Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (paphiopedilum concolor) ở thái nguyên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌCTRẦN THỊ THU TRANG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN HÀI ĐỐM Paphiopedilum concolor Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor)

Ở THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2020

Thái Nguyên - 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor)

Ở THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2020

LỜI CAM ĐOAN

T x y tr u t t ệ ư s

ư TS Vũ T ị L Mọ trí tr uậ vă ều rõ uồ

ố Cá số ệu, kết quả u tr uậ vă tru t v ư từ

bố tr ột tr k á

Thái Nguyên, ngày tháng 12 năm 2020

Tác giả

Trần Thị Thu Trang

ị k t uật v p t í ệm Khoa ã tạ ều kiệ úp ỡ tôi trongquá trình làm luậ vă t ạ sĩ.

Tôi xin cảm ơ ình và bạn bè luôn bên cạnh ng hộ, khuyến khích,ộng viên tạ ộng l ể tôi hoàn thành luậ vă y

Trong quá trình làm luậ vă k trá k ỏi những sai sót, tôi mongnhậ ược s ó óp quý báu từ phía thầy cô và bạ bè ể tôi hoàn thành bảnluậ vă

Thái Nguyên, ngày tháng 12 năm 2020

Tác giả

Trần Thị Thu Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN .ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH .vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấ ề 1

2 Mục tiêu nghiên c u 2

3 Nội dung nghiên c u 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Gi i thiệu về lan H v H Đốm 4

1.1.1 Phân loại lan Hài (Paphiopedilum) 4

1.1.2 N uồ ố .5

1.1.3 Đặ ể t á .6

1.1.4 Đ ều kiệ s t á .7

1.1.5 H ệ trạ y H V ệt N 8

1.1.6 Đặ ểm th c vật học c H Đốm 12

1.2 P ươ p áp ố v tí in vitro 14

1.2.1 Quy trình nhân giống in vitro [20] 14

1.2.2 Cá p ươ p áp ố v tí H Đốm 16

1.3 Tình hình nghiên c u lan Hài trên thế gi v tr ư c 17

1.3.1 Trên thế gi i 17

1.3.2 Tron ư c 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đố tượng và vật liệu nghiên c u 27

2.2 Đị ểm và thời gian nghiên c u 28

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên c u 28

2.3.1 Hóa chất 28

2.3.2 Thiết bị 28

2.3.3 Dụng cụ 29

2.4 P ươ p áp u 29

2.4.1 P ươ pháp khử trùng chồi non 29

2.4.2 P ươ p áp k ử trùng quả Đốm 30

2.4.3 Nghiên c u ảnh ưởng c trường t i khả ă ảy mầm c a hạt lan H Đốm 30

2.4.4 P ươ p áp chồi in vitro 30

2.4.5 Nghiên c u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c H Đốm 31

2.4.6 P ươ p áp ư cây ra ngoài t nhiên 31

2.4.7 P ươ p áp ă sóc H Đốm ở ư i 32

2.4.8 P ươ p áp p tí v xử lí số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên c u p ươ p áp k ử trùng m u 33

3.2 Nghiên c u ả ưởng c a tuổi quả v trường t i khả ă ảy mầm c a hạt l H Đốm 36

3.3 Nghiên c u ả ưởng c a một số chất ều s trưở ến khả ă nhân nhanh và s s trưởng c a chồ H Đốm 40

3.3.1 Ả ưởng c a BAP kết hợp v NAA ến khả ă v sinh trưởng c a chồ H Đốm non sau khi nảy mầm 40

3.3.2 Ả ưởng c a nồ ộ BAP ến khả ă ồi 44

3.4 Nghiên c u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c H Đốm 49

3.5 Nghiên c u ư y in vitro r vườ ươ .52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 67

RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA

DANH MỤC BẢNG

Bả 1.1: Cá ó H V ệt N t t ạ bả tồ Tổ

Bả tồ T Quố tế IUCN 10Bảng 2.1: Hóa chất nghiên c u 30Bảng 2.2: Thiết bị nghiên c u 30Bảng 3.1: Ả ưởng c a thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% ối v ichồi H Đốm sau 2 tuần 37Bảng 3.2: Hiệu quả c a chế ộ khử trù ối v i quả lan Hài Đốm .38Bảng 3.3: Ả ưởng c a tuổi quả v trường t i khả ă ảy mầm

c a hạt lan Hài Đốm 40Bảng 3.4: Kết quả nghiên c u ả ưởng c a BAP kết hợp v i NAA ến khả

ă v s trưởng c a chồ H Đốm sau 50

ngày 46Bảng 3.5: Ả ưởng c a nồ ộ BAP ến khả ă nhân chồi và sinh

trưởng c a chồi in vitro 49

Bảng 3.6: Kết quả nghiên c u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c a

y H Đốm in vitro 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái lan Hài Đốm 13

Hình 2.1: Đố tượng và vật liệu nghiên c u 29

H 2.2: Sơ ồ thí nghiệm 31

Hình 3.1: Tái sinh l H Đốm bằng p ươ p áp ạt 42

Hình 3.2: Ả ưởng c a BAP kết hợp v NAA ế s trưởng c a chồi H Đốm non sau 50 ngày 47

Hình 3.3: Chồi lan Hài Đố s trưở tr trường bổ sung BAP ở các nồ ộ từ 1 – 4mg/l sau 4 tuần 50

Hình 3.4: Chồ H Đố s trưở tr trường bổ sung BAP ở các nồ ộ từ 1 – 4mg/l sau 8 tuần nuôi cấy 51

