Xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên và bình vôi

Bên cạnh đó, cũng tồn tại vấn đề về một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ thảo dược không có tác dụng thực sự, có thể vì nhiều nguyên nhân: nguồn thảo dược nguyên liệu không đảm bảo chất l

ơ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ PHAN ANH

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẾ PHẨM

TỪ DƯỢC LIỆU CHỨA LẠC TIÊN VÀ

BÌNH VÔI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

0

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ PHAN ANH

MSV: 1601033

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẾ PHẨM

TỪ DƯỢC LIỆU CHỨA LẠC TIÊN VÀ

BÌNH VÔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 Th.S Nguyễn Hoàng Lê

2 T.S Nguyễn Khắc Tiệp Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

2 Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI – 2021

Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Th.s Nguyễn Hoàng Lê - Giảng viên bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường ĐH Dược Hà Nội và T.s Nguyễn Khắc Tiệp - Giảng viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em thực hiện khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất; Bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường ĐH Dược Hà Nội, thầy cô và các anh, các chị đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường ĐH Dược Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để em có được thành quả ngày hôm nay

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn ở bên động viên,

cổ vũ và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 6 năm 2021

Sinh Viên

Nguyễn Thị Phan Anh

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về dược liệu Bình vôi và Tetrahydropalmatin 2

1.1.1 Dược liệu Bình vôi 2

1.1.2 Tetrahydropalmatin 3

1.2 Tổng quan về dược liệu Lạc tiên và Vitexin 5

1.2.1 Dược liệu Lạc tiên 5

1.2.2 Vitexin 6

1.3 Tiêu chuẩn của viên nang chứa dược liệu 9

1.4 Một số phương pháp phân tích sử dụng trong xây dựng tiêu chuẩn chất lượng 10

1.4.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 10

1.4.2 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.4.3 Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 12

2.1 Điều kiện thực nghiệm 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22

3.1 Lựa chọn tiêu chí đánh giá viên nang chứa Lạc tiên và Bình vôi 22

3.2 Thử nghiệm khả thi và thẩm định phương pháp kiểm nghiệm 22

3.2.1 Kết quả định tính 22

3.2.2 Mất khối lượng do làm khô 25

3.2.3 Giới hạn kim loại nặng Error! Bookmark not defined 3.2.4 Giới hạn nhiễm khuẩn 26

3.2.5 Phép thử định lượng THP 29

3.3 Tổng hợp kết quả và bàn luận 42

3.3.1 Tổng hợp kết quả kiểm nghiệm 42

3.3.2 Tổng hợp phương pháp kiểm nghiệm Error! Bookmark not defined 3.3.3 Bàn luận 44

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh hoặc tên Khoa học Tên tiếng Việt

AAS Atomic Absorption Spectroscopy Quang phổ hấp thụ nguyên tử

HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao

phosphat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích THP 5

Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích Vitexin 8

Bảng 1.3: Yêu cầu về giới hạn các chỉ tiêu vi sinh 10

Bảng 2.1: Các chất chuẩn sử dụng 12

Bảng 2.2: Các vi sinh vật kiểm định 12

Bảng 3.1: Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô 26

Bảng 3.4: Kết quả xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 26

Bảng 3.5: Kết quả xác định tổng nấm men, nấm mốc 27

Bảng 3.6: Kết quả xác định VK gram âm dung nạp mật 28

Bảng 3.7: Các điều kiện xử lý mẫu chế phẩm định lượng 29

Bảng 3.8: Độ phù hợp hệ thống 35

Bảng 3.9: Thời gian lưu các mẫu phân tích 37

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 38

Bảng 3.11: Kết quả độ thu hồi mẫu chuẩn THP 39

Bảng 3.12: Kết quả độ lặp lại 40

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 41

Bảng 3.14 Kết quả định lượng THP trong mẫu 42

Bảng 3.15: Tổng hợp kết quả kiểm nghiệm 43

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu và phương pháp thử 46

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Hình ảnh sau khi chế biến của củ Bình vôi (dược liệu Bình vôi) 2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo Tetrahydropalmatin 3

Hình 1.3: Hình ảnh dược liệu Lạc tiên sau khi chế biến 6

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Vitexin 7

Hình 1.5: Cấu tạo máy HPLC 11

Hình 2.1: Quy trình xử lý mẫu xác định giới hạn VSV 18

Hình 2.2: Vi khuẩn S aureus chỉ mọc trên môi trường thạch muối mannitol 19

Hình 2.3: Vi khuẩn E coli (VK gram âm) có thể mọc trên môi trường thạch VRBA 19

Hình 2.4: VK E coli mọc trên môi trường thạch MacConkey 19

Hình 3.1: Sắc kí đồ định tính THP 22

Hình 3.2: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện DĐVN 23

Hình 3.3: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện [26] 24

Hình 3.4: Sắc kí đồ các mẫu chuẩn THP soi ở UV-366 nm 25

Hình 3.5: Hình ảnh cấy mẫu lên môi trường VRBA ở các nồng độ khác nhau 28

Hình 3.6: Hình ảnh cấy mẫu lên môi trường thạch MacConkey 28

Hình 3.7: Hình ảnh cấy mẫu lên môi trường thạch muối mannitol 29

Hình 3.8: Kết quả khảo sát các điều kiện sắc kí mẫu 31

Hình 3.9: Kết quả khảo sát thay đổi tỷ lệ pha động 33

Hình 3.10: Sắc kí đồ chuẩn THP 6,5ppm chạy tỉ lệ 30% ACN 33

Hình 3.11: Phổ UV của THP chuẩn 34

Hình 3.12: Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu 37

Hình 3.13: Đường chuẩn và phương trình hồi quy 38

Hình 3.14: Xác định LOQ dựa vào tỷ lệ S/N 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, “thực phẩm bảo vệ sức khoẻ” đã trở thành một cụm từ

