Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học loài trân châu ba vì ( lysimachia baviensis c m hu) và trân châu thưa ( lysimachia laxa baudo)

Các tác dụng này đều được ghi lại trong nhiều tài liệu của Việt Nam như sách “Từ điển cây thuốc Việt Nam” Võ Văn Chi, “Danh lục cây thuốc Việt Nam” Viện dược liệu...[4], [11] Mặc dù đã

CHÂU BA VÌ (Lysimachia baviensis

C.M.Hu) VÀ TRÂN CHÂU THƯA

(Lysimachia laxa Baudo)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2021

CHÂU BA VÌ (Lysimachia baviensis

C.M.Hu) VÀ TRÂN CHÂU THƯA

(Lysimachia laxa Baudo)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng

2 TS Nguyễn Quang Hưng

Nơi thực hiện

1 Bộ môn Dược liệu

2 Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật

HÀ NỘI 2021

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, em đã nhận được rất nhiều sự sự quan tâm, động viên, chỉ bảo tận tình từ quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên em xin được bày tỏ lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc nhất đến DS NCS Nguyễn Thanh Tùng người thầy tận tụy đã trực tiếp hướng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ và

dẫn dắt em từ những ngày đầu bỡ ngỡ đến hết chặng đường thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Quang Hưng – Viện sinh thái

và tài nguyên sinh vật đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm nghiên cứu cho em trong quá trình thực hiện

Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung và bộ môn Dược liệu nói riêng đã tận tình dạy bảo và truyền đạt kiến thức trong suốt những năm tháng ngồi trên ghế nhà trường

Em cũng xin cảm ơn chân thành tới toàn thể anh chị, bạn bè cùng làm việc và các

em đã luôn đồng hành, giúp đỡ và động viên em trong thời gian thực hiện khóa luận

Cuối cùng em xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc để tiếp thêm động lực giúp em cố gắng hơn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 7 tháng 6 năm 2021 Sinh viên

Đồng Thị Hiền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật chi Lysimachia L 3

1.1.1 Lịch sử phân loại và vị trí phân loại chi Lysimachia L 3

1.1.2 Phân bố chi Lysimachia L 4

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Lysimachia L 7

1.2 Tổng quan thành phần hóa học các loài Lysimachia L tại Việt Nam 7

1.2.1 Nhóm hợp chất Flavonoid 8

1.2.2 Nhóm hợp chất Saponin 9

1.2.3 Các hợp chất thuộc nhóm khác 10

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Lysimachia L 11

1.3.1 Công dụng 11

1.3.2 Tác dụng sinh học 11

1.4 Tổng quan về 2 loài Lysimachia baviensis C.M.Hu và Lysimachia laxa Baudo 11

1.4.1 Lysimachia baviensis C.M.Hu 11

1.4.2 Lysimachia laxa Baudo 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học 15

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi 16

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hóa học 16

2.3.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 16

2.3.3.2 Định lượng polyphenol toàn phần trong dịch chiết dược liệu 16

2.3.3.3 Định lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu 16

2.3.3.4 Triển khai sắc ký lớp mỏng các phân đoạn dịch chiết 2 loài Lysimachia

baviensis và Lysimachia laxa 18

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 203.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 203.1.1 Đặc điểm thực vật loài Lysimachia baviensis 203.1.2 Đặc điểm thực vật Lysimachia laxa 21

3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hiển vi 2 loài Lysimachia baviensis C.M.Hu và

Lysimachia laxa Baudo 22

3.2.1 Đặc điểm giải phẫu (thân, lá) 2 loài nghiên cứu 223.2.2 Đặc điểm bột dược liệu 2 loài nghiên cứu 253.3 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 273.4 Kết quả định lượng polyphenol toàn phàn trong dịch chiết dược liệu 2 loài nghiên cứu 29 3.5 Kết quả định lượng flavonoid toàn phàn trong dịch chiết dược liệu 2 loài nghiên cứu 29

3.6 Kết quả triển khai sắc ký lớp mỏng dịch chiết 2 loài Lysimachia baviensis và

Lysimachia laxa 31

BÀN LUẬN 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 41 PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Tiêu bản thực vật 2 loài nghiên cứu

Phụ lục 2 Kết quả giám định tên khoa học 2 loài nghiên cứu

Phụ lục 3 Các phản ứng hóa học dùng để định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong dịch chiết 2 loài nghiên

3.6 Bảng kết quả các vết trên sắc ký đồ phân đoạm n-hexan của 2 loài 31 3.7 Bảng kết quả các vết trên sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat của 2 loà

triển khai với hệ dung môi (I) toluen - ethyl acetat - acid formic

(14:10:1)

33

3.8 Bảng kết quả các vết trên sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat của 2 loài

triển khai với hệ dung môi ethyl acetat-acid formic-nước (8:1:1) 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.2 Công thức saponin nhóm olean-12-en và nhóm

3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ acid

3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

3.11

Ảnh chụp sắc kí đồ phân đoạn n-hexan của dịch chiết L baviensis và

L laxa triển khai với hệ dung môi n-hexan-ethyl acetat (3:1) quan sát

ở (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử, (b) ánh sáng trắng sau khi

phun thuốc thử, (c) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử

31

3.12

Ảnh chụp sắc kí đồ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết L baviensis

và L laxa triển khai với hệ dung môi toluen-ethyl acetat-acid formic

(14:10:1) quan sát ở (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử, (b) UV

366 nm sau khi phun thuốc thử

33

3.13

Ảnh chụp sắc kí đồ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết L baviensis

và L laxa triển khai với hệ dung môi ethyl acetat-acid formic-nước

(8:1:1) quan sát ở (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử, (b) UV

35

366 nm trước khi phun thuốc thử, (c) ánh sáng trắng sau khi phun

thuốc thử, (d) UV 366 nm sau khi phun thuốc thử

3.13

Ảnh chụp sắc kí đồ phân đoạn nước của dịch chiết L baviensis và L

laxa triển khai với hệ dung môi Cloroform – methanol – nước

(65:35:10) quan sát ở (a) UV 254 nm trước khi phun thuốc thử, (b)

