Tài liệu CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN A (HAV) TRONG THỰC PHẨM doc

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người HAV định vị ở gan gây nhiễm virus máu khởi phát sự nhiễm trùng...  Chẩn đoán giai đoạn cấp tính dựa vào IgM anti-HAV bằng phương pháp miễn dịch phóng

I ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

1 Cấu tạo

2 Khả năng kháng của HAV

3 Khả năng nhân lên của virus

4 Khả năng miễn dịch của cơ thể

II KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

1 Dịch tễ học

2 Gây bệnh cho người

III CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN HAV

1 Phương pháp miễn dịch học

2 Phương pháp PCR

1 Cấu tạo:

 Virus HAV thuộc chi Hepatovirus (trước

đây thì nó được phân loại thuộc chi

Enterovirus ), họ Picornaviridae

 HAV trưởng thành có đường kính 27-32nm, hạt virus không có vỏ ngoài

 Vật chất di truyền của HAV là RNA

 HAV có thể tồn tại ở -200C trong nhiều năm,

700C trong 10 phút, pH=1-2 trong 2h ở nhiệt

độ phòng, hoặc trong môi trường chứa ether, chloroform 20%

Vì vậy HAV có khả năng duy trì và lây lan nhanh môi trường

HAV có thể bị bất hoạt bởi:

 Sử dụng hóa chất: formaldehyde, HgCl2, Iod, Clo, Kali permanganat …

 Tia UV

 Autoclave 1210C trong 20 phút

 HAV có khả năng nhân lên trong nguyên

tương tế bào gan

 Có thể nuôi cấy HAV nhưng tốc độ nhân lên rất chậm

 Khi bị nhiễm HAV, cơ thể sẽ sản xuất kháng thể anti-HAV: IgM và IgG

 Virus sẽ bị phân giải bởi enzyme

aminotransferase và loại thải qua phân

1 Dịch tễ học:

 HAV được tìm thấy trong mồ hôi, nước bọt,

nước tiểu, phân người bị bệnh.

 HAV theo thức ăn, nước uống bị nhiễm virus

xâm nhập vào cơ thể người.

 Sò, ốc là một nguyên nhân lây bệnh đáng kể

 HAV chỉ gây bệnh cho người và linh trưởng

 Các con đường lây truyền:

- Lây truyền từ người sang người

- Lây truyền qua thức ăn, nước uống

- Lây truyền từ loài linh trưởng

Mức độ nhiễm HAV tại các

khu vực trên thế giới

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người HAV định vị ở gan

gây nhiễm virus máu

khởi phát sự nhiễm trùng

 Thời gian ủ bệnh khoảng 14-50 ngày.

 Triệu chứng: chán ăn, mỏi mệt, sốt, nhức đầu, vàng da xuất hiện 1-2 tuần sau khi bị nhiễm bệnh, nước tiểu đậm màu, gan đau, enzyme aminotransferase tăng cao trong máu

 Virus HAV chỉ gây bệnh cấp tính

 Hiện nay trên thế giới vẫn chưa có thuốc đặc trị, nên sử dụng vaccine là biện pháp cần

thiết

Các giai đoạn nhiễm bệnh của bệnh viêm gan A

A- Vật liệu:

 Virus và việc nuôi cấy:

- HAV được nhân lên trong fetal rhesus

kidney-4 (FRhK-4)-derived cells

- Dịch nổi tế bào nuôi cấy chứa 105 TCID50HAV trên 1 ml được sử dụng làm đối chứng dương

 Mẫu shellfish (động vật vỏ giáp: trai, sò, tôm,

cua) Mytilus galloprovincialis

 Ly trích RNA virus: RNA virus được ly trích bằng bộ kit FastTrack 2.0 Kit

 Chẩn đoán (giai đoạn cấp tính) dựa vào IgM anti-HAV bằng phương pháp miễn dịch

phóng xạ hoặc miễn dịch enzyme

 Tìm IgG anti - HAV có giá trị chẩn đoán dịch tễ

a Phương pháp miễn dịch liên kết

enzyme (ELISA)

 Phương pháp ELISA được sử dụng chủ yếu

để phát hiện sự có mặt của kháng thể IgM trong máu bệnh nhân nghi nhiễm HAV

 Nguyên lí: tương tự như ELISA, nhưng RIA

Các bước tiến hành

kỹ thuật RIA

a RT-PCR:

 Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR

 Phản ứng gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi đôi RNA – cDNA, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi đôi DNA thứ hai.

- Giai đoạn 2: dùng sợi đôi DNA vừa làm được

tổng hợp làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng

PCR theo các bước cơ bản.

 Trong kỹ thuật này có hai cặp primer khác nhau được sử dụng nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen

 Phản ứng PCR sau khi thực hiện bước sao

mã ngược tạo cDNA phải được thực hiện qua hai giai đoạn

 Giai đoạn 1: phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kì với cặp mồi thứ nhất

 Giai đoạn 2: sản phẩm PCR giai đoạn 1 được dùng làm

khuôn mẫu cho PCR giai đoạn 2 Cặp mồi thứ hai sẽ bắt cặp phía trong (nested) của sản phẩm PCR giai đoạn 1

Phản ứng PCR giai đoạn 2 sẽ khuếch đại đoạn gen cần xác định.

Quy trình phát hiện HAV bằng hnRT-PCR

 Sản phẩm RT-PCR và hnRT-PCR lần lượt

có kích thước 248 và 173bp

 Phản ứng RT-PCR với độ pha loãng 10 lần chủng HAV có thể phát hiện được 1 TCID50(50% tissue culture infective doses) trên 25g dịch shellfish

 Độ nhạy của RT-PCR cho những mẫu shellfish bị nhiễm HAV ngoài thực tế:

 Kết quả RT-PCR được xác minh lại bằng PCR:

hnRT- http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/ R/Radioimmunoassay.html