin

AG ± GA ở vị

hoặc 202 (GA) trên exon 5, làm thay đổi Sparagine

haptoglobin và Hb tự do có thể xuất hiện trong huyết tương và nước tiếu Nếu soi HC không nhuộm thì phát hiện được vật thể Heinz

Hình 1.5 Cơ chế thiếu enzyme G6PD dẫn đến hồng cầu dễ tan máu cấp

Một số thuốc có thể gây tán huyết trên bệnh nhân thiếu enzyme G6PD

chloramphenicol, quinolone, sulphonamide, vitamine K, quinidine, dimercaprol, phenylhydrazine, primaquine, pyrimethamine, quinidine, pamaquine, chloroquine, quinine,

có những vùng SRLH nặng lại có tỷ lệ thiếu G6PD thấp Do đó, chúng ta

phải tìm hiểu mối liên quan giữa thiếu G6PD trong những vùng SRLH

1.3 Các phương pháp phát hiện thiếu hụt G6PD [17],[18],[19]

Vì những người thiếu G6PD ít có biểu hiện lâm sàng nên để chẩn đoán bệnh nhân có thiếu G6PD hay không cần có các phương pháp xác định Hiện nay một số phương pháp đã được áp dụng tại trên thế giới và Việt Nam:

- Phương pháp huỳnh quang của Ernest Beutler: Phương pháp này

được giới thiệu vào năm 1966, định tính dựa trên nguyên lý chuyển hóa glucose-5-phosphate (G6P) không phát quang khi có mặt của G6PD và NADP, chuyển thành 6 phospho glucononolacton (6PG) là một chất phát quang, nên có thể nhận biết dưới ánh sáng đèn cực tím Phương pháp này hiện nay được sản xuất thành kit lưu hành trên thị trường;

- Phương pháp tạo vòng formazan: Phương pháp do tác giả Fujii H giới

thiệu năm 1984 định tính, dựa trên nguyên lý chuyển màu của MTT từ một chất có màu vàng nhạt sang màu xanh sẫm với sự có mặt của NADPH, mà NADPH được tạo thành với sự có mặt của G6PD, có ưu điểm là có thể tiến hành trên các mẫu máu khô trên giấy thấm, sau đó các mảnh giấy thấm chứa máu được đặt đen thạch chứa hóa chất Các ca thiếu G6PD không có vòng màu xanh sẫm (formazan) được tạo thành Đường kính của vòng màu xanh nói lên hoạt độ G6PD có trong mẫu máu Tuy nhiên, phương pháp cho kết quả sau 8 giờ và phụ thuộc vào điều kiện và thời gian bảo quản mẫu máu;

- Phương pháp Akira Hỉrono: Phương pháp được giới thiệu vào năm

1998, định tính dựa trên nguyên lý tạo vòng formazan, có ưu điểm là trả lời kết quả nhanh chỉ sau 30 phút và không cần các thiết bị đắt tiền [29];

- Phương pháp định lượng theo kit của hãng Roche: Phương pháp

vừa mang tính định tính vừa định lượng hoạt độ G6PD thường áp dụng trong nghiên cứu và thực hành điều trị [20],[21];

- Phương pháp xác định thiếu men G6PD bằng test nhanh: Đánh giá

được thiếu G6PD có độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác cao được một số quốc gia và cơ sở điều trị áp dụng trong phát hiện chẩn đoán rất phổ biến, song không đánh giá mức độ thiếu;

- Phương pháp phân tích chất liệu di truyền dựa vào sinh học phân

tử: Phương pháp này đã được dùng để xác định các đột biến và biến thể

G6PD

1.4 Bệnh sốt rét và các khía cạnh liên quan men G6PD

1.4.1 Giới thiệu các loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do KSTSR truyền từ người bệnh sang

người lành thông qua muỗi Anopheles spp., bệnh lưu hành ở địa phương, có

thể phát thành dịch Từ năm 1881 đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện ít

nhất 5 loài KSTSR gây bệnh trên người, gồm Plasmodium malariae (Laveran, 1881), P vivax (Grassi và Feletti, 1890), P falciparum (Welch, l897), P ovale (Stephens, 1922) và P knowlesi (Sinton và Mulligan, 1933)

1.4.2 Chu kỳ sinh học của ký sinh trùng sốt rét

Chu kỳ sinh học và phát triển bao gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn sinh sản hữu tính trên muỗi và giai đoạn sinh sản vô tính trên người Giai đoạn phát triển trong cơ thể người biểu hiện:

+ Giai đoạn mô: Thoa trùng trong hạch nước bọt của muỗi Anophen truyền bệnh Khi muỗi đốt, thoa trùng sẽ đi ngay vào trong máu, lưu hành ở