UV 366 nm trước khi phun thuốc thử, (c) ánh sáng trắng sau khi phun

thuốc thử

37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Trân Châu (Lysimachia L.) thuộc họ Anh thảo (Primulaceae Vent.) bao gồm

hơn 180 loài được ghi nhận trên toàn thế giới, phân bố chủ yếu ở vùng khí hậu ôn đới

và cận nhiệt đới Bắc bán cầu, một vài loài ở châu Phi, châu Úc, Nam Mỹ và vùng nhiệt đới Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam [15], [26], [33] Hiện nay, Việt Nam đã ghi

nhận khoảng 20 loài thuộc chi Lysimachia L phân bố ở các tỉnh từ Bắc vào Nam [6],

[27], [28]

Các loài thuộc chi Lysimachia L ở Việt Nam từ lâu đã được dùng làm thuốc chữa bệnh trong dân gian như: Trân châu hoa chụm (L congestiflora Hemsl.) dùng để chữa viêm gan, lỵ, ho nhiều đờm, trẻ em co giật; Trân châu thưa (Lysimachia laxa Baudo) chữa giun đũa; Trân châu nhị dài (L lobeloides Wall.) dùng để chữa ho, vú sưng đau, cầm máu, tiêu viêm, thấp khớp; Trân châu ba lá (L insignis Hemsl.) có tác dụng điều huyết, chỉ huyết, hành khí, tán ứ, sơ phong thông lạc, bình can; Trân châu ba vì (L

baviensis C.M.Hu) dùng chữa thấp nhiệt, hoàng đản, khó tiểu tiện, bạch đới, băng lậu

Các tác dụng này đều được ghi lại trong nhiều tài liệu của Việt Nam như sách “Từ điển cây thuốc Việt Nam” (Võ Văn Chi), “Danh lục cây thuốc Việt Nam” (Viện dược liệu) [4], [11]

Mặc dù đã được sử dụng làm thuốc từ rất lâu, thông tin về đặc điểm thực vật cũng

như thành phần hóa học của các loài thuộc chi Lysimachia L ở Việt Nam còn rất hạn chế Trong 20 loài ở Việt Nam chỉ có 5 loài L congestiflora Hemsl., L clethroides DC.,

L fortunei Maxim, L candida Lindl., L sikokiana Miq được nghiên cứu về mặt hóa

học bởi các nhóm nghiên cứu trên thế giới Gần đây, Nguyễn Quang Hưng và Lê Ngọc

Văn đã nghiên cứu đặc điểm hiển vi, định tính các loài L vietnamensis, L congestiflora,

L insignis và L decurrens, sử dụng sắc ký lớp mỏng [7], [10] Hai loài Trân châu ba vì (L baviensis C.M.Hu) và Trân châu thưa (L laxa Baudo) mới chỉ được mô tả khá sơ bộ

về đặc điểm hình thái, sinh thái, tính vị tác dụng và công dụng trong các tài liệu Nhằm mục đích cung cấp các dữ liệu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của 2 loài này tại Việt Nam, làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu này, khóa luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của loài

Trân châu ba vì (Lysimachia baviensis C.M.Hu) và Trân châu thưa (Lysimachia laxa

Baudo)” được thực hiện Đề tài gồm các mục tiêu sau:

- Mô tả đặc điểm thực vật, vi học hai loài nghiên cứu

- Định tính thành phần hóa học, định lượng polyphenol toàn phần và flavoinid toàn phần trong dược liệu hai mẫu nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật chi Lysimachia L 1.1.1 Lịch sử phân loại và vị trí phân loại chi Lysimachia L

*Trên thế giới

Họ Anh thảo (Primulaceae Rich.) gồm 24 chi và khoảng 1000 loài Chi

Lysimachia L là một trong những chi lớn nhất của họ này Năm 1866, Klatt là người

đầu tiên nghiên cứu phân loại chi Lysimachia L ông đã mô tả 45 loài và phân chia chi

thành 9 phần Sau đó, năm 1905, Pax và Knuth đã công nhận 110 loài và chia chi này thành 16 phần Năm 1928, Handel-Mazzetti đã công nhận 147 loài trên toàn thế giới, trong đó có 83 loài ở Trung Quốc, đồng thời ông cũng sắp xếp lại và phân chia chi

Lysimachia L chủ yếu dựa trên các đặc điểm về màu hoa, số lượng và hình dáng cánh

hoa, nhị lép, kiểu mọc của hoa thành 5 phân chi bao gồm: Naumburgia, Pallidia,

Idiophyton, Lysimachiopsis và Lysimachia Hệ thống phân loại của ông tiếp tục được

sửa đổi và đóng góp thêm bởi nhiều tác giả sau đó như Chen & Hu (1979), Bennell &

Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen Takhtajan (2009), chi Lysimachia

L có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật: Plantae

Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta

Lớp thực vật hai lá mầm: Magnoliopsida

Bộ Anh Thảo: Primulales

Họ Anh Thảo: Primulaceae

Chi Trân Châu: Lysimachia L [33]

*Ở Việt Nam

Trong bộ Thực vật chí Campuchia-Việt Nam-Lào xuất bản năm 1992 bởi Bảo

tàng lịch sử tự nhiên quốc gia Paris, đã có 18 loài thuộc chi Lysimachia L được ghi nhận

[41]

Tài liệu “Cây cỏ Việt Nam” (1999) của Giáo sư Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận 17 loài có mặt tại Việt Nam, trong đó 11 loài được dùng làm thuốc theo ghi nhận ở cuốn

“Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Tiến sĩ Võ Văn Chi (2012) [6] Năm 2005, giáo sư

Phan Kế Lộc ghi nhận thêm loài L vittiformis F.H Chen & C.M.Hu [28] và năm 2011

tiếp tục công bố thêm 2 loài mớithuộc chi này là L vietnamensis L.K Phan & C.M.Hu

và L verbascifolia C.M.Hu & L.K.Phan [27] Gần đây nhất vào năm 2017, Yi Hua Tong cùng cộng sự ghi nhận thêm một loài L rupestris F.H.Chen & C.M.Hu [34] Như vậy, tổng cộng nước ta hiện có khoảng 20 loài thuộc chi Lysimachia L

1.1.2 Phân bố chi Lysimachia L

Chi Lysimachia L với hơn 180 loài được ghi nhận trên toàn thế giới, phân bố chủ

yếu ở vùng khí hậu ôn đới và cận nhiệt đới Bắc bán cầu, một vài loài ở châu Phi, châu

Úc, Nam Mỹ và vùng nhiệt đới Đông Nam Á.[15], [33]

Tại Việt Nam các loài thuộc chi này phân bố rộng rãi từ Bắc vào Nam.[4], [6]

