Bài giảng Phân tích thực phẩm - Chương 5: Phân tích protein trong thực phẩm

Bài giảng Phân tích thực phẩm - Chương 5: Phân tích protein trong thực phẩm có nội dung trình bày về vai trò của protein cho cơ thể; phân tích định lượng protein; nhóm các phương pháp xác định protein thô, nhóm các phương pháp xác định protein hòa tan, nhóm các phương pháp xác định phi protein,... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

T M QUANG TR NG C A PROTEIN Ầ Ọ Ủ

 Vai trò sinh h c c a Protein ọ ủ

 Vai trò dinh d ưỡ ng c a Protein ủ

VAI TRÒ VÀ GIÁ TR  C A PROTID  Ị Ủ

TRONG DINH D ƯỠ NG

+ Protein là h p ph n ch  y u quy t đ nh toàn b  các đ c ợ ầ ủ ế ế ị ộ ặ

tr ng c a kh u ph n th c ăn. Khi thi u protein trong ch  ư ủ ẩ ầ ứ ế ế

đ  ăn hàng ngày s  d n đ n nhi u bi u hi n x u:ộ ẽ ẫ ế ề ể ệ ấ

 ­ S c kh e b  suy dinh dứ ỏ ị ưỡng, sút cân mau, ch m l n đ i ậ ớ ố

v i tr  emớ ẻ

 ­  Gi m kh  năng mi n d ch, kh  năng ch ng đ  c a c  ả ả ễ ị ả ố ở ủ ơ

th  đ i v i m t s  b nhể ố ớ ộ ố ệ

­ Gây  nh h ả ưở ng x u đ n ho t đ ng bình th ấ ế ạ ộ ườ ng 

c a nhi u c  quan ch c năng nh  gan, tuy n n i ti t  ủ ề ơ ứ ư ế ộ ế

và h  th n kinh  ệ ầ

 ­ Làm thay đ i thành ph n hóa h c và c u t o hình  ổ ầ ọ ấ ạ thái c a x ủ ươ ng (l ượ ng calci gi m, l ả ượ ng magie tăng  cao).

­ Do đó m c protein cao ch t l ứ ấ ượ ng t t (protein ch a  ố ứ

đ  các acid amin không thay th ) là c n thi t trong  ủ ế ầ ế

kh u ph n ăn cho m i l a tu i ẩ ầ ọ ứ ổ

Protein là thành ph n nguyên sinh ch t c a t  bào  ầ ấ ủ ế

Protein tham gia cân b ng năng l ằ ượ ng c a c  th   ủ ơ ể

Protein là ch t kích thích ngon mi ng  ấ ệ

VAI TRÒ VÀ GIÁ TR  C A PROTID  Ị Ủ

TRONG DINH D ƯỠ NG

Đ NH L Ị ƯỢ NG PROTEIN THÔ

 Ph ươ ng pháp KjelDahl

 Ph ươ ng pháp Dumas

• Nhà hóa h c ngọ ười Đan m ch; X ạ Johan G.C.T. Kjeldahl (1883).

• M c đích: ụ  Xác đ nh hàm l ị ượ ng nit  t ng  ơ ổ

PH ƯƠ NG PHÁP KJELDAHL (1883)

 Phân hủy  Chưng cất  Chuẩn độ

8

Quy Trình

PH ƯƠ NG PHÁP KJELDAHL (1883)

Các yếu tố:

+ Đi u ki n vô c  hóa m u ề ệ ơ ẫ

+ Th  t  cho m u và hóa ch t vào bình Kjeldalh ứ ự ẫ ấ + Thi t l p n ng đ  cho NaOH ế ậ ồ ộ

+ Th  quá trình ch ng c t là hoàn toàn  ử ư ấ

+ Làm m u tr ng đ  lo i b   nh h ẫ ắ ể ạ ỏ ả ưở ng c a môi  ủ

tr ườ ng

PH ƯƠ NG PHÁP KJELDAHL (1883)

PH ƯƠ NG PHÁP  DUMAS  C I  Ả

Thermal conductivity detector

The nitrogen content is then measured

10

PH ƯƠ NG PHÁP  DUMAS  C I TI N Ả Ế

+ Đ u dò TCD ch a m t dây  ầ ứ ộ tóc  đ ượ c đ t   m t nhi t đ   ố ở ộ ệ ộ

nh t đ nh ấ ị  + Trong đi u ki n bình  ề ệ

th ườ ng có m t dòng nhi t  n  ộ ệ ổ

đ nh t  dây tóc đ n detector.  ị ừ ế

T o ra th   n đ nh ạ ế ổ ị + Khi có m t ch t  đ ộ ấ ượ ữ c r a  giãi t  c t, thì l p t c đ  d n  ừ ộ ậ ứ ộ ẫ nhi t c a c t b  gi m, dây tóc  ệ ủ ộ ị ả nóng lên làm đi n tr  thay  ệ ở