khá thông dụng trong đời sống thường nhật Các thực phẩm bảo vệ sức khỏe nguồn gốc thiên nhiên trong thời gian gần đây được gia tăng sử dụng, vì được coi là an toàn, nhưng trên thực tế, đã có nhiều trường hợp thực phẩm bảo vệ sức khỏe có trộn trái phép hoạt chất hoá dược không công bố, gây nguy hại cho sức khoẻ Bên cạnh đó, cũng tồn tại vấn đề về một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ thảo dược không có tác dụng thực sự, có thể vì nhiều nguyên nhân: nguồn thảo dược nguyên liệu không đảm bảo chất lượng, quy trình sản xuất không phù hợp làm mất tác dụng của dược liệu Tuy nhiên vẫn tồn tại nhiều thực phẩm bảo

vệ sức khỏe từ dược liệu có chất lượng tốt các thuốc dược liệu được kiểm soát chất lượng rất chặt chẽ, nhưng yêu cầu đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe không được nghiêm ngặt giống như thuốc từ dược liệu Do vậy, việc tiêu chuẩn hoá tốt các chế phẩm từ dược liệu là một phần quan trọng để có thể phát triển các thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị bệnh hiệu quả, tiến tới phát triển thành dược liệu

Các nhà nghiên cứu kêu gọi việc thực thi nghiêm ngặt và đặt ra những tiêu chuẩn quy định cho thực phẩm bảo vệ sức khoẻ như dược phẩm cùng một mục tiêu là bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng [34] Nightcare – thực phẩm bổ sung hỗ trợ điều trị mất ngủ do trường đại học Bách Khoa Hà Nội nghiên cứu và phát triển, chứa đồng thời hai dược liệu Bình vôi

và Lạc tiên Hiện nay trên thị trường được bán dưới dạng thực phẩm chức năng, đã được chứng nhận an toàn ở Cục an toàn Vệ sinh thực phẩm Do đó nhóm nghiên cứu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hiện đang phối hợp với nhóm nghiên cứu ở bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất

lượng của chế phẩm chứa Bình vôi và Lạc tiên” với mục tiêu:

• Xây dựng tiêu chí chất lượng cho chế phẩmchứa Bình vôi và Lạc tiên

• Thử nghiệm tính khả thi và thẩm định phương pháp kiểm nghiệm phù hợp để đánh giá chất lượng của chế phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về dược liệu Bình vôi và Tetrahydropalmatin

1.1.1 Dược liệu Bình vôi

1.1.1.1 Đặc điểm dược liệu và phân bố

Dược liệu Bình vôi (Tuber Stephaniae), là phần rễ củ đã phơi hay sấy khô của cây Bình vôi (Stephania glabra - Họ Tiết Dê), mặt ngoài màu đen, hình dạng không nhất định

Bình vôi trồng 2-3 năm có thể cho thu hoạch củ, củ trồng càng lâu thì năng suất càng cao

Để củ có hàm lượng hoạt chất cao nhất, nên thu hoạch vào mùa thu - đông [7] Ở Việt Nam

có khoảng 10 -12 loài, trong đó có 8-9 loài có rễ củ to còn được gọi chung là “củ Bình vôi”, phân bố chủ yếu ở vùng núi đá vôi các tỉnh phía Tây Bắc: Hà Giang; Lào Cai; Lạng Sơn; Cao Bằng…

Hình 1.1: Hình ảnh sau khi chế biến của củ Bình vôi (dược liệu Bình vôi)

1.1.1.2 Thành phần hóa học

Hàm lượng alkaloid toàn phần cũng như hàm lượng Tetrahydropalmatin thay đổi

tùy theo loài và vùng thu hái [6] Loài Stephania glabra chứa alkaloid chính là

Tetrahydropalmatin, hay còn gọi là rotundin; hyndarin Ngoài ra còn chứa cyleanin; stephanin; palmatin; tinh bột, đường và acid hữu cơ [7]

1.1.1.3 Công dụng

Theo kinh nghiệm của nhân dân, Bình vôi chữa mất ngủ, ho hen, sốt, kiết lỵ, đau bụng Bình vôi được phối hợp với các vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngứa lở

ngâm rượu hay chè thuốc Củ Bình vôi còn có tác dụng dùng ngoài bằng cách giã nát, đắp vào chỗ vết thương [7] Bình vôi còn rất hữu ích trong việc điều trị bệnh béo phì và xơ vữa động mạch [23]

1.1.2 Tetrahydropalmatin

Trong chuyên luận Dược điển Việt Nam V, Tetrahydropalmatin (THP) là hoạt chất chính dùng để định tính, định lượng dược liệu Bình vôi

1.1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý, hóa học

Cấu trúc hóa học của Tetrahydropalmatin được thể hiện ở Hình 1.2 [36]

