BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯU THỊ NGỌC HÂN XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CÁC DUNG MÔI TRONG NƯỚC THẢI CƠ SỞ SẢN XUẤT TRÁI PHÉP MET VÀ MDMA BẰNG GC
TỔNG QUAN
MDMA
1.2.1 Khái niệm và thông tin cơ bản
MDMA là một loại ma túy tổng hợp nằm trong nhóm ATS, hoạt động như một chất kích thích và gây ảo giác MDMA sau khi được phát hiện 2 năm được công ty dược phẩm Merck (Đức) sở hữu vào năm 1912 Ban đầu được gọi là “Methylsafrylaminc”, nó được sử dụng như một hợp chất gốc để tổng hợp các loại thuốc kiểm soát chảy máu MDMA đã thu hút được một số ít các bác sĩ tâm thần để sử dụng ở người vào cuối những năm 1970 và đầu những năm 1980, mặc dù chưa trải qua các thử nghiệm lâm sàng chính thức cũng như không nhận được sự chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) [30]
Ecstasy “thuốc lắc” thường được dùng để chỉ MDMA ở dạng viên nén hoặc viên nang, đây là cách phổ biến nhất mà người dùng sử dụng thuốc Các nhà nghiên cứu đã xác định rằng nhiều viên thuốc lắc không chỉ chứa MDMA ở các nồng độ khác nhau, mà còn chứa một số loại thuốc khác hoặc kết hợp thuốc có thể gây hại Các chất kích thích được tìm thấy trong các viên thuốc lắc bao gồm methamphetamine, ketamine, caffeine, ephedrine, thuốc giảm ho không kê đơn dextromethorphan, heroin, phencyclidine (PCP) và cocaine [30]
Tại Việt Nam, Ecstasy đứng thứ 3 trong các loại ma túy về mức độ sử dụng chỉ sau heroin và MET Các mẫu Ecstasy thu giữ được chủ yếu xuất hiện ở dạng viên nén hoặc viên nang nhộng với thành phần chứa từ 3-32% MDMA (3-32%), kích thước lớn hơn một chút so với viên methamphetamine Ecstasy chủ yếu được phân phối ở các thành phố lớn đặc biệt là Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Quảng Ninh và Hải Phòng
Từ năm 2005 Ecstasy ngày càng trở nên sẵn có nhưng cũng chưa phổ biến bằng methamphetamine dạng viên [3]
Tình trạng quản lý pháp luật: Số thứ tự: 28 - Bảng I (các chất ma túy rất độc, tuyệt đối cấm sử dụng trong lĩnh vực y tế; việc sử dụng các chất này trong phân tích, kiểm nghiệm, nghiên cứu khoa học và điều tra tội phạm theo quy định đặc biệt của cơ quan có thẩm quyền) theo Nghị định số 67/2001/NĐ-CP ngày 01/10/2001 của Chính phủ [3]
Tên IUPAC: 1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-N-methylpropan-2-amine
Công thức hóa học: C11H15NO2
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học và hình ảnh 3D của MDMA [45]
1.2.3 Một số quy trình điều chế MDMA
Tương tự như MET, quá trình điều chế MDMA cũng liên quan đến hai quy trình Leuckart (Hình 1.7) và khử amin (Hình 1.6) Tuy nhiên tiền chất của hai trình này với MET là P2P còn đối với MDMA sẽ sử dụng 3,4-methylenioxyphenyl-2-propanone (3,4-MDP-2-P) Đây là những quy trình đơn giản về mặt kỹ thuật và không đòi hỏi nhiều kiến thức về hóa học, chính vì vậy nó rất phổ biến và hay được sử dụng khi điều chế MET và MDMA trái phép Có bốn phương thức có thể điều chế MDMA bằng phản ứng khử amin, tất cả đều sử dụng methylamine làm dung môi phản ứng tuy nhiên các chất xúc tác lại khác nhau Bốn chất xúc tác đó bao gồm: NaBH3CN, NaBH4, hỗn hống Al/HgCl2, Niken Raney (Ni-Al)/H2 Phản ứng Leuckart là phản ứng phổ biến nhất được dùng trong các phòng thí nghiệm sản xuất trái phép các ma túy ATS trong đó có MDMA Để điều chế MDMA, phản ứng Leuckart có thể dùng hai dung môi phản ứng là formamide hoặc N-methylformamide, sau đó khử hóa bằng LiAlH4 hoặc thủy phân để cho ra sản phẩm cuối cùng [19]
Hình 1.6: Quy trình khử amin hóa điều chế MDMA từ 3,4-MDP-2-P [19]
Hình 1.7: Quy trình Leuckart điều chế MDMA từ 3,4-MDP-2-P [19]
Ngoài hai quy trình phổ biến trên, MDMA còn một quy trình tổng hợp riêng khác với MET đó là quy trình sử dụng safrole làm tiền chất hay còn gọi là quy trình bromopropane (Hình 1.8) Đây cũng là quy trình không đòi hỏi chi phí quá cao và có thể được tinh chế tiền chất từ các loại tinh dầu bán sẵn như tinh dầu xá xị (tinh dầu de vàng) Sau khi được cộng hợp brom, sản phẩm trung gian có thể phản ứng với methylamine để tạo thành MDMA Safrole cũng thường được sử dụng để sản xuất 3,4- MDP-2-P sau khi được đồng phân hóa để tạo ra isosafrole [19]
Hình 1.8: Quy trình bromopropane điều chế MDMA từ safrole [19]
1.3 Một số loại dung môi thường xuất hiện trong quy trình điều chế MET và
Ma túy sản xuất trái phép thường chứa các tạp chất ở dạng vi lượng Khi phản ứng hóa học diễn ra, các tạp chất khác nhau có thể được hình thành và tồn dư từ nguyên liệu và hóa chất ban đầu do thiếu kiểm soát chất lượng trong quá trình sản xuất bất hợp pháp Tạp chất có hai nguồn gốc: tự nhiên (thành phần của ma túy tự nhiên như thuốc phiện và lá coca), và tổng hợp (thành phần trong nguyên liệu ban đầu, dung môi và chất trung gian của sản phẩm tiền chất) Việc xác định và định lượng các tạp chất này cung cấp rất nhiều thông tin cho các cơ quan chức năng để xác định đặc tính và so sánh mức độ sản xuất trái phép các chất ma túy [3]
Như đã nêu ở mục 1.1.3 và 1.2.3, MET và MDMA có thể được sản xuất bằng nhiều quy trình với dung môi và hóa chất đặc trưng cho mỗi quy trình nên thông tin về tạp chất của mỗi chất cũng như mỗi con đường điều chế là khác nhau Có hai loại tạp chính trong điều chế MET và MDMA đó là tạp hữu cơ và tạp vô cơ
Tạp vô cơ là dư lượng kim loại được sử dụng làm chất xúc tác, chất khử, thành phần của chất độn hoặc là các chất thôi nhiễm từ phụ gia và tá dược trong quá trình sản xuất các viên ma túy tổng hợp
