Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ lá cây đinh lăng răng thu hái tại thái bình

quinquefolia là một trong những loài cây được trồng phổ biến tại huyện Tiền Hải, tỉnh Thái Bình, được người dân sử dụng làm cây cảnh và làm thuốc chữa bệnh với công dụng tăng cường sức

THÁI BÌNH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2021

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, động viên, chỉ bảo tận tình từ gia đình, thầy cô giáo và bạn bè

Đầu tiên với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành

tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người đã dìu dắt em từ những ngày đầu làm khóa

luận, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn DS Lê Hương Giang cùng các thầy cô, các anh chị

kĩ thuật viên đang công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận

Em xin cảm ơn DS Nguyễn Hồng Thịnh, DS Sengkham Choumlivong, Trần Thị Thùy Chi, Trần Thị Lương Linh, Phonevilay Phothisan đã động viên, đồng

hành, truyền động lực cho em để em có thể hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo môi trường học tập, tận tình giảng dạy truyền tải cho em tri thức quý báu trong suốt 5 năm ngồi trên ghế nhà trường

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp

đỡ, an ủi em để em có thể tiếp tục thực hiện và hoàn thành khóa luận

Do điều kiện chủ quan và khách quan, khóa luận khó tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô và hội đồng để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 08 tháng 06 năm 2021

Sinh viên

Nguyễn Thị Lệ

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Đinh lăng (Polyscias) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias) 2

1.1.3 Đa dạng và phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias) 2

1.1.4 Thành phần hóa học của chi Đinh lăng (Polyscias) 2

1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias) 8

1.2 Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei 9

1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei 9

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Polyscias guilfoylei 9

1.2.3 Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 13

2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ 13

2.1.2.2 Phương tiện và máy móc 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn 14

2.3.2 Phân lập các hợp chất 15

2.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất 17

3.1 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn từ lá cây Đinh lăng răng 18

3.2 Phân lập một số hợp chất từ lá cây Đinh lăng răng 18

3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 21

3.4 Bàn luận 27

3.4.1 Về phương pháp chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn 27

3.4.2 Về phương pháp phân lập các hợp chất 27

3.4.3 Về các hợp chất phân lập được 27

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

cv : cultivar

ESI-MS : ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc : ethyl acetat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 So sánh số liệu NMR của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo Tr 22

Bảng 3.2 So sánh số liệu NMR của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo Tr 25

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.2 Các hợp chất được phân lập từ loài Polyscias guilfoylei Tr 12

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập lá Polyscias guilfoylei Tr 19

Hình 3.2 Sắc ký đồ của phân đoạn LB28 và hợp chất LB1.1 (132) Tr 20

Hình 3.3 Sắc ký đồ của phân đoạn LB28-85-2 và hợp chất LB2 Tr 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Song song với xu hướng phát triển mạnh mẽ của các thuốc tân dược hiện nay, các thuốc có nguồn gốc thảo dược cũng đang được đẩy mạnh đầu tư nghiên cứu bởi tính

an toàn, không gây độc hoặc ít gây độc, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể Bên cạnh

đó, các dược liệu cũng chính là nguồn nguyên liệu phong phú trong lĩnh vực bán tổng hợp các thuốc hóa dược bởi có những hợp chất tổng hợp hóa dược không làm được hoặc khó làm được, nhưng lại dễ dàng chiết xuất từ dược liệu, từ đó tiết kiệm được chi phí, thời gian và công sức trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới Vì vậy, việc triển khai mạnh mẽ nghiên cứu khoa học, ứng dụng kết quả nghiên cứu vào xây dựng nguồn nguyên liệu và hiện đại hóa y học cổ truyền là yêu cầu tất yếu trong tình hình hiện nay

Đinh lăng từ lâu đã được ứng dụng trong các bài thuốc cổ truyền với nhiều công dụng khác nhau Được gọi là “nhân sâm của người nghèo” vì có những tác dụng là tăng cường sức dẻo dai, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, giảm mệt mỏi, bổ dưỡng, giúp ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí óc, tăng cân và chống