Tên IUPAC: (

13aS)-2,3,9,10-

tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5H-isoquinolino[2,1-b] isoquinoline

Công thức phân tử: C21H25NO4

Khối lượng phân tử: 355.4 g/mol

Hình 1.2: Công thức cấu tạo Tetrahydropalmatin

Tetrahydropalmatin là một alkaloid berberin thu được bằng cách bổ sung hai phân

tử hydro vào vòng pyridin của palmatin [36] THP có đầy đủ các tính chất của alkaloid THP là chất rắn, có màu vàng Dạng base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ: methanol; ethanol; cloroform… [6]

1.1.2.2 Tác dụng dược lý

Đồng phân levo-Tetrahydropalmatin (l-THP) góp phần vào tác dụng chữa bệnh của dược liệu Bình vôi, còn đồng phân dextro-Tetrahydropalmatin (d-THP) có các tác dụng dược lý riêng như làm giảm thiểu monoamin và có độc tính [27] Ngoài ra, d-THP còn hoạt động như là một chất cung cấp dopamin còn l-THP lại là chất đối kháng dopamin trong não

THP có tác dụng giảm đau và đã được sử dụng trên lâm sàng ở Trung Quốc trong hơn 40 năm như một loại thuốc giảm đau Tuy nhiên cơ chế giảm đau của nó vẫn chưa rõ ràng [31], có thể do tác dụng giảm đau đối kháng naloxon và không có ái lực với receptor opioid [33] hoặc đối kháng thụ thể dopamin D1 [32]

b Tác dụng an thần, gây ngủ, giải lo âu

Tác dụng này là do sự đối kháng với thụ thể dopamin D1/D2 trên não [16]

c Cải thiện chứng sa sút trí tuệ liên quan đến lão hóa

Một nghiên cứu tiến hành tiêm dưới da D-galactose, một loại đường khử gây stress oxy hoá gây suy giảm trí nhớ, với liều 100 mg/kg/ngày cho chuột trong 8 tuần đồng thời với uống THP ở liều 20,40,80 mg/kg/ngày Kết quả cho thấy THP có thể bảo vệ hệ thống thần kinh chống lại những tổn thương do D-galactose gây ra [20]

d Tiềm năng trong việc điều trị chứng nghiện cocain

Các thử nghiệm lâm sàng sơ bộ ở Trung Quốc cho thấy l-THP làm giảm thèm muốn thuốc, tái nghiện và hỗ trợ quá trình cai nghiện ở những người nghiện heroin Cơ chế được cho là do sự đối kháng thụ thể dopamin của l-THP [27]

e Tác dụng dược lý khác

Tetrahydropalmatin còn có một số tác dụng dược lý khác bao gồm tác dụng hạ huyết

áp [18], tác dụng bảo vệ tế bào nội mô do chiếu xạ gây ra [30], tác dụng bảo vệ các tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở cơ tim [15]…

1.1.2.3 Các phương pháp xác định

Bình vôi là dược liệu rất phổ biến, trong đó THP là thành phần hoạt chất chính đã được nhiều nhà nghiên cứu tiến hành phân tích Một số phương pháp phân tích THP trong Bình vôi được trình bày trong Bảng 1.1

HPLC:

Pha tĩnh: Kromasil ODS C18

(250 mm × 4,6 mm,5 μm) Pha động: Methanol: Đệm phosphat (65:35)

Detector DAD

Độ thu hồi:

97,98%, RSD=1,19%

Guan Qiang

và cộng sự

(2009) [14]

Dược liệu Huyền Hồ

HPLC Pha tĩnh: ZORBAX SB C18 Pha động: methanol-acid phosphoric (60∶40)

Detector: DAD

Độ thu hồi:

99,84%, RSD=0,46%

LLOQ = 0,01 µg/ml

Nhận xét: Trong hầu hết các bài nghiên cứu, các tác giả chủ yếu sử dụng pha tĩnh là

cột C18 không phân cực và pha động phân cực chứa methanol (MeOH), detector hay dùng

là Diode- Array detector (DAD)

1.2 Tổng quan về dược liệu Lạc tiên và Vitexin

1.2.1 Dược liệu Lạc tiên

1.2.1.1 Mô tả dược liệu

lông Cuống lá dài 3 cm đến 4 cm Phiến lá mỏng màu lục hay hơi vàng nâu, dài và rộng khoảng 7 cm đến 10 cm, chia thành 3 thùy rộng, đầu nhọn Mép lá có răng cưa nông, gốc

lá hình tim Lá kèm hình vẩy phát triển thành sợi mang lông tiết đa bào, tua cuốn ở nách lá [4] Ở Việt Nam, Lạc tiên là loài mọc tự nhiên phân bố rộng rãi nhất Cây phân bố ở khắp các tỉnh trung du, vùng núi thấp (dưới 1000m) và đôi khi cả vùng đồng bằng [7]

Hình ảnh dược liệu Lạc tiên được trình bày ở Hình 1.3

Hình 1.3: Hình ảnh dược liệu Lạc tiên sau khi chế biến

1.2.1.2 Thành phần hóa học

Thân mang lá của cây Lạc tiên mọc ở Việt Nam có triterpen, flavonoid, alkaloid, acid hữu cơ và chất khử Các hợp chất phenol có mặt cả trong thân và lá Alkaloid chỉ có trong lá, chủ yếu là Vitexin và xylosyl Vitexin [5] Hàm lượng flavonoid toàn phần là 0,074% Ngoài ra cây còn chứa 0,033% alkaloid, trong đó có harman [7]