Tạp hữu cơ là các chất hữu có thể được tìm thấy trong tiền chất, chất độn hoặc có thể được tạo ra trong quá trình tổng hợp MET và MDMA Ngoài ra, các tạp này còn có thể chính là các dung môi hữu được sử dụng cho việc tổng hợp và điều chế hoặc là tiền tiền chất để tổng hợp nên tiền chất gốc Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu vào các loại tạp hữu cơ điển hình sinh ra trong các quá trình tổng hợp MET và MDMA Ví dụ như đối với con đường Leuckart khi tổng hợp MET sẽ sinh ra hai loại tạp điển hình như α,α’-dimethyldiphenethylamine và N,α,α’- trimethyldiphenethylamine [24] hoặc khi tổng hợp MDMA sẽ hình thành nên N-formyl- MDMA
Nghiên cứu này sẽ tập trung chủ yếu vào các dung môi được sử dụng trong quá trình sản xuất MET và MDMA Các chất này có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp ma túy hoặc cũng có thể là các chất tồn dư trong quá trình tổng hợp và tinh chế tiền chất Vì lý do an ninh, các tài liệu công bố chính thức sẽ không cho phép đưa ra chi tiết qui trình sản xuất ma túy hoặc điều kiện, hiệu suất từng phản ứng tổng hợp để xác định các dung môi hữu cơ sử dụng, khả năng tồn dư và thải bỏ Vì vậy tác giả sẽ tổng hợp các dung môi thường gặp thông qua các tài liệu đánh giá từ tổ chức chính phủ và thống kê các dung môi xuất hiện trong khi sản xuất hoặc dòng thải theo từng loại ma túy
Theo báo cáo của chương trình kiểm soát thuốc của Liên Hợp Quốc (1998), các dung môi thường xuất hiện trong sản xuất MET là Aceton, Benzen,Cloroform, Ethyl ether, Ethanol, Isopropanol, Ethyl acetat, Pyridin, Tetrahydrofuran, Ether dầu hỏa Các dung môi thường xuất hiện trong quá trình sản xuất MDMA là Aceton, Benzen,
Ethanol, DMF, Ethyl ether, Isopropanol, Methanol, Toluen, MEK [39]
Ngoài ra, một số nghiên cứu đánh giá môi trường của các cơ sở sản xuất trái phép ma túy ATS cũng khẳng định sự có mặt nhiều dung môi hữu được sử dụng trong quy trình sản xuất MET và MDMA như: Acid acetic, Anhydrid acetic, Aceton, Benzaldehyd,
Benzyl clorid, Methylen clorid, Benzen, Cloroform, Diethyl ether, Methnol, Ethanol,
Cyclohexan, Isopropanol, Methyl ethyl keton, Ethyl acetat, Acetaldehyd, Toluen, …
Tuy nhiên các tài liệu trên chỉ đưa ra tên các dung môi nhưng không đề cập đến nồng độ hay tần suất xuất hiện của các loại dung môi này trong các mẫu nước thải hay các mẫu môi trường Với đối tượng là dung môi trong nước thải, đề tài đã tiến hành lựa chọn 6 loại dung môi hòa tan và phân tán tốt trong nước thường gặp trong các quy trình sản xuất MET và MDMA để tiến hành phân tích là: Aceton, Ethyl acetat, Methyl ethyl keton, Methylen clorid, Isopropanol và Acetaldehyd Các dung môi này được xác định có mặt trong các quy trình sản xuất MET và MDMA nhưng tần suất sử dụng và quy trình thực tế sử dụng chưa được công bố Nhóm tác giả đã lựa chọn các dung môi này do đây là những dung môi phổ biến trên thị trường hóa chất nên các đối tượng sản xuất sẽ dễ sử dụng hoặc một số dung đặc thù được coi là tiền chất như MEK [39] Bên cạnh đó, đây cũng là các loại dung môi có sẵn chuẩn tại phòng thí nghiệm của nhóm tác giả, thuận lợi cho quá trình nghiên cứu
1.4 Một số thông tin và đặc tính lý hóa của các dung môi lựa chọn phân tích
Aceton, Ethyl acetat, Methyl ethyl keton, Methylen clorid, Isopropanol và
Acetaldehyd là các dung mỗi được lựa chọn để phân tích Trong đó aceton, Isopropanol được ghi nhận là có mặt trong quy trình sản xuất của cả MET và MDMA, Ethyl acetat,
Một số thông tin và đặc tính lý hóa của các dung môi lựa chọn phân tích
Aceton, Ethyl acetat, Methyl ethyl keton, Methylen clorid, Isopropanol và
Acetaldehyd là các dung mỗi được lựa chọn để phân tích Trong đó aceton, Isopropanol được ghi nhận là có mặt trong quy trình sản xuất của cả MET và MDMA, Ethyl acetat,
Methylen clorid, Acetaldehyd là các dung môi được tìm thấy sử dụng trong các cơ sở sản xuất MET, dung môi còn lại là MEK thường được sử dụng để sản xuất MDMA
Bảng 1.1 Một số thông tin về các dung môi cần phân tích [45]
Công thức và cấu trúc hóa học
Khối lượng phân tử Điểm sôi
Tan vô hạn trong nước (tại
Methyl ethyl keton butan-2-on
Hơi tan trong nước (27,5g/L tại 20 0 C)
Hơi tan trong nước (13g/L tại 25 0 C)
Tan vô hạn trong nước (tại
Tan vô hạn trong nước (tại
Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ, tiêm mẫu không gian hơi
1.5.1 Sắc ký khí khối phổ
Sắc ký khí là phương pháp phân tích nhờ vào khả năng tách các chất trong một mẫu hỗn hợp dựa trên tính phân cực của các chất đó Quá trình tách trong sắc ký khí chỉ áp dụng cho các chất có khả năng bay hơi hoặc có thể tạo thành dẫn xuất có khả năng bay hơi Pha động được sử dụng trong sắc ký khí là các khí trơ như: nitơ, heli, hydro… Hai loại cột sắc ký (pha tĩnh) của sắc ký khí bao gồm cột nhồi và cột mao quản, trong đó cột mao quản có nhiều ứng dụng phổ biến hơn Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản: khí mang (pha động), cột sắc ký (pha tĩnh), hệ thống tiêm mẫu, detector và hệ thống phân tích xử lý dữ liệu [1]
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Hiện nay, có bốn kiểu detector khối phổ chính đang được sử dụng bao gồm: detector khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT), detector khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS), detector khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF), detector khối phổ tứ cực (Quadrupole) Detector phổ biến nhất hiện này là detector tứ cực (một hoặc ba tứ cực) do có độ nhạy cao trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS như Scan, SIM, SRM, MRM, ngoài ra MS/MS còn có thể làm được kiểu đo mất phân tử trung hòa (neutral loss), thích hợp cho phân tích vi lượng các chất [46]