Hình 3.5: Ả ưởng c a NAA t i khả ă r rễ c H Đốm 56

Hình 3.6: Cây lan Hài Đố s trưởng và phát triển ở nhà ư i 57

1 Đặt vấn đề

H ượ ười biết ến từ rất s m khoảng 2.800 ă TCN,hoa này ược coi là một trong nhữ ỉnh cao tiến hóa c a các loài hoa Hiệnnay, trên thế gi i có khoảng 800 chi và 25.000 - 30.000 loài lan, họ Lan(Orchidaceae) chiếm vị trí th hai sau họ Cúc (Asteraceae) trong ngành th c vậthạt kín [30] Vì vậy, hình thái, cấu tạ ũ ư ệ thống phân loại c a họ nàyrất ạng và ph c tạp

Việt Nam là quố ược t ưu ã , ó ộ ạng sinh học cao,phong lan Việt N ạng về số loài, màu sắc và ch ng loại v i trên 140 ạ

ọ t uộ ố y hài Vệ Nữ Sabot de Venus v ườ A ù v ý

ĩ tươ t Lady's slippers [1] H ệ y, V ệt N ã t t ấy k ả 22

t uộ Paphiopedilum tr ó ó ều ặ ữu ó á trị ỉ xuất

ệ tạ V ệt N ư H Đỏ, H V , H Tí , H Trắ ,Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đố , H L y H R u,…[1].Lan H Đố ột tr ữ H ượ t t ấy s ất ở

V ệt N Ngoài tên l H Đố ượ ọ l H Gấ y Vạ Đ ể Hài, chúng t ườ ọ ở ãy ú ó sươ ù b p ư Bắ Cạ , Bắ G, Sơ L , T á N uy , Vĩ P ú , L Đồ , … L H Đố có hoa

u v tươ ó ố ỏ u ỏ, t ườ ở t từ ù từ 1 ế 3 b

v ươ t ơ ẹ , t k ết L H Đố ượ t ị trườ tr ng

ư v ư ư uộ , ất ở Anh l H Đố ượ b ểu

học H ệ y, ố bằ k t uật u ấy in vitro p át tr ể ạ

ẽ ó t ể tạ r số ượ y , sạ bệ , ổ ị về ặt truyề trong ột t ờ ắ v áp ượ t ị trườ ượ ột ả pháp

ý tưở ể bả tồ H k ỏ uy ơ bị tuyệt [13] Những nghiên c u ng dụng các k thuật nuôi cấy mô tế b ể nhân nhanh các loài lan

H ặc hữu ở Việt Nam còn ít và kết quả t u ược còn rất hạn chế do gặp nhiều

k ó k ă tr k u v u c a quy trình nhân giống các loài này, kết quả thuược m i chỉ t b ầu ở một vài giố ư H Hằng [2], Hài Hồng [3], Hài Bóng [4]

Xuất p át từ ữ vấ ề t t ễ ở tr ú t t ế ề t :

“Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây Lan Hài Đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhân giống thành công cây lan H Đốm (Paphiopedilum concolor bằ

p ươ p áp ố in vitro óp p ầ bả tồ v u ấp y ố

sả xuất

3 Nội dung nghiên cứu

cây con in vitro ra vườ ươ .

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về lan Hài và lan Hài Đốm

1.1.1 Phân loại lan Hài (Paphiopedilum)

Lan Hài là một nhóm rất khác biệt Chúng dễ ược nhận ra bởi hoa

k á t ường v i hoa ở giữa dạng túi giố ư ếc hài (gọi là môi haycánh môi) nằm ở vị trí thấp nhất c a hoa [3], [10], [18]

Về ặt t vật ọ , á H t uộ v 5 v p t 2 ó

b ồ : N ó 1 gồm các chi Cypripedium, Phragmipedium, Mexipedium,

Selenipedium sống ở vùng Bắc Á, châu Âu và châu M Nhóm 2 là chi Paphiopedilum.

Chi Cypripedium ó k ả 50 , t ườ ượ ọ H Vệ Nữ, p

bố ở á vù

Chi Mexipedium, chi Phragmipedium v Selenipedium ồ k ả 25

p bố ở vù ệt u Mĩ Chi lan hài Phragmipedium có khoảng 20

loài sống ở Mexico, Trung và Nam M R f ã ặt tên và phân loại chúng vào

ă 1896 C Selenipedium có khoảng 6 loài sinh sống ở Trung và Nam

M Selenipedium ượ R b ặt tên và phân loạ v ă 1854 T

Selenipedium có từ chữ Hy Lạp là selen (moon - mặt tră v p u s pp r –

hài) Selenipedium rất khó trồng trong nhà v tr t ú ũ rất

hiếm thấy y ũ ược bảo vệ tránh s diệt ch ng Thân cây cao khoảng 50cm Trục phát hoa có thể ến 50 hoa nhỏ, t ường có màu hồng hay maroon, rất ẹp

Chi lan hài Mexipedium chỉ có một giống duy nhất Mexipedium

xerophyticum Nó ược tìm thấy lầ ầu ở Oaxaca (Mexico) và chỉ có ở ó Hơ

nữa lúc phát hiệ , ười ta chỉ thu hoạ ược có 7 cây Lú ầu, Xerophyticum

ược Soto Arenas, Salaza và Hagsater mô tả và sắp vào trong chi

Phragmipedium v ă 1990 Đế ă 1992, A b rt & C s ng dụng k

thuật phân tích phân loại th c vật hiệ ại d a trên cấu trú DNA ã sắp vào chi

riêng biệt Mexipedium.