đó trong vòng 30 phút Một số lớn thoa trùng bị thực bào, còn lại một số vào các tế bào nhu mô gan một cách trực tiếp Trong tế bào gan, thoa trùng cuộn tròn lại, nguyên sinh chất lớn dần lên, phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh bọc một ít nguyên sinh chất Như vậy KSTSR đã sinh sản vô tính thành nhiều

ký sinh trùng khác Với P vivax và P ovale thì KSTSR không phóng thích

hết vào trong máu, mà vẫn còn một lượng KST tồn tại ở trong gan được gọi

là thể ngủ, do vậy hay gây cơn sốt rét tái phát sau vài tuần hoặc vài năm kể từ

lần nhiễm đầu tiên

+ Giai đoạn hồng cầu: Mezoroit được phóng thích khỏi tế bào gan vỡ bắt đầu xâm nhập vào bên trong hồng cầu Thể KSTSR trẻ nhất rất nhỏ gọi là thể nhẫn, sau đó lớn dần lên, gọi là thể tư dưỡng Thể tư dưỡng trưởng thành tiếp tục quá trình phân chia vô tính HC Nhân KSTSR phân chia thành nhiều nhân con, tiếp theo là sự phân chia bào tương tạo thành thể phân liệt Các thể phân liệt già trưởng thành chứa các KSTSR đã được phát triển hoàn toàn, lúc đó HC bị vỡ ra các mezoroit xâm nhập tiếp tục vào hồng cầu mới để một chu trình mới lại bắt đầu Những thể hoa thị phân chia bắt nguồn ngay từ giai đoạn phân chia vô tính tiền HC cũng đã có những thể bị biệt hoá hữu tính thành giao bào Sau khi xâm nhập HC mới chúng phát triển nhưng không phân chia và tạo thành giao bào trưởng thành có hình thể khác nhau tuỳ loài KSTSR

Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi: Giao bào đực và giao bào cái được muỗi hút vào dạ dày sẽ trưởng thành và thay đổi Trong giao bào đực phân nhân, nguyên sinh chất kéo dài thành 4-8 roi, môi roi có cấu trúc hình sợi dài 20-25

µm, những thể roi này tách hẳn khỏi tế bào gốc và hoạt động tự do

Giao bào cái trải qua quá trình trưởng thành và chuyển dạng thành giao

tử cái Trong dạ dày muỗi giao tử đực kết hợp với giao tử cái tạo thành hợp

tử Hợp tử này chuyển dạng kéo dài ra tạo thành thể noãn và di động tới thành dạ dày muỗi chui qua đó ra ngoài và định cư ở đấy để phát triển Noãn bào lớn dần song song với sự phân chia liên tiếp của nhân và bào tương [22] Nhân phân chia của phôi bào tử tạo thành những thoa trùng hình thoi có chiều dài 10-15µm Thoa trùng di động và phá vỡ màng noãn bào, thâm nhập vào các xoang cơ thể muỗi Sau đó, thoa trùng được giải phóng khỏi xoang để di chuyển đến tuyến nước bọt của muỗi cái Thời điểm này nếu muỗi đốt người thoa trùng sẽ tiếp tục chu kỳ mới trên cơ thể người

- Điều trị cắt cơn và tiệt căn:

+ Với P vivax dùng các thuốc diệt thể vô tính trong HC chỉ có tác

dụng điều trị cắt cơn và hiện nay chloroquin vẫn là thuốc còn nhạy với

P vivax Để diệt thể ngủ trong gan, chống tái phát xa cho đến nay trên thế

giới cũng chỉ có duy nhất primaquin phosphate (PQ) với liệu trình dài 2 viên/ngày trong 14 ngày liên tiếp theo liều khuyến cáo của TCYTTG (WHO, 2015) và Hướng dẫn Chẩn đoán và Điều trị của Bộ Y tế Việt Nam (Bộ Y tế, 2016) Trong khi đó PQ là thuốc duy nhất trong các thuốc thuộc nhóm 8-aminoquinolein, chống chỉ định với trẻ em dưới 6 tháng tuổi, phụ nữ có thai

và thiếu men G6PD

Với P falciparum, chỉ cần dùng thuốc diệt thể vô tính trong HC là đủ để

cắt cơn và tiệt căn theo phác đồ thuốc phối hợp có artemisinin (ACTs) với primaquin liều duy nhất đang dùng theo khuyến cáo [25]

1.5 Nghiên cứu về biến thể G6PD và mối liên quan với bệnh sốt rét [45]

Primaquin phosphate (PQ) là thuốc sốt rét được dùng để tiêu diệt thể

ẩn và giao bào của P vivax giai đoạn trong tế bào gan, ngừa tái phát và thể giao bào chống lây lan trong cộng đồng của P falciparum ở bệnh nhân Điều này sẽ nguy cơ cho bệnh nhân P vivax bị thiếu hụt enzym

G6PD khi dùng PQ dài ngày

Bảng 1.3 Phân nhóm các biến thể thiếu men G6PD

Nhóm 2

487G  A ( Mahidol) 592C  T ( Coimbra) 563C  T ( Mediterranean) 1360C  T ( Union) 1376G  T ( Canton) 1388G  A (Kaiping)