Đặc điểm phân bố của các loài thuộc chi Lysimachia L ở Việt Nam hiện nay được tóm

tắt trong bảng sau:

Bảng 1.1 Phân bố các loài Lysimachia L ở Việt Nam

candida Lindl

Trân châu trắng, Lý mạc trắng, Đan điền thảo

Cao Bằng, Lạng Sơn (Đồng Đăng), Thái Nguyên, Hà Nội, Ninh Bình (chợ Ghềnh, Nho Quan), Thanh Hóa, Quảng Trị, Thừa

Thiên Huế [4], [6], [9], [11], [41]

chapaensis Merr

Trân châu Sapa, Lý mạc Sapa

Lào Cai (Sapa) [6], [9], [11], [41]

4

Lysimachia chenii

C.M.Hu

Trân châu chen, Lý mạc chen

Quảng Trị ( núi Răng Cọp) [4], [6], [9], [11], [41]

5

Lysimachia

clethroides DC

Trân châu rau, Trân châu Thái,

Lý mạc liệt tra

Kon Tum (Đắk Glei, Ngọc Linh), núi Ngọc

Lĩnh [4], [6], [9], [11], [41]

Lý mạc hoa phù

Lào Cai (Sapa), Quảng Nam [4], [6], [9], [11], [41]

decurrens G.Forst

Trân châu đứng, Lý mạc đứng

Phổ biến khắp cả nước từ Bắc vào Nam: Lai Châu, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình( Chợ Bở, Suối Rút), Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị (Bố Giang), Thừa

Thiên Huế, Quảng Nam [4], [6], [9], [11], [41]

Lâm Đồng (Đà Lạt, Langbian, Bidoup)

Khánh Hòa, Nha Trang [4], [6], [9], [11], [41]

9

Lysimachia

fortunei Maxim

Lý mạc Fortune, Rau tinh tú

Cao Bằng, Lạng Sơn (Đồng Đăng), Quảng

Ninh (Quảng Yên) [6], [9], [41]

Cao Bằng, Lạng Sơn đến Quảng Nam,

Đà Nẵng, Lạng Sơn, Hà Nam (Kim Bảng), Đà Nẵng, Kon Tum (Đắc Tô)

[4], [6], [9], [11], [41]

11 Lysimachia laxa

Baudo

Trân châu thưa, Lý mạch thưa

Lào Cai (Ô Quy Hồ, Sapa), Kon Tum (Đắc

Tô, Ngọc Phan), Lâm Đồng (Bidoup)

bị đơn Lý mạc lổ bình

Lào Cai (Sapa) [4], [6], [9], [11], [41]

Lý mạc cọng

Kon Tum (Kon Plong, Tân Lập), Ninh

Thuận (Cà Ná) [6], [9], [41]

14

Lysimachia

petelotii Merr

Trân châu petelot, Lý mạc petelot

Lào Cai (Sapa), Kon Tum

[6], [9], [41]

siamensis Bon

Trân châu trườn, Lý mạc xiêm

Lai Châu, Sơn La (Mường La, 700m), Hòa Bình, Gia Lai, Kon Tum, Đắc Lắc (1000-1100m), Lâm Đồng (Đà Lạt)

Bắc Cạn (Na Ri) [27]

verbascifolia

Thanh Hóa (Quan Hóa)

[27]

Hà Giang (Quản Bạ)

[28]

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Lysimachia L

Cây cỏ mọc thẳng đứng hoặc bò, hiếm khi là cây bụi thấp, nhẵn nhụi hoặc có lông tơ, thường có các tuyến xuất hiện dưới dạng các chấm nhỏ hoặc sọc Lá mọc xen

kẽ, mọc đối hoặc mọc so le, thường nguyên, không chia thùy Hoa đơn độc mọc ở nách

lá hoặc thành chùm ở ngọn, thường được rút ngắn thành cụm hoa có lá bắc Hoa có cuống, đối diện với một lá hoặc lá bắc [30] Đài thường có 5 thùy (ít khi có 6-9 thùy),

có thể phát triển cùng quả Tràng màu trắng hoặc vàng, đôi khi tím; hoa đều, hàn liền hình đinh hoặc hình chuông, chia thùy 5 (hiếm khi 6-9) Nhụy hoa thường có 5 lá noãn Chỉ nhị tự do hoặc hợp thành ống chỉ nhị, dính trên thành ống tràng; bao phấn đính gốc, đính lưng hoặc đính giữa; mở bằng lỗ ở đỉnh hoặc khe ở bên Quả nang hình cầu hoặc hình trứng, thường mở bằng van hoặc không tự mở [15] Hạt hình bầu dục có vỏ ngoài sáng bóng, được bao phủ bởi vỏ dày, màu xám hoặc màu vàng nâu, bề mặt có lỗ như tổ ong Thường xuất hiện lông ở các nốt của thân cây, trong các bộ phận của hoa, bề mặt bên trong tràng hoa, ống nhị và chỉ nhị [30]

1.2 Tổng quan thành phần hóa học các loài Lysimachia L tại Việt Nam

Trên thế giới các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Lysimachia còn rất

hạn chế, tuy nhiên ở một số nước, đặc biệt là Trung Quốc đã có nghiên cứu khá sớm về

thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Lysimachia L như các hợp chất flavonoid

từ L punctata L.(1970), L clethroides Duby (1986), L nummularia (1990), L thysiflora (1997); benzoquinon trong sáu loài L clethroides Duby, L ephemerum L., L thyrsiflora L., L nummularia L., L punctata L., L ciliata (2008); acid phenolic từ L nummularia (1989); saponin từ L thyrsiflora (1975) và L vulgaris (1998) [29]

Tại Việt Nam, mặc dù một số loài đã được sử dụng từ lâu, hiện nay các nghiên

cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Lysimachia L còn rất hạn chế Trong

số 20 loài ở Việt Nam, chỉ có 5 loài được nghiên cứu thành phần hóa học bởi các nhóm

nghiên cứu trên thế giới là L congestiflora Hemsl., L clethroides Duby, L fortunei Maxim, L candida Lindl., L sikokiana Miq Những nghiên cứu về chi này ở Việt Nam mới tiến hành ở những bước đầu, cụ thể hơn, có 4 loài L congestiflora Hemsl, L

decurrens, L insignis, L vietnamensis được nghiên cứu bởi nhóm nghiên cứu tại Việt