Chi Paphiopedilum uy ất ó 2 ồ k ả 75 p

bố ở vù ệt u Á từ N Ấ Độ v Đ Hy y p í T y ế

P pp , N w Gu v Quầ ả S ở p í Đông Chi lan hài

Paphiopedilum ược Pfitzer phân loạ v ặt t v ă 1886 P p p u

có tên từ chữ Hy Lạp Paphos (tên c a một thành phố tr ảo Cyprus) và pedilon

ĩ , ầy) Cá Paphiopedilum ệt u Á ã ượ tạ

rộ rã tr u trồ tr ơ 140 ă qu Cá t uộ

Phragmipedium ũ ã ượ tạ ư ộ t ấp ơ

Ở V ệt N á H ều t uộ chi Paphiopedilum, tông

Cypripedioideae, ọ p ụ Epidendroideae, ọ L (Orchidaceae), bộ L (Orchidales), p p H (Liliidae), p Một á ầ (Monocotyledoneae,

Hạt kí (Angiospermatophyta), T vật (Plantae)[10] (Leonid

Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Lan Hài ViệtNam [1]

1.1 u n c

Chi Paphiopedilum ó uồ ố từ vù ụ ị Đ N Á tr ó

ó V ệt N Cá uy t uỷ ất y ượ t t ấy yếu ởTru Quố v ề Bắ V ệt N , ỗ ạ tr y ều ó k u p bốrất ạ ế [1]

Hầu ư tất ả á ều bắt uồ từ á tổ t k ểu yp x s ó sáu ả b b ả b v ọ b á v b ả b

uố P ầ á ỉ ó ột r ẻ, tuy ũ

ó ó ụ , s rất ế Trụ ụ ó tơ ầy v

ắ y ó u ặ Lá ụ ấp v ó ạrất k á u tùy từ , từ ú á y tr v ó óp ọ ếbầu ụ tr Lá t ườ ó ít tơ ơ á p ầ k á ụ

H á b ều ễ ậ t ấy ở b á v t ườ ơ x è xuố ư t ều C ú ó t ể ó t , bầu ụ , tr rộ

H ọ tr á t ườ ọ ư bó y k ểu rừ ít k p tá ,yếu á ỏ á v y b ư á ườ ỉ Cá p ụ s ù yếu số bá tr vỏ y ỗ tr á vù rừ y ù ẩ ộ1200m – 1500m [23].

Tạ V ệt N H t ườ p bố ở vù ó ượ ư , ẩ ộ .Tuy ặ trư vù k í ậu ệt ó ù ú t ườ

1.1.5 iện trạn câ lan i iệt am

L H i ó á trị t ươ ạ , ượ sưu tầ v t k ế rất ều

V s ệ ữu ơ 20 t uộ Paphiopedilum, V ệt N ột

tr á quố ó uồ H t p p ú K ữ p

p ú về ạ , V ệt N ó ều ặ ữu ó á trị t ẩ ĩcao ượ t ế ư uộ [21] V vậy t trạ t u t ập v xuất k ẩu

H ột á ồ ạt, k k ể s át ế v ệ H y ế tr

t ồ t ờ v t trạ trườ t bị k t á ạ k ệt ư

ệ y H b ế ất ó

D tr ữ u t ị ầ y, t trạ bả tồ á

H tr t t t u uẩ á t ạ về ộ ạ tuyệt

tổ bả tồ t Quố tế IUCN ượ tổ kết ở bả 1.1

Bảng 1.1 Cá ó H V ệt N t t ạ bả tồ Tổ

Bả tồ T Quố tế IUCN

Tên loài ti ng Latinh) Tên loài ti ngviệt) T nh trạng

Tr t tế ộ ạ tuyệt ố v tất ả á H V ệt

N ượ ỉ r ở bả tr y ã bị t y ổ ều tr t ờ ầ y s suy ả á quầ t ể ượ b ết Tr ữ ă ầ y, qu á ợt

ều tr t ị ã p át ệ r tố ộ p á uỷ ạ ẽ tr ệ rộ ữ

k u rừ sót ạ V ệt N yếu tr á ỉ ú á v [1], [23],

[32]

Trư t H ạ k ệt t , ều ươ tr quố về

bả tồ quý y ã ượ tr ể k yếu t u t ập, p ạ ,

u về á H v bả tồ trườ số t ú Một tr ợp tá quố tế về ĩ v y tả á ố H ở V ệt

N ó tá ả L Av ry v, P p Cr bb, P Kế Lộ v

N uyễ T ế H ệp ă 2004 [1]

Một ạ ư rộ k ắp á k u bả tồ ã ượ t ập ở V ệt N

Đặ b ệt ạt á k u bả tồ ã bả tồ á H ư:

- Khu bảo tồn Ngọ L K Tu , C u Y S Đắc Lắc), Núi Bà

L Đồng) bảo tồn loài P appletonianum.

- Khu bảo tồ M R y K tu , T u Đ N L Đồ bảo

tồn loài P callosum.

- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng

Sơ , P C H B , k u bảo tồ T ượ Đ N L Đồ bảo

tồn P.dalatensis.

- Vườn Quốc Gia H L Sơ L C , P Qu H G , Pà

C H B bảo tồn loài P dianthum, P.micranthum.

- Khu bảo tồ N H Tuy Qu bảo tồn loài P.emersoii,

P.hangianum, P malipoense varjackii.

- Vườn quố T Đả , H L Sơ bảo tồn loài

P.gratrixianum.

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằ bảo tồn loài P helenae.

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong

N bảo tồn loài P malipoense.

Lạ Sơ , H N , N Đị [28], [30].

Rất ó t ể y ột tr ữ H ượ t t ấy s ất ở

V ệt N , v á t H Đố y Vạ Đ ể H ũ ã ó tất ả vẻ

ẹp u vàng nhạt, cùng hàng ngàn nhữ ố u ỏ k ồngnhất trên cả mặt trư c c a bông hoa Kí t ư c hoa to, t ường nở thành từngchùm từ 1- 3 chiếc rất ẹp, ươ t ơ a chúng thật nhẹ nhàng thanh khiếtngây ngất lòng khách lãng du

Tên khác: Hài Mỏ Giày, Vạ Điểm Hài

Tên khoa học: Paphiopedilum concolor (Lindl.) Pfitz

1.1.6.2 nh th i

T ượ sĩ Trầ V ệt Hư H Đố ó ặ ể s u: Ðị ọ

t bụ , k ó t

Dạ á: Lá ọ s , p ế t u , ó v trắ ạt, ặt ư ơ ỏ,dài 10 - 18 , rộ 4 - 5 Dạ : Cuố ụ ắ 5-7 cm) mang 1-