độc….[4], [12] Loài Đinh lăng răng (Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv

quinquefolia) là một trong những loài cây được trồng phổ biến tại huyện Tiền Hải, tỉnh

Thái Bình, được người dân sử dụng làm cây cảnh và làm thuốc chữa bệnh với công dụng tăng cường sức khỏe, nâng cao sức đề kháng, giảm đau đầu, chống co giật cho trẻ khi ngủ… Tuy nhiên, cho đến nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu về hóa thực vật cũng như hoạt tính sinh học của loài này Một số nghiên cứu về loài này đã được nhóm nghiên

cứu Trường Đại học Dược Hà Nội thực hiện và có một số công bố [5] , [17] Vì vậy với

mong muốn tiếp tục hoàn thiện cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học làm cơ sở cho việc

tiêu chuẩn hóa vị thuốc và tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo, khóa luận “ Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ lá cây đinh lăng răng thu hái tại Thái Bình” được thực hiện với mục tiêu:

Phân lập và xác định cấu trúc 1 -2 hợp chất từ lá cây Đinh lăng răng

Họ Nhân sâm (Araliaceae)

Chi Đinh lăng (Polyscias)

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias)

Cây gỗ nhỏ hay nhỡ có dáng mảnh và có tán lá đẹp, thường xanh, không gai Lá kép lông chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van Bộ nhị 5, bao phấn hình trứng hay thuôn Bầu dưới 2 ô, ít khi 3-4 ô; vòi nhụy 2-4 rời hay hợp ở gốc Quả dẹt, ít khi gần hình cầu Hạt dẹt [1]

1.1.3 Đa dạng và phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias)

Chi Đinh lăng bao gồm khoảng 116 loài, chủ yếu phân bố ở khu vực Madagascar, đặc biệt ở một số đảo ở Thái Bình Dương [1], [20], [26], [49] Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Đinh lăng được trồng ở nhiều nơi để làm cảnh và làm hàng rào, chỉ có vài loài

được sử dụng làm thuốc , được dùng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.)

Harms - đây là loài có nhiều tác dụng dược lí giống Nhân sâm [3]

1.1.4 Thành phần hóa học của chi Đinh lăng (Polyscias)

Chi Polyscias được báo cáo là có 97 hợp chất thuộc các nhóm hợp chất hóa học khác nhau đã được phân lập và xác định cấu trúc từ 12 loài thuộc chi này (P fruticosa,

P scutellaria, P dichroostachya, P nodosa, P fulva, P duplicate, P amplifolia, P serrata, P murrayi, P australiana, P balfouriana và P guilfoylei) Saponin được coi

là thành phần chính được phân lập từ các loài thuộc chi Polyscias [20]

Cấu trúc hóa học các nhóm hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi Polyscias:

Các saponin có aglycon là acid oleanolic [6], [15], [25], [26],[29], [33], [39], [40],

octadecen–1,3,4–triol (62)

Hình 1.1 Các hợp chất được phân lập từ chi Polyscias

1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias)

Đinh lăng đã được nghiên cứu với nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính gây độc

tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, diệt nhuyễn thể, chống hen suyễn, chống viêm, chữa lành vết thương,[20] … Được gọi là “nhân sâm của người nghèo” vì có những tác dụng tương tự Nhân sâm, như tăng cường sức dẻo dai, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, giảm mệt mỏi, bổ dưỡng, giúp ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí óc, tăng cân và chống độc….[4], [12] Một số nghiên cứu cụ thể:

Nước sắc rễ của cây Đinh lăng lá xẻ có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như Nhân sâm [12] Các thí nghiệm trên chuột cho thấy Đinh lăng lá xẻ có tác dụng lợi tiểu, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ siêu cao tần [7], [12] Đinh lăng lá xẻ có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả năng chịu đựng của bộ đội và các vận động viên thể thao, lợi tiểu, trị ho [4], [8]

Alexander L.Eaton và cộng sự (2014) đã công bố nghiên cứu dịch chiết ethanol

của rễ cây Polyscias duplicata có hoạt tính chống lại dòng tế bào ung thư buồng trứng