GC-MS là sự kết hợp của 2 kỹ thuật GC (sắc ký khí) và MS (khối phổ) vì các hợp chất thích hợp để phân tích bằng phương pháp GC (khối lượng phân tử thấp, độ phân cực trung bình hoặc thấp, ở nồng độ ppb – ppm) cũng tương thích với các yêu cầu của phương pháp MS và đều thực hiện quá trình phân tích ở pha hơi (cùng trạng thái) Điểm “mâu thuẫn” duy nhất giữa GC và MS là áp suất làm việc khác nhau, áp suất ở lối ra cột GC là áp suất khí quyển còn áp suất trong buồng ion hóa lại là áp suất thấp (10 -5 –
10 -6 Torr) Nhược điểm này đã được khắc phục bằng kỹ thuật sử dụng bơm chân không hiệu suất cao vào và các cột sắc ký mao quản (đường kính trong từ 0,18 tới 0,32mm) được đặt trực tiếp vào buồng nguyên tử hóa của đầu dò khối phổ [46] Các chất phân tích sẽ được tiêm vào cột và được phân tách bằng hệ thống sắc ký khí Sau khi ra khỏi cột các chất này sẽ bị ion hóa bằng nguồn ion, các kỹ thuật ion hóa chính được sử dụng trong GC-MS là EI (ion hóa điện tử) và CI (ion hóa hóa học) EI là kỹ thuật ion hóa phân tử hữu cơ đầu tiên và là kỹ thuật phổ biến nhất, có số lượng ứng dụng nhiều nhất Quá trình ion hóa xảy ra khi có sự tương tác bắn phá một electron với electron của chất phân tích Nếu năng lượng truyền đến đủ lớn tương tác của một electron được gia tốc với chất phân tích sẽ dẫn đến sự kích thích các electron của chất phân tích để hình thành ion phân tử Khối lượng phân tử của ion được tạo ra bằng về mặt “số lượng” so với khối lượng của phân tử bởi vì khối lượng của một điện tử là không đáng kể Đối với các phân tử dễ bay hơi, bền nhiệt nhưng không ổn định khi đó kỹ thuật ion hóa hóa học (CI) có thể sử dụng thay thế cho EI do ít tạo ra các mảnh phân tách hơn [46]
1.5.2 Tiêm mẫu không gian hơi HS (headspace)
Headspace là kỹ thuật tiêm mẫu ở trạng thái hơi thay vì ở dạng lỏng như kỹ thuật tiêm khác Hiện nay, có 02 hình thức tiêm mẫu headspace phổ biến: headspace tĩnh và headspace động Tiêm mẫu headspace tĩnh là hệ thống bao gồm buồng chứa có khả năng ổn định và kiểm soát nhiệt độ Ngoài ra thiết bị còn được gắn các lọ chứa mẫu rắn hoặc lỏng được đặt trong buồng đến khi thành phần bay hơi đạt cân bằng giữa các pha với nhau thì mới nạp mẫu khí vào máy sắc ký.Tiêm mẫu headspace động là hệ thống chứa các bộ phận thực hiện công đoạn nhúng chìm buồng chứa mẫu trong hỗn hợp các chất bay hơi trong cột hấp phụ ở điều kiện nhiệt thấp; sau đó tiến hành giải hấp các chất lưu giữ vào pha động thông qua việc làm nóng nhanh cột hấp phụ [36]
Tiêm mẫu headspace tĩnh là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay Yếu tố quan trọng nhất của kỹ thuật là hệ số phân bố giữa pha lỏng và pha khí trong quá trình gia nhiệt ủ mẫu Có nhiều thông số ảnh hưởng đến hệ số phân bố giữa pha lỏng và pha khí trong bộ phân headspace như: thời gian ủ mẫu, nhiệt độ ủ mẫu, thể tích của vial, thể tích mẫu… Trong đó thời gian ủ mẫu và nhiệt độ ủ mẫu là hai thông số quan trọng ảnh hưởng đến nồng độ pha khí và tín hiệu thu được Thông thường nhiệt độ ủ mẫu càng lớn và thời gian ủ mẫu càng dài thì tín hiệu pic sắc ký thu được càng cao, tuy nhiên điều này không phải đúng với tất cả các chất phân tích, đặc biệt trong một hỗn hợp các chất bay hơi khác nhau [36] Chính vì vậy khi tiến hành xây dựng phương pháp đây là hai thông số nên được lựa chọn để khảo sát
1.5.3 Ứng dụng của sắc ký khí khối phổ và tiêm mẫu không gian hơi
GC-MS là phương pháp có độ nhạy cao và hiệu quả vì vậy đây là một trong những phương pháp có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Một số ứng dụng bao gồm: Phân tích tồn dư dung môi, định tính các nhóm chức, xác định độ tinh khiết của hoạt chất, định tính, định lượng hoạt chất, phân tích tinh dầu, phân tích tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu, phân tích quá liều thuốc, dùng trong nghiên cứu và phát triển để xác định hỗn hợp các chất có trong các sản phẩm tự nhiên, nghiên cứu chuyển hóa [29]
Hiện này có hai phương pháp định tính thường được áp dụng trong GC-MS Phương pháp thứ nhất là so sánh dữ liệu sắc ký đồ (thời gian lưu và phổ khối) của chất cần chất tích với chất chuẩn có chứng chỉ Tuy nhiên trên thực tế, có rất nhiều trường hợp rất khó để tìm được chất chuẩn phù hợp Phương pháp thứ hai là sự kết hợp của nhiều tố: thời gian lưu trên pha tĩnh dựa trên độ phân cực, cùng với phổ khối đã được thực nghiệm bằng kỹ thuật EI, thế đặt là 70 eV và so sánh với các dữ liệu đã được công bố trên các thư viện như NIST, WILEY Phương pháp này có thể được dùng để dự đoán, thăm dò và có thể dùng để khẳng định sự có mặt của chất phân tích Tuy nhiên phần lớn các trường hợp để đưa ra sự khẳng định chắc chắn vẫn cần đến chất chuẩn có chứng nhận Nguyên nhân là do sự trùng hợp ngẫu nhiên của thời gian lưu và các mảnh phổ đặc biệt trong định tính hỗn hợp nhiều thành phần có thể gây ra dương tính giả [29]