3 , á bắ ắ ơ bầu H v tươ ó ố ỏ u ỏ, rộ 5-7cm,

á x rộ , ó r ; 4 , ị s sả 2, ị p v ó

p át tr ể tốt ếu ượ ếu sá tạ v ờ V ù è ể H

Đố ư về p í bắ sẽ ậ ượ ượ á sá t í ợp, ư nam

ó t ể sẽ u ấp quá ều á sá ặt trờ tr t ếp

- Độ ẩ : L H Đố ầ ó ộ ẩ v ệt ộ t í ợp cho phát

tr ể v s trưở Nư y t ườ ượ trữ tr á ầ uy tr ộ

ẩ v tư ư t ườ xuy ở 60% Tư ư ỗ tuầ 1 ế 2 ầ

v sá s tốt ất tùy theo ệt ộ y xuố t ấp T ườ xuy p u á sẽ úp ẩ k k í Cu ấp ưu t k k í sạ sẽ

Ca2+ 40 v M 2+ 20 – 30 Tư ư ậ trư v s u k bó p ,

ếu t ấy ầu á bị u k t ừ v ệ tư p S ậu k á

t ể trồ ó ấu ệu ụ át

- Giá thể trồ : Có t ể trồ tr á t ể ư , xơ ừa, sỏi, vỏ t ,

ó t ể tư t p bó 2 ầ tuầ tr suốt ù s trưở y

1.2 Phương pháp nhân giống v t nh in vitro

1.2.1 Qu tr nh nhân i n in vitro

1.2.1.1 Chuẩn bị cây làm vật li u gốc

V tr u ấy in vitro y sẽ ữ ặ tí v tí trạ

y ẹ b ầu tr ạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩ t ậ C y ẹ

t ườ y ó ều ặ tí ưu v ệt, k ẻ, ó á trị kinh tế S u ó, ọ

ơ qu ể ấy u t ườ , ạ t ó ồ , á ặ M ọ ể u ấy t ường là mô có khả ă tá s tr

trườ u ấy sạ bệ , ữ ượ á ặ tí s ọ quý y ẹ, ít

uy ơ b ến dị Tuỳ t ều kiệ , ạ y ó t ể k 3-6 t áng [16]

1.2.1.2 Thiết lập h thống cấy vô trùng

L ạ uyể u vật từ v trường nuôi cấy ể tạ

uy ệu sạ bệ ố , ạ y ượ t ế t á

bư : K ử trù bề ặt u vật v uẩn bị á trường nuôi cấy Cấy

u vật v ố ệ ặ b u ấy ó s trườ tạ

ạ y ạ ấy u in vitro Cá u nuôi cấy nếu không bị

nhiễm khuẩ , ấ , v rus sẽ ượ u tr p u i cấy v ều kiệnnhiệt ộ á sá p ù ợp S u ột t ờ ất ị , từ u u ấy ãbắt ầu xuất ệ á ụ tế b ặ á ơ qu ặ á p v tí G

ạ y p ụ t uộ v từ ố tượ ố , t t ườ k

từ 2 – 12 t á ặ ít ất 4 ầ ấy uyể [23]

1.2.1.3 Nhân nhanh chồi

Đ y ạ sả xuất y ố quyết ị ệu quả quá tr

u ấy , y ượ t u ầu ườ u ấy K u

ấy sạ ã ược tạ r , từ ó ậ ượ á ụ ồ v á p v tí strưở tốt tr quá tr u ấy sẽ bư v ạ sả xuất N ườ t ầ

tạ r tố ộ ất tr ều k ệ u ấy T p ầ v ềukiệ trườ ầ tố ưu á ể tạ ượ ụ t u Đố v

trườ ồ , ườ t sử ụ á ất kí t í s trưở t uộ ó

yt k BAP, k t v ồ ộ k á u tuỳ từ ố tượ y Quy

tr ấy uyể ể ồ t ườ tr k ả 1 – 2 t á tuỳ loàicây, tỷ lệ nhân nhanh khoả 2 – 8 ầ s u ột ầ ấy uyể N u

ạ y t ườ k 10 – 36 t á G ạ ồ từ ột v

ồ b ầu k k quá u ể trá s t b ến dị soma

1.2.1.4 Tạo rễ

Cá ồ t tr quá tr u ấy ó t ể p át tr ể rễ t s ,

ư t t ườ á ồ y p ả ấy uyể s ột trườ k á ể

kí t í tạo rễ Đố v trường tạo rễ, ườ t t ườ sử ụ ất kí t

í s trưở t uộ ó ux ư NAA, IAA, IBA T t ườ

ạ y k 2 – 8 tuầ tuỳ ố tượ K y ó á bộ p ậ t , á, rễ

v kí t í ất ị ả bả s trưở , p át tr ể b t ườ

ã r rễ tạ t y ỉ v kí t ư ất ị ượ uấ uyệ

v uyể r vườ ươ C y u ấy in vitro ượ s trưở v p át

tr ể tr ữ ều k ệ tố ưu về ệt ộ, ộ ẩ , pH, ưỡ V vậytrư k ư r trồ , ườ t ầ uấ uyệ y ể t í v ều k ệ

t Quá tr t í v ều k ệ b y ở ạ ầu

y u ầu ầ ượ ă só ặ b ệt V vậy y ượ uyể từ trườ từ

bã ơ ư s vườ ươ v ữ ều k ệ k ó k ă ơ vườ

ươ ầ p ả áp á y u ầu: y bằ v ó ệ t ố p u sươ u ấp ộ ẩ v át y, á t ể trồ y ó t ể ất ù , ặ

- P ươ p áp ấy : y p ươ p áp uy ất ệ y ó t ể

ố H tr quy ệp, y ượ sả xuất t ố

u từ ột y bố ẹ S v p ươ p áp tá ết t t ườ ó tố ộ

p át tr ể 1 y ă t p ươ p áp u ấy sẽ sả xuất ượ k ả4tr ệu y ă Cá H t ườ ượ u ấy tr trườ

Mur s & Sk 1962, H r, V & W t ó bổ su ất ều strưở ư NAA, 2,4D, BA, TDZ, K t ,…tr ều k ệ v trù

to N ờ t ế bộ k ọ y y ườ t ó t ể ấy ều bộ p ậ k á

u y ể t á t ể ố pr t r ư ỉ s trưở ,

ồ b , ọ , á, ốt t ặ rễ [6]

1.3 Tình hình nghiên cứu lan Hài trên th giới và trong nước

1.3.1 Trên thế iới

T t ườ Paphiopedilum ượ ố bằ trồ ạt y

tá y ã trưở t r k ỏ y ẹ Tuy nhiên tỷ lệ hạt nảy mầm trong

t nhiên lại rất thấp vì hạt lan Hài quá nhỏ, không ch a chất d trữ và chỉ có một

p ư p ó k t ể phát triể t p ươ t b t ườ ược

ó á H rất hiếm dạng dại vì thế ệu quả ố t ấp

k áp u ầu t ị trườ [12] P ươ p áp u ấy in vitro

S ảy ầ v tr Paphiopedilum, t qu s kết ợp ữu s

v v s , ột p ươ p áp p ổ b ế v ệ u ấy in vitro (Zeng et al., 2013) Ở P p p u , ã ó 58 p ươ p áp ảy mầm in vitro ược mô

tả, hoặc 80,6% trong số tất cả các nghiên c u in vitro Tuy nhiên, việc xử lý hạt

giống và tỷ lệ nảy mầm c a nhiều loài/cây Paphiopedilum là rất thấp v t ườ

bị ả ưở bở ều yếu tố k xá ị Ar tt , 2008 P r k t ,

1988 S t quá tr v ố Paphiopedilum từ á u

ấy ex vitro t tươ ố ạ ế uồ uy ệu ế , ữ k ó

k ă qu ế s ễ bẩ v k uẩ v ấ u ấy v s p át

tr ể k á u ấy số sót ư ều k ệ in vitro (Huang, 1988;

Stewart & Button, 1975) [63]

Cá u ầu t về u ấy H ượ t ệ bở Bub k

ă 1973, ã t ế u ấy p s 3 ạ H v 8 loại

H M trường nuôi cấy ch yếu sử dụng MS (1962) hoặc môi trường

y ư ó ải biên [34] Nă 1975, St w rt v cộng s t ế ả

ồ b ể tạ r sẹ , k ó s t ột v y tr quá

tr u ấy Tuy á sẹ rất k ó tá s , s u ột t ờ u ấy

ữ sẹ y sẽ ết V ý y ầu ết á u về u ấy

mô Paphiopedilum ều sử ụ uồ vật ệu b ầu từ ạt [63].

Kết quả nghiên c u c a Ding và cộng s (2004) về ả ưởng s chín c a hạt giố , trường nuôi cấy, nguồn carbon và các chất phụ gia hữu ơ ến s

nảy mầm, phát triển protocorm c a lan P.armeniacum ã t ấy khi sử dụng

hạt giố ạt 200 ngày tuổi tỷ lệ nảy mầm c a hạt ạt cao nhất trong khi tỷ lệnảy mầm c a hạt sau thụ phấn 300 ngày là thấp nhất Đ ều này là do sau khi thụphấn kéo dài thì hạt có hiệ tượng hình thành vỏ ượ qu sát ư i kính hiển

v v ó ã ă ản s hấp t u ưỡng c a hạt làm cho tỷ lệ nảy mầm giả á kể [40]

Theo Liu và cộng s (2006) thì loài lan Hài P.armeniacum có khoảng thời

gian từ khi hạt nảy mầ ến khi hình thành cây phải mất 4 ă [53] Những nỗ

l ể tạo ra các khối mô sẹo c a lan Hài từ á ạn gố , t ã k t công Tuy nhiên, một v H ã t tr v ệc tạo raprotocorm, mô sẹo, chồi, hạt Đ ều ó ch ng tỏ rằng lan Hài lai dễ ơ s

v i các loài bả ị D ó, việc nhân giống các loài lan Hài ch yếu ạt ượcbằng cách tạo ra s cộng sinh c a hạt ể thuận lợi cho s nảy mầm c a hạt trongnuôi cấy mô [26], [32], [34]

Kết quả nghiên c u c a Lee (1998), Ding và cộng s (2004) cho thấy ảnh ưởng c a s trưởng thành hạt giố ến s nảy mầm phụ thuộc vào loài S nảy mầm c a hạt tươ ối thấp do nộ ũ k p át tr ển trong quá

trình phát triển c a hạt, ơ ữa vỏ hạt rất mỏng có thể k ể bảo vệphôi từ s khô hạn S hình thành c a một l p biểu bì trên bề mặt phôi có thể

ảm bả uy tr ộ ẩm cho các tế b p ũ ư bảo vệ s tá ộng c a

ều kiện vật lý Tuy nhiên l p biểu bì làm giảm tỷ lệ nảy mầm c a hạt trong

ống nghiệm [48], [53] Theo Lee (1998) s nảy mầm c a loài P.delenatii tố ưu

tại thờ ểm 150 ngày sau thụ phấn (68%), tỷ lệ nảy mầm giảm mạnh khi hạt thu

ở 210 ngày sau thụ phấn do khi này hạt ã í ầy Ở 150 ngày sau thụphấn, l p ut ượ t ầy và các tế b ã ã t k

b , ó p p s hấp t u ưỡng tốt nhất [47]