871 G  A (Viangchan)

1.5.1 Tại Việt Nam

Chiến lược Phòng chống và Loại trừ sốt rét (PCSR và LTSR) ở Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng trong việc giảm gánh nặng bệnh tật và tử vong rõ rệt, không còn dịch sốt rét xảy ra trên phạm vi toàn quốc trong vài năm gần đây Tuy nhiên, cơ cấu KSTSR đã thay đổi, với

số ca P vivax đang gia tăng, có nhiều vùng chiếm tới 50% Việt Nam

đang triển khai Chiến lược PCSR và LTSR, trong khi có sự chuyển dịch

cơ cấu như thế sẽ khó khăn về kỹ thuật Do đó, điều trị các ca sốt rét P vivax có thiếu hụt G6PD sẽ đặt ra một thách thức rất lớn Trong khi kỹ

thuật để phát hiện thiếu hụt G6PD chưa được áp dụng trong tất cả các cơ

sở y tế, một điều tra để xác định tỷ lệ thiếu hụt G6PD ở các nhóm dân tộc sống trong vùng SRLH là rất cần thiết, để góp phần vào sự định hướng của chính sách sử dụng PQ một cách an toàn và hiệu quả [6],[8]

Trước đây, trong nước một số nghiên cứu về thiếu men G6PD liên quan đến bệnh sốt rét tại Việt Nam như Hoàng Văn Sơn, Đoàn Hạnh Nhân,

Tạ Thị Tĩnh, Lê Thị Việt Nga, Huỳnh Hồng Quang trên một vài nhóm dân

tộc nhưng chưa tìm được mối liên quan nào giữa sốt rét và thiếu hụt G6PD Đồng thời, việc xác định các biến thể liên quan G6PD tại Việt Nam vẫn còn hạn hữu với cỡ mẫu nhỏ Y văn trong và ngoài nước trước đây cho thấy tỷ lệ thiếu G6PD thay đổi khác nhau ở nhiều vùng địa lý và trên nhiều nhóm dân tộc [6],[8],[9],[10]

Tại Việt Nam, các nhà khoa học đã nghiên cứu về men G6PD từ năm

1969, Đặng Hanh Phức dùng thử nghiệm sàng lọc đơn giản của Brewer cho kết quả tỷ lệ thiếu hụt men G6PD Ở Hà Nội là 5,3%, ở Hải Phòng 7,5% Năm

1978, Hoàng Văn Sơn tại Viện Nhi Trung ương có một nghiên cứu cho biết

tỷ lệ thiếu men G6PD 2-6% ở những vùng không có sốt rét, một số vùng SRLH nặng tỷ lệ thiếu hụt lên tới 20-24%

Một nghiên cứu của Đoàn Hạnh Nhân, Tạ Thị Tĩnh tiến hành theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên trên 1.676 nam học sinh phổ thông cơ sở tuổi từ 6-15 tại 8 huyện thuộc 4 tỉnh (Hoà Bình, Hà Giang, Sơn La, Thanh Hoá) từ 1996-1997 Kết quả cho thấy, thiếu G6PD trên HC có tỷ lệ cao tại một số vùng SRLH nhẹ như Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Như Xuân (19,7%), Mường La (17,8%) và thấp tại một số vùng sốt rét không lưu hành như Mèo Vạc (0,3%) và Nga Sơn (0,5%) [12],[14],[15] Tỷ lệ thiếu enzym ở các dân tộc khác nhau cho kết quả khác nhau, cao nhất là nhóm dân tộc Mường (31%), Thổ (22,6%) và Thái (19,3%); rất thấp ở nhóm dân tộc Kinh (0,5%) và dân tộc Mông (0,3%)

Một nghiên cứu khác của Đoàn Hạnh Nhân và Tạ Thị Tĩnh cùng cộng sự năm 1999, tiến hành tại Gia lai, Bình Phước nơi SRLH nặng cho biết tỷ lệ thiếu G6PD của dân tộc Gia rai, Ba na, X’ Tiêng tương ứng là 2,3%; 1,7% và 3,4%, đồng thời không có mối liên quan giữa thiếu G6PD với bệnh sốt rét Theo tác giả Hoàng Hạnh Phúc khi điều tra tỷ lệ thiếu men G6PD trong phổ thông cơ sở cho thấy tỷ lệ thiếu enzym G6PD trong dân tộc Kinh tại Hà

Nội là 0,86%, Hoà Bình là 4,53%, học sinh dân tộc Mường tại Hoà Bình là

11 36%

Theo Nguyễn Thọ Viễn khi nghiên cứu trên bệnh nhân có KSTSR thấy

tỷ lệ thiếu G6PD tới 60,71%, thiếu hoàn toàn tới 25%, trong lúc người không

có KSTSR thiếu men G6PD là 37,04% và hoàn toàn là 6,79%, qua đó tác giả

đã nhận định hiện tượng thiếu men G6PD có liên quan đến sốt rét [16]

Theo nghiên cứu của Trần Thị Chính và cộng sự nghiên cứu trên người Kinh tại Hà Nội và khu vực quanh Hà Nội tỷ lệ thiếu G6PD là 1,75% Thiếu hụt men G6PD là một nguyên nhân gây thiếu máu tan máu di truyền Thông thường trên lâm sàng hay gặp thiếu máu do tan máu mạn tính Những trường hợp tan máu cấp tính hay xảy ra khi có tác động của một số tác nhân gây oxy hoá, đặc biệt là thuốc sốt rét (primaquin, quinin)

