TCVN: BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN. PHẦN XX: BỆNH DỊCH TẢ LỢN

- FITC Fluorescein isothiocyanate: Chất phát tín hiệu huỳnh quang- MEM Minimal essential medium: Môi trường nuôi cấy tế bào - NPLA Neutralising Peroxidase - Linked Assay: Phương pháp t

Lời nói đầu

TCVN XXXX: 2018 do Chi cục Thú y vùng VI - Cục Thú y

biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề

nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,

Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN XXXX: 2018

Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán –

Phần XX: Bệnh Dịch tả lợn

Animal disease – Diagnostic procedure – Part XX: Classical swine fever disease

CẢNH BÁO  Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết

bị và các thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề

an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn

2 Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt

2.1 Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh Dịch tả lợn (Classical swine fever disease)

Bệnh Dịch tả lợn (classical swine fever disease- CSF) là bệnh truyền nhiễm gây ra

bởi một loại vi rút cấu trúc RNA thuộc giống Pestivirus, họ Flaviridae Vi rút Dịch tả

lợn chỉ có một serotype duy nhất Bệnh chỉ xảy ra ở loài lợn với các mức độ khácnhau tùy thuộc vào độc lực vi rút, tuổi động vật mẫn cảm và thời gian nhiễm bệnh.Lợn có thể bị mắc bệnh ở mọi lứa tuổi

2.2 Chữ viết tắt

- CSF (Classical swine fever): Bệnh Dịch tả lợn

- DNA (Deoxyribonucleic acid): Axít deoxyribonucleic

- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays): Phản ứng miễn dịch liên kếtenzyme

- FBS (Fetal bovine serum): Huyết thanh thai bê

- FITC (Fluorescein isothiocyanate): Chất phát tín hiệu huỳnh quang

- MEM (Minimal essential medium): Môi trường nuôi cấy tế bào

- NPLA (Neutralising Peroxidase - Linked Assay): Phương pháp trung hòa trên tếbào

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát

- PK 15 (Porcine kidney): Tế bào thận lợn

- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng RT-PCR

- RNA (Ribonucleic acid) : Axít ribonucleic

- SK-6 (Swine kidney 6): Tế bào thận lợn

- TCID 50 (50% tissue culture infective dose): Liều gây nhiễm 50% tế bào

- Natri clorua (NaCI)

- Natri phosphat (Na2HPO4)

- Natri hydroxit (NaOH) 1 N

- Dung dịch axít chlohydric (HCl) 1N

- Dung dịch đệm phosphat glycerin

- Các loại thuốc kháng sinh: penicillin, streptomycin, polymicin

- Huyết thanh thai bê

- Tế bào thận lợn sơ cấp, tế bào dòng PK 15, SK-6

- Chất gắn kết Dịch tả lợn (Kháng thể huỳnh quang Dịch tả lợn)

- Chất gắn kết globulin kháng thể lợn

- Vi rút cường độc Dịch tả lợn gây bệnh trên lợn

- Vi rút cường độc Dịch tả lợn chủng thuần hóa trên tế bào

4 Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

- Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ -20oC đến -80oC

- Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2oC đến 8oC

- Tủ ấm

- Cân điện tử có mức cân nhỏ nhất là 1/10000 g

- Tủ sấy

- Nồi hấp

- Buồng an toàn sinh học cấp 2

- Máy ly tâm lạnh có thể đạt gia tốc ly tâm 1500 g/min đến 2500 g/min, 10.000 g/min

và 12.000 g/min

- Máy khuấy từ

- Máy lắc ống (vortex mixer)

- Kính hiển vi đảo ngược (dùng soi tế bào)

- Giấy nhôm bao gói

- Khay chứa các dung dịch làm ELISA

- Ống Leighton

- Lọ nuôi tế bào loại T25, T75

- Đĩa nuôi tế bào loại 6 giếng

- Bệnh Dịch tả lợn là một trong những bệnh trên lợn với đặc điểm là cường huyếtdưới da hoặc tím tái và không có dấu hiệu lâm sàng đặc hiệu Trong một số trườnghợp các bệnh tích quan sát không đủ cơ sở kết luận bệnh do có thể nhầm lẫn với

các trường hợp do Dịch tả lợn Châu Phi, bệnh phó thương hàn do Salmonella, bệnh

tụ huyết trùng do Pasteurella, bệnh viêm phổi do Actinobacillus và Haemophillus suis

hay bệnh do PCV2, hội chứng PRRS

5.2 Triệu chứng lâm sàng

Thời gian ủ bệnh từ 3 ngày đến 8 ngày, bệnh xuất hiện với các thể như sau:

- Thể quá cấp tính

Bệnh xuất hiện đột ngột, không có triệu chứng ban đầu (tiền chứng), con vật ủ rũ, bỏ

ăn, sốt cao 40°C đến 42°C, con vật dẫy dụa rồi chết nhanh Diễn biến bệnh trongvòng 1-2 ngày, tỷ lệ chết tới lên đến 100%

- Thể cấp tính

Lợn ủ rũ, kém ăn, rồi bỏ ăn, sốt cao 41°C đến 42°C kéo dài đến lúc gần chết, mắtviêm đỏ có dử, chảy nước mũi, miệng có loét phủ nhựa vàng ở lợi, chân răng, hầu;lợn thường bị ói mửa, thở khó, nhịp thở rối loạn Lúc đầu táo bón sau đó tiêu chảyphân bết vào mông, đuôi mùi thối khắm có khi có máu tươi Trên da có nhiều điểmxuất huyết lấm tấm ở tai, mõm, bụng và 4 chân Vào cuối kỳ bệnh, lợn bị bại 2 chânsau đi loạng choạng hoặc không đi được Nếu ghép với các bệnh khác thì các triệuchứng trên trầm trọng hơn

- Thể mãn tính

Nếu thể cấp tính kéo dài con vật chuyển sang thể mãn tính Con vật gầy còm lúc đitáo lúc tiêu chảy, ho khó thở, da lưng sườn có những vết đỏ có khi loét ra từngmảng

Bệnh tiến triển từ 1 đến 2 tháng lợn chết do kiệt sức hoặc có thể khỏi nhưng gầycòm khó vỗ béo Những con khỏi bệnh có thể miễn dịch nhưng nó là nguồn gieo rắc

đỏ gạch, niêm mạc ruột nhất là van hồi manh tràng có những nốt loét, hạch lâm basưng tụ máu có màu đỏ sẫm.

Lách không sưng hoặc ít sưng nhưng có hiện tượng nhồi huyết, xuất huyết ở viềnlách

Thận xuất huyết ở lớp vỏ Phổi viêm tụ máu có nhiều vùng bị gan hóa, hoại tử cứnglại Màng phổi có những chỗ chấm đỏ xuất huyết

- Thể mãn tính

Ruột viêm có mụn loét tròn Có khi thấy thành ruột già dày cứng lên, niêm mạc trởnên sần sùi Phổi dính vào lồng ngực bằng tổ chức liên kết chứa những cục hoại tử

có vỏ liên kết cứng

6 Chẩn đoán trong phòng xét nghiệm

6.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

(Dựa theo TCVN 8402:2010_Chẩn đoán bệnh động vật – Quy trình mổ khám)

- Mẫu bệnh phẩm: máu kháng đông, lách, hạch bạch huyết, hạch amidan, thận, dịchnổi tế bào sau khi phân lập vi rút để phát hiện vi rút Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh

để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dịch tả lợn

- Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả đượcđặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2oC đến 8oC Mẫu bệnhphẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửibệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đóngbăng Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 4oC đến 8oC tối đa trong 7 ngày Lưu mẫubệnh phẩm ở nhiệt độ -20oC đến -80oC

6.2.2 Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên

Có thể sử dụng mẫu bệnh phẩm là huyễn dịch nghiền bệnh phẩm hoặc huyếtthanh/huyết tương lợn ốm Khi sử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn củanhà sản xuất

Các bước tiến hành: Tham khảo Phụ lục B

6.2.3 Phương pháp realtime RT-PCR phát hiên kháng nguyên

6.2.3.1 Chiết tách RNA

- Sử dụng kít chiết tách RNA cho vi-rút Dịch tả lợn theo hướng dẫn của nhà sản xuấttheo kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96 Hoặc có thể sử dụng cácloại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách RNA vi rút (Tham khảo Phụlục C)

- RNA sau khi chiết tách được bảo quản ở 4oC nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản-20oC trong thời gian dài

6.2.3.2 Chuẩn bị mồi và mẫu dò

- Lựa chọn mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo khuyếncáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn mồi và mẫu dò phù hợp Các bộ mồi và mẫu

dò để phát hiện vi rút Dịch tả lợn được liệt kê trong Bảng D1 trong phụ lục D

- Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 µM và mẫu dò ở nồng độ 6 µM với nước tinh khiết,không DNase/RNase

- Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng được thể hiện trong Bảng D2 trongphụ lục D

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu master mix tiến hành:

+ Cho 20µl hỗn hợp master mix vào ống PCR 0,2 ml

+ Cho 5 µl RNA dương chuẩn của vi rút CSF có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCRđối chứng dương

+ Cho 5 µl nước tinh khiết không DNase/RNase vào ống PCR đối chứng âm

+ Cho 5 µl RNA của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR

+ Đặt ống PCR vào máy realtime RT-PCR

Lưu ý: Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứngdương và mẫu đối chứng âm

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng được nêu trong Bảng D3 trong phụ lục D

Chú thích: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đálạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

- Với điều kiện phản ứng:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh Dịch tả lợn khi kết quả realtime RT-PCRdương tính Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sửdụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả

6.2.4 Phân lập vi rút

6.2.4.1 Chuẩn bị tế bào

Tách tế bào một lớp (thận lợn sơ cấp, PK-15, SK-6, ) bằng trypsin 0.5% khoảng từ

5 đến 10 phút ở 37°C Cho môi trường phát triển (dung dịch Eagle’ MEM chứa 5%huyết thanh thai bê - FBS) vào trộn đều, ly tâm 160 g trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi,hòa tan tế bào với một lượng môi trường phát triển sao cho đạt mật độ 2x106 tếbào/ml môi trường phát triển và bổ sung dung dịch kháng sinh/Glutamin (0,2 ml dungdịch kháng sinh/Glutamin trong 10 ml huyễn dịch tế bào)

6.2.4.2 Gây nhiễm tế bào

- Trộn huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý với huyễn dịch tế bào theo tỷ lệ 1/10, rồi nuôicấy trong ống Leighton có sẵn lamen hoặc trong các lọ nuôi tế bào hay đĩa nuôi tếbào Ủ ở 37°C

- Thu hoạch huyễn dịch tế bào sau 24 giờ và 72 giờ gây nhiễm, giám định vi rút bằngphản ứng ELISA hoặc phản ứng realtime RT-PCR

6.2.5 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

6.2.5.1 Chuẩn bị mẫu

- Dùng máy cắt lạnh cắt các tổ chức bệnh phẩm (amiđan, lách, hạch ) thành nhữnglát mỏng từ 5 mm đến 7 mm đặt lên phiến kính, mỗi phiến từ 2 lát đến 3 lát Dùng bútkim cương đánh dấu ký hiệu số của bệnh phẩm, chủng loại tổ chức lên phía góc tráicủa phiến kính

- Để tiêu bản khô tự nhiên

- Nếu không có máy cắt lạnh thì dùng phương pháp in tổ chức: dùng dao sắc mỏngcắt dứt khoát một nhát trên miếng tổ chức (amiđan, lách ) dùng panh nhọn gắpmiếng tổ chức thấm trên giấy lọc cho đến hết máu, ấn nhẹ mặt cắt tổ chức lên phiếnkính, dùng bút đánh dấu, để khô tự nhiên

6.2.5.2 Chuẩn bị mẫu thử trên môi trường tế bào

- Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10% với môi trường tế bào có bổsung kháng sinh Sau đó ly tâm 2000 g trong 15 phút, thu dịch nổi phía trên

- Cấy mẫu bệnh phẩm lên tế bào thận lợn đã chuẩn bị sẵn trong ống nghiệmLaighton có lá kính, mỗi mẫu bệnh phẩm cấy 2 ống đến 4 ống

- Sau khi cấy bệnh phẩm 24 giờ đến 48 giờ, lấy lá kính ra, để khô tự nhiên và chờtiến hành các bước sau

CHÚ Ý: Khi cấy bệnh phẩm lên tế bào cần có 2 ống đối chứng tế bào khỏe, 2 ống đốichứng nhiễm vi rút Dịch tả lợn Đánh dấu các ống tế bào

vào cố định, để ở -20°C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó lấytiêu bản ra để khô tự nhiên Axeton được cho vào bình sạch tái sử dụng.

6.2.5.4 Nhuộm mẫu thử

- Dùng chất gắn kết FITC đã pha loãng ở nồng độ sử dụng nhỏ lên các phiến kínhhoặc lá kính đã gắn bệnh phẩm đảm bảo thuốc nhuộm phủ kín tổ chức Đặt cácphiến kính, lá kính này vào khay ấm (giữ cho bề mặt luôn ướt trong suốt quá trìnhnhuộm) tủ ấm 37°C trong 30 phút

- Rửa bỏ chất gắn kết

- Sau khi lấy ở tủ ấm ra, đổ bỏ chất gắn kết, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịchđệm (PBS) pH = 7,2 vào tiêu bản cho sạch chất gắn kết, đặt tiêu bản vào cốc córãnh, đổ ngập PBS vào ngâm rửa 2 lần đến 3 lần, mỗi lần 5 phút Cuối cùng tráng lạibằng nước cất hai lần

- Đặt nghiêng tiêu bản trên giấy lọc hoặc thấm nhẹ cho khô

- Nhỏ một giọt dung dịch đệm glyxerin lên phiến kính tiêu bản rồi đậy lá kính lên hoặcnhỏ 1 giọt dung dịch đó lên phiến kính sạch rồi đậy lá kính lên

- Các đối chứng trong phương pháp huỳnh quang trực tiếp

+ Đối chứng âm tính (-): tiêu bản tế bào thận lợn hoặc hạch, lách lợn khỏe mạnhnhuộm chất gắn kết Kết quả không phát quang

+ Đối chứng dương tính (+): tiêu bản Dịch tả lợn dương tính nhuộm chất gắn kết Kếtquả có phát quang sáng rõ từng đám ở những nguyên sinh chất có vi rút dịch tả lợn.+ Đối chứng miễn dịch đặc hiệu: tiêu bản bệnh phẩm sau khi cố định axeton đượcnhỏ 1 giọt kháng huyết thanh dịch tả lợn đặc hiệu, để ở 37°C trong 30 phút Đổ bỏhuyết thanh, rửa bằng PBS trước khi gắn chất gắn kết Kết quả tiêu bản không phát

- Đọc và trả lời kết quả theo Bảng 1.

Các tiêu bản Kết quả huỳnh quang Kết luận

6.2.6 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

6.2.6.1 Chuẩn bị mẫu, xem 6.2.5.1.

6.2.6.2 Cố định tiêu bản, xem 6.2.5.3.

6.2.6.3 Gắn kháng huyết thanh Dịch tả lợn lên tiêu bản

- Nhỏ từ 0,1 ml đến 0,2 ml kháng thể Dịch tả lợn lên mỗi tiêu bản đặt trong khay ấm

để ở nhiệt độ 37°C trong 30 phút (tiêu bản luôn luôn ướt trong suốt quá trình ủ)

- Đổ bỏ huyết thanh, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) lên phiến kínhtiêu bản trong cốc dung dịch đệm 10 min, thay PBS nhiều lần và liên tục lắc nhẹphiến kính

- Lấy ra để tiêu bản khô, nhỏ chất gắn kết globulin miễn dịch kháng Dịch tả lợn lêncác tiêu bản, đặt vào khay ẩm ở 37°C trong 30 phút

- Sau đó thực hiện các bước như 6.2.5.4

6.2.6.4 Đọc kết quả

- Tiêu bản kháng nguyên dương tính gắn với chất gắn kết: kết quả (+)

- Tiêu bản tổ chức khỏe gắn chất gắn kết: kết quả (-)

- Tiêu bản bệnh phẩm cần kiểm tra nhỏ globulin miễn dịch không gắn FITC sau đónhỏ tiếp chất gắn kết: kết quả đọc huỳnh quang giảm nhiều

- Đọc và trả lời kết quả theo Bảng 1

6.2.7 Phương pháp tiêm truyền qua thỏ

6.2.7.1 Chuẩn bị mẫu

Chọn 6 thỏ mạnh khỏe từ 1,8 kg/con đến 2 kg/con Chia thỏ làm 2 lô, mỗi lô 3 thỏ:

- Tiêm 1 ml dịch huyền phù bệnh phẩm nghi Dịch tả lợn (máu của lợn bệnh đã khửfibrin hoặc hạch lách lợn bệnh pha loãng 1/10 đã xử lý kháng sinh) vào tĩnh mạch tai

3 thỏ của lô 1 Theo dõi thân nhiệt thỏ mỗi ngày 2 lần trong 7 ngày (thỏ phải khôngsốt)

- Sau 7 ngày, tiêm 1 ml vắc xin nhược độc Dịch tả lợn chủng C pha loãng 1/10 vàotĩnh mạch tai 3 thỏ của lô 1 và 3 thỏ của lô 2.

- Phương pháp trung hòa trên tế bào (NPLA - Neutralising Peroxidase - LinkedAssay) Ngoài việc sử dụng với mục đích chẩn đoán bệnh, phương pháp phát hiệnkháng thể bằng phương pháp trung hòa trên tế bào còn có ý nghĩa đánh giá hiệu giákháng thể khi tiêm phòng vắc-xin Dịch tả lợn Phương pháp này để xác định hàmlượng kháng thể có trong huyết thanh nhờ sự ức chế của kháng thể đối với vi rútDịch tả lợn được gây nhiễm trên tế bào Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục F

7 Kết luận

Lợn được xác định mắc bệnh Dịch tả lợn khi có các đặc điểm Dịch tễ học, triệuchứng lâm sàng của bệnh Dịch tả lợn và kết quả dương tính với một trong nhữngphương pháp xét nghiệm sau:

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên dương tính

- Phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút dương tính

- Phân lập được vi rút trên môi trường tế bào, và giám định vi rút Dịch tả lợn dươngtính

- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dương tính

- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp dương tính

- Phản ứng tiêm truyền qua thỏ dương tính

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể dương tính ở lợn chưa tiêm phòng