Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC DÙNG TRONG CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG

NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI

Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên,

Dương Văn Hợp

Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội

Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền

Viện Chăn nuôi

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô

lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi

quan tâm Nó giúp thức ăn cho động vật

không bị hỏng và giữ được dinh dưỡng

trong thời gian dài Bảo quản thức ăn cho

gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung

vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các

vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic

và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra

là một phương pháp bảo quản được nhiều

quốc gia trên thế giới ứng dụng

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có

hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong

bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình

lên men hiệu quả hơn Phân loại bằng sinh

học phân tử kết hợp với các đặc điểm sinh lý

sinh hoá của các chủng vi khuẩn sinh axit

lactic góp phần quan trọng trong việc lựa

chọn ra các chủng có các đặc tính tốt và an

toàn về mặt sinh học

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguồn vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập

từ 30 mẫu cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước

bún

- Các vi sinh vật kiểm định: Escherichia

coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhi,

Shigella flexneri được lữu giữ tại Bảo tàng

giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật

và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia

Hà Nội

2.1.2 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường MRS thạch (g/l):

Glucoza-20,0; K2HPO4-2,0; CaCO3-5,0;

CH3COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO4.7H2O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO4.4H2O- 0,28; Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa đủ- 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121o

C/15 phút

- Môi trường MRS dịch thể (g/l): Có thành

phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO3

- Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật

kiểm định(g/l): Cao thịt - 3,0; Pepton- 5,0;

NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1 lít; pH 7,0; khử trùng 121o

C/15 phút

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp định tính và định lượng

- Định lượng axit theo Therner (Emanuel và cộng sự, 2005)

- Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989)

2.2.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic

- Phân lập: Sử dụng phương pháp pha loãng

giới hạn (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự,

1972)

- Tuyển chọn: Xác định khả năng lên men

đồng hình; chịu nhiệt; kháng khuẩn; sinh bacterioxin; sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất (tinh bột, casein, pectin, xylan, CMC) và khả năng đối kháng theo các phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1972)

2.2.3 Phương pháp phân loại

- Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992)

- Phân loại dựa trên giải trình tự ADNr 16S

Xác định trình tự ADNr 16S của các

chủng vi khuẩn theo phương pháp của

Sakiyama và cộng sự (2009) Sản phẩm

PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên

máy đọc trình tự tự động (ABI

PRISM®3100-Avant Genetic

Analyzer-Mỹ) Kết quả đọc trình tự được xử lý trên

phần mềm Clustal X của Thompson và cộng

sự, 1997 Các trình tự được so sánh với trình

tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ

liệu của DDBJ, EMBL, GenBank Cây phát

sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử

dụng phương pháp của Saitou và Nei

(1987); phân tích Bootstrap (Felsenstein,

1985) được thực hiện từ 1000 lần lặp lại

ngẫu nhiên

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi

khuẩn lactic lên men đồng hình

3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh axit

Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà,

nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân

lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2

ngày ở nhiệt độ 30oC

3.1.2 Tuyển chọn các vi khuẩn lactic

- Xác định khả năng sinh axit lên men đồng

hình của các vi khuẩn phân lập

Các chủng phân lập được nuôi trên môi

trường MRS dịch thể có đặt ống Durham

Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng

phân lập có 131 chủng không sinh khí trong

ống Durham là lên men đồng hình

- Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi

khuẩn sinh axit

Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống

khởi động phải có khả năng sinh trưởng

được ở nhiệt độ cao, vì nhiệt độ thường tăng

trong quá trình ủ chua thức ăn, và sinh

trưởng được ở nhiệt độ trong dạ cỏ của động

vật Dựa vào tiêu chí này, 131 chủng lên

Bảy mươi chủng vi khuẩn sinh axit chịu nhiệt được nuôi trên môi trường MRS dịch

thể trong 48 giờ, hàm lượng axit tổng số của

dịch nuôi cấy được xác định Kết quả cho thấy 18 chủng có khả năng sinh axit cao từ 20-21 mg/ml, 43 chủng sinh axit từ 15-19 mg/ml và 9 chủng còn lại có hàm lượng axit

từ 8-14 mg/ml

- Xác định khả năng sản sinh axit lactic và kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn

Để xác định khả năng sinh axit lactic của

18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi cấy của các chủng này được định lượng axit lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng thời cũng xác định khả năng kháng một số

vi khuẩn gây bệnh trên dịch này Kết quả thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch nuôi Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi

các chủng đối với E coli từ 20-30 mm, M luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ

20-34 mm và Shigella flexneri 10-20-34 mm

Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi các chủng nghiên cứu cũng được xác định Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm định Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn kiểm định Kích thước vòng kháng (D-d) đối

với E coli từ 8-12 mm, M luteus từ 2-6

mm, Salmonella typhi từ 3-6 mm và Shigella flexneri 10-12 mm

Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5; 3-10; 4-4, 8-10; 9-17 và L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm tra một số đặc tính sinh học và tiến hành phân loại

Khả năng sinh enzyme được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất

Bảng 1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của dịch nuôi vi khuẩn

STT

Ký hiệu chủng

Hoạt tính enzym (D-d, mm) Amylase CMC-ase Pectinase Protease Xylanase

Chú thích: D-Đường kính vòng phân giải, d- Đường kính lỗ khoan (5 mm)

Kết quả bảng trên cho thấy 7 chủng

nghiên cứu đều có khả năng sinh các enzym

ngoại bào phân giải các cơ chất (trừ chủng

L01) Như vậy, ngoài khả năng sinh axit

cao, các chủng nghiên cứu còn có khả năng

sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất

có trong thành phần ủ thức ăn chăn nuôi

- Xác định khả năng đối kháng giữa các

chủng lựa chọn

Tám chủng nghiên cứu được nuôi trên

môi trường MRS bằng phương pháp cấy

vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau Sau

3 ngày, ở nhiệt độ 37oC, ở tất cả các mẫu

đều sinh trưởng tốt Kết quả này cho thấy 8

chủng không đối kháng nhau và hoàn toàn

có thể được sử dụng kết hợp với nhau trong

quá trình lên men chế biến thức ăn gia súc

3.2 Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn

3.2.1 Xác định trình tự 16S ADNr và xây

dựng cây phân loại

ADN hệ gen của 8 chủng nghiên cứu

được tách chiết Đoạn gen mã cho ARNr

16S được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử

dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau

đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong

phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi và mồi ngược Kết quả đọc trình tự được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank bằng công

cụ Blast Search để xác định đến tên loài Trình tự ADNr 16S của 8 chủng nghiên cứu được xác định Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần

gũi nhất với các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus và Lactobacillus Pediococcus acidilactici được sử dụng làm nhóm ngoài

Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với Enterococcus lactis (hình 1) So sánh trình

tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4

và 9-17 có mức tương đồng 99,7-100 % với

các loài của nhóm Lactobacillus plantarum;

chủng L01 có mức tương đồng 99,9 % với

Enterococcus lactis

Hình 1 Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loài có quan hệ họ hàng gần

3.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá

của các chủng vi khuẩn

Qua nghiên cứu các đặc điểm hình thái,

sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn

cho thấy tất cả 08 chủng này đều thuộc

nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng

catalaza âm tính, không có khả năng di

động, lên men đồng hình, có khả năng đông

tụ sữa, sinh trưởng ở pH 4-8,5; nhiệt độ

20-40oC và nồng độ muối 0-8% Hình thái tế

bào có 2 dạng: hình que (chủng 2-9, 2-10,

3-và trehalose (trừ chủng 4-14 3-và 8-10) Sáu trong số các chủng nghiên cứu không lên men từ các nguồn glycerol và D-xylose (trừ chủng 2-9 và L01)

Chưa thể kết luận được 7 chủng nghiên cứu có tế bào hình que thuộc chính xác loài nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA

vì chúng có độ tương đồng là 99.7% -100%

so với các loài thuộc nhóm Lactobacillus plantarum Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu trước đây, L pentosus thường lên men

Pediococcus acidilactici_ EF059987 Lactobacillus brevis_M58810

Lactobacillus acidifarinae_AJ632158 Lactobacillus parabuchneri_AB205056

100

Lactobacillus malefermentans_AM113783

54

Lactobacillus versmoldensis_AJ496791 Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556

Lactobacillus paraplantarum_AJ306297

3-10

Lactobacillus plantarum_AJ965482 Lactobacillus pentosus_D79211

64

4-14 9-17 2-9 3-5 8-10

56

2-10

75

63

72

66

72

62

100

53

Enterococcus lactis_DQ255948

L01

Enterococcus faecium_AJ301830

86

Enterococcus durans_AJ276354 Enterococcus hirae_Y17302

94

64 Enterococcus mundtii_AF061013

82

Enterococcus pseudoavium_ AF061002

98

Enterococcus gallinarum_ AF039900 Enterococcus faecalis_AB012212

54

56

52

100

55

0.02

1996) Kết hợp các đặc điểm sinh học phân

tử và đặc điểm sinh lý, sinh hoá có thể xếp

chủng 2-9 thuộc loài Lactobacillus pentosus

Các chủng 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4, 9-17

thuộc loài Lactobacillus plantarum Chủng

L01 có tế bào hình cầu, có các đặc điểm

thuộc loài Enterococcus lactis

Hình 2 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng 2-9 nuôi 2 ngày trên môi trường MRS