Nam cho thấy thành phần hóa học chính của 4 loài này là flavonoid, saponin và tanin [7] [10]

Từ đó cho thấy, các hợp chất đã được nghiên cứu có trong các loài thuộc chi

Lysimachia L chủ yếu là flavonoid, saponin, acid hữu cơ, triterpen và steroid [29] trong

đó điển hình hơn cả là flavonoid và saponin triterpenoid

1.2.1 Nhóm hợp chất Flavonoid

Các loài Trân châu thuộc chi Lysimachia L rất giàu flavonoid với khoảng 70 hợp

chất được phân lập và tồn tại chủ yếu dưới dạng flavonol-O-glycosid của một số hợp chất như kaempferol, quercetin, myricetin và syringetin và các gốc đường có thể là glucopyranose, galatose, arabifuranose, [14]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của kaempferol, quercetin, myricetin

Trong một số loài, flavonoid là thành phần có hoạt tính sinh học chính Các hợp

chất flavonoid chủ yếu được phân lập từ các loài L clethroides Duby, L candida Lindl.,

L fortunei Maxim, L congestiflora Hemsl., trong đó khoảng hơn 40 flavonoid được

phân lập từ loài loài L clethroides Duby, tồn tại dưới dạng flavonol-O-glycosid, điển

hình như astragalin (kaempferol glycosid) [18] và các kaempferol glycosid khác có các gốc đường là rutinose [25], galactose [42], pyranose [22], [46], hay quercetin glycosid (như isoquercitrin) [17] chiếm đa số Ngoài ra trong loài L clethroides Duby còn có

dạng flavonol aglycon như: kaempferol [18], quercetin [42], myricetin [35] và rutin [45]

Một số thành phần điển hình của các loài khác như: isorhamnetin glycosid (L fortunei Maxim [39], [48]), kaempferol glycosid (L congestiflora Hemsl [14], L candida Lindl [50], L fortunei Maxim [39]); syringetin glycosid (L congestiflora Hemsl [53]);

larycitrin (L congestiflora Hemsl [43]); myricetin, myricitrin và myricetrin (L

congestiflora Hemsl [47], [51])

Ngoài ra, các dạng flavonoid khác cũng chiếm tỷ lệ nhỏ trong các loài thuộc chi này, bao gồm: flavan-3-ol ((+)-catechin, (-)-epicatechin, epigallocatechin, (+)-gallocatechin); flavanon (eriodictyol, naringenin), flavon (vitexin, 7-O-glucosyl

liquiritigenin); dạng C-glycosid; flavonoid bị methyl hóa (isorhamnetin trong loài L

fortunei Maxim [44] và flavonol glycosid bị acyl hóa

(quercetin-3-O-β-D-(6-O-Z-p-coumaroyl) glucopyranosid) [25], [35]

1.2.2 Nhóm hợp chất Saponin

Saponin được xác định từ các loài đã nghiên cứu chủ yếu đều thuộc nhóm saponin triterpenoid và hầu hết có cấu trúc khung oleanan, có 2 nhóm cấu trúc phổ biến: 13β,28 epoxyoleanan và olean-12-en Đến năm 2007, saponin đã được báo cáo từ khoảng 12

loài thuộc chi trên toàn thế giới, chủ yếu là các loài có nguồn gốc ở Châu Á bao gồm L

capillipes Hemsl., L candida Lindl., L congestiflora Hemsl., L davurica Ledeb., L foenum-graecum Hance, L microcarpa Hand-Mazz., L paridiformis Franch., L sikokiana Miq., L heterogenea Klatt, L clethroides Duby và 2 loài ở Châu Âu gồm L vulgaris L và L thyrsiflora L [29] Đến nay, đã có khoảng 5 loài thuộc chi này ở Việt

Nam được nghiên cứu về hợp chất saponin

Năm 2017, một nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 saponin triterpenoid từ bộ

phận trên mặt đất của loài L fortunei Maxim gồm fortunosid A - F [40] Trong khi đó,

từ bộ phận toàn cây của loài L lobelioides Wall phân lập được 4 hợp chất lobelioidosid

A - D cũng có cầu nối 13,28-epoxy nhưng ở vị trí 16 có nhóm oxo và một nhóm OH ở

vị trí 23 [20]

Thành phần có hoạt tính quan trọng nhất trong loài L sikokiana Miq Là các hợp

chất saponin Từ bộ phận trên mặt đất của loài này đã phân lập được 7 saponin chính, trong đó lysikokianosid 1 là thành phần có hoạt tính mạnh nhất Hợp chất lisikokianosid

1 có chứa sapogenin là protoprimulagenin A gắn với các gốc đường α-arabinose; glucose; β-xylose [19] Ngoài ra, lysikokianosid 1 còn được tìm thấy trong các loài khác

β-của chi như L clethroides Duby [21], [29]; L candida Lindl [37], [49]; L fortunei

Maxim [40]

Nhóm olean-12-en Nhóm 13β,28 – eopxyoleanan

Hình 1.2 Công thức saponin nhóm olean-12-en và nhóm 13β,28-eopxyoleananan

1.2.3 Các hợp chất thuộc nhóm khác

Một số acid hữu cơ đã được phân lập từ các loài Lysimachia có ở Việt Nam bởi

các nhóm nghiên cứu trên thế giới Năm 2012, Dong Liang và cộng sự đã phân lập được

17 acid carboxylic từ bộ phận trên mặt đất của loài L clethroides Duby [23] Các acid béo (acid hexadecanoic, acid lacceroic) cũng được phân lập từ loài L lobelioides Wall năm 2009 [54] Ngoài ra, acid palmitic cũng được tìm thấy trong 2 loài L candida Lindl

và L fortunei Maxim [44], [50]

Năm 2012, Xu Qiong-ming cùng các cộng sự đã báo cáo phân lập được một triterpenoid pentacylic từ dịch chiết cloroform là 3β-myristoxyurs-12-en19,28-olid cùng với 4 triterpenoid khác gồm: hederagenin, acid betulinic, acid ursolic, acid 19α-

hydroxyurs-12-en-28-oic từ loài L clethroides Duby [38] Triterpenoid phân lập được trong 2 loài L fortunei Maxim và L congestiflora Hemsl hạn chế hơn: 9,19- cyclolanost-24-en-3-on trong loài L fortunei Maxim [44], taraxerol trong loài L

congetiflora Hemsl [39]