Trong chuyên luận Dược điển Việt Nam V, Vitexin (VTX) là hoạt chất chính dùng

để định tính dược liệu Lạc tiên bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

1.2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý, hóa học

Cấu trúc hóa học của Vitexin thể hiện ở hình 1.4 [37]

Tên IUPAC:

5,7-dihydroxy-2-(4-

hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl)

oxan-2-yl] chromen - 4-one

Công thức phân tử: C21H20O10

Khối lượng phân tử: 432,4 g/mol

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Vitexin

Vitexin là chất rắn, có màu vàng, khó tan trong dung môi hữu cơ, tan tốt trong dimethyl sulfoxid [5]

1.2.2.2 Tác dụng dược lý

a Tác dụng chống oxy hóa

Vitexin có tác dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng loại bỏ các gốc tự do sinh ra

do quá trình tiếp xúc với tia UVB Vitexin chống lại các loại phản ứng oxy hóa, quá trình peroxy hóa lipid và các tổn thương oxy hóa khác trong một loạt các bệnh liên quan đến oxy hóa, bao gồm co giật, suy giảm trí nhớ, thiếu máu cục bộ não, nhiễm độc thần kinh, tổn thương cơ tim và hô hấp và rối loạn chức năng trao đổi chất [11]

b Tác dụng chống viêm

Vitexin đã được chứng minh là có tác dụng ức chế cơn đau do viêm, ngăn chặn sự suy giảm khả năng của động vật trong việc loại bỏ các gốc tự do và ức chế sản xuất các cytokin gây viêm [28]

c Tác dụng đối với đường huyết

Vitexin và các chất tương tự của nó đã được nghiên cứu như một chất chống tăng đường huyết Cho chuột uống Vitexin hoặc Isovitexin cho thấy Vitexin làm giảm đáng kể đường huyết sau ăn Vitexin ức chế α-glucosidase, có tác dụng làm giảm nguy cơ đái tháo

d Tác dụng đối với tim mạch

Vitexin tạo ra tác dụng co bóp tích cực trên tâm nhĩ bị cô lập của thỏ mà không liên quan đến hoạt hóa thụ thể β1 - adrenergic Vitexin làm tăng đáng kể lưu lượng nước tiểu

và bài tiết natri và kali trong nước tiểu Hơn nữa, Vitexin làm giảm đáng kể huyết áp động mạch trung bình do tác dụng lợi tiểu của nó [13]

e Một số tác dụng dược lý khác

Vitexin còn có một số tác dụng dược lý khác bao gồm: tác dụng chống ung thư [29], tác dụng kháng khuẩn [21], tác dụng kháng cholinesterase [24], tác dụng bảo vệ thần kinh [28]…

1.2.2.3 Các phương pháp xác định

Một số phương pháp phân tích Vitexin trong Lạc tiên được liệt kê trong Bảng 1.2

Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích Vitexin

Tên tác giả Mẫu Chuẩn

Dịch chiết lá Lạc tiên trong ethanol

HPTLC Pha động: Ethylacetat- Methanol- Nước cất- Acid formic (50:2:3:6)

Pha tĩnh: silicagel GF254 Bước sóng phát hiện: 340 nm

Hàm lượng Vitexin: 0,030%-0,310% LOD= 0,290 µg/ml LOQ= 0,879 µg/ml

Pongpan và

cộng sự

(2007) [19]

Lạc tiên

Dịch chiết lá Lạc tiên

RP-HPLC Pha tĩnh: Cột C18 (250 ×4,6 mm,

5 μm) Pha động: isopropanol-tetrahydrofuran-nước (5:15:80)

và 0,3% acid formic

Detector: DAD

Hàm lượng Vitexin; 0,04%-0,13%

1.3 Tiêu chuẩn của viên nang chứa dược liệu

1.3.1 Tiêu chuẩn chất lượng của Viên nang [4]

• Độ đồng đều khối lượng (phụ lục 11.3)

Đáp ứng yêu cầu quy định trong phụ lục 11.3, Dược điển Việt Nam V

Khối lượng trung bình (KLTB) % chênh lệch so với KLTB

Bằng hoặc lớn hơn 300 mg 7,5%

• Độ rã (phụ lục 11.6)

Đáp ứng yêu cầu quy định trong phụ lục 11.6, Dược điển Việt Nam V

Yêu cầu về chỉ tiêu độ rã: Thời gian rã: ≤ 30 phút/ nước Mẫu thử đạt yêu cầu nếu tất cả 6 viên đều rã Nếu có 1 đến 2 viên không rã, lặp lại phép thử với 12 viên khác Mẫu thử đạt yêu cầu nếu không dưới 16 trong so 18 viên thử rã

• Định tính

• Định lượng

1.3.2 Tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc [4]

• Mất khối lượng do làm khô

Đáp ứng yêu cầu quy định trong phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam V

Yêu cầu về chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô: ≤ 5%

• Kim loại nặng

Đáp ứng yêu cầu về giới hạn kim loại nặng trong thực phẩm bổ sung được quy định trong quy chuẩn kĩ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm

Yêu cầu: Hàm lượng Pb ≤ 3ppm [2]

• Giới hạn nhiễm khuẩn

Đáp ứng yêu cầu quy định trong phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam V