Phân tích tồn dư dung môi là một trong những ứng dụng tiêu biểu của phương pháp GC-HS Trong ngành dược cũng như các lĩnh vực nghiên cứu khác, chỉ tiêu tồn dư dung môi thường để chỉ quá trình phân tích các tạp hữu cơ bay hơi được hình thành trong quá trình tổng hợp, sản xuất và đóng gói sản phẩm Trong sản xuất thuốc, theo yêu cầu của GMP, GLP các chất này phải được loại bỏ hoặc chỉ được tồn tại trong giới hạn cho phép Đối với lĩnh vực khoa học hình sự đây cũng là một trong nhưng chỉ tiêu quan trọng góp phần xác định và truy vết các cơ sở sản xuất trái phép các chất ma túy Detector chính hay được sử dụng là detector ion hóa ngọn lửa (FID) hoặc detector khối phổ (MS) Hầu hết các mẫu phân tích được đưa vào hệ thống phân tích bằng bộ phận tiêm mẫu không gian hơi (headspace) Một số trường hợp sử dụng bộ vi chiết pha rắn hoặc tiêm trực tiếp mẫu dung dịch chứa hoạt chất Khi sử dụng bộ phận tiêm mẫu không gian hơi mẫu sẽ được cho vào một vial được hàn kín và gia nhiệt Mẫu dạng khí sẽ được hút và tiêm vào hệ thống sau khi có sự cân bằng giữa pha khí và pha lỏng (hoặc rắn) Quá trình tách sẽ dựa trên độ phân cực của các chất và được phát hiện bằng detector FID hoặc MS Phương pháp thường được áp dụng cho các mẫu dược phẩm tan trong các dung môi như nước, DMSO, DMA, DMF, DMI, NMP hoặc benzyl alcol Kỹ thuật tiêm mẫu không gian hơi là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất khi phân tích tồn dư dung môi Sắc ký khí khối phổ cho phép định tính và định lượng đồng thời nhiều dung môi tồn dư và các chất bay hơi trong quá trình phân tích sau khi được tối ưu hóa phương pháp
Hình 1.9: Hệ thống sắc ký khí khối phổ với bộ phận tiêm mẫu không gian hơi [29]
Tình hình nghiên cứu tồn dư dung môi trong nước thải
Như đã trình bày mục 1.5.3 phân tích tồn dư dung môi là một trong những ứng dụng tiêu biểu của phương pháp GC-HS Tuy nhiên hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam và nhóm tác giả chỉ tìm được thông tin về 1 nghiên cứu trên thế giới sử dụng phương pháp GC-HS đối với đối tượng là nước thải là của F An (2012) và cộng sự, nhưng nghiên cứu này chỉ cung cấp phần tóm lược nên không có nhiều các thông tin cụ thể về phương pháp và kết quả đối với từng loại dung môi Hầu hết các nghiên cứu tồn dư dung môi tập trung chủ yếu trong ngành dược do đây là chỉ tiêu yêu cầu trong dược điển các nước Chính vì vậy khi xây dựng phương pháp nhóm nghiên cứu đã tham khảo một số tài liệu về phân tích tồn dư dung môi trong dược phẩm để lựa chọn các thông số về điều kiện sắc ký Phương pháp chủ yếu được áp dụng là GC-HS với detector FID Nghiên cứu của Carla M.T (2015) và cộng sự xây dựng phương pháp phân tích 15 dung môi trong đó Aceton và Ethyl acetat bằng GC-FID đã sử dụng cột DB-624 (30m ì 0,53mm, 3àm) với dung mụi pha mẫu là DMSO, mẫu được ủ ở 105 0 C/45 phỳt và được tiêm 2,5 ml vào cột, nhiệt độ lò cột khởi đầu là 40 0 C giữ 20 phút sau đó tăng đến
240 0 C với tốc độ 10 0 C/phút [11] Một nghiên cứ khác cũng sử dụng GC-FID là của Abida L (2017) và cộng sự, DMSO vẫn là dung môi được lựa chọn tuy nhiên cột sắc ký được sử dụng là HP-Innowax (30m ì 0,25mm, 0,25àm) để phõn tỏch cỏc dung mụi như Methylen clorid, methanol, n-hexan, toluene, nhiệt độ ủ mẫu là 80 0 C nhưng thiếu thông tin thời gian ủ mẫu và chương trình lò cột [7] Chỉ có một số ít các nghiên cứu trên thế giới phân tích tổn dư dung môi trong dược phẩm sử dụng detector MS, trong đó có thể kể đến nghiên cứu của John S khi phân tích đồng thời 30 dung môi hữu cơ bao gồm cả Aceton và Isopropanol bằng GC/MS-HS, nghiên cứu đã sử dụng hỗn hợp DMSO:DMAC (1:1) làm dung môi pha mẫu, cột sắc ký với đường kính trong nhỏ DB-
624 (20m ì 0,18mm, 1àm), chương trỡnh lũ cột bắt đầu với nhiệt độ 40 0 C giữ 5,3 phỳt, tăng 20 0 C/phút đến 130 0 C và 40 0 C/phút đến 240 0 C, tác giả sử dụng chế độ SCAN và SIM kết hợp trong khoảng 15-350 m/z [25]
Nghiên cứu của chúng tôi xây dựng phương pháp GC-HS kết nối với detector
MS hướng tới phân tích đồng thời một số dung môi trên đối tượng nước thải phù hợp với điều kiện của cơ quan chức năng trong truy vết ma túy Từ đó hướng tới hỗ trợ công tác điều tra và truy vết các cơ sở sản xuất ma túy tổng hợp trái phép Tuy nhiên khi xây dựng phương pháp nhóm tác giả cũng đã gặp một số khó khăn do không có tài liệu tham khảo nào phù hợp về đối tượng nền mẫu Các phân tích trong dược phẩm chủ yếu sử dụng dung môi hữu cơ để pha mẫu như DMSO, DMAC, DMF … không có nghiên cứu nào sử dụng nước (nền mẫu chính của nghiên cứu) làm dung môi Bởi vậy nhóm tác giả đã xây dựng phương pháp dựa trên những thông tin về các loại dung môi, đồng thời khảo sát các thông số sắc ký dựa trên kết quả tham khảo các nghiên cứu tồn dư dung môi trong dược phẩm kết hợp với lựa chọn các điều kiện sẵn có tại phòng thí nghiệm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1.1 Trong thẩm định phương pháp phân tích
- Các dung môi hữu cơ trong nước: Aceton, Ethyl acetat, MEK, Methylen clorid, Isopropanol, Acetaldehyd
- Mẫu nền: Mẫu nước hồ Bảy Mẫu đã được xử lý và kiểm tra không có các dung môi cần phân tích
- Mẫu thêm chuẩn: Các chuẩn dung môi được thêm ở nồng độ đích vào mẫu nền
2.1.1.2 Trong nghiên cứu trên mẫu thực
- Mẫu thực: Một số mẫu nước hồ, nước thải thu thập được ở một số địa điểm trên địa bàn thành phố Hà Nội
Bảng 2.1 Bảng thông tin chuẩn dung môi
STT Tên chuẩn dung môi
Loại hóa chất Hãng sản xuất Code Số lô
3 Methylen clorid ACS Merck - Đức 1060501000 K5016650819
5 Ethyl acetat ACS Merck - Đức 1096231000 K51753923938
6 Methyl ethyl keton (MEK) ACS Mallinckrodt
- Nước cất hai lần được lọc qua hệ thống deion.
Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích
- Thiết bị: Hệ thống sắc ký khí khối phổ Agilent 7000 GC/MS Triple Quad kết nối với hệ thống tiêm mẫu không gian hơi Agilent CTC Analytics G6500
- Cột sắc ký: Cột mao quản Agilent DB-WAX 30m ì 0,250 mm ì 0,25 àm
- Máy lắc siêu âm Elma Sonic S120H (Đức)
- Máy lọc nước deion Simplicity UV Merck (Đức)
- Micropipet Labopette Hirschmann loại 20-200àl, 100-1000àl, 500-5000àl (Đức)
- Bình định mức, pipet thủy tinh class A, ISOLAB (Đức)
2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích
2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm của từng dung môi: Hút chính xác một lượng dung môi chuẩn vào bình định mức 100,0 ml, phân tán đều dung môi và pha loãng bằng nước deion đến vạch theo bảng dưới đây:
Bảng 2.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc
STT Tên dung môi Tỷ trọng Lượng dung mụi chuẩn (àl)
- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc: pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng nước deion đến nồng độ thích hợp
- Dung dịch nội chuẩn làm việc (25 ppm): Hút 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc Iso amyl alcol vào bình định mức 200 ml và pha loãng bằng nước deion đến vạch
2.2.2 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
Tham khảo tài liệu [3,7,11,35,36,44] và điều kiện thực tế tại phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát với các điều kiện sắc ký như sau:
+ Thời gian ủ mẫu: Khảo sát trên mẫu thêm chuẩn hỗn hợp nồng độ 5 ppm đối với mỗi dung môi, tiến hành ủ mẫu trong các khoảng thời gian 10 phút - 20 phút - 30 phút và phân tích trong cùng điều kiện sắc ký
+ Nhiệt độ ủ mẫu: Khảo sát trên mẫu thêm chuẩn hỗn hợp nồng độ 5 ppm đối với mỗi dung môi, tiến hành ủ mẫu tại các nhiệt độ 90 0 C - 100 0 C - 110 0 C và phân tích trong cùng điều kiện sắc ký
Lựa chọn thời gian ủ mẫu và nhiệt độ phù hợp đáp ứng được thời gian ngắn và tín hiệu của các pic lớn
- Điều kiện chương trình lò cột
+ Nhiệt độ khởi đầu: Khảo sát trên mẫu thêm chuẩn hỗn hợp nồng độ 5 ppm đối với mỗi dung môi, tiến hành phân tích mẫu với nhiệt độ ban đầu 30 0 C - 35 0 C giữ 6 phút + Tốc độ tăng nhiệt: Khảo sát trên mẫu thêm chuẩn hỗn hợp nồng độ 5 ppm đối với mỗi dung môi, tiến hành phân tích mẫu với nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút sau đó tăng lên 90 0 C với tốc độ 15 0 C/phút - 20 0 C/phút
Lựa chọn nhiệt độ khởi đầu và tốc độ nhiệt độ phù hợp đáp ứng được thời gian ngắn đồng thời độ phân giải đạt yêu cầu
2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích
- Mẫu trắng : Mẫu nước deion dùng để pha mẫu, tiến hành phân tích lặp lại 6 lần
- Mẫu nền : Mẫu nước hồ Bảy mẫu, tiến hành phân tích lặp lại 6 lần
- Mẫu thêm chuẩn : Thêm chuẩn hỗn hợp tại nồng độ LOQ vào mẫu nền và tiến hành phân tích lặp lại 6 lần
- Mẫu chuẩn : Pha các chuẩn đơn có nồng độ Isopropanol 10 ppm và các dung môi còn lại là 5 ppm trong nước deion và tiến hành phân tích
- Mẫu chuẩn hỗn hợp : pha hỗn hợp chuẩn trong nước deion từ các chuẩn gốc 1000 ppm : Aceton 2 ppm, Ethyl acetat 1 ppm, MEK 2 ppm, Methylen clorid 1 ppm, Isopropanol 6 ppm, Acetaldehyd 2 ppm
+ Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu nền không có các pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các pic chuẩn tương ứng trong các mẫu chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp [5]
+ Sắc ký đồ của mẫu thêm chuẩn phải cho các pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các pic chuẩn trong các mẫu chuẩn đơn và mẫu chuẩn hỗn hợp [5] + Tính điểm IP của các pic trong mẫu thêm chuẩn theo quy định của hội đồng châu Âu [33] Yêu cầu điểm IP ≥ 3
2.2.3.2 Độ thích hợp của hệ thống
- Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 ppm mỗi dung môi
- Ghi lại các sắc ký đồ và xác định thời gian lưu, diện tích pic của các dung môi cần phân tích và nội chuẩn
- Yêu cầu: Độ phân giải giữa các pic ≥ 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối của:
+ Tỷ lệ diện tích pic dung môi cần phần tích với diện tích pic nội chuẩn: RSDS/IS ≤ 7,3% [10]
+ Thời gian lưu: RSDthời gian lưu ≤ 2,0 % đối với mỗi dung môi cần phân tích
2.2.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn [5,10,18]
- Khoảng tuyến tính được khảo sát bắt đầu từ khoảng LOQ ước lượng đến nồng độ cao nhất mà vẫn đảm bảo độ tuyến tính
- Tiến hành với mẫu chuẩn hỗn hợp từ 5-6 mức nồng độ của từng chất (mỗi nồng độ tiêm lặp lại 3 lần)
- Xác định đường biểu diễn tương quan giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic cần xác định so với nội chuẩn
- Đường chuẩn được xây dựng từ khoảng tuyến tính để đảm bảo khoảng nồng độ bao trùm vùng nồng độ trong mẫu thực tế
+ Hệ số tương quan tuyến tính (r): r ≥ 0,995 hay R 2 ≥ 0,99
+ Độ chệch của các điểm cho tất cả các nồng độ không quá ± 15 %, không được quá ± 20 % ở nồng độ LOQ [18]
2.2.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [5,10,12]
- Dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thêm: Ước lượng LOD của phương pháp Tạo mẫu thêm chuẩn hỗn hợp khoảng 5-7 lần LOD ước lượng của từng chất Phân tích mẫu đã tạo 10 lần lặp lại, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn SD
+ Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy
+ Nếu R < 4 thì phải tiến hành lại với dung dịch thử đặc hơn
+ Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung dịch thử đã dùng và tiến hành làm lại thử nghiệm
Tiến hành với 09 mẫu thử thêm chuẩn trong khoảng tuyến tính đã xây dựng, tương ứng với 03 mức nồng độ LOQ, trung bình và cao của khoảng tuyến tính (mỗi mức nồng độ 03 mẫu) (n = 9), xác định độ thu hồi của các chất phân tích độ thu hồi phải đạt yêu cầu theo quy định của AOAC [10] Độ thu hồi được tính theo công thức sau: Độ 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖 (%) = 𝐶 𝑚𝑐
Cmc: Nồng độ dung môi cần phân tích trong mẫu thêm chuẩn
Clt: Nồng độ dung môi cần phân tích theo lý thuyết x
Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD r ) ở các nồng độ khác nhau [10]
TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi
- Độ lặp lại: Chuẩn bị mẫu thử ở 3 mức nồng độ như độ đúng, tiến hành phân tích lặp lại 06 đối với mỗi mức nồng độ theo quy trình đã xây dựng Xác định RSD đối với mức nồng độ
Yêu cầu: Giá trị RSD phải đạt yêu cầu theo bảng 2.3
2.2.4 Ứng dụng phương pháp phân tích
- Ứng dụng phương pháp đã xây dưng tiến hành thử trên 3 mẫu nước hồ thu thập được
2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016 để xử lý số liệu và trình bày kết quả.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng quy trình phân tích
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
- Điều kiện cố định ban đầu: Tham khảo các tài liệu [3,7,11,35,36] và thông số máy + Thiết bị: Hệ thống sắc ký khí khối phổ Agilent 7000 GC/MS Triple Quad kết nối với bộ tiêm mẫu không gian hơi Agilent CTC Analytics G6500
+ Cột sắc ký: Cột mao quản Agilent DB-WAX 30m ì 0,250 mm ì 0,25 àm
+ Chế độ lắc mẫu trong buồng headspace: Thời gian: lắc 5 giây nghỉ 2 giây, tốc độ lắc 500 vòng/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 1000 àl + Nhiệt độ bơm tiờm mẫu: 85 0 C
+ Chế độ tiêm: chia dòng (Split) 10:1 + Nhiệt độ inlet: 200 0 C
+ Khí mang: Heli Chế độ khí: đẳng dòng Tốc độ khí mang: 1,0 ml/phút
+ Detector EI Nhiệt độ nguồn ion: 230 0 C Nhiệt độ transfer line: 260 0 C
+ Chế độ MS: Full scan trong khoảng 29-110 m/z
- Kết quả các điều kiện cần khảo sát:
+ Khảo sát trên mẫu thêm chuẩn hỗn hợp nồng độ 5 ppm đối với mỗi dung môi + Thời gian ủ mẫu: Tiến hành ủ mẫu trong 3 khoảng thời gian: 10 phút, 20 phút và
30 phút Trong khoảng thời gian ủ mẫu 10 phút, 4/7 pic dung môi cần phân tích cho tín hiệu cao nhất, tín hiệu của 3 pic còn lại không quá khác biệt so với pic của hai điều kiện còn lại như bảng 3.1 và hình 3.1 Do vậy, lựa chọn thời gian ủ mẫu là
10 phút (600s) để giảm thời gian phân tích
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian ủ mẫu
STT Tên dung môi Thời gian lưu (phút)
Hình 3.1 Sắc ký đồ tại thời gian ủ mẫu 10 phút
+ Nhiệt độ ủ mẫu: Lựa chọn khảo sát 3 mức nhiệt độ ủ mẫu: 90 0 C, 100 0 C và 110 0 C khi ủ mẫu 10 phút Với thời gian đó, tại nhiệt độ 110 0 C, 4/7 pic cho tín hiệu cao nhất, đặc biệt pic có tín hiệu thấp nhất là Isopropanol tăng tín hiệu lên 1,8 lần so với thời gian ủ 90 0 C và tăng 1,2 lần so với thời gian ủ 100 0 C Lựa chọn nhiệt độ ủ mẫu là 110 0 C để thu được các pic có tín hiệu tốt nhất như bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát nhiệt độ ủ mẫu
STT Tên dung môi Thời gian lưu (phút)
Hình 3.2 Sắc ký đồ tại nhiệt độ ủ mẫu 110 0 C
+ Nhiệt độ khởi đầu: Khi tiến hành phân tích mẫu với nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút, độ phân giải giữa các pic liền kề đều đạt yêu cầu (Rs ≥ 1,5) Đối với nhiệt độ ban đầu 35 0 C giữ 6 phút, 5 pic đầu tiên cho độ phân giải giữa các pic thấp hơn so với nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút và độ phân giải giữa Methylen clorid và Isopropanol thấp hơn 1,5 Lựa chọn nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút để tăng độ phân giải giữa các pic Kết quả khảo sát này được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát nhiệt độ khởi đầu
STT Tên dung môi Độ phân giải
+ Tốc độ tăng nhiệt: Phân tích mẫu với nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút sau đó tăng lên 90 0 C với tốc độ 15 0 C/phút - 20 0 C/phút làm thay đổi thời gian lưu, độ phân giải của 2 pic Acetaldehyd và Iso amyl alcol Tuy nhiên hai pic trên có độ phân giải lớn nên ít chịu tác động từ việc tăng nhiệt Vậy lựa chọn nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút sau đó tăng lên 90 0 C với tốc độ 20 0 C/phút để rút ngắn thời gian phân tích như hình 3.3
Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký được lựa chọn
+ Sắc ký đồ cho thấy tất cả các dung dịch cho pic phụ không xác định tại thời điểm dưới 2 phút, nên tối ưu hóa sắc ký đồ sử dụng chương trình cắt dung môi 2 phút