Đến nay, nhiều nước trong khu vực Tây Thái Bình Dương có các dạng đột biến biến thể enzyme G6PD được phát hiện như biến thể Viangchan, Canton, Kaiping, Union, Mahidol Theo Tsiu A Sane khi điều trị cho 15 bệnh nhân thiếu men G6PD bằng PQ liều 13,2mg x 1,5 viên/ngày tại Bệnh viện E thì có hai người bị tan huyết mạnh phải dừng thuốc và xử trí cấp cứu Điều này cho thấy việc xác định tỷ lệ thiếu G6PD ở một số nhóm dân tộc và những

cá thể thiếu men G6PD hiện đang sống trong vùng SRLH là vô cùng cần thiết

từ đó có những biện pháp phòng tránh tai biến trong điều trị

1.5.2 Trên thế giới

Trên thế giới các điều tra về mặt dịch tễ học cho thấy tần suất thiếu enzym cao nhất ở các nhóm dân tộc sống trong vùng SRLH Theo Enest Beutler và cộng sự, trên thế giới có khoảng 400 triệu người thiếu G6PD, bệnh gặp ở tất cả các nhóm dân tộc, chủng tộc khác nhau Tần suất thiếu hụt G6PD khác nhau tùy thuộc vào dân tộc và vùng địa lý, nhưng cao nhất là các khu vực Địa Trung Hải, châu Phi và Nam Á, ít gặp hơn ở khu vực Bắc Âu

[25],[26],[27] Theo Matsuoka H và Khui Iwai, tỷ lệ thiếu men G6PD ở Lào

là 7,2%, Thái Lan 11.5%, ở Indonesia là 3,7% và Myanmar là 5,4%

Theo điều tra của Bouma tại Pakistan năm 1995, tỷ lệ thiếu enzyme cũng rất khác nhau ở các dân tộc khác nhau, tỷ lệ thiếu enzyme ở nhóm dân tộc Pathan là 15,8 %, Uzbak là 9,1%, Tajik 2,9% và Tukoman là 2,1% Các nghiên cứu dịch tễ học thấy tần suất thiếu enzyme G6PD cao nhất gặp ở nhóm dân tộc sống trong vùng SRLH Điều tra của Ganczakowski-M, tỷ lệ

thiếu hụt G6PD chung ở Vanuatu là 6,8%, mức độ khác nhau ở các điểm điều

tra, dao động từ 0-39%, có sự tương quan thuận giữa thiếu men G6PD với mức độ sốt rét tại đây [48],[49] Một nghiên cứu của Devi ST điều tra tại Ấn

Độ cũng cho thấy vùng SRLH nặng có tỷ lệ thiếu G6PD là 14,13%, trong khi

đó tại vùng SRLH nhẹ, tỷ lệ thiếu enzym chỉ chiếm 5,5%

Theo Laundry, khi nghiên cứu trên trẻ em ở Gabon, châu Phi thì chỉ có những bệnh nhân nữ thiếu hụt G6PD dạng dị hợp tử mới có khả năng bảo vệ

đối với sốt rét và chỉ với những trường hợp nhiễm P falciparum mà thôi Một

số tác giả khác lại cho rằng tất cả dù đang hợp tử, dị hợp tử hay bệnh nhân nam bán hợp tử đều có khả năng bảo vệ đối với Theo Beutler, tiến hành nghiên cứu những ca thiếu hụt G6PD dạng dị hợp tử ở hai quần thể HC thì

HC bình thường có nhiều KSTSR hơn HC bị thiếu G6PD Tương tự, Luzatto thấy nhiều KSTSR trong HC bình thường hơn HC thiếu enzyme G6PD [30],[35]

Trong nghiên cứu in vitro người ta nhận ra là KSTSR sốt rét ít phát triển

ở những hồng cầu thiếu G6PD Cơ chế của hiện tượng này có nhiều giả thuyết, có giả thuyết cho là KSTSR cần NADPH cho sự xâm nhập và tồn tại nên ở bệnh nhân thiếu hụt G6PD, lượng NADPH tại HC thấp không

thích hợp cho sự phát triển của nó Nghiên cứu in vitro thấy HC thiếu hụt G6PD nhiễm P falciparum bị thực bào mạnh hơn gấp 2-3 lần so với HC

bình thường cũng nhiễm P falciparum Có sự tăng nồng độ của

immunoglobuline và bổ thể C3 ở ca thiếu hụt G6PD làm thuận lợi hơn cho

quá trình thực bào [31],[34] các HC nhiễm P falciparum vì thế ức chế phát

triển của KSTSR này

Hình 1.6 Tần suất thiếu enzyme G6PD và biến thể đa hình thiếu enzyme G6PD

Ở khu vực châu Á, người ta đã tìm thấy các loại đột biến như Gaoche và Chinese-4 ở Trung Quốc, Ube và Konan ở Nhật Bản, Chinese-3 ở Philipines, Mahidol ở Đông Nam Á, Trung Quốc và Đài Loan, G6PD Union, một đột biến lớp 2, đầu tiên được mô tả ở người Philipines trên đảo Hawai (Mỹ), sau

đó lại tìm thấy ở cực rất xa của địa cầu, quần đảo Vanuatu thuộc Tây Nam Thái Bình Dương Tiếp đó tìm thấy ở Lào, Trung Quốc, Nhật Bản [36],[37],[39]