Các chủng được lựa chọn đều là những

chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh

và được sử dụng rất phổ biến trong các chế

phẩm probiotic Đây là các chủng nằm trong

danh sách các loài vi sinh vật được AAFCO

(American Feed Control Officials) Mỹ cho

phép sử dụng trong chế biến thức ăn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợn,

Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch,

Phạm Văn Ty (1976), Một số phương

pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2,

Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội

Bevilacqua A.E., Califano A.N (1989)

Determination of organic acids in dairy

products by high performance liquid

chromatography J Food Sci 54:

1076-1079 (1989)

Bringel, F., Curk, M C & Hubert, J C

(1996) Characterization of lactobacilli by

Southern-type hybridization with a

Lactobacillus plantarum pyrDFE probe

Int J Syst Bacteriol 46: 588–594

Curk M.C., Hubert J.C & Bringel F

(1996) Lactobacillus paraplantarum sp

nov., a new species related to

Lactobacillus plantarum Int J Syst

Bacteriol 46: 595–598

Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P., Gheorghe, C (2005) Isolation of a

Lactobacillus plantarum strain used for

obtaining a product for the preservation of

fodders African Journal of Biotechnology

4(5): 403-408

Felsenstein J (1985) Confidence limits on

phylogenies: an approach using the

bootstrap Evolution 39: 783-791

Kandler O & Weiss N (1986) Regular,

nonsporing Gram-positive rods In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol 2, pp 1208–1234 Edited by P H A Sneath, N S Mair, M

E Sharpe & J G Holt Baltimore: Williams & Wilkins

Kimura M (1980) A simple method for

estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies

of nucleotide sequences J Mol Evol 16:

111-120

Kozaki M., Uchimura T & Okada S (1992) Experimental manual of lactic acid

bacteria Asakurasyoten, Tokyo, Japan

Saitou N and Nei M (1987) The

neighbor-joining method: a new method for

reconstructing phylogenetic trees Mol Biol

Evol 4: 406-425

Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen,

M G., Miyadoh, S., Duong, V H &

Ando, K (2009) Kineosporia babensis

sp nov., isolated from plant litter in

Vietnam Int J Syst Evol Microbiol 59:

550-554

Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F.,

Jeanmougin F & Higgins D.G (1997)

The CLUSTAL_X windows interface:

flexible strategies for multiple sequence

alignment aided by quality analysis tool

Nucleic Acids Res 25: 4876-4882

Swezey J.L., Nakamura L.K., Abbott

T P & Peterson R E (2000)

Lactobacillus arizonensis sp nov., isolated from jojoba meal Int J Syst

Evol Microbiol 50: 1803-1809

Zanoni, P., Farrow, J A E., Phillips, B

A & Collins, M D (1987) Lactobacillus

pentosus (Fred, Petersen, and Anderson)

sp nov., nom rev Int J Syst Bacteriol 37:

339-341

SUMMARY

ISOLATION AND SCREENING OF LACTIC BACTERIA USED IN FOOD

PROCESSING AND PRESERVATION OF FORAGES AND

AGRICULTURAL RESIDUES FOR RUMINANTS

Dao Thi Luong, Nguyen Thi Anh Đao, Nguyen Thi Kim Quy, Tran Thi Le Quyen,

Duong Van Hop

Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi

Tran Quoc Viet, Ninh Thi Len, Bui Thị Thu Huyen

National Institute of Animal Husbandry

134 bacterial strains were isolated from natural fermentating resources Based on the ability of the homofermentation, heat resistance, the lactic acid, bacteriocin and extracellular enzyme production, 8 strains (2-9, 2-10, 3-5; 3 -10; 4-4, 8-10, 9-17 and L10) were selected

Based on the morphological, physiological and biochemical characteristics and the

sequence analysis of 16S rDNA, the strain 2-9 was identified as Lactobacillus pentosus; strains 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4 and 9-17 belong to Lactobacillus plantarum and strain L01 is considered Enterococcus lactis These strains are safe microorganisms, without causing disease

and very popularly used in probiotic preparations

Lời cảm ơn

Công trình được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài ”Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phụ phế phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn