Tài liệu CHUYỂN GEN VÀ VACCINE THỰC VẬT doc

 Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật thực vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau...  Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua dòng mầm vì vậy mọi t

Chuyển gen

và vaccine thực vật

Prof Chu Hoang Mau Ph.D.

Genetic and Molecular Biologist

Vice President

Thainguyen University

Mobile: 0913383289 Mail: Mauchkstn@yahoo.com Mauchdhtn@gmail.com

Nội dung

Chuyển gen

Khái niệm

Chuyển gen (transgenesis): Đưa một đoạn DNA

ngoại lai vào hệ gen (genome) của một cơ thể đa bào Đoạn DNA ngoại lai sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau

Khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và động vật

Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell)

Khái niệm

 Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gene therapy)

Có trường hợp các tế bào mầm không mang DNA ngoại lai Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gene therapy) cũng được sử dụng Các tế bào mầm này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho thế

hệ sau

 Thuật ngữ GMO (Genetically modified

organism)-Sinh vật biến đổi gen, được sử dụng chủ yếu để chỉ các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm

Khái niệm

 Ðộng vật (Thực vật) chuyển gen là động vật (thực vật) có

gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome của nó

 Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào,

kể cả các tế bào sinh sản mầm

 Nếu dòng tế bào mầm bị biến đổi, các tính trạng bị biến đổi

này sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp thông qua sinh sản

 Nếu chỉ có dòng tế bào sinh dưỡng bị biến đổi, chỉ có cơ thể

mang các tế bào sinh dưỡng đó bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho thế hệ sau

 Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật (thực vật) chỉ thành

công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau

Khái niệm: Gen chuyển

 Gen chuyển (transgene) là gen ngoại lai được

chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền

 Các gen chuyển được sử dụng để tạo động vật, thực

vật chuyển gen có nguồn gốc từ các loài sinh vật khác nhau

Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động (thực

vật) chuyển gen

 Nguyên tắc cơ bản trong việc tạo động vật (thực vật)

chuyển gen là đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào động vật (thực vật) (do con người chủ động tạo ra)

 Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua

dòng mầm vì vậy mọi tế bào kể các tế bào mầm sinh sản của động vật (thực vật) đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi như nhau

Cơ chế hợp nhất của DNA ngoại lai vào

genome

 Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome

được thực hiện với sự tham gia của các cơ chế sửa sai DNA của tế bào

 Sự hợp nhất của đoạn DNA ngoại lai vào genome

diễn ra theo cơ chế tái tổ hợp tương và không tương đồng

DNA ngoại lai hợp nhất vào genome nhờ quá trình tái tổ

hợp không tương đồng

Cơ chế thay thế gen bằng tái tổ hợp tương đồng

Vector chuyển gen

 Vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA

ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen tế bào chủ

 Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin di

truyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau

 Tế bào chủ thường là E.coli cho nên phần lớn các vector là các

phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc là bacteriophage

 Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym hạn

chế và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác nhờ enzym

Các đặc tính của vector

 Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng

không quá lớn

 Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control

sequences) như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter

 Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của

enzym hạn chế

 Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường

là các gen kháng chất kháng sinh)

Các loại vector dùng trong chuyển gen ở động vật

 Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors)

 Vector transposon

 Vector retrovirus

Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen

Các loại vector dùng trong chuyển gen ở

Thực vật khi sử dụng Agrobacterium

 Sự gây ra các khối u do Agrobacterium

 Agrobacterium tumefaciens và A rhizogenes là hai loài vi

khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm

 Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn

và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến

sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro

Bệnh khối u hình chóp ở cây mâm xôi

(Rubus) do A.tumefaciens gây ra

Ti-plasmid của Agrobacterium

tumefaciens

Ti-plasmid có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng

được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ

dưới 30oC

Trong khi hình thành khối u, T-DNA được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-DNA ổn định trong genome nhân

T-DNA được phiên mã trong các tế bào khối u tạo ra nhiều mRNA polyadenyl

Cơ chế chuyển T-DNA

Kỹ thuật chuyển gen ở động vật

1. Tách chiết ADN, phân lập gen mong muốn

2. Tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật

3. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

4. Chuyển gen vào phôi động vật (vi tiêm, tế bào gốc

phôi, vector virus)

5. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật

bậc cao

6. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

7. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục

Chuyển gen ở thực vật

 Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào hệ gen của một

sinh vật được gọi là quá trình biến nạp (transformation)

 Những cây được biến nạp được gọi là cây biến đổi

gen (genetically modified plant-GMP)

 Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào

thực vật riêng lẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

1 Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.

2 Phân lập gen

3 Gắn gen vào vector biểu hiện để biến nạp.

4. Biến nạp vào E coli.

5 Tách chiết DNA plasmid.

6 Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các

phương pháp khác nhau đa kể trên.

7 Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.