A2780 ở người (IC50 là 6µg/mL) [27]

Năm 2020 một nghiên cứu về các điều kiện chiết xuất tối ưu với nhóm polyphenol

và flavonoid trong rễ P.fruticosa chỉ ra rằng dịch chiết ethanol 90% của rễ P.fruticosa

với tỉ lệ nguyên liệu : ethanol (1:20g/ml), thời gian chiết 3 giờ, ở nhiệt độ 300C có khả năng thu dọn các gốc tự do DPPH (IC50=96,14µg/mL) và hoạt tính chống oxy hóa ABTS (IC50=38,76µg/mL) [35]

1.2 Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei

1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei

Năm 2019, Lê Hương Giang và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm thực vật của Đinh lăng răng gồm cây gỗ nhỏ, cao khoảng 2-3m, rễ cọc ăn sâu xuống đất, có nhiều rễ phụ Thân gỗ phân nhánh từ gốc; thân già có màu nâu đường kính 4-6 cm, thân non màu xanh đậm, đường kính từ 0,8-1,2 cm, có đốm trắng nhỏ; bề mặt thân có nhiều nốt sần;

có sẹo dạng nhẫn là vết tích của bẹ lá sau khi rụng Lá kép lông chim 2 lần dài 18-36 cm; cuống lá dài 12-20 cm có bẹ lá dài 1,5-2 cm ôm lấy thân, mặt ngoài màu xanh đậm

có nốt sần, mặt trong màu xanh nhạt; ở mấu đầu tiên của lá kép, có 2-5 nhánh Lá chét

22 đến 32; cuống dài 1-3 cm, đường kính 0,2 cm, cuống có cánh rộng khoảng 0,2 cm mỗi bên; phiến lá màu xanh đậm, hai mặt đều nhẵn, hình dạng đa dạng: hình gần tròn, hình gốc lệch, ngọn lá chia 2 thùy hoặc xẻ sâu thành 2-3 thùy đều hoặc không đều nhau, kích thước 2-6 cm × 2-6 cm; gốc lá thường tròn hoặc hơi tù; gân lá hình mạng có 2-5 gân chính xuất phát từ gốc, nổi rõ 2 mặt; mép lá có răng thưa cách nhau 0,5 đến 1

0,1-cm [5]

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Polyscias guilfoylei

Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã công bố nghiên cứu về thành phần hoá học của lá loài

Polyscias guilfoylei gồm các hợp chất sau [16],[36] :

acid 3–O–β–D–

glucuronopyranosyloleanolic (64)

acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(13)–β–

D–glucuronopyranosyloleanolic (65)

glucopyranosyl este (69)

Ashmawy và cộng sự (2019) đã công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa

học của lá Polyscias guilfoylei [19] phân lập được 9 hợp chất, cụ thể là:

kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (79) quercetin 3-O-β-glactopyranosid (80)

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (81)

Lê Hương Giang và cộng sự (2019) đã phân lập được 2 hợp chất từ thân cây

Polyscias guilfoylei [5], bao gồm:

Hình 1.2 Các hợp chất được phân lập từ loài Polyscias guilfoylei

1.2.3 Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei

Reksi và cộng sự (2015) nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol của lá Polyscias

guilfoylei có hoạt tính chống oxy hoá rất có triển vọng [47]

Ashmawy và cộng sự (2018) đã nghiên cứu tinh dầu lá Polyscias guilfoylei cho

thấy hoạt tính gây độc dòng tế bào Caco-2 với IC50 là 70,62 μg/mL [34] Năm 2019,

Rajani và cộng sự đã công bố kết quả hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu lá Polyscias

guilfoylei đối với tế bào ung thư hạch bạch huyết trên cả hai mô hình in vivo và in vitro

[30]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là lá cây Đinh lăng răng thu hái vào tháng 8/2020 tại huyện Tiền Hải - Thái Bình Mẫu được thu hái tại vùng trồng đã được quy hoạch và giám định

mẫu từ tháng 3/2019, được giám định tên khoa học là Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv quinquefolia (Phụ lục 1) Tiêu bản thực vật hiện đang được lưu giữ tại