Kết luận các điều kiện đã khảo sát tối ưu:
- Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ ban đầu 30 0 C giữ 6 phút, sau đó tăng lên 90 0 C với tốc độ 20 0 C/phút không giữ, tăng 40 0 C/phút đến 185 0 C Tổng thời gian phân tích là 11,375 phút
- Thời gian cắt dung môi: 2 phút
Thẩm định quy trình phân tích
3.2.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và mẫu
- Hút chính xác 4,0 ml dung dịch mẫu chuẩn đơn hoặc chuẩn hỗn hợp hoặc mẫu thêm chuẩn, thêm 1,0 ml dung dịch nội chuẩn 25 ppm vào trong vial 20 ml, đậy nắp kín, sau đó tiến hành phân tích sắc ký
- Chuẩn bị các dung dịch như trong mục 2.2.2.1 và tiến hành sắc ký theo quy trình đã xây dựng Kết quả thu được theo bảng sau:
Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu - Thời gian lưu
STT Dung môi phân tích
Hình 3.4 Độ đặc hiệu - Sắc ký đồ mẫu trắng (nước deion)
Hình 3.5 Độ đặc hiệu - Sắc ký đồ mẫu nền
Hình 3.6 Độ đặc hiệu - Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn
Hình 3.7 Độ đặc hiệu - Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp
- Trên sắc ký đồ của mẫu thêm chuẩn (Hình 3.6) xuất hiện các pic có thời gian lưu tương ứng với các pic trên sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp (Hình 3.7) và có thời gian lưu tương ứng với pic chính trên sắc ký đồ của các chuẩn đơn (Phụ lục 1)
- Trên sắc ký đồ của mẫu trắng (Hình 3.4) và mẫu nền (Hình 3.5) không cho pic có thời gian lưu trùng với các pic trên sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp (Hình 3.7) và sắc ký đồ của các chuẩn đơn (Phụ lục 1)
3.2.2.2 Tính điểm IP đối với các phổ khối trong mẫu thêm chuẩn :
- Phân tích phổ khối thu được với từng chất trong mẫu thêm chuẩn, đánh giá và tính điểm nhận dạng (IP) dựa vào sự xuất hiện của các mảnh phổ, đối chiếu với dữ liệu trong phổ thư viện NIST [47] Đối với kỹ thuật khối phổ một lần phân giải thấp 1 ion đạt được 1,0 điểm Sau khi phân tích phổ khối của các chất trong mẫu thêm chuẩn (Phụ lục 2) thu được kết quả như sau:
Bảng 3.5 Kết quả độ đặc hiệu - Điểm nhận dạng (IP)
STT Dung môi cần phân tích
Ion đặc trưng theo thư viện phổ NIST
Ion xuất hiện trong mẫu thử Điểm IP đạt được
Nhận xét: Tất cả các chất đều có điểm IP ≥ 3, như vậy phương pháp có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu [33]
3.2.3 Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký lặp lại 5 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 ppm mỗi dung môi
Bảng 3.6 Kết quả độ thích hợp hệ thống
Dung môi cần phân tích
Tỷ lệ diện tích pic
RSD tỷ lệ diện tích pic Độ phân giải
Nhận xét: Độ phân giải giữa tất các pic đều > 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối của:
+ Tỷ lệ diện tích các pic dung môi cần phân tích so với diện tích pic nội chuẩn: 2,9 - 4,9 ≤ 7,3 %
+ Thời gian lưu: RSDthời gian lưu < 0,5 % đối với mỗi dung môi cần phân tích Độ thích hợp của hệ thống đạt yêu cầu độ phân giải theo Dược điển Việt Nam V và RSD đạt theo giới hạn độ chính xác của AOAC
Xây dựng các mẫu chuẩn hỗn hợp tại các dãy nồng độ từ 0,5 ppm đến 100 ppm từ chuẩn gốc 1000 ppm dựa trên LOQ ước tính và phân tích theo quy trình Mỗi nồng độ tiêm 3 lần và xác định giá trị trung bình của tỷ lệ diện tích pic dung môi cần phân tích so với diện tích nội chuẩn Xác định sự tương quan giữa nồng độ dung môi cần phân tích có trong mẫu và tỷ lệ diện tích pic giữa dung môi cần phân tích và nội chuẩn tương ứng thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp hồi qui tuyến tính Kết quả xác định mối tương quan này được trình bày ở Bảng 3.7 và Hình 3.8
Bảng 3.7 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính của phương pháp
Tỷ lệ diện tích pic 0,2872 0,8886 1,464 9,125 18,336 Độ chệch (%) 20 13,1 -12,3 0,4 -0,03
Tỷ lệ diện tích pic 0,1504 0,3116 0,9551 1,6632 20,6200 40,2990 Độ chệch (%) 17,3 -1,6 2,8 -13,7 2,1 -0,5
Tỷ lệ diện tích pic 0,2565 0,5324 1,4567 2,5203 12,5384 25,9035 Độ chệch (%) 1,0 5,0 13,9 -1,7 -2,5 0,6
Tỷ lệ diện tích pic 0,2838 0,5627 1,5546 2,4908 26,0986 52,2262 Độ chệch (%) -9,9 -1,1 14,6 4,7 0,02 0,2
Tỷ lệ diện tích pic 0,5285 1,3141 2,4380 3,6644 7,4721 Độ chệch (%) -16,8 6,1 4,4 -3,7 0,4
Tỷ lệ diện tích pic 0,2190 0,4297 0,9947 4,3776 8,6209 Độ chệch (%) -11,4 -14,9 8,5 0,6 -0,2
Hình 3.8a Đồ thị biễu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic so với nội chuẩn của Aceton, Isopropanol và Acetaldehyd
Hình 3.8b Đồ thị biễu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic dung môi cần phân tích so với nội chuẩn của Ethyl acetat, MEK và Methylen clorid
Kết quả cho thấy trong khoảng tuyến tính đã xây dựng cho từng dung môi phân tích với hệ số R 2 từ 0,9988 đến 1,000 Các giá trị độ chệch so với điểm chuẩn ban đầu đều nằm không nằm ngoài khoảng giới hạn ± 15% và ± 20 % tại mức nồng độ ở giới hạn định lượng theo yêu cầu của nhiều tổ chức tại Mỹ, Canada, Châu Âu [18] Như vậy, đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung môi phân tích và tỷ lệ diện tích pic của các chất phân tích so với diện tích nội chuẩn đạt yêu cầu và được chấp nhận
3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Đánh giá LOD, LOQ của phương pháp dựa vào độ lệch chuẩn trên mẫu thêm chuẩn Tạo mẫu thêm chuẩn có nồng độ lần lượt như sau: Aceton 5ppm, Ethyl acetat 1,5 ppm, MEK 3,5 ppm, Methylen clorid 1,5 ppm, Isopropanol 12 ppm, Acetaldehyd 3,5 ppm Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng (hình 3.9) Tính toán tỷ lệ diện tích pic giữa dung môi cần phân tích (r) và nồng độ của các chất (Ct) theo các đường chuẩn đã xây dựng trong khoảng tuyến tính mục 3.1.2.3 và xác định kết quả LOD, LOQ và R theo mục 2.2.2.4
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn thẩm định LOD, LOQ
Kết quả thẩm định LOD, LOQ được trình bày trong Bảng 3.8
Nhận xét : Giá trị R của tất cả các mẫu thêm chuẩn hỗn hợp đều nằm trong khoảng
4-10 nên nồng độ dung dịch là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy [12]
Bảng 3.8 Kết quả thẩm định LOD, LOQ
T1 T2 T3 T4 T5 r1 Ct1 r2 Ct2 r3 Ct3 r4 Ct4 r5 Ct5
Aceton 0,8566 5,48 0,8430 5,41 0,7870 5,10 0,8326 5,35 0,7681 5,00 Ethyl acetat 0,4933 1,43 0,5363 1,54 0,4745 1,39 0,5130 1,48 0,5466 1,56 MEK 0,8401 3,30 0,8751 3,44 0,8345 3,28 0,8612 3,38 0,9280 3,64 Methylen clorid 0,7487 1,35 0,8310 1,50 0,7829 1,41 0,7768 1,40 0,8827 1,60 Isopropanol 1,0175 11,85 0,9804 11,34 1,1176 13,22 1,0872 12,80 1,0465 12,24 Acetaldehyd 0,3442 3,26 0,3527 3,36 0,3450 3,27 0,3512 3,34 0,3238 3,02
T6 T7 T8 T9 T10 Kết quả r6 Ct6 r7 Ct7 r8 Ct8 r9 Ct9 r10 Ct10 Sd LOD
3.2.6 Độ đúng Độ đúng của phương pháp được đánh giá bằng phương pháp xác định độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn Thêm chuẩn hỗn hợp ở 03 mức nồng độ: LOQ, trung bình và cao vào mẫu nền, tiến hành theo quy trình phân tích thử, mỗi mức thực hiện 03 lần Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng Tính toán tỷ lệ diện tích pic giữa dung môi cân phân tích (r) và nồng độ của các chất (Ct) theo các đường chuẩn đã xây dựng trong khoảng tuyến tính mục 3.1.2.3 và xác định độ thu hồi theo mục 2.2.2.5 Sắc ký đồ đại diện cho phần độ đúng được trình bày ở phụ lục 1
- Mẫu nồng độ LOQ: Từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm thêm vào 100,0 ml mẫu nền một lượng chính xác để có nồng độ hỗn hợp như sau: Aceton 3,5ppm, Ethyl acetat 0,72 ppm, MEK 1,3 ppm, Methylen clorid 0,9 ppm, Isopropanol 6,5 ppm, Acetaldehyd 1,8 ppm (chuẩn bị 3 mẫu) Tiến hành theo quy trình thử đã xây dựng
- Mẫu nồng độ trung bình: Từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm thêm vào 100,0 ml mẫu nền một lượng chính xác để có nồng độ hỗn hợp như sau: Aceton 5ppm, Ethyl acetat
2 ppm, MEK 5 ppm, Methylen clorid 2,5 ppm, Isopropanol 15 ppm, Acetaldehyd 5 ppm (chuẩn bị 3 mẫu) Tiến hành theo quy trình thử đã xây dựng
- Mẫu nồng độ cao: Từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm thêm vào 100,0 ml mẫu nền một lượng chính xác để có nồng độ 50 ppm đối với từng dung môi (chuẩn bị 3 mẫu) Tiến hành theo quy trình thử đã xây dựng
Kết quả độ thu hồi được trình bày trong bảng 3.9
Bảng 3.9: Kết quả độ thu hồi của phương pháp
Thể tích thêm vào (àl)
Tỷ lệ diện tích pic (r)
Lượng tìm lại (ppm) Độ thu hồi (%)
Thể tích thêm vào (àl)
Tỷ lệ diện tích pic (r)
Lượng tìm lại (ppm) Độ thu hồi (%)
Thể tích thêm vào (àl)
Tỷ lệ diện tích pic (r)
Lượng tìm lại (ppm) Độ thu hồi (%)
Kết quả thẩm định độ đúng cho thấy ở các mức nồng độ đối với từng dung môi đều đạt độ thu hồi theo yêu cầu theo AOAC [10]
Tiến hành tạo mẫu thêm chuẩn ở 3 nồng độ tương tự như độ đúng Mỗi nồng độ làm lặp lại 06 lần Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng Tính toán tỷ lệ diện tích pic giữa dung môi cân phân tích (r) và nồng độ của các chất (Ct) theo các đường chuẩn đã xây dựng trong khoảng tuyến tính mục 3.1.2.3 Tính giá trị RSD của từng nồng độ đối với từng dung môi Sắc ký độ đại diện cho từng nồng độ được trình bày trong phụ lục Kết quả độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.10
Bảng 3.10 Kết quả độ lặp lại
Tỷ lệ diện tích pic (r)
Nồng độ trong mẫu (ppm)
Yêu cầu RSD theo AOAC
Tỷ lệ diện tích pic (r)
Nồng độ trong mẫu (ppm)
Yêu cầu RSD theo AOAC
Tỷ lệ diện tích pic (r)
Nồng độ trong mẫu (ppm)
Yêu cầu RSD theo AOAC
Từ kết quả thu được và so sánh theo quy định của AOAC, các dung môi ở mỗi nồng độ đều có độ lặp lại trong giới hạn cho phép Như vậy phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [10]
Ứng dụng phương pháp phân tích
Thu mẫu: 5 lít tại mỗi khu vực vào ngày 15/5/2021: hồ Văn Chương (mẫu 1), hồ Thiền Quang (mẫu 2) và hồ Thành Công (mẫu 3) Tiến hành phân tích các mẫu trên (mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần) theo quy trình phân tích Sắc ký đồ thu được của các mẫu đều không cho thấy sự có mặt của các dung môi cần phân tích
Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu 1
Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu 2
Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu 3