Đến nay, các nhà khoa học đã xác định có ít nhất 400 biến thể G6PD

và 130 đột biến điểm khác nhau Mỗi loại biến thể có đặc điểm về tính gắn kết khác nhau, tỉnh ổn định của enzyme trên màng hồng cầu và khả năng thay đổi hoạt tính protease dẫn đến ổn định hay bất ổn định màng hồng cầu

1.6 Thiếu enzyme G6PD và sử dụng thuốc primaquine phosphate [23],[24]

Thuốc primaquine (PQ) đã được sử dụng liên tục kể từ năm 1952 để

ngăn ngừa tái phát xa sốt rét do P vivax và P ovale Thuốc PQ có độc tính

gây tán huyết trên những cá nhân thiếu enzyme G6PD và ở những nơi mà bệnh nhân sốt rét đang sống thì khâu thực hành không được kiểm tra G6PD xem có thiếu hay không và giám sát liệu trình dùng thuốc trong 1-2 tuần [22] Tuy nhiên, không có liệu pháp thuốc nào khác thay thế để ngăn chặn sự tái

phát của sốt rét P vivax và P ovale Liều dùng hàng ngày 0,25 hay 0,5 mg/kg

trong 14 ngày gây ra thiếu máu tan máu cấp trên một số bệnh nhân thiếu enzyme G6PD Tình trạng di truyền gen lặn liên kết giới tính X dị hợp tử đã ảnh hưởng đến 400 triệu người trên phạm vi toàn cầu

Theo ước tính toàn cầu, các quốc gia lưu hành sốt rét, tần suất alen trung bình của thiếu enzyme G6PD ước tính là 8% (7,4-8,8%) Vì bản đồ gen G6PD với nhiễm sắc thể X, tần suất nam thiếu enzyme G6PD trên giới nam giống nhau Tần suất nữ thiếu enzyme G6PD ước tính là tổng các thể đồng hợp tử ở nữ cộng với một phần nhỏ thể dị hợp tử khoảng chừng 30% hoặc ít hơn so với hoạt tính G6PD thông thường Về tổng thể thì con số này chiếm khoảng 350 triệu người thiếu enzyme G6PD

Kể từ năm 1956, thiếu enzyme G6PD đã được nhận ra như một nguyên nhân nhạy cảm với PQ Bất cứ khi nào không thể kiểm tra thiếu enzyme G6PD trước khi cho thuốc PQ, khi đó đưa ra quyết định cần chân nhắc đến lợi ích và nguy cơ tiềm tàng dựa vào uống thuốc PQ trên các bệnh nhân thiếu

enzyme G6PD với nguy cơ tái phát nhiều cơn trên lâm sàng do sốt rét P vivax khi dùng PQ Ngoài ra, sự góp phần các cơn tái phát lặp đi lặp lại của P vivax vào tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cũng như lan truyền bệnh cũng nên xem

xét Về mặt thực hành, nên có công cụ chẩn đoán tại chỗ về tình trạng thiếu

enzyme G6PD khi gặp ca nhiễm P vivax và hiện nay Chương trình Sốt rét

toàn cầu của Tổ chức Y tế thế giới đang đánh giá vai trò các công cụ chẩn đoán thiếu enzyme G6PD tại chỗ về hiệu quả và chi phí

Một số vấn đề đặt ra của TCYTTG hiện nay là ứng dụng các bằng chứng sẵn có để trả lời các câu hỏi sau: (i) Mức độ thấp nhất nào của tỷ lệ thiếu enzyme G6PD mà không cần phải xét nghiệm kiểm tra enzyme G6PD khi

dùng thuốc điều trị tiệt căn sốt rét P vivax? (ii) Loại xét nghiệm nào nên dùng

để phân loại nam giới có thiếu hay bình thường enzyme G6PD? (iii) Loại xét nghiệm nào có thể dùng để xác định nữ dị hợp tử như một nguy cơ lâm sàng tan huyết khi dùng PQ Điều này đỏi hỏi có kiến thức về mức độ thiếu enzyme G6PD (tỷ lệ thiếu G6PD trên hồng cầu, điều này có thể khác nhau trên các nữ dị hợp tử giữa 0% và 100% vì ở ngưỡng đó thuốc PQ sẽ gây các cơn tán huyết trên lâm sàng khi dùng liều chuẩn khuyến cáo để điều trị tiệt

căn sốt rét do P vivax Khi một nam giới được phân loại thiếu enzyme G6PD

hoặc khi một nữ phân loại như một thể dị hợp có tỷ lệ biểu hiện lâm sàng thiếu enzyme G6PD trên hồng cầu, hay khi thể dị hợp G6PD không thể xem

là an toàn thì khi đó quản lý ca bệnh P vivax như thế nào là phù hợp?