8 Tái sinh cây biến nạp.

9 Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc

Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot )

Kh¸i niÖm miÔn dÞch

 Miễn dịch là khả năng tự vệ của cơ thể bằng sự thích ứng bảo vệ

tự nhiên, cũng như khả năng chủ động của cơ thể chống lại bất kỳ khả năng chủ động

một vật lạ

một vật lạ xâm nhập vào cơ thể.

 Khoa học nghiên cứu về miễn dịch nói chung được gọi là miễn dịch

học (immunology) Nếu nghiên cứu về cơ chế tác động phân tử và ảnh hưởng của yếu tố di truyền (hệ gen) lên miễn dịch, thi gọi là

miễn dịch học phân tử (molecular immunology).

trung ương trong việc điều hòa miễn dịch.

 Nghiên cứu các khả năng đáp ứng miễn dịch, các đáp ứng miễn dịchyếu tố miễn dịch của cơ thể đáp ứng theo các loại hình: miễn dịch dịch thể, miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian

tế bào và miễn dịch thực bào

Kh¸i niÖm…

 Miễn dịch học nghiên cứu ứng dụng các quy luật các quy luật

đó trong các phản ứng huyết thanh học, phản ứng huyết thanh học

khoa học khác như: hoá học, hoá học hoá sinh học, sinh lý

học, tế bào học, vật lý học, huyết thanh học, phóng xạ

xạ học, vi sinh vật học, sinh học phân tử và lượng

C¸c lo¹i miÔn dÞch

C¸c lo¹i miÔn dÞch

 Miễn dịch tự nhiên (còn gọi là miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch Miễn dịch tự nhiên

chủng loại hay miễn dịch có tính chất di truyền).

 Miễn dịch tự nhiên là loại có sẵn của chủng loại mang tính chất di có sẵn của chủng loại

truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, khi sinh ra sinh vật đó đã được thừa hưởng.

 Có nhiều bệnh truyền nhiễm của động vật mà người không mắc Ví dụ: người không mắc bệnh dịch tả của vịt hay không mắc bệnh dịch

tả của lợn.

 Có nhiều bệnh truyền nhiễm của người mà động vật không mắc Ví dụ: động vật không mắc bệnh thương hàn hay bệnh sởi của người.

 Có nhiều bệnh mà ở lứa tuổi này mắc, lứa tuổi khác không mắc: trẻ

em dễ bị mắc bệnh bại liệt còn người lớn không mắc.

Miễn dịch tiếp thu hay miễn dịch thu

được

 Loại miễn dịch này không phải tự nhiên mà có mà là thu được

trong quá trình sống của người hoặc động vật Miễn dịch này phát sinh dưới những kích thích đặc hiệu (vi sinh vật gây bệnh, những kích thích đặc hiệu

sản phẩm độc của chúng) mà qua khỏi hoặc khi tiêm vaccin hay kháng huyết thanh v.v…

 Miễn dịch này có tính chất đặc dị tức là cơ thể động vật miễn dịch

đối với vi sinh vật gây bệnh nhất định nhưng vẫn còn tính cảm thụ đối với vi sinh vật gây bệnh khác.

 Miễn dịch thu được chia làm 2 loại: miễn dịch thu được chủ động

và miễn dịch thu được bị động.

Vaccine an ®­îc

 Tiêm chủng là biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn ngừa các bệnh

truyền nhiễm Mỗi năm có một tỷ liều vaccine được sản xuất và phân phối Nguồn thu từ vaccine đã tăng gần 3 lần trong vòng 20 năm qua, đạt 5,4 tỷ USD năm 2000

 Mặt khác, do hiện tượng kháng kháng sinh của các chủng vi

khuẩn và sự gia tăng đáng báo động của các vi sinh vật mới và tái xuất hiện khiến cho nhu cầu về vaccine vẫn là ưu tiên số 1

 Từ những năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới "oral

vaccine" (vaccine đường miệng) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được có nguồn gốc thực vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này.

Vaccine n ®­îc ă

 Vaccine ăn được có hoạt tính tương tự như vaccine thông

thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt Nỗ lực sản xuất vaccine đầu tiên từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990 Sau

đó, nhiều thành công khác về vaccine thực vật cũng được công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây

 Số lượng các nghiên cứu về vaccine ăn được gia tăng đã chứng

tỏ tính ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dễ dàng do không cần giữ lạnh

 Thuât ngữ "plant edible vaccine" thường xuyên được nhắc đến

trong nhiều hội thảo quốc tế về công nghệ sinh học thực vật những năm gần đây như một vaccine thế hệ mới

 VXAD từ thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa

trên hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn

 VXAD là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống

miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào.

(i)Vaccine là thuốc hoặc chế phẩm có chứa tác nhân hoặc các thành

phần của tác nhân gây bệnh có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch để bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự gây bệnh của tác nhân đó

(ii) VXAD là một sản phẩm gây đáp ứng miễn dịch để bảo vệ cơ thể

tránh được sự gây bệnh Vaccine có thể đưa vào cơ thể qua đường tiêm, đường miệng và dạng sol khí.