Chen và cộng s (2004a ã u s hình thành chồi tr c tiếp từ

mảnh lá c a các loài lan Hài lai Paphiopedilum phiIippinense (lai PH59 và

PH60) Mảnh cắt á ã tr c tiếp hình thành các chồi bất ịnh từ các vùng vết

t ươ tr v 1 t á , k u ấy tr trường M S bổ sung 2,4-D (0,4,52 và 45,25 microM) và TDZ (0, 0,45, 4,54 và 22,71 M) Hai loại mảnh cắt(mảnh cắt lá nguyên vẹn dài 1,5 cm và mảnh cắt á 0,5 ược sử dụng.Trong con lai PH59, khi bổ su 4,54 r M TDZ tă số ượng chồi trungbình từ các mảnh cắt lá Trong con lai PH60, 4,52 μM 2,4-D cộng v i 0,45 μMTDZ ã t ú ẩy s hình thành chồi tr c tiếp từ các mảnh cắt lá Cây con khỏemạnh có 1-3 rễ nhậ ược sau khi chuyể trường không có hoóc môntrong 22 tháng Nhữ y y ược thích nghi trong nhà kính và pháttriển tốt v i tỷ lệ sống 100% [35]

Các kết quả nghiên c u về thành phần mô trường nuôi cấy ến s nảy mầm

c a hạt lan Hài c a Lee và cộng s 2010 ã t ấy có mối quan hệ giữaượng muố k á tươ ối thấp và nồ ộ N v ơ tr trường KC và

VW (nồ ộ muối khoáng KC: 13,42 mM; WV: 16,3 mM; nồ ộ N v ơKC: 12,25 mM; VW: 3,78 mM ) S nảy mầ ạt cao nhất tr trường

KC Hiệu quả kích thích s nảy mầm c a hạt tr trường KC do có một

ượ x tươ ối cao nồ ộ (4,23 mM) so v i VW (1,94 mM), và ¼

MS, ½MS (0,75 và 1,5 mM) Việc cung cấp canxi ản ưở ế tă trưởng

và s phân chia nhân c a th c vật Pr t r t u ược trên VW l ơ tr ½

MS, do nồ ộ p sp t tươ ối cao (4,74 mM) c a VW so v i ¼ MS và

½ MS 0,32 M v 0,62 M v KC 1,84 M P sp t ược hấp thu bởi

rễ ã kí t í tă trưởng protocorm [49]

Khi nghiên c u về ả ưởng c a nguồ rb k á u ến s nảy

mầm c a hạt lan Hài loài P.armeniacum và P.micranthun, Chen và cộng s

(2004b) ã ận thấy s nảy mầm c a hạt ạt cao nhất tr trường có bổ sung glucose và cao gấp 2 lần so v trường có saccarose [36]

Theo Ng CY và Saleh NM (2011), s nhân giống c a P Rothschildianum

ạt ược thông qua s hình thành in vitro c a các protocorm th cấp (PLB) từ

PLB sơ ấp phát triển từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân PLBs ược nuôi cấy trêntrườ ½ MS ượ c bổ sung v i các nồ ộ khác nhau (1,0, 2,0, 3,0 và 4,0μM) c BA v k t ể cảm ng PLB th cấp Số ượng PLB th cấp cao nhất

ượ t tr trườ ½ MS ược bổ sung kinetin 4,0 μM, v i trungbình 4,1 PLB trên mỗi m u sau 8 tuần nuôi cấy Các PLB th cấp tiếp tục sinhsôi nảy nở ơ ữa và hình thành 9,5–12,1 PLB m i trên mỗi PLB th cấp sau

k ược nuôi cấy tr trường ½ MS không có chất ều s trưởng

th c vật ược bổ sung dịch chiết chuối 60 g / L chuối (BH) Những PLB bậc ba

y ã ược nuôi cấy tr trường có ch a các chất phụ gia hữu ơ k ánhau, ch ng hạ ư BH, ư c dừ , k t y v u ể tái sinh câycon Trong số các chất phụ gia hữu ơ ược thử nghiệm, việc bổ sung 20% CW

v trườ ½ MS ã ến tỷ lệ tái sinh cây con trung bình tốt nhất từPLBs, ạt 67,9% sau 8 tuần nuôi cấy [57]

Nă 2011, L v á ộ s ũ ã tá s ồ từ sẹ y

ỉ từ ụ P deperle v P armeni Tuy nhiên, ầ rất ều

t ờ ể y H r v vậy p ươ p áp y k ệu quả ơ

á p ươ p áp k á [51] Theo nghiên c u c a Luan VQ và cộng s (2012)cho thấy trườ 1 2 MS ược bổ sung TDZ 0,5 mg/l và NAA 0,1 mg/L là

phù hợp nhất cho s tă s ồi nụ c a P delenatii và P callosum [53].

Theo Zheng và cộng s ( 2013), một số yếu tố ả ưở ến tỷ lệ nảy

mầm c a hạt Paphiopedilum trưởng thành: vỏ hạt không thấ ư c do s có mặt

c a các chất c chế hóa họ ư bs s ABA , ặc thiếu hormone kíchthích s nẩy mầ V r K r , 1987 Tr á ều kiện nảy mầm thíchhợp, phôi bào tử c a hầu hết các hạt ư trưởng thành hoàn toàn có vỏ hạt cóthể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu ượ ư c và các chất dinhưỡng, trong khi các hạt trưởng thành có thể có khả ă ống và bảoquản l ơ p vỏ hạt ã t ệ v ượ ư c thấp ơ [64]

Kết quả u Zeng v ộ s 2013 t ấy hân giống hài Hằng

từ hạt 180 ngày sau thụ phấn (DAP) là phù hợp Hạt nảy mầm (72,67%) trêntrường có ch a NAA 0,5 mg/ , ư c dừa 10%, than hoạt tính 1,0 g/l Môitrườ ½ MS bổ su 2,4D 5,0 mg/ l và TDZ 1,0 mg/ l p ù ợp ất tạ

mô sẹ v b ệt ó tạ pr tocorm s u 60 ảy ầ M trườ ½ MS bổ su kinetin 5,0 mg/l, BA 2,0 ặ 1,0 mg/ p ù ợp tạ ồ từ pr t r