    N ng đ   protein đ ồ ộ ượ c xác đ nh, trong đó có ch a các  ị ứ

g c phenol nh  tyrosine b ng cách cho ph n  ng v i  ố ư ằ ả ứ ớ

h p ch t màu  ợ ấ phenol Folin­Ciocalteu, ph n  ng kép ả ứ  

t o ph c đ ng. Ph n  ng g m hai b ạ ứ ồ ả ứ ồ ướ c: 

 Cu2+ t o ph c v i các liên k t peptide trong protein    ạ ứ ớ ế ở

pH ki m.  ề

 Ph c h p protein­Cu ứ ợ 2+ s  xúc tác cho ph n  ng oxy  ẽ ả ứ hóa các nhóm phenol có trong tyrosine hay trytophan 

b ng thu c th   ằ ố ử Folin­phenol: (Na2MoO4 + Na2WO4 + 

H3PO4 trong phenol) t o ph c h p có màu xanh  ạ ứ ợ

d ươ ng đ m h p th  ánh sáng   b ậ ấ ụ ở ướ c sóng 750nm

Nguyên T c: ắ

PH ƯƠ NG PHÁP  LOWRY (1951)

PH ƯƠ NG PHÁP  LOWRY (1951)

+ Các acid m nh và mu i ammonium sulphat  nh hạ ố ả ưởng lên ph n  ng.ả ứ

+ Thường dùng BSA làm ch t chu nấ ẩ

+ Thành ph n acid amin  nh hầ ả ưởng đ n s  phát tri n ế ự ểmàu trong ph n  ng LOWRY (đ  d ng đả ứ ể ự ường chu n ẩnên dùng các protein có c u trúc tấ ương t  đ  có k t qu  ự ể ế ảchính xác.)

+ Nh ng bi n đ i c a hóa ch t, nhi t đ , và th i gian ữ ế ổ ủ ấ ệ ộ ờđòi h i ph i d ng đỏ ả ự ường chu n m i l n khi ti n hành.ẩ ỗ ầ ế

+ Đ  nh y cao: cho phép xác đ nh t  10 ­ 200 µg of ộ ạ ị ừ

protein, bước sóng h p th  trong kho ng : ấ ụ ả 500 ­ 750 nm

PH ƯƠ NG PHÁP  LOWRY (1951)

+ S  hi n hi n c a 5 acid amin có tính kh   ự ệ ệ ủ ử

(tyrosine,  tryptophan,  cysteine,  histidine,  and 

asparagine) trong chu i peptide hay trong m ch  ổ ạ

protein s  làm tăng c ẽ ườ ng đ  màu c a s n ph m  ộ ủ ả ẩ

kh , làm cho c n b ng chuy n d ch v  phía ph i.     ử ầ ằ ể ị ề ả

PH ƯƠ NG PHÁP  LOWRY (1951)

Lowry thu c th  Cố ử  (1 N Folin thu c th  phenol)ố ử

Pha loãng 2 N Folin phenol (Sigma, Fisher, ho c VWR) v i m t l ặ ớ ộ ượ ng n ướ ươ c t ng 

đ ươ ng.

Chu n b  ngay tr ẩ ị ướ c khi s  d ng ử ụ

Lowry thu c th  Dố ử  (thu c th  A và B k t h p)ố ử ế ợ

Tr n 1 th  tích thu c th  B và 50 th  tích thu c th  A . Chu n b  ngay tr ộ ể ố ử ể ố ử ẩ ị ướ c khi s   ử

+ Phương pháp này có đ  nh y g p 100 l n so v i ộ ạ ấ ầ ớ

phương pháp biure, ngưỡng phát hi n tệ ương đ i l n t  ố ớ ừ20­ 2000 µg

+ Các h p ch t nh  đợ ấ ư ường kh  và amoniac có  nh ử ả

hưởng đ n quá trìnhế

PH ƯƠ NG PHÁP BCA (1985)

PH ƯƠ NG PHÁP BCA (1985)

PH ƯƠ NG PHÁP  BRADFORF (1976)

Nguyên t c: ắ

Trong môi trường H+ Protein  k t h p v i Coomassie  ế ợ ớ

(Coomassie  Brilliant Blue  G ­ 250)  t o ra ph c màu ạ ứ

xanh, có kh  năng h p thu b c x    bả ấ ứ ạ ở ước sóng  595nm. 

Cường đ  màu t  l  v i n ng đ  protein trong dung d ch. ộ ỷ ệ ớ ồ ộ ị

T  phừ ương trình đường chu n ta tính đẩ ược hàm lượng protein

Thu c th  đ ố ử ượ c hòa tan b ng etanol sau  ằ

đó pha loãng b ng n ằ ướ c kh  ion ử

PH ƯƠ NG PHÁP  BRADFORF (1976)

• Đo ph  h p th  (A) c c đ i   ổ ấ ụ ự ạ ở

+ Dung d ch 3 mg / ml dung d ch protein tiêu chu n BSA và protein  ị ị ẩ

m u ẫ

+ Quang ph  v i đèn UV ổ ớ

1. S  d ng 3 mg/ml dung d ch protein tiêu chu n đ  chu n b ử ụ ị ẩ ể ẩ ị

dãy chu n g m các n ng đ   20 , 50, 100, 250 , 500 , 1000, 2000 , và  ẩ ồ ồ ộ

3000 µg / ml trong cùng dung môi. M u Blank ch  ch a dung môi  ẫ ỉ ứ

2. B t đèn tia c c tím c a quang ph  k  và thi t l p   b ậ ự ủ ổ ế ế ậ ở ướ c sóng 280  nm.

Nên kh i đ ng 30 phút tr ở ộ ướ c khi đo .