Vaccine ăn được

Vaccine ăn được

(iii) Ngoài ra, VXAD là vaccine tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều

chuỗi polypeptide của protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh Người ta chọn lọc những gen mã hoá cho các thành phần này, đưa vào vector, dựa vào hệ thống di truyền thực vật để khuếch đại gen và biểu hiện thành các kháng nguyên protein mong muốn.

(iv) Cụm từ "an được" ở đây đề cập đến sự chấp nhận của cơ thể,

tức là vaccine này bền vững trong dịch tiêu hoá, đi qua đường tiêu hoá mà không bị phân huỷ Các thực vật ăn được có thể dùng để sản xuất kháng nguyên này là khoai tây, cà chua, chuối, rau diếp, gạo, lúa mì, đậu tương và ngô (

Chuyển gen tạo vaccine ăn được

 Điểm quan trọng nhất trong thiết kế vector biểu hiện là

promoter, đây phải là promoter khoẻ, có ái lực mạnh với RNA - polymerase của vật chủ và hoạt động của promoter được điều hoà một cách dễ dàng

 Trong sản xuất vaccine ăn được, người ta thiết kế một

vector gồm hai gen: Một gen mã hoá cho kháng nguyên virus và một gen kháng sinh

 Chuyển gen ổn định: Chuyển gen vào nhân là

phương pháp chuyển gen ổn định do gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể thực vật được ứng dụng phổ biến trong sản xuất protein đầy đủ chức năng

Vaccin thực vật (vaccine ăn được)

 Vaccine ăn được là vaccine tác động vào thể dịch,

kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào

 Vaccine ăn được nguồn gốc thực vật có hoạt tính

tương tự như vaccine thông thường

 Khác với vaccine thường là vaccine ăn được do thực

vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt

Đặc điểm của vaccine thực vật

Vaccin thực vật được chính mô và thành tế bào thực vật bao bọc, hạn chế được sự phá hủy và ổn định, bền vững trong cơ thể

Dễ sử dụng: đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa; Vaccin này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ)

Dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên, giá thành thấp.

Tính ổn định cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và kinh tế cao.

Độ an toàn cao, ít bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh của động vật và người.

Có thể không cần tinh sạch như các loại vacxin khác.

Quy trình sản xuất

Thiết kế vector chứa

gen quan tâm

Chuyển vector vào vi

khuẩn Agrobacterium

Chuyển gen quan tâm

vào tế bào thực vật

Kiểm tra khả năng miễn

dịch ở động vật

Tinh sạch và sản xuất

•~ 20% trọng lượng tươi

•10%

•20 000mg/kg

•Độ tinh sạch cao

•~ 0,2% trọng lượng tươi

•Mức độ biểu hiện 1%

•20mg/kg

PROTEIN LÁ VÀ HẠT

 Virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện trên thế giới đã từ lâu

 Năm 1988 đã giải mã được gen mã hoá hemagglutinin (gen H5) của

virus cúm H5N1 phân lập ở Scotland.

 Năm 1997 18 trường hợp nhiễm cúm H5N1 phát hiện ở Hong Kong, 6

ca tử vong

 Cuối năm 2003 đầu năm 2004 dịch cúm gia cầm đã lan rộng ra nhiều

nước châu á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Indonesia Hàng triệu gia cầm đã bị chết

và bị tiêu huỷ do virus cúm H5N1

 Virus H5N1 đã vượt ra khỏi phạm vi châu á và lan sang cả các nước

châu âu như Rumani, Nga, Thuỵ điển, Thổ Nhĩ kỳ, Đức, Pháp v.v

 Theo thông báo của WHO, trên thế giới đã có tới hơn một trăm trường

hợp nhiễm cúm H5N1, trong đó có hơn sáu mươi trường hợp tử vong.

Dịch cúm A/H5N1 và tình hình nghiên cứu cúm

A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới

Dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới

H5N1 có thể nhiễm từ gia cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất trầm trọng và gây ra nhiều ca tử vong

Cúm A/H5N1

Virus cúm có tính chất đặc biệt:

- Bộ gen phân cắt sẵn thành 8 phân đoạn khác nhau

- Hai gen thuộc phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho hai kháng nguyên quan

Virus cúm A/H5N1

Vaccine cúm A/H5N1 và biện pháp phòng chống

 Cúm gia cầm H5N1do virus thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra

Những năm gần đây đã gây nên đại dịch gây thiệt hại lớn về kinh tế và con người các nước trên trên thế giới, đặc biệt là các nước Đông nam Á

Biện pháp tốt nhất để ngăn chặn dịch cúm là dùng vaccine Với

sự tiến bộ của khoa học và công nghệ, một số vaccine phòng chống virus cúm A đã được nghiên cứu và thử nghiệm thành công, bao gồm:

Vacxin bất hoạt (inactivated vaccine) Vacxin nhược độc (attenuated vaccine) Vacxin thế hệ mới:

- vacxin tái tổ hợp (recombination vaccine)