Hợp chất sterol phổ biến nhất là stigmasterol có trong các loài L candida Lindl [50]; L fortunei Maxim [44]; L clethroides Duby [52] và L congetiflora Hemsl [47]

Ngoài ra có các steroid khác phân lập được như β-sitosterol, daucosterol,

chondrillasterol từ L lobelioides Wall [54]; spinasterol từ L candida Lindl.[50]; 24ethyl-5α-cholesta-7,22(E)-dien-3β-ol và 9,19-cyclolanost-24-en-3-on từ L fortunei

Maxim [44]

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Lysimachia L

1.3.1 Công dụng

Các loài thuộc chi Lysimachia L có nhiều công dụng, đặc biệt là ở Châu Á, trong

đó phổ biến hơn cả là ở Trung Quốc Trong dân gian cây thường được dùng làm trà thảo

mộc để điều trị các bệnh về đường tiêu hóa [36] Rễ hay toàn cây của loài L clethroides

Duby được dùng chữa bệnh phù nề, vàng da, kiết lỵ, sốt thấp khớp, vô kinh, bầm tím, gãy xương, chảy máu, chấn thương, viêm vú, nhọt, rắn cắn, và viêm gan; thân và lá mềm còn được dùng làm rau ăn [18], [25]; trong khi bộ phận trên mặt đất được sử dụng rộng

rãi với công dụng chữa đau họng, phù nề [17], [23], [24] Ngoài ra, toàn cây của loài L

candida Lindl được sử dụng để điều trị sốt, sưng, viêm da, gãy xương [37] Lá tươi của

loài L laxa Baudo dược dùng để tẩy giun sán đường tiêu hóa [31] Loài L lobelioides

Wall được dùng trong dân gian điều trị thấp khớp, phù nề, kiết lỵ và chấn thương [20]

1.3.2 Tác dụng sinh học

Tác dụng gây độc tế bào: Điển hình là các hợp chất flavonoid trong L clethroides

Duby được nghiên cứu là có tác dụng gây độc tế bào thông qua ức chế sự tăng trưởng các tế bào ung thư bạch cầu K562, ngăn chặn hiệu quả một số dòng tế bào ung thư như dòng tế bào ung thư bạch cầu ở người L1210, ức chế di căn trên dòng tế bào ung thư gan H22 và dòng tế bào ung thư cổ tử cung U14 [25]

Chống nấm: Anagallisin C là hợp chất chính trong loài L candida Lindl., có khả

năng chống nấm Aspergillus flavus [37]

Chống oxy hóa: Một nghiên cứu gần đây vào năm 2017 của Sanjoy Gupta và

cộng sự cho thấy tác dụng loại bỏ gốc tự do (DPPH) từ dịch chiết methanol của loài L

laxa Baudo Theo đó hợp chất phenolic và flavonoid là hợp chất thực vật chính trong

cây này có hoạt tính chống oxy hóa, dọn gốc tự do [31], [32]

Tác dụng khác: Tác dụng giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, diệt vius, chống

dị ứng [36]; chống kết tập tiểu cầu, hạ đường huyết và tác dụng bảo vệ gan [17], [18]

1.4 Tổng quan về 2 loài Lysimachia baviensis C.M.Hu và Lysimachia laxa Baudo 1.4.1 Lysimachia baviensis C.M.Hu

Tên Việt Nam: Trân châu ba vì

Đặc điểm thực vật: Cây cỏ nhiều năm, cao 25cm, thân đơn, mọc thẳng, không

lông, phiến lá bầu dục, 8-15 x 3,5-6 cm, đáy bất xứng, gân phụ 6-8 cặp Cụm hoa mọc đầu cành hay ở nách lá trên cuống dài đến 4-6 cm, mỗi chùm khoảng 5-7 hoa, hoa màu

vàng tươi, cao 1-2,5 cm, vành cao 9,5 mm, đài hoa 7-7,7 mm hình mũi mác, chỉ nhị ngắn [6], [41]

Sinh thái: mọc rải rác trong rừng thưa, ở độ cao 800m, ra hoa vào tháng 4 – 5 [4],

[6], [9], [41]

Phân bố: Vùng Nam Trung Bộ của Trung Quốc gồm các tỉnh Quảng Đông, Hồ

Nam, Hải Nam,…và Việt Nam [55] Ở Việt Nam tập trung vùng núi Ba Vì, Hà Nội [4], [6], [9], [41]

Công dụng và tác dụng sinh học: L baviensis thường dùng chữa thấp nhiệt, hoàng

đản, tiểu tiện bất lợi bạch đới, băng lậu [9], [11]

1.4.2 Lysimachia laxa Baudo

Tên Việt Nam: Trân châu thưa, Lý mạch thưa [4], [6], [9], [11]

Đặc điểm thực vật: Cỏ hàng năm, cao 40 – 60 cm, không lông Lá mọc xen kẽ,

phân bố đều khắp thân Lá có phiến không lông, mỏng, bầu dục thon nhọn 2 đầu, hình mũi mác, dài 6-8 cm, lá trên nhỏ, gân phụ 6-8 cặp, cong, cuống 1-2 cm Hoa đơn độc mọc ở nách lá, cuống hoa mỏng như chỉ, hoa rộng 1,5 cm; đài cao 4 mm; cánh hoa cao

1 cm; nhị 5, chỉ nhị gắn trên vòng tràng hàn liền Quả nang tròn to 7-8 mm [6], [41]

Sinh thái: Cây thường mọc rải rác dưới tán rừng thưa, ở độ cao 1400–1900m Ra

hoa tháng 6-7 [4], [6], [9], [11], [41]

Phân bố: (Hình 1.4) Trên thế giới: Assam, Trung Nam Trung Quốc, phía Đông

dãy Himalaya, đảo Java, đảo Sunda nhỏ, Sumatra (Indonesia), Myanmar, Nepal, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam [56] Ở Việt Nam tập trung ở Lào Cai (Sapa, Ô Quy Hồ), Kon Tum (Đắc Tô, Ngọc Phan), Lâm Đồng [4], [6], [9], [11]

Công dụng và tác dụng sinh học: L laxa có tác dụng chữa giun đũa, có hoạt tính

chống oxy hóa, dọn gốc tự do [9], [11], [32]

Hình 1.3 Bản đồ phân bố loài Lysimachia baviensis trên thế giới

Hình 1.4 Bản đồ phân bố loài Lysimachia laxa trên thế giới

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất L baviensis được thu hái tại huyện Lâm Bình, tỉnh Tuyên Quang, L laxa được thu hái tại Vườn quốc gia Cúc Phương, Ninh