[65] Deb CR và Jakha HY (2019), ã u nhân giống in vitro và nuôi cấy p ư trưởng thành loài lan Hài Paphiopedilum

villosum var boxallii (Rchb F.) Pfitzer từ nguyên liệu là quả ó ộ tuổi từ 150

ế 300 DAP tr á trườ ưỡng khác nhau, có bổ sung c á c n g uồ n

c a c b o n h ữu ơ k á u, ư c dừa, than hoạt tính, NAA và BA ở các nồ ộ kết hợp khác nhau Hạt từ quả 240 DAP nảy mầm ạt 60% tr trường MS

có ch a sucrose 3%, NAA 2 μM v BA 6 μM Bổ su ư c dừa không hỗ trợ

s nảy mầm c a hạt ư ỗ trợ s phân hóa s t á ơ t ể giống protocorm (PLBs) Hạt nảy mầm chuyển thành PLBs và biệt hóa thành cây con

Cá PLB ã uyể ổi thành cây con có rễ mạ tr trườ MS ược

bổ su su r s 3% , NAA v BA tươ ng 2 v 6 μM tr ó ó t i 7 chồi / m u cấy cho mỗi chu kỳ nuôi cấy Cá y ã r rễ ược làm c ng bằng cách nuôi cấy tr trường MS 1/10 có ch a sucrose (1%) và chất nền

c ng (cát, c h ất h ữ u ơ t hối rữa, mảnh gạch, than c i và phân bò khô theo tỷ lệ 1:

1: 1: 1: 1) Các cây c ược chuyển sang các bầu ch a giá thể hỗn hợp v i65% cây cấy số sót tr ều kiện nhà kính [39].

1.3 Tron n ớc

Trư y do lan Paphiopedilum là giố ơ t ườ t t ường

ù p ươ p áp tá bụ ể nhân giố Đ y p ươ p áp ơ ản, dễ

th c hiện và cây con tách ra có tỷ lệ số ư k áp nhu cầucây giố ười ta ít sử dụ p ươ p áp y [21]

ă L t uộ Paphiopedilum ở V ệt N P.villosum, P.

tranlienianum, P.hangianum, P.malipoense, P.micranthum bằ ả ã v p

tíc t t truyề vù ITS-rDNA Kết quả p tí ố qu ệ ữ

các loài trong chi Paphiopedilum tr ơ sở p tí t t truyề ạ

Khi nghiên c u ạng di truyề H Đốm (Paphiopedilum

concolor Pfitzer) bả ịa c a Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và

cộng s ã ậ x t: L H Đốm (P concolor Pfitzer) bả ịa c a Việt

Nam rất ạng và phong phú Các m u giống thu thập tại các vùng sinh thái

k á u ều ó á ặ ể ặ trư r về hình thái Kết quả phân tích bằng k thuật RAPD – PCR chỉ ra hệ số tươ ồng di truyền c a các m u Hài

Đố ộng từ 0,56 ến 0,94; 16 m u H Đốm nghiên c u ược phân t

6 ó k á u P ươ p áp tả á ặ ể t á v p ươ pháp á

á truyền ở m ộ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ l n

u ể công việc phân loạ ư i loài trở í xá ơ , p ục vụ cho côngtác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài

bả ịa c a Việt Nam [30]

Dương Tấn Nh t và cộng s 2005, 2007 ã ố ược loài lan Hài

Hồng (Paphiopedilum delenatii) một ặc hữu c a Việt Nam bằng k

thuật gây vết t ươ ơ i, nuôi cấy lỏ v k ốt thân có ch a mắt ể tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổ ược nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp v i việc gây vết t ươ v u ấy tr trường

lỏ ã t u ược 5,2 chồi/m u b ầu khi nuôi cấy tr trường MS có bổ

su TDZ 1,0 C á y s u k ượ k ạn thân bằng cách sử dụng ánh sáng trắng c è uỳ qu v á sá ỏ c è LED, ược cắt thành từ ốt rồi nuôi cấy tr trường MS có bổ sung các chất ều tiết

s trưởng khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ su BA 2 , tr trường có bổ sung Zeatin 1,5 mg/l hoặc TDZ 1,5 mg/l thì cho chất ượng chồi tốt nhất [22], [23], [60], [61]

trên bằ p ươ p áp ieo hạt trong ống nghiệ Đồng thời họ ũ t r

p ươ p áp tá ầ ư ột biện pháp bổ su ể nhân giống Hài Hằng và

H T Đảo Không dừng tạ ó, á k ọ ã u thành côngviệc nuôi trồng nhữ y ó tr tr vườ ươ [21]

Trong nghiên c u c Vũ Quốc Luận và cộng s (2014) về lan Hài Hồngcho thấy các chồi non lan Hài Hồ ó 4 á ược cấy v trường SH có bổsung BA 0,5 mg/l; NAA 0,5 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 9,0 g/l; than hoạt tính1,0 v ượ u tr ều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài

á ốt t , s u ó ượ ư r ều kiện chiếu sá t 2 t á ể lá tổnghợp diệp lục tố v á ă ượng cần thiết cho cây Kết quả cho thấy các chồiược kéo dài trung bình 10,5 cm, v i số lá m i hình thành trung bình 5lá/chồ , tươ ng v 5 ốt/chồ t u ượ s u 120 y u tr ều kiện tối