Yêu cầu về chỉ tiêu giới hạn nhiễm khuẩn được trình bày trong Bảng 1.3

Bảng 1.3: Yêu cầu về giới hạn các chỉ tiêu vi sinh

Dạng thuốc Tổng

VSV hiếu khí

Tổng nấm

Không có Salmonella trong 10 g

Không có Escherichia coli, Staphylococcus

aureus trong 1 g

1.4 Một số phương pháp phân tích sử dụng trong xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

1.4.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC)

• Nguyên tắc: Các thành phần trong hỗn hợp có ái lực khác nhau với với pha tĩnh rắn

và pha động lỏng, di chuyển với tốc độ khác nhau trên pha tĩnh [10]

Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích [1]

Rf = 𝑑𝑅

𝑑𝑀

Trong đó:

dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động, đo trên cùng một đường đi của vết (cm)

Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1

• Ứng dụng: Sắc kí lớp mỏng là một công cụ hữu ích trong nhiều lĩnh vực

- Dược phẩm và thuốc: TLC được sử dụng trong việc xác định, kiểm tra độ tinh khiết

và xác định nồng độ của hoạt chất, chất phụ trợ và chất bảo quản trong thuốc và chế phẩm thuốc, kiểm soát quá trình trong quá trình sản xuất tổng hợp Các dược điển khác nhau đã chấp nhận kỹ thuật TLC để phát hiện tạp chất trong thuốc hoặc hóa chất

- Phân tích thực phẩm: TLC được dùng trong định tính thuốc trừ sâu và thuốc diệt

nấm, các chất phụ gia bị cấm… trong các mẫu thực phẩm [10]

1.4.2 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

• Nguyên tắc: HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất

trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích dịch sinh học nói riêng Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và yêu cầu của công việc Có thể thống kê các kỹ thuật sắc ký lỏng theo mức độ phổ biến trong thực tế: sắc ký phân bố (bao gồm các sắc ký cặp ion), sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1] Cấu tạo của một máy HPLC được thể hiện trong Hình 1.5

Hình 1.5: Cấu tạo máy HPLC

• Ứng dụng

HPLC đươc ứng dụng trong định tính, định lượng và tinh chế chất phân tích trong nhiều nền mẫu (chế phẩm, dược liệu, dịch sinh học, thực phẩm, môi trường…) HPLC có thể được sử dụng trong các ứng dụng sau: lọc nước, phát hiện tạp chất trong ngành dược phẩm, định tính định lượng hoạt chất trong hỗn hợp… [35]

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1 Điều kiện thực nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

Đối tượng phân tích: Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Nightcare – Công ty TNHH Dược

Nanocare Việt Nam, 1 viên nang chứa 400mg cao chiết gồm có 500mg Lạc tiên và 500 mg Bình vôi, số lô 011119, hạn dùng 17/11/2022

Các chất chuẩn sử dụng trong việc phân tích định tính, định lượng và thử giới hạn kim loại nặng (KLN) được trình bày trong Bảng 2.1

4 Dược liệu Bình vôi

chuẩn

CV0115012.01

Thụy Điển Các vi sinh vật kiểm định được trình bày ở Bảng 2.2

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Acetonitril, ethanol, methanol loại dùng cho HPLC; Acid phosphoric, kali dihydro phosphat (PA, Merck, Đức); Toluen, amoniac đặc, cloroform, acid fomic, ethyl acetat (Trung Quốc); Nước cất 2 lần, nước siêu lọc

Hóa chất dùng cho phép thử giới hạn VSV: VRB Agar, Tryptic Soy Broth, TSB, SDA (Merck, Đức); Mannitol salt Broth, Brilliant Green Bile Broth, Macconkey (HiMedia,

Ấn Độ); Thạch bột (Hạ Long, Việt Nam)

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị

• Thiết bị sử dụng:

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies Series 1200 với detector DAD, phần mềm Chemstation (Agilent, Mỹ); Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử model AA-6800 (Shimazu, Nhật); Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức); Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan); Cân phân tích A&D model GR – 200 (Nhật); Máy đo pH Eutech pH 700 (Singapore); Máy phá mẫu vi sóng MDS-6G (Trung Quốc); Cân kĩ thuật TE 1502 S, máy

ly tâm, tủ cấy vô khuẩn, tủ ấm 30oC, 37oC (Đức)

• Dụng cụ sử dụng:

Cột sắc ký Sunfire C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm), tiền cột C18

Micropipet loại 10-100 µL và 100-1000µL (Ba Lan)

Đầu côn cho micropipet (loại 10-100 µL và 100-1000µL)

Màng lọc cellulose 0,45 µm

Các dụng cụ thuỷ tinh khác: đũa thủy tinh, cốc có mỏ, bình nón nút mài, pipet bầu, pipet chia vạch, bình định mức, đĩa petri, ống nghiệm thủy tinh (Trung Quốc)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Bình vôi: cân khoảng 10 g cắt nhỏ, cho vào bình nón nút mài 100 ml Thêm khoảng

80 ml ethanol - nước (1:1), siêu âm 45 phút, lọc thu lấy dịch chấm sắc kí

Mẫu chế phẩm và cao dược liệu: Cân khối lượng bột viên và bột cao dược liệu tương ứng với khối lượng trung bình, thêm khoảng 10 ml ethanol - nước (1:1), siêu âm 10 phút, lọc thu lấy dịch chấm sắc kí