Phòng tiêu bản cây thuốc - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (Số hiệu HNIP/18547/19) (Phụ lục 2) Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, để ráo, sấy ở 65oC đến

độ ẩm dưới 10%, cho vào túi PE kín để bảo quản tại nơi thực hiện khóa luận (Bộ môn Dược học cổ truyền)

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ

- Hóa chất: Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18

F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), pha đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck) Dung môi công nghiệp n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), n-butanol, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH), ethanol ( EtOH), H2SO4 đặc 98%, HCl đặc 95%, nước cất (H2O)

- Các hóa chất thuốc thử khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam V

2.1.2.2 Phương tiện và máy móc

- Sắc ký cột dùng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 63 - 200 µm (Merck), silica

- Máy đo phổ khối LCMS8045 của Shimadzu, Nhật Bản

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) của hãng Bruker (500MHz), Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, VAST

- Máy cô quay 5 lít và 20 lít của BÜCHI, Thụy Sĩ

- Bể siêu âm WiseClean (Hàn Quốc), máy siêu âm Elmasonic S ( Đức)

- Bếp cách thủy BATHS

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm và 365nm (Pháp)

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa, Thụy Sỹ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn lần lượt là n-hexan, ethyl acetat,

n-butanol, nước của lá cây Đinh lăng răng

- Phân lập một số hợp chất ở phân đoạn n-butanol của lá cây Đinh lăng răng

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn

Phương pháp chiết các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi

- Lá cây được tách riêng, cắt nhỏ, sấy khô và được xay thô, sau đó được chiết bằng dung môi EtOH với trợ giúp của siêu âm 30 phút x 3 lần; cất thu hồi dung môi dưới

áp suất giảm được cao toàn phần, lưu một phần cao toàn phần, sau đó hòa cao vào

nước cất, lần lượt chiết lỏng – lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan; ethyl acetat; n-butanol) Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm các phân đoạn thu được cắn n-hexan (cắn Hexan); cắn ethyl acetat (cắn EtOAc); cắn n-butanol (cắn

BuOH); cắn nước (cắn H2O) (Hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành

phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh

là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh, lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu cần tách Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác

nhau có độ phân cực tăng dần Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha

đảo

Dược liệu

- Chiết với ethanol 96%, 3 lần x 30 phút/ lần

- Thu hồi dung môi

Cao toàn phần

- Phân tán trong nước

- Lắc với n-hexan (3 lần)

- Thu hồi dung môi

Phân đoạn nước

- Thu hồi dung môi

Phân đoạn nước

- Thu hồi dung môi

- Lắc với ethyl acetat (3 lần)

 Chuẩn bị cột: Chọn cột thủy tinh có đường kính thích hợp, chiều dài cột gấp 3

lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập Cột được rửa sạch, tráng

bằng MeOH, để khô tự nhiên Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn lên giá theo phương thẳng đứng

 Nhồi cột: Cân lượng silica gel phù hợp cho vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa

giải, khuấy đều cho đến khi hết bọt Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị Mở

khóa cột, rót tiếp dung môi để dội sạch silica gel dính trên thành cột và để ổn

định Giữ lại một ít dung môi để cột không bị khô trước khi khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột

 Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan với một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan

hoàn toàn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel tối thiểu, loại dung môi đến

khi thu được bột khô và tơi, nghiền bằng chày cối cho mịn

 Nạp mẫu: Xả bớt lượng dung môi còn lại trên cột sau đó đưa từ từ mẫu lên cột tránh vón thành cục và xuất hiện nhiều bọt khí

 Rửa giải: Cho hệ dung môi thích hợp vào cột đã được nạp mẫu Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô

 Thu dịch: hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh, ống nghiệm với thể tích phù hợp Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng để gộp các lọ, ống nghiệm

có cùng sắc kí đồ Loại bỏ dung môi thu được cắn

 Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc kí lớp mỏng và đo HPLC

Các bước tiến hành: Silica gel RP-18

 Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa, đường kính 1cm (2cm), chiều cao 45cm, rửa sạch, tráng bằng MeOH, để khô tự nhiên, cố định trên giá theo phương thẳng đứng, lót bông vào đáy cột

 Nhồi cột: Cân lượng silica gel pha đảo phù hợp cho vào cốc có mỏ, tạo hỗn dịch

với dung môi là MeOH, rót lên cột, mở van cho dung môi chảy xuống, để lắng, tưới thành cột bằng MeOH, để ổn định cột Giữ lại ít dung môi trên cột tránh khô cột

 Trước khi tiến hành nạp mẫu, luyện cột với dung môi rửa giải thích hợp với thể

tích dung môi gấp 2 lần chiều cao silica gel trên cột

 Nạp mẫu: Mẫu được hòa tan vào lượng tối thiểu MeOH (siêu âm), xả hết dung

môi trên cột, đưa mẫu lên cột bằng pipet pasteur (khóa van)

 Rửa giải: Mở van cho chảy xuống hết bề mặt, cho hệ dung môi rửa giải thích hợp

vào cột đã được nạp mẫu Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để

đảm bảo cột không bị khô

 Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh hoặc ống nghiệm với thể tích

phù hợp Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng để gộp các lọ, ống

nghiệm có cùng sắc ký đồ Loại bỏ dung môi thu được cắn

 Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc kí

lớp mỏng và đo HPLC

b) Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Được sử dụng để thăm dò hệ dung môi tách và theo dõi quá trình rửa giải

Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng

sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Quá trình chạy

sắc ký phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong

chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau

Bản mỏng: sắc ký TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thường silica

gel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck)

Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai

bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng được phun dung dịch acid sulfuric 10% trong

EtOH sau đó sấy nóng bản mỏng ở 110 độ C trong khoảng 5 - 10 phút

2.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng

thái, màu sắc, ) và dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn từ lá cây Đinh lăng răng

Lá cây Đinh lăng răng (4,1 kg) được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 650C đến độ ẩm dưới 10%, chia vào 3 bình thủy tinh (dung tích 10 lít) tiến hành ngâm với ethanol 96% (8 lít/bình x 3 lần) ở nhiệt độ thường (24 giờ) Sau đó tiếp tục ngâm ở 450C (24 giờ) Siêu âm 3 lần x 30 phút (khoảng cách mỗi lần siêu âm là 30 phút) rồi được chiết nóng Lọc, gộp dịch lọc, và loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần (1128,54 g) Cao toàn phần được chia làm 3 phần, hòa tan mỗi phần vào 1 lít nước

cất, sau đó mỗi phần chiết lần lượt với dung môi n-hexan (0,5 lít × 3 lần), EtOAc (0,5 lít × 3 lần), và n-butanol (0,5 lít × 3 lần) Tiến hành thu hồi dung môi dưới áp suất giảm theo từng phân đoạn Thu được các cao phân đoạn n-hexan (282,66 g), EtOAc (126,07

g) và n-butanol (150,54 g) (Hình 3.1)

3.2 Phân lập một số hợp chất từ lá cây Đinh lăng răng

Phân đoạn n-butanol (150,54 g) được chạy qua cột sắc ký (11 x 64 cm) pha tĩnh

là silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethan:methanol (50:1, 20:1, 10:1, 5:1,

1:1 v:v), thu được 59 phân đoạn (LB1 – LB59) Phân đoạn LB28 (5,60 g) cho qua cột pha đảo RP-18 (2 x 45 cm), pha động là methanol:nước (1:3, 1:2, 1:1,5, 1:1, 2:1, 3:1, 3,5:1 v:v) cho 148 phân đoạn (LB28-1 – LB28-148), trong đó phân đoạn LB28-132 thu