Bình vào tháng 4 năm 2020 và tháng 3 năm 2021 Sau khi thu hái, một phần được ngâm trong ethanol 50 % để nghiên cứu đặc điểm hiển vi Một phần mẫu được ép thành tiêu bản khô để nghiên cứu đặc điểm hình thái và lưu mẫu Phần còn lại được phơi se, sấy trong tủ sấy có thông gió ở 50 ºC đến khô, xay tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon sạch kín, để chỗ mát, sử dụng làm nghiên cứu đặc điểm bột và thành phần hóa học

Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học và lưu tiêu bản tại phòng Tài nguyên thực vật - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật (Viện hàn lâm khoa học và công

nghệ Việt Nam) với mã số tiêu bản Lysimachia baviensis C.M.Hu (106.03-2018.06)-2

và Lysimachia laxa Baudo (106.03-2018.06)-5

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Thuốc thử, dung môi, hóa chất

- Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Nước Javen, nước cất, acid acetic 5 %, xanh methylen, đỏ son phèn, glycerin

- Dùng trong định tính sơ bộ các thành phần hóa học: NaOH 10 %, dd gelatin 1 %, FeCl3

5 %, H2SO4 đặc, thuốc thử diazo, thuốc thử Fehling A & B, Na2CO3, thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Bouchardat, chì acetat 10 %, acid picric…

- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích

đã ghi trong Dược điển Việt Nam V

Phương tiện và máy móc:

- Kính hiển vi: Leica DM 1000

- Kính soi nổi: Stereo Blue

- Cân kỹ thuật: Sartorius TE412

- Tủ sấy Memmert

- Máy xác định độ ẩm OHAUS

- Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon

- Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H)

- Máy ly tâm PLC

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bình nón, ống nghiệm, cốc có mỏ, pipet…)

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC của CAMAG (Thụy Sĩ) bao gồm: hệ thống chấm mẫu Linomat V, buồng triển khai tự động ADC-2, buồng chụp sắc ký Visualizer Hệ thống được điều khiển qua máy tính có cài phần mềm visionCATs

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học 2 loài nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu thân, lá, đặc điểm bột dược liệu 2 loài nghiên cứu

- Định tính thành phần hóa học mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

- Định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu bằng phương pháp đo quang

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giám định tên khoa học

Mẫu được thu hái, xử lý, làm tiêu bản theo quy trình làm tiêu bản thực vật trong tài liệu “Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc” [3] và lưu giữ tiêu bản tại phòng Tài nguyên thực vật - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật (Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam)

Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây tại thực địa theo phương pháp ghi trong tài liệu phân loại thực vật [1], [3]

Sử dụng phương pháp so sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Thực vật chí Campuchia, Việt Nam, Lào (Flore du cambodge du Laos

et du Viêtnam) [4], [15], [41], đồng thời tham khảo ý kiến của các chuyên gia về phân loại thực vật để giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hiển vi

Đặc điểm vi phẫu: Dược liệu được ngâm mềm, cắt bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm

tay, chọn các lát cắt mỏng, nguyên vẹn tẩy bằng cloramin hoặc javen đến khi trắng.Tiếp tục rửa với nước nhiều lần rồi rửa với acid acetic 5% và cuối cùng được rửa lại bằng nước Nhuộm vi phẫu thu được bằng xanh methylen 1% đã pha loãng với nước trong 30 phút rồi rửa lại bằng nước Đỏ carmin được sử dụng trong lần nhuộm tiếp theo trong khoảng 30 phút Tiêu bản sau nhuộm được rửa lại bằng nước Đặt vi phẫu vào 1 giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính Sau đó tiến hành soi tiêu bản dưới kính hiển

vi quang học, chụp ảnh, mô tả [2], [3], [8]

Đặc điểm bột: Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, đem tán thành bột mịn

bằng thuyền tán đã được làm sạch và khô, rây qua rây 180µm và lên tiêu bản Soi tìm

và quan sát các đặc điểm dưới kính hiển vi quang học Mô tả đặc điểm của bột và chụp ảnh [2], [8]

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hóa học

Phần trên mặt đất (lá và thân cây) được phơi se, sấy trong tủ sấy có thông gió ở

50 ºC đến khô, xay tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon sạch kín, để chỗ mát, khô ráo để làm các phản ứng hóa học định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ và triển khai sắc

ký lớp mỏng các phân đoạn dịch chiết 2 loài nghiên cứu [2], [5]

2.3.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Tiến hành các phản ứng định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu theo tài liệu “Thực tập dược liệu”; “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [2], [5] Quy trình định tính được trình bày trong Phụ lục 3

2.3.3.2 Định lượng polyphenol toàn phần trong dịch chiết dược liệu

Định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [13] Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% được pha loãng với nước

Dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 2,5 mg acid gallic chuẩn, hòa tan

bằng methanol trong bình định mức 25 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch Pha loãng

để được dãy dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột mỗi loài cho vào các bình nón,

thêm 50ml methanol 80%, chiết hồi lưu trong 2 giờ, để nguội, lọc thu lấy dịch chiết

Dịch chiết thu được tiếp tục được pha loãng như sau để nồng độ dung dịch đo quang nằm trong khoảng tuyến tính:

Với loài L baviensis lấy chính xác 5 ml dịch chiết dược liệu cho vào bình định mức 25ml, thêm methanol 80% đến vạch thu được dung dịch thử loài L baviensis

Với loài L laxa lấy chính xác 5 ml dịch chiết dược liệu cho vào bình định mức 25ml, thêm methanol 80% đến vạch thu được dung dịch thử loài L laxa

Tiến hành định lượng: Lần lượt cho 1 ml mỗi dung dịch acid gallic chuẩn (nồng

độ 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100µg/ml) vào bình định mức 10 ml, thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút Thêm 1 ml nước cất lắc đều, thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5%, định mức bằng nước cất hai lần Sau 60 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 754,5 nm (đã khảo sát) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Giá trị A được ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần Mẫu thử được tiến hành theo quy trình tương tự

Nồng độ dung dịch đo quang được tính theo công thức:

𝐻100

Trong đó:

C: Nồng độ dung dịch đo quang (µg/ml)

a, b: hệ số của phương trình đường chuẩn của acid gallic

Y là độ hấp thụ quang của dung dịch đo quang của mẫu thử ở bước sóng 754,5 nm H: độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