Chuẩn Tetrahydropalmatin: Cân chính xác khoảng 13,0 mg, pha trong 10 ml ethanol (EtOH), lắc xoáy 5 phút

Lạc tiên: cân khoảng 10g cắt nhỏ, cho vào bình nón nút mài 100 ml Thêm khoảng

10 ml ethanol - nước (1:1), siêu âm 45 phút, lọc thu lấy dịch chấm sắc kí

Mẫu chế phẩm và cao dược liệu: Cân khối lượng bột viên và bột cao dược liệu tương ứng với khối lượng trung bình viên, thêm khoảng 10 ml ethanol - nước (1:1), siêu âm 10 phút, lọc thu lấy dịch chấm sắc kí

Chuẩn Vitexin: cân chính xác khoảng 10,0 mg, pha trong 10 ml ethanol (EtOH), lắc xoáy 5 phút

a Định lượng THP trong chế phẩm chứa Bình vôi bằng HPLC

• Các mẫu cần chuẩn bị: Mẫu chuẩn THP 130 µg/ml, dãy đường chuẩn có nồng độ từ

• Xây dựng điều kiện sắc kí

Tham khảo Dược Điển Việt Nam V, điều kiện chạy sắc kí là:

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 283 nm

Các điều kiện trên có thể được thay đổi để tách được THP ra khỏi các thành phần khác trong mẫu

b Định lượng Vitexin trong chế phẩm chứa Lạc tiên bằng HPLC

Trong khóa luận này, chúng tôi không tiến hành khảo sát điều kiện định lượng VTX, phương pháp nghiên cứu được thực hiện trong một nghiên cứu trước đó của nhóm Với các điều kiện sắc kí như sau:

Cột kích thước (25 cm X 4 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 pm)

Pha động: Dung dịch acid phosphoric 0,1% pH 2,6 – Acetonitril (87,5: 12,5) Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 pm, lắc siêu âm

Detector quang phổ tử ngoại đặt ờ bước sóng 342 nm

Tốc độ dòng: 1,3 ml/min

Thể tích tiêm: 15 µl

2.2.1.3 Giới hạn kim loại nặng

Trong đề tài này, chúng tôi không tiến hành xác định do điều kiện vật chất ở bộ môn không thể tiến hành trên thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử với kĩ thuật lò graphit (GF-AAS) Công nhận giới hạn kim loại nặng là 3 ppm [2] với quy trình tiến hành giống phụ lục 9.4.11, Dược Điển Việt Nam V

2.2.1.4 Giới hạn nhiễm khuẩn

Gồm 5 chỉ tiêu: Tổng vi sinh vật hiếu khí; Tổng nấm men, nấm mốc; Escherichia

coli; Staphylococcus aureus; Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật

a) Quá trình chuẩn bị mẫu

Chúng tôi xây dựng quy trình dựa vào kinh nghiệm của bộ môn Công Nghiệp Dược

và tham khảo phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam V

Quy trình thử giới hạn nhiễm khuẩn đã được xây dựng sẵn tại tổ Vi sinh sinh học, đại học Dược Hà Nội, trên cở sở phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam V và tình hình sẵn có vật tư máy móc của đơn vị Cụ thể, phương pháp lọc, rửa để loại chất ức chế vi sinh vật sẽ được thay thế bằng phương pháp ly tâm, rửa Hai phương pháp cho kết quả tương đương Các kiểm tra về chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đã được thẩm định trước đó tại bộ môn

• Nguyên tắc: Dung dịch mẫu được xử lý loại tạp thô, sau đó được ly tâm, loại dịch

và rửa cắn với PBS để loại các chất ức chế VSV Mẫu đã loại chất ức chế sẽ được pha loãng đến nồng độ phù hợp, cấy lên môi trường tương ứng để đánh giá tổng hiếu khí và tổng nấm (TSA cho tổng hiếu khí và SDA cho tổng nấm) Tổng vi sinh vật gây bệnh được xác định thông qua bước tiền ủ để khôi phục và chọn lọc VSV, sau đó được cấy lên môi trường tương

ứng để đánh giá số lượng Gram âm dung nạp mật, E coli và S aureus (môi trường tương ứng VRBA, Macconkey và Thạch muối Manitol)

Quy trình xử lý mẫu xác định giới hạn VSV được thể hiện trong Hình 2.1

Hình 2.1: Quy trình xử lý mẫu xác định giới hạn VSV

Quy trình chuẩn bị mẫu và loại bỏ chất ức chế vi sinh vật được tiến hành như sau: Hòa hỗn hợp bột chế phẩm (tương đương 1g) trong 10 ml PBS vô khuẩn, votex trong

5 phút Chuyển vào 5 ống eppendorf 2 ml Ly tâm với tốc độ chậm, thời gian ngắn (1000 rpm, 1 phút) để loại tạp thô không tan Phần dịch ly tâm chứa vi sinh vật (nếu có) sẽ được chuyển vào vào 5 ống eppendorf 2 ml Ly tâm tốc độ cao (15000 rpm, 3 phút), vi sinh vật (nếu có) nằm ở phần cắn ly tâm, loại phần dịch ly tâm Phần cắn ly tâm được rửa bằng PBS

vô khuẩn (1,5 ml / eppendorf), lắc xoáy 1 phút, sau đó ly tâm tốc độ cao (15000 rpm, 3 phút), loại dịch ly tâm 2 lần, loại dịch hòa tan và rửa này mục đích để loại các chất ức chế

vi sinh vật có trong mẫu thực nghiệm

Phần cắn chứa vi sinh vật (nếu có) sẽ được hòa tan trong PBS Gộp 5 ống eppendorf, thu được ống eppendorf chứa 1 ml có nồng độ tương đương 1 g mẫu /ml.Sử dụng cho các chỉ tiêu đánh giá

b) Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường thạch TSA, lỏng TSB, thạch SDA, thạch muối mật tím đỏ (VRBA),