Đối với các test kiểm tra enzyme G6PD, gần đây các nghiên cứu ấn bản cung cấp phân tích so sánh giữa các test với nhau Bằng chứng tập trung vào các số liệu test nhanh chẩn đoán tại chỗ kiểm tra G6PD, sử dụng công cụ này hợp lý tại các vùng nhiệt đới có hạn chế về nguồn lực Một loại test G6PD định tính (CareStart™) và bộ cảm biến sinh học định lượng được hoạt độ

dụng tại các vùng mà P vivax lưu hành

Hiện tại chính sách quốc gia sử dụng thuốc PQ chống tái phát và kiểm

tra thiếu enzyme G6PD là hầu hết các quốc gia có lưu hành P vivax có

khuyến cáo dùng PQ chống tái phát theo khuyến cáo của TCYTTG, ngoại trừ

4 nước Algeria, Campuchia, Ethiopia và Somalia không khuyến cáo dùng, các nước còn lại đều dùng liều chuẩn 0,25 mg/kg mỗi ngày trong 14 ngày, hay một số khác dùng liều 0,5 mg/kg mỗi ngày trong 7 hoặc 14 ngày Một phân tích tổng hợp gần đây cho biết hiệu lực liều 0,25 mg/kg hàng ngày (14

ngày) đối với các chủng P vivax ôn đới và liều 0,5 mg/kg hàng ngày (14 ngày) đới với các chủng nhiệt đới để ngăn chặn tái phát do P vivax Tuy nhiên, các chương trình của các quốc gia có P vivax lưu hành đều đang dùng

liều thấp (0,25 mg/kg/ngày trong 14 ngày) trên nền tảng nguy cơ cao ở tổng liều hiệu lực cao Chỉ có Iran dùng liều PQ một lần một tuần 0,75 mg/kg trong 8 tuần mà không thử G6pD thường quy Việc ứng dụng liều này trên bệnh nhân mà chúng ta không biết tình trạng thiếu enzyme G6PD sẽ thay đổi

ở từng quốc gia và ngay cả trong một nước thì tỷ lệ thiếu này cũng đã khác nhau tùy vùng và dân tộc

Ngoài ra, các dữ liệu về thuốc sốt rét PQ cũng được ghi nhận ở các quốc gia có khuyến cáo dùng PQ nhưng không thử enzyme G6PD, tỷ lệ kê đơn

thấp khoảng 10% trên số ca nhiễm P vivax Lý do không kê đơn PQ trong điều trị P vivax thì rất nhiều và phức tạp, nhưng nguy cơ độc tính trên hồng

cầu ở người thiếu enzyme G6PD có thể là yếu tố chính Việc thiếu các test dùng tại thực địa dễ dàng và phù hợp, thì việc dùng PQ sẽ khó khăn khi dùng liệu trình 14 ngày

1.7 Các biến thể thiếu enzyme G6PD và mức độ nghiêm trọng

Trên các bệnh nhân có G6PD bình thường, thuốc PQ là rất an toàn và

dung nạp tốt với hiệu lực cao trong việc ngăn chặn tái phát P vivax Một thử

nghiệm gần đây liều PQ 0,5 mg/kg hàng ngày trong 14 ngày chỉ định sau khi

dùng dihydroartemisinin-piperaquine để điều trị sốt rét P vivax cấp cũng cho

thấy có độ an toàn và dung nạp thuốc tốt, với hiệu lực chữa khỏi 98% về chặn tái phát Thuốc PQ sinh ra tán huyết trên các bệnh nhân thiếu enzyme G6PD khi so sánh thời gian bán hủy của enzyme với mức độ tồn lưu hoạt độ enzyme G6PD có liên quan đến các biến thể di truyền G6PD Về cơ bản, độ nặng của thiếu enzyme G6PD được phân loại nhẹ hay trầm trọng, phần lớn lệ thuộc vào sự giảm hoạt tính của enzyme G6PD liên quan đến mỗi biến thể

Vào những năm 1980, TCYTTG đã đưa ra một phân loại mà trong đó xác định các biến thể thiếu G6PD hay gặp hoặc là lớp II (hoạt độ <10% so với bình thường) hay lớp III (hoạt độ >10% so với bình thường) Loại prototype của lớp II là G6PD Mediterranean và prototype của lớp III là G6PD A- (biến thể châu Phi phổ biến) Phân loại các biến thể khác như lớp II hay lớp III thường dựa trên một vài mẫu thử tại các la bô khác nhau Liên quan giữa hoạt độ enzyme và tính nhạy cảm với tán huyết cấp là dựa trên một số lượng nghiên cứu tương đối nhỏ trên các người lớn trưởng thành khỏe mạnh dùng với PQ

Một số nghiên cứu lâm sàng chỉ ra thuốc PQ trên các cá nhân có biến thể A- hay Mediterranean rằng loại biến thể A- bị tan huyết khoảng 30% trên hồng cầu trong một tuần dùng thuốc PQ liều 0,5 mg/kg hàng ngày, nhưng sau