Hàm lượng polyphenol toàn phần có trong dược liệu được tính theo acid gallic (GAE) theo công thức:

𝑋 = 𝐶 𝑥 10−3𝑥 𝑉 𝑥 𝐾

𝑀𝑑𝑙 𝑥 (100−𝑎)𝑥 10 −2 (𝑚𝑔 𝐺𝐴𝐸/g dược liệu)

Trong đó:

X: Hàm lượng polyphenol toàn phần của mẫu thử (mg GAE/g dược liệu)

C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/ml)

V: Thể tích dung dịch chiết gốc (50 ml) K: Hệ số pha loãng

Mdl : Khối lượng dược liệu (g) a: Độ ẩm dược liệu (%)

2.3.3.3 Định lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu bằng phương pháp tạo màu với AlCl3 trong môi trường kiềm

Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình

cầu Chiết hồi lưu với 20ml methanol 80 % trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 850C Lọc thu lấy dịch chiết, thêm tiếp 20ml methanol và tiến hành chiết lần 2 Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 50ml và bổ sung tới vạch định mức bằng methanol 80%, lắc đều thu được dung dịch thử

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5mg quercetin chuẩn (độ

tinh khiết 98%) vào bình định mức 25ml và định mức bằng methanol 80% ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 196µg/ml

Tiến hành định lượng:

Hút chính xác 2 ml dịch chiết vào bình định mức 10ml, thêm 0,2ml dung dịch nhôm clorid (10% kl/tt), 0,4ml dung dịch natri acetat 0,5M và định mức tới 10,0ml bằng methanol Hỗn hợp phản ứng để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó xác định

độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ tại bước sóng khảo sát Giá trị A ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu

Hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dược liệu được tính theo công thức:

X = 𝐶 𝑥 10−3𝑥 𝑉 𝑥 𝐾

𝑀 𝑑𝑙 𝑥 (100−𝑎)𝑥 10−2 (𝑚𝑔 𝑄𝐸/g dược liệu)

Trong đó:

X: Hàm lượng flavonoid toàn phần của mẫu thử (mg QE/g dược liệu)

C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/ml)

V: Thể tích dung dịch chiết gốc (50 ml) K: Hệ số pha loãng

Mdl : Khối lượng dược liệu (g) a: Độ ẩm dược liệu (%)

2.3.3.4 Triển khai sắc ký lớp mỏng các phân đoạn dịch chiết 2 loài Lysimachia baviensis

và Lysimachia laxa

Với mục đích sơ bộ khảo sát thành phần hóa học 2 loài nghiên cứu để làm căn cứ cho các nghiên cứu tiếp theo về hóa thực vật của 2 loài, chúng tôi tiến hành chiết xuất dịch chiết methanol toàn phần cũng như các phân đoạn dịch chiết 2 loài nghiên cứu sử

dụng n-hexan và ethyl acetat

Chuẩn bị dịch chiết: Cân 1g bột dược liệu thô mỗi loài, chiết hồi lưu với methanol

80%, chiết 2 lần, mỗi lần làm với 25 ml methanol 80 % trong 1 giờ Gộp dịch chiết, để nguội, gạn lấy dịch chiết và cất thu hồi dung môi đến cắn Phân tán cắn trong 10 ml

nước, rồi lắc với n-hexan 5 lần, mỗi lần 10 ml Gộp và thu lấy phân đoạn n-hexan, tiếp

tục lắc lớp nước với ethyl acetat 5 lần, mỗi lần 10 ml Gộp và thu lấy phân đoạn ethyl acetat, cất thu hồi dung môi đến cắn Gộp và thu lấy phân đoạn còn lại (phân đoạn nước)

3 phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và phân đoạn nước được thu hôi dung môi đến cắn

Hòa tan cắn mỗi phân đoạn thu được trong 1ml methanol, được dung dịch thử 3 phân

đoạn n-hexan, ethyl acetat và phân đoạn nước

bản mỏng được hoạt hóa 110oC trong 1 giờ

Pha động: Khảo sát một số hệ dung môi pha động phù hợp với từng phân đoạn

dịch chiết, lựa chọn hệ dung môi cho kết quả tách tốt nhất

Chấm sắc ký: Chấm 20µl dịch chiết loài L baviensis, 20µl dịch chiết L laxa từng

phân đoạn lên cùng bản mỏng sử dụng hệ thống chấm sắc ký Linomat V, để khô tự nhiên

Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín,

để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 1

cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm, 366nm Sau đó phun thuốc thử rồi soi, chụp ảnh ở bước sóng 366nm Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết được phân tích số lượng, vị trí các vết sử dụng phần mềm visionCATs

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu

3.1.1 Đặc điểm thực vật loài Lysimachia baviensis

Đặc điểm hình thái: Cây thảo nhiều năm, không lông, cao 25-30 cm Lá mọc đối,

phiến lá hình trứng hay trứng rộng tới hình tròn, dài 10-15 cm, rộng 8-12 cm, đáy hình tim hoặc bất xứng, gân bên 5-7 cặp, cuống dài 3-5 cm Hoa mọc chùm ở đầu cành hay

ở nách lá trên cuống dài đến 4-6 cm, mỗi chùm khoảng 5-9 hoa, hoa màu vàng tươi, cao 1-2,5 cm, tiêu nhụy, bầu có lông rải rác, chỉ nhị rất ngắn, bao phấn hình mũi mác, màu trắng hoặc tím nhạt

Hình 3.1 Ảnh chụp đặc điểm thực vật loài Lysimachia baviensis C.M.Hu

1 Dạng sống; 2 Chùm hoa; 3 Hoa; 4 Nụ; 5 Đài hoa; 6 Tràng hoa;

7 Bầu; 8 Nhị hoa

So sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Thực vật chí Campuchia, Việt Nam, Lào (Flore du cambodge du Laos et du Viêtnam) [4], [15],

[41], đồng thời tham khảo ý kiến của các chuyên gia về phân loại thực vật, nhóm nghiên

cứu xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Lysimachia baviensis C.M.Hu