3 . Setting m u blank có A = 0 ẫ

4 . Đo đ  h p th  c a dãy dung d ch chu n và dung d ch protein m u  ộ ấ ụ ủ ị ẩ ị ẫ

c n đo. N u A, , c a protein m u là > 2.0, pha loãng m u h n n a  ầ ế ủ ẫ ẫ ơ ữ trong cùng dung môi và đo l ườ ng A, , , m t l n n a  ộ ầ ữ

5.  T o m t đ ạ ộ ườ ng cong chu n b ng các d  li u t  n ng đ  và đ   ẩ ằ ự ệ ừ ồ ộ ộ

h p thu A c a dãy chu n. T  ph ấ ủ ẩ ừ ươ ng trình đ ườ ng chu n tình hàm  ẩ

l ượ ng protein trong m u ẫ

V t li u và cách ti n hànhậ ệ ế

Nguyên t c: d a trên kh  năng h p thu c a liên k t ắ ự ả ấ ủ ếpeptide   bở ước sóng 205nm. Phương pháp có th  xác ể

Ý nghĩa: TVB là t ng hàm lổ ượng base d  bay h i bao ể ơ

g m: ch  y u TMA, DMA, NHồ ủ ế 3  và m t s  amin m ch ộ ố ạ

ng n khác. TVB là m t trong nh ng ch  s  dùng đ  xác ắ ộ ữ ỉ ố ể

đ nh đ  tị ộ ươ ủi c a th y h i s n.ủ ả ả

Nguyên t c:  ắ Ca c nit  baz  bay h i có trong m u đ́ ơ ơ ơ ẫ ược chi t b ng dung d ch axit percloric. Sau khi đế ằ ị ược ki m ề

hóa, d ch chi t đị ế ược ch ng câ t bă ng h i nư ́ ̀ ơ ước và các 

thành ph n nit  baz  bay h i đầ ơ ơ ơ ược h p th  trong bình ấ ụ

ch a axit. Chu n đ  các nit  baz  đã h p th  b ng dung ứ ẩ ộ ơ ơ ấ ụ ằ

d ch axit clohydric chu n.ị ẩ

Phương pháp này áp d ng cho các m u có t ng hàm lụ ẫ ổ ượng nit  baz  bay h i t : 5 mg/100g đê n 100 mg/100 gơ ơ ơ ừ ́

HÀM L ƯỢ NG TVB (TCVN 9215 : 2012)

HÀM L ƯỢ NG TVB ( TCVN 9215 : 2012)

V HCl

NV mđđ

N

TVB

xđ

đm 100)

(

HÀM L ƯỢ NG TVB ( TCVN 9215 : 2012)

HÀM L ƯỢ NG TMA 

+ S  phân c t TMAO t o ra TMA, trimetylamin là m t ự ắ ạ ộamin d  bay h i có mùi khó ch u, đ c tr ng cho mùi th y ễ ơ ị ặ ư ủ

s n ả ươn h ng.ỏ

+ Nhi u công trình nghiên c u đã quan tâm đ n ch  s  ề ứ ế ỉ ố

TMA và TVB trong đánh giá đ  tộ ươ ủi c a th y s n.ủ ả

+ TMA được xem là m t ch  s  đánh giá đ  tộ ỉ ố ộ ươ ủi c a 

th y s n. Gi i h n cho phép là nh  h n 15mg/100gủ ả ớ ạ ỏ ơ

Ý nghĩa

HÀM L ƯỢ NG TMA 

Quy trình phân tích:

0 1 2 3 4 M 1 M­ 2 TMA 0,01 mg/ml 0 1 2 3 4

Acid Picric 5 5 5 5 5 5 5

Lắc đều đo ở bước song λ = 410nm

HÀM L ƯỢ NG TMA 

Nguyên t c:  ắ Các axit amin t  do đự ược chi t v i dung ế ớ

d ch axit clohydric loãng. Các ch t có phân t  lị ấ ử ượng l n ớ

ch a nit  đứ ơ ược k t t a v i axit sulfosalicylic và đế ủ ớ ược lo i ạ

b ng cách l c. D ch l c đằ ọ ị ọ ược đi u ch nh pH t i 2,20. Axit ề ỉ ớamin được tách b ng s c ký trao đ i ion và xác đ nh b ng ằ ắ ổ ị ằ

ph n  ng v i ninhydrin s  d ng detector UV­Vis đo   ả ứ ớ ử ụ ở

bước sóng 570 nm

HÀM L ƯỢ NG ACID AMIN T  DO Ự

TCVN 8764:2012

HÀM L ƯỢ NG ACID AMIN T  DO Ự

TCVN 8764:2012

Ph n  ng xãy raả ứ