đó bình phục trở về lượng haematocrite ban đầu và duy trì mức này dù vẫn đang dùng liều đó trong nhiều tuần nữa Sự bù trừ này được giải thích do ngẫu nhiên mà ở đó các hồng cầu già nhất bị phá hủy và rồi được thay thế bởi các quần thể hồng cầu dung nạp tốt với thuốc PQ, điều này biểu hiện dung nạp ngay cả khi dùng liều cao PQ liên tục (30 mg mỗi ngày) Trong khi đó, người có biến thể Mediterranean không biểu hiện dung nạp vì nhiều hồng cầu non hơn có hoạt độ enzyme G6PD tồn lưu không đủ chống lại với các sang

chấn oxy hóa của PQ, kết quả là thiếu máu tan máu xảy ra nghiêm trọng hơn

và không thể tự giới hạn được Do đó, dù có đa dạng về mức độ thiếu enzyme G6PD, nguy cơ tán huyết do dùng PQ cũng nên cân nhắc và để ý đến tất cả các biến thể G6PD

Liều dùng PQ hàng ngày như hiện nay được coi là tương đối an toàn trên các bệnh nhân biến thể African A- là hoàn toàn không đúng, vì diện rộng đặc tính của các biến thể A- thường xem là nhẹ và tự giới hạn có thể khác nhau từ một số nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ, hơn nữa trên các cá nhân là nam giới tình nguyện khỏe mạnh Có 3 type G6PD A- ở châu Phi và người ta không biết kiểu gen nào trên các cá nhân là khó cho việc dùng PQ qua các nghiên cứu tiến hành những năm 1950 và 1960 (dù kiểu gen phổ biến nhất thường là có

sự thay thế nucleotide G202A) [40],[46] Ngoài ra, có hai ca tử vong ở Brazil

bị quy kết tan máu là do dùng PQ, cả hai đều được giải phẩu tử thi và có biến thể A- Do đó, phân loại các biến thể thiếu G6PD như “nhẹ” và “nghiêm trọng” nhằm mục đích hướng dẫn đưa ra quyết định trên lâm sàng và các nhà khoa học cho rằng liều hàng ngày PQ 0,5 mg/kg trong 14 ngày có thể tiềm năng gây tán huyết cấp trên các bệnh nhân có biến thể G6PD là A- Ngoài ra, trong việc giám sát dược cảnh giác vẫn còn giới hạn ở các quốc gia có bệnh lưu hành, một số lượng tương đối nhỏ ấn bản về tác hại nghiêm trọng khi kê đơn PQ mà không có test G6PD vì không thấy các nguy cơ tiềm tàng này [50],[51]

Một số định nghĩa sau đây được đưa ra sau khi cân nhắc kỹ của nhóm chuyên gia về thiếu enzyme G6PD của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2016):

- Trên nam giới: Bất cứ người nam nào có hoạt độ G6PD trên hồng cầu dưới 30% so với trị số trung bình bình thường thì được coi là thiếu G6PD Người ta đoán chừng đối tượng này bán dị hợp đối với một alen thiếu G6PD Bất cứ người nam nào có hoạt độ enzyme G6PD từ 30% trở lên so với mức

trung bình được coi là G6PD bình thường và người ta coi đó là bán dị hợp alen G6PD bình thường;

- Trên nữ giới: Bất cứ người nữ nào có hoạt độ G6PD hồng cầu dưới 30% mức trung bình bình thường được coi là thiếu enzyme G6PD Khi đó, người ta đoán chừng hoặc là người đó có đồng hợp tử alen thiếu G6PD, hoặc

có đột biến hai alen (chẳng hạn alen Viangchan và một alen Mahidol), hoặc người đó có dị hợp tử alen thiếu G6PD, trong đó quần thể hồng cầu thiếu G6PD nổi trội hơn Bất cứ người nữ nào có hoạt độ G6PD trên hồng cầu từ 80% trở lên so với mức trung bình hay trung vị bình thường được coi là mức G6PD bình thường Người ta ước tính rằng người đó hoặc là đồng hợp tử đối với alen G6PD bình thường hoặc là dị hợp tử của một alen thiếu G6PD và một alen G6PD bình thường, trong đó quần thể hồng cầu có mức G6PD bình thường nổi trội hơn Bất cứ phụ nữ nào có mức hoạt độ enzyme G6PD từ 30-80% so với mức G6PD bình thường thì coi như là loại bán thiếu enzyme G6PD; ước tính người đó có dị hợp tử với alen thiếu G6PD và một alen G6PD bình thường

Hơn 10 năm qua, xét nghiệm phát hiện phát quang (fluorescent spot FST) đã được coi là test định tính sàng lọc thiếu enzyme G6PD TCYTTG chấp nhận một loại test định tính G6PD mới ít nhất là tương đương kết quả với FST trong thực hành, vì đây là một test thương mại đã được dùng rộng rãi tại các la bô lâm sàng, ngân hàng máu và các bệnh về máu như an toàn truyền máu [44] Tuy nhiên, quy trình rất phức tạp và đòi hỏi kỹ năng la bô và trang thiết bị cùng với dây chuyền lạnh cho các thuốc thử, đồng thời các test định tính sẽ không phù hợp để phát hiện các thể dị hợp thiếu enzyme G6PD ở nữ, nên sẽ có nguy cơ tan máu cấp khi dùng PQ dài ngày, đồng thời test định tính

test-sẽ không phát hiện mức độ thiếu và bán thiếu

Điều đó sẽ không khả thi để sử dụng thường quy tại các vùng nhiệt đới,

đặc biệt là các cơ sở y tế xa xôi mà ở đó bệnh nhân sốt rét đang có mặt và cần chẩn đoán, nên nhu cầu cần có công cụ định lượng tốt hơn và dễ sử dụng