S u ó á ồ ượ ư s ều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếptục hình thành lá m i tuy nhiên không nhận thấy có s p ốt Sau 180 ngàynuôi cấy các chồ ược cắt t 5 ốt riêng biệt v i 1 lá và 1 rễ, riêng phầ ỉnhchồ ược giữ nguyên v i 3 lá và 2 rễ Cuố ù á ốt t ược trồng trêngiá thể d Đ L t u ược kết quả cao nhất ở vị trí ốt thân số 1 v i tỷ lệsống sót (100%) sau 12 tháng [15]

Hoàng Thị Giang và cộ s 2010 u ố in vitro và nuôi trồ ố H P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) Kết quả u

cho thấy, trường nhân nhanh protocorm và tạo chồ trường RE có bổ

su ư ừ 150 v uố í 100 ệ số ất (4,3 lần)

Bổ sung NAA 0,4 mg/l – 0,6 v trường cho khả ă r rễ tốt ất

Cá kết quả thí nghiệ vườ ươ t ấy, y ạt tiêu chuẩ r vườn

ươ 3 – 4 cm, có từ 3 – 4 lá, 4 – 5 rễ [5]

Ở Việt Nam, nhóm tác giả Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc vàNguyễn Tiến Hiệp (2004) ã ó ững nghiên về mặt th c vật họ ối v i lanHài Việt Nam thông qua những chuyến khảo sát th c tế Trong cuố sá “L

Hài Việt N ” ó tá ả ã i thiệu k á ầy và chi tiết các loài lan Hài

có ở Việt N ù á á á về th c trạng c a các loài này [1]

T u N uyễ T ị Sơ v ộ s 2012 , k u ấy ạt

từ quả n Dendrobium fimbriatum Hook 3 thá tuổ t ấy trườ t í

ợp ảy ầ v p át s pr t r ạt trườ MS bổ su

ư ừ 100 ml/l, sucrose10 g/l, agar 6,0 ít; M trườ

proto r tốt ất trườ KC 100 ND, 10 sucrose, 60g khoai tây,6,0g agar ít trườ ; M trườ t í ợp ất ồ v tr là

MS bổ su ư ừ 100ml/l, sucrose 20g/l, uố í 60g/l, agar 6,0g/l; Môi trườ tạ y ỉ RE bổ su su r s 10g/l, THT1g/l, agar6,0g/l [25]

N uyễ T ị Cúc v á ộ s (2014) ã u ả ưở b

ó ợp ất ữu ơ k á u: ó uố , k t y, ư ừ ; ó

p pt , tr pt , bột ấ v ó tả sp ru quá tr s h

trưở v p át tr ể H Hồ Paphiopedilum delenatii) in vitro Kết

quả t ấy, ả b ó ợp ất ữu ơ ều ó tá ụ tă số ượ

Nguyễn Thị Tình và cộng s (2018) ã u ả ưởng c a môi trường nuôi cấy ơ bản, chất ều s trưởng th c vật v AC ến khả ă

vi nhân giống c a lan P vietnamense Đã xá ịnh rằng HgCl2 0,2% có thể ược

sử dụ tr v 5 ế 10 p út ể khử trùng chồi nách c a P vietnamense,

t u ược 65,55% m u sạch, trường 1/2 MS bổ sung BA 2,0 mg/l và NAA

1,0 mg/l, cho khoảng 2,85 chồi/m u, trường thích hợp nhất ể tái sinh vànhân chồi Ngoài ra, kết quả ũ ỉ ra rằng NAA 0,5 mg/l và THT 1,0 g/l chokhả ă tạo rễ tốt nhất (88,89%) [28].

N uyễn Phúc Huy v ộ s (2019) ã u ả bộ lan Hài

P villosum từ á ồ in vitro Cá ồ 1,5 ó uồ ố từ á

ốt ầu t tr trườ bổ su TDZ 0,5 ượ tr u ị

ở á ồ ộ v t ờ ượ k á u v s u ó ượ uyể s trườ r rễ Tỷ ệ ả bộ ạt 19,88% k xử í 50 μM

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đố tượng nghiên c u: Giống lan Hài Đốm khoẻ mạnh, sạch bệ , ược

ưu ữ tạ vườn bảo tồn lan c a Khoa Công nghệ sinh học, Trườ Đại họcKhoa học Thái Nguyên

- Vật liệu nghiên c u: Vật liệu cho nhân giống in vitro gồm hai loại là: (1)

Chồi non khoảng 2 tháng tuổi m i tái sinh từ rễ cây lan Hài Đốm; (2) Quả lan

H Đố ược thu thập từ các cây lan H Đốm nuôi trồng tạ vườn bảo tồn lanHài c trườ Đại học Khoa học Thái Nguyên

C

Hình 2.1: Đố tượng và vật liệu nghiên c u

A) Cây lan Hài Đốm trồng tại nhà ưới, B) Chồi non an ài Đốm,

C) Qu lan Hài Đốm

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đị ểm: Thí nghiệ ược tiến hành tại phòng Nuôi cấy mô tế bào th c vật, Khoa Công nghệ sinh học, Trườ Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên

- Thời gian nghiên c u: Từ 01/2019 ến 11/2020

2.3 Hóa chất và thi t bị nghiên cứu

2.3.1 óa chất

Bảng 2.1: Hó ất u Hóa chất

2.3 Thiết bị

Bảng 2.2: Thiết bị nghiên c u Thi t bị

Bộ pippet

Hanna HI2210Kingson

2.3.3 Dụn cụ

P , , k , t , ĩ p ptr , ố , ố , è ồn, giấy thấm,bình nuôi cấy, túi nilon

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Cá bư c nghiên c u ược tóm tắt t sơ ồ sau:

ư c cất khử trùng 3 lần, tiếp t ược khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong cáckhoảng thời gian 10 phút, 12 phút và 15 phút có bổ sung vài giọt Tween 20, saumỗi lần khử trùng rửa lại m u bằ ư c cất khử trùng nhiều lần Sau khi khửtrùng, m u ược cấy trườ ã uẩn bị trường MS hoặc MS bổ