Dược điển Việt Nam V Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng môi trường thương mại tương ứng, sau đó hấp tiệt khuẩn ở 121oC, 20 phút Đổ ra đĩa petri

c) Tiến hành

• Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp thử: Sự phù hợp của phương pháp thử đã

được thực hiện ở bộ môn Công Nghiệp Dược Trong thí nghiệm này chúng tôi không

tiến hành lại

• Kiểm tra tính đặc hiệu của môi trường: Cấy đồng thời các vi khuẩn E coli; vi khuẩn

S aureus, (E coli cũng là vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm dung nạp mật)

lên cùng một môi trường Kết quả được trình bày trong Hình 2.2, Hình 2.3, Hình 2.4

Hình 2.2: Vi khuẩn S aureus

chỉ mọc trên môi trường thạch

muối mannitol

Hình 2.3: Vi khuẩn E coli (VK gram âm) có thể mọc trên môi trường thạch

VRBA

Hình 2.4: VK E coli mọc trên môi trường thạch MacConkey.

• Xác định tổng hiếu khí và tổng nấm men, nấm mốc

Mẫu sau quá trình loại chất ức chế vi sinh vật (dung dịch tương đương 1 g mẫu/ml)

sẽ được pha loãng liên tục (0,5 ml trong 4,5 ml PBS) đến nồng độ phù hợp trong PBS vô khuẩn Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện 4 nồng độ pha loãng để có nồng độ tương ứng là 0, -1, -2, -3 (log) Cấy lên thạch TSA cho tổng hiếu khí Ủ 35℃, 3-5 ngày Đến CFU

và đánh giá kết quả Cấy lên thạch SDA cho tổng nấm Nhiệt độ 30℃, 5-7 ngày Đếm CFU

và đánh giá kết quả

• Xác định vi sinh vật gây bệnh

Nguyên tắc: Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật, E coli và S aureus được xác định

dựa trên 2 bước Bước 1 là tiền ủ, vai trò kích thích vi sinh vật (nếu có) phát triển Bước 2, cấy lên môi trường thạch chọn lọc để xác định sự tồn tại (nếu có) của vi sinh vật

Với từng loại vi khuẩn tiến hành theo phụ lục 13.6, Dược Điển Việt Nam V

2.2.1.5 Mất khối lượng do làm khô

Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu thị bằng phần trăm (khối lượng/khối lượng) khi được làm khô trong điều kiện xác định

Dùng dụng cụ dùng để sấy bằng thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút Cân một lượng chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm, dàn đều trong chén Sử dụng tủ sấy, tiến hành sấy ở nhiệt độ 105oC, trong 1h đến khối lượng không đổi Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm bằng silica gel rồi cân ngay

Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Yêu cầu cần đạt được:

+ Hệ số tương quan r ≥ 0,995

+ Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn trong khoảng ± 15% trong

đó Y= 𝐶𝑡−𝐶𝑐

𝐶𝑐 × 100%, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

d) Độ lặp lại

Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng Độ lặp lại là mức độ gần nhau giữa các kết quả

riêng lẻ của các phép đo theo đúng quy trình thử nghiệm lặp lại, và được biển diễn bằng độ

lệch chuẩn tương đối Yêu cầu: RSD ≤ 2.7% [9]

e) Độ đúng

Tiêu chí thẩm định phép thử định lượng Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ

mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị

được chấp nhận là đúng Xác định độ đúng dựa vào độ thu hồi: Thêm một lượng xác định

chất chuẩn vào các mẫu thử, tiến hành 6 mẫu Tiến hành phân tích sắc kí các mẫu thêm

chuẩn, sau đó tính độ thu hồi theo công thức:

R%= 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎê𝑚 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛−𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎử

𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑡ℎê𝑚 × 100%

Yêu cầu: Độ thu hồi trong khoảng từ 90%-107% [9]

f) Giới hạn phát hiện (LOD)

Tiêu chí thẩm định phép thử định tính và định lượng Giới hạn phát hiện là nồng độ

mà tại đó giá trị xác định được không lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp Là

nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được

Với phép thử định lượng, xác định LOD dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) LOD được

chấp nhận mà tại đó S/N=3

Xác định LOD cho phép thử định tính dựa vào việc phân tích lặp lại 10 lần mẫu chuẩn Yêu

cầu: 100% số lần thử đều phát hiện được vết [8]

g) Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng

bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOQ dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) Thông thường, LOQ = 3x LOD

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1 Lựa chọn tiêu chí đánh giá viên nang chứa Lạc tiên và Bình vôi

Dựa trên chuyên luận chung viên nang, chuyên luận riêng của dược liệu Bình vôi và Lạc tiên của Dược Điển Việt Nam V kết hợp với Thông tư 43/2014/TT-BYT quy định về quản lý thực phẩm chức năng, tôi lựa chọn một số tiêu chí sau để đánh giá chất lượng chế phẩm:

1 Định tính THP và Bình vôi

2 Định tính VTX và Lạc tiên

3 Mất khối lượng do làm khô

4 Giới hạn kim loại nặng

5 Giới hạn nhiễm khuẩn

6 Định lượng THP

7 Định lượng VTX

Các chỉ tiêu từ 1 đến 6, phương pháp kiểm nghiệm được tham khảo từ Dược Điển Việt Nam

V, các quy trình xử lý mẫu được điều chỉnh cho phù hợp với chế phẩm nghiên cứu Với tiêu chí 7, chưa có phương pháp định lượng trong Dược Điển Việt Nam V nên nhóm nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định bằng HPLC trong một nghiên cứu trước với điều kiện được trình bày như trong Chương 2

3.2 Thử nghiệm khả thi và thẩm định phương pháp kiểm nghiệm

Trên bản mỏng khi soi UV, ở các dải khai triển dược liệu Bình vôi, chế phẩm và bán thành phẩm có xuất hiện các vết màu đen nhạt (ở bước sóng 254 nm) và các vết phát huỳnh quang màu xanh lá (ở bước sóng 366 nm) đều có giá trị Rf = 0,89 tương đương với vết xuất hiện trong dải khai triển chất chuẩn THP Điều đó chứng tỏ trong chế phẩm, cao dược liệu

và dược liệu Bình vôi có chứa THP nhưng hàm lượng THP trong chế phẩm và bán thành phẩm khá nhỏ do cường độ màu của vết mờ

3.2.1.2 Định tính Vitexin

Tiến hành phân tích sắc kí các mẫu theo hệ pha động Dược điển Việt Nam V [4] thu được các kết quả sắc kí đồ như Hình 3.2 (A, B, C)

Hình 3.2: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện DĐVN

A Soi đèn UV-254 nm B Soi đèn UV-366 nm

C Phun thuốc thử hiện màu, soi đèn UV-366 nm

Nhận thấy rằng, ở bước sóng 366 nm vết Vitexin chỉ phát huỳnh quang khi phun thuốc thử, đồng thời trong chế phẩm và cao dược liệu không xuất hiện vết có Rf tương đương với vết xuất hiện trong dải khải triển chất chuẩn và dược liệu Lạc tiên (Rf = 0,76) Chúng tôi cho rằng hàm lượng Vitexin trong chế phẩm quá nhỏ, không đủ để hiện màu hoặc do trong chế phẩm/ bán thành phẩm chứa nhiều loại dược liệu và tạp chất hơn nên hệ pha động tham khảo từ DĐVN không phù hợp để tách Vitexin ra khỏi hỗn hợp nhiều thành phần Chúng tôi tiến hành thử hệ pha động: ethylacetat - methanol - nước cất - acid formic

Hình 3.3: Sắc kí đồ khảo sát hệ pha động định tính Vitexin theo điều kiện [26]

A Soi đèn UV-254 nm B Soi đèn UV-366 nm

C Phun thuốc thử hiện màu, soi đèn UV-366 nm

Nhận thấy xuất hiện các vết màu đen nhạt (ở bước sóng 254 nm) và các vết phát huỳnh quang màu xanh lá khi phun thuốc thử (ở bước sóng 366 nm) đều có Rf = 0,83 trên các dải khai triển của chuẩn Vitexin, dược liệu Lạc tiên và chế phẩm Tuy nhiên, màu xanh phát huỳnh quang của vết chế phẩm không hoàn toàn giống với màu của vết chuẩn và vết dược liệu Lạc tiên Điều đó có thể do trong chế phẩm có Vitexin và các chất có cấu trúc giống Vitexin

3.2.1.3 Thẩm định phương pháp định tính

a Độ đặc hiệu

Chấm lần lượt 4 dung dịch gồm có Bình vôi, chuẩn THP, chế phẩm và cao dược liệu Tiến hành chạy sắc kí thu được sắc kí đồ như Hình 3.1 (A, B)

Nhận xét: Trong cả 2 sắc kí đồ thu được khi soi dưới đèn UV-254nm và UV-366 nm

đều xuất hiện 3 vết trong 3 dung dịch Bình vôi, chế phẩm, cao dược liệu có cùng giá trị Rf

như trong dung dịch chuẩn THP (Rf = 0,89) Phương pháp có độ chọn lọc tốt

b Giới hạn phát hiện

Tiến hành chấm thử các dung dịch chuẩn THP lần lượt ở các mức nồng độ 65 ppm; 26 ppm;

13 ppm; 6,5 ppm Mỗi dung dịch chấm 3 lần thu được kết quả như Hình 3.4 (A) Sau đó, tiến hành pha dung dịch chuẩn THP 13 ppm và dung dịch chuẩn THP 6,5 ppm Mỗi dung dịch pha thành 10 mẫu thử Tiến hành chấm sắc kí các mẫu dung dịch thử ở 2 nồng độ trên

Hình 3.4: Sắc kí đồ các mẫu chuẩn THP soi ở UV-366 nm

Do đó, chúng tôi dự đoán LOD là khoảng 13 ppm

3.2.2 Mất khối lượng do làm khô

• Tiến hành xác định trên 3 mẫu thử

• Công thức tính kết quả:

• Yêu cầu: Không quá 5%

• Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1