3.1.2 Đặc điểm thực vật Lysimachia laxa

Đặc điểm hình thái: Cây thảo mọc hàng năm Thân cao 40-60 cm, mọc đứng, có

góc, thường phân nhánh Lá mọc so le, phân bố đều dọc thân cây; phiến không lông, mỏng, hình bầu dục-mũi mác, dài 4-11 cm, rộng 0,5-2,5 cm, thon nhọn 2 đầu, hình nêm

và men theo ở gốc, nhọn mũi nhiều hay ít, dạng màng, mặt trên có lông tơ rải rác, mặt dưới không lông, có điểm tuyến màu nâu, gân bên 6 – 8 cặp; cuống lá dài 1-2 cm Hoa đơn độc ở nách lá Cuống mảnh như chỉ, dài 2,5 cm Đài chia thùy hình trứng bầu dục,

có tuyến Tràng màu vàng, cao gấp đôi đài, chia sâu thành thùy hình trứng ngược – bầu dục Nhị có chỉ nhị chỉ nhị gắn trên vòng tràng hàn liền Quả nang tròn, đường kính 5 – 6mm, mang vòi tồn tại, mở bởi khe dài tới gốc

Hình 3.2 Ảnh chụp đặc điểm thực vật loài Lysimachia laxa Baudo

So sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Thực vật chí Campuchia, Việt Nam, Lào (Flore du cambodge du Laos et du Viêtnam) đồng thời

tham khảo ý kiến của các chuyên gia về phân loại thực vật, nhóm nghiên cứu xác định

tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Lysimachia laxa Baudo

3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hiển vi 2 loài Lysimachia baviensis C.M.Hu và Lysimachia laxa Baudo

3.2.1 Đặc điểm giải phẫu (thân, lá) 2 loài nghiên cứu

 Lysimachia baviensis C.M.Hu

Vi phẫu thân (Hình 3-1)

Mặt cắt hình bầu dục, có những mấu lồi Từ ngoài vào trong có: Lớp biểu bì gồm một hàng tế bào nhỏ, sắp xếp đều đặn (1), dưới lớp biểu bì tế bào mô dày hình đa giác, tập chung nhiều hơn ở chỗ lồi của thân cây, có thành dày lên ở góc (2) Mô mềm vỏ gồm các tế bào hình đa giác, thành mỏng, kích thước không đồng đều, sắp xếp lộn xộn (3) Libe gồm các tế bào đa giác, kích thước nhỏ, xếp thành vòng liên tục bao quanh gỗ (4),

gỗ tập trung thành các vòng liên tục (5) Trong cùng là mô mềm ruột gồm các tế bào đa giác kích thước lớn hơn so với mô mềm vỏ, thành mỏng (6)

Hình 3.3 Ảnh vi phẫu thân Lysimachia baviensis C.M.Hu

1 Biểu bì; 2 Mô dày; 3 Mô mềm vỏ; 4.Libe; 5.Gỗ; 6 Mô mềm ruột

Vi phẫu lá:

Phần gân lá: mặt lá trên hơi lõm, mặt dưới lồi Biểu bì trên gồm 1 hàng tế bào lớn, không đồng đều, xếp sát nhau (1) Dưới lớp biểu bì là mô mềm, gồm các tế bào

thành mỏng hình đa giác, sắp xếp lộn xộn (2) Bó libe-gỗ ở gân chính tạo thành hình vòng cung hướng lên trên, bó ở giữa to nhất Các bó gỗ xếp thành vòng không liên tục, hướng lên trên (4) Cung libe bao phía ngoài bó gỗ (3) Ngoài ra có thể quan sát thấy bó libe - gỗ phụ nằm gần bó libe gỗ chính Sát lớp biểu bì dưới là 1-2 hàng tế bào mô dày, hình đa giác, có thành dày lên ở các góc (6) Biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào nhỏ (1) Trên bề mặt biểu bì có thể quan sát thấy các lông tiết, chân 1-3 tế bào (7)

Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào nhỏ, xếp không đều (9), giữa là mô khuyết, gồm các tế bào thành mỏng, kích thước không đồng đều, để

hở những khoảng trống (8)

Hình 3.4 Ảnh vi phẫu lá Lysimachia baviensis C.M.Hu 1.Biểu bì dưới; 2 Mô mềm; 3 Libe; 4 Gỗ; 5 Biểu bì trên; 6 Mô dày;

7 Lông tiết; 8 Mô khuyết; 9 Biểu bì phiến lá

 Lysimachia laxa Baudo

Vi phẫu thân

Mặt cắt hình tròn hoặc bầu dục Từ ngoài vào trong có: Lớp biểu bì gồm một hàng tế bào nhỏ, hình đa giác, không đều nhau, màng ngoài có một lớp cutin mỏng bao bọc (1) Sát lớp biểu bì là 1-2 hàng tế bào mô dày (2) Mô mềm vỏ gồm các tế bào thành uốn lượn, hơi bị ép bẹt, kích thước không đồng đều, sắp xếp lộn xộn (3) Các tế bào mô

cứng nằm riêng lẻ ở nội bì, sát lớp libe (4) Libe gồm các tế bào đa giác, kích thước nhỏ, xếp thành vòng liên tục bao phía ngoài gỗ (5), gỗ tập trung thành các vòng tròn liên tục đồng tâm (6) Trong cùng là mô mềm ruột chiếm phần lớn tiết diện vi phẫu, gồm các tế bào đa giác, kích thước lớn, thành mỏng, các góc có khoảng gian bào nhỏ (7)

Hình 3.5 Ảnh vi phẫu thân loài Lysimachia laxa 1.Biểu bì; 2 Mô dày; 3 Mô mềm vỏ; 4 Mô cứng; 5 Libe; 6 Gỗ; 7 Mô mềm ruột

Vi phẫu lá

Phần gân lá: mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi Biểu bì trên 1 hàng tế bào hình chữ nhật kích thước đồng đều, xếp sát nhau (7) Dưới lớp biểu bì là mô mềm, gồm các tế bào thành mỏng hình đa giác, sắp xếp lộn xộn (3) Trong mô mềm ở phiến lá, có bó libe

gỗ phụ (6) Cung libe - gỗ nằm ở giữa gân chính Cung gỗ gồm các bó gỗ xếp thành từng dãy, nằm phía trong, hướng lên trên (5) Cung libe bao phía ngoài cung gỗ (4) Nằm sát lớp biểu bì dưới là 1-2 hàng tế bào mô dày, dày lên ở góc (2) Biểu bì dưới là các tế bào hình tròn nhỏ, kích thước đồng đều, xếp đều nhau (1)

Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào kích thước không đồng đều, xếp sát nhau Ở giữa là mô mềm khuyết, gồm các tế bào thành mỏng, kích thước không đồng đều