được hợp chất 1 (ký hiệu LB1.1) (79,5mg) Phân đoạn LB28-85 (0,8 g) được tiếp tục

cho qua cột pha đảo RP-18 (2 x 45 cm), rửa giải với hệ methanol:nước = 1:2 (v:v) thu được 8 phân đoạn (LB28-85-1 – LB28-85-8) Phân đoạn LB28-85-2 (39,2 mg) cho qua cột pha đảo RP-18 (1 x 45 cm), rửa giải với hệ methanol:nước (1:3, 1:2,5, 1:2, 1:1 v:v)

thu được hợp chất 2 (ký hiệu LB2) (26,9 mg) (Hình 3.1)

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập lá Polyscias guilfoylei

Dung môi khai triển CHCl 3 : MeOH : H 2 O = 65:35:10 (v:v:v) (dùng lớp dưới)

A UV 254nm

B Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH

Hình 3.2 Sắc ký đồ của phân đoạn LB28 và hợp chất LB1.1 (132)

Dung môi khai triển Ethyl acetat : Methanol : Acid formic :Nước = 10:1:1:1(v:v:v) Phân đoạn LB28-85-2 kí hiệu T, hợp chất LB2 kí hiệu 97

A UV 254nm

B Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH

Hình 3.3 Sắc ký đồ của phân đoạn LB28-85-2 và hợp chất LB2

3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Hợp chất 1 (ký hiệu: LB1.1) thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng

Dựa trên tín hiệu mảnh ion m/z = 793,60 [M-H]- thu được trong phổ khối ESI-MS và kết hợp với phổ 13C NMR, công thức phân tử của hợp chất LB1.1 được xác định là

C42H66O14 (M = 794) Trên phổ 1H NMR (Bảng 3.1) cho thấy những tín hiệu singlet đặc

trưng của nhóm methyl (CH3) tại δH 0,74 (3H, s, H-25); 0,90 (3H, s, H-24); 0,91 (3H, s, H-29); 0,92 (3H, s, H-26); 0,95 (3H, s, H-30); 1,22 (3H, s, H-23); và 1,25 (3H, s, H-27), gợi ý đây là những tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl thuộc khung triterpen Kết hợp với phổ 13C NMR, thu được 42 tín hiệu với 2 tín hiệu carbon tại δC 122,4 (C-12); 144,6 (C-13) đặc trưng cho nối đôi ở vị trí C12-C13 của khung olean và tín hiệu cộng hưởng tại δC 180,1 (C-28) gợi ý là tín hiệu đặc trưng của nhóm -COOH tại vị trí C-28 Từ dữ liệu phổ thu được dẫn đến kết luận rằng hợp chất là một triterpen thuộc khung oleanan

Sự hiện diện của hai carbon anomer qua hai mũi cộng hưởng ở δC = 106,4 (C-1′) và 105,4 (C-1′′) cùng với 8 carbon loại -CH của phân tử đường cộng hưởng trong vùng

87,1 - 71,3 ppm, cho phép dự đoán LB1.1 là một saponin có gắn hai phân tử đường

Như vậy, LB1 có phần aglycon là acid oleanolic và phần đường gồm có hai phân tử đường (δC = 106,4 và 105,4), đó là đường glucose (δC = 62,2, C-6′′) và đường glucuronat (δC = 172,0, C-6′ (-COOH)) Sự có mặt của 2 phân tử đường còn được xác định qua sự hiện diện của hai proton ở δH = 5,32 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′), 4,94 (1H, d, J = 8,0 Hz,

H-1′) Hai phân tử đường đều có cấu hình β do hằng số ghép của hai proton anomer này

là J = 7,5 và 8,0 Hz Phân tử đường thứ nhất gắn vào aglycon tại C3 (δC = 89,1), phân

tử đường thứ hai gắn vào phân tử đường thứ nhất tại C-3′ (δC = 71,4) Phổ ESI-MS giúp

tái xác định LB1.1 là một saponin với phần aglycon là acid oleanolic, phần đường gồm

có một phân tử glucuronat và một phân tử glucose So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp

chất LB1.1 với những giá trị đã công bố trong tài liệu tham khảo [46] trình bày ở bảng

3.1, dẫn đến kết luận hợp chất LB1.1 được xác định là acid (1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (Hình 3.4)