và không cần thiết bị phức tạp và phiên giải kết quả nhanh là rất thiết thực Trong trường hợp tình trạng thiếu enzyme G6PD không được biết và test không có sẵn thì quyết định kê đơn PQ hàng ngày để ngăn ngừa tái phát xa phải dựa trên đánh giá sau: (i) Dữ liệu về tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trên quần thể tại chỗ, (ii) Khả năng xác định và giám sát an toàn và quản lý sự tán huyết

do dùng PQ điều trị, (iii) Lợi điểm của việc điều trị để giảm số tái phát Bệnh

nhân mắc sốt rét cấp do P vivax hay P ovale mà tình trạng enzyme G6PD

không biết như thế nào thì có thể dùng liều hàng tuần 0,75 mg/kg/tuần trong 8 tuần dưới sự giám sát chặt chẽ về các triệu chứng thiếu máu tan máu cấp trong 3 tuần đầu dùng thuốc

Chương 2 ĐỔI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 10/2018 đến tháng 7/2019;

- Địa điểm: Nghiên cứu tiến hành tại một số xã thuộc huyện có sốt rét lưu

hành của 3 tỉnh Ninh Thuận, Gia Lai và Đăk Nông:

+ Xã Ia Drech, thuộc huyện Krông Pa (tỉnh Gia Lai);

+ Xã Đăk Drong, thuộc huyện Cư Jut (tỉnh Đăk Nông);

+ Xã Ma Nới, thuộc huyện Ninh Sơn (tỉnh Ninh Thuận)

Các xã được chọn ở trên đều nằm trong vùng sốt rét lưu hành, đặc biệt

trong cơ cấu KSTSR có tỷ lệ P vivax chiếm tương đối cao và có nhiều nhóm

dân tộc đang sinh sống, làm việc

Hình 2.1 Địa điểm nghiên cứu tại tỉnh Gia Lai, Ninh Thuận và Đăk Nông

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Những người dân đang sống ở vùng có sốt rét lưu hành tại các điểm được chọn nghiên cứu của tỉnh Gia Lai , Ninh Thuận và Đăk Nông Tiêu chuẩn phù hợp để chọn mẫu gồm:

2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Người từ 6 tháng tuổi trở lên;

- Người dân đồng ý tham gia nghiên cứu hoặc có sự đồng ý của cha mẹ, hoặc người giám hộ trong trường hợp là trẻ em;

- Đồng ý ký giấy chấp thuận tham gia nghiên cứu

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Trẻ em dưới 6 tháng tuổi (vì hiện nay thuốc primaquin phosphate cho phép sử dụng để diệt giao bào và chống tái phát xa cho người từ 6 tháng tuổi trở lên);

- Đang mắc bệnh cấp tính, thiếu máu, phụ nữ mang thai;

- Không đồng ý tham gia vào nghiên cứu

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Một số đặc điểm chung về mẫu nghiên cứu tại một số vùng dân cư thuộc 3 tỉnh Đăk Nông, Gia Lai, Ninh Thuận;

- Tỷ lệ sốt rét tại địa điểm nghiên cứu;

- Tỉ lệ thiếu enzyme G6PD tại các điểm nghiên cứu theo giới, nhóm tuổi, dân tộc, nghề nghiệp, tiền sử mắc sốt rét,

- Một số yếu tố liên quan giữa thiếu G6PD và các yếu tố trên

- Các biến thể di truyền (genetic variants) của thiếu enzyme G6PD.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu gồm hai mục tiêu và có hai thiết kế tương ứng:

- Nghiên cứu 1: Xác định tỷ lệ thiếu men G6PD và một số yếu tố liên

quan theo thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích;

- Nghiên cứu 2: Xác định biến thể G6PD trên các đối tượng được xác

định có thiếu enzyme G6PD dựa theo thiết kế phân tích di truyền các biến thể trong phòng thí nghiệm tại phòng Sinh học phân tử của Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford tại thành phố Hồ Chí Minh và phân tích đối chiếu

la bô ở Viện Sanger (Cambridge, Anh)

Tổng số 3 huyện của ba tỉnh là 216 người x 3 huyện = 648 người;

- Cỡ mẫu cho phân tích các biến thể di truyền tại phòng sinh học phân tử

là toàn bộ các mẫu xác định qua điều tra có thiếu enzyme G6PD

2.4.3 Phương pháp chọn mẫu

- Trong một tỉnh chọn chủ đích mỗi xã thuộc mỗi huyện Cư Jut (Đăk

Nông), Krong Pa (Gia Lai) và Ninh Sơn (Ninh Thuận) đều thuộc vùng SRLH;

- Trong một xã, lấy danh sách các thôn, bon trong vùng SRLH và chọn

ngẫu nhiên 3 thôn, làng cho đến khi đủ cỡ mẫu;

- Từ danh sách các đối tượng từ 6 tháng tuổi trở lên ở 3 thôn, bon, làng

được lựa chọn bằng phương pháp ngẫu nhiên hệ thống