Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (paphiopedilum concolor) ở thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THU TRANG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN HÀI ĐỐM Paphiopedilum concolor Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor)

Ở THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2020

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor)

Ở THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công ngh sinh h c

Mã s : 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2020

Thái Nguyên - 2020

LỜI CAM ĐOAN

TS

Tác giả

Trần Thị Thu Trang

LỜI CẢM ƠN

Khoa Công ngh sinh h c i h c Khoa h c Thái Nguyên ã t n tình

h ng d n, ch b o tôi trong su t th i gian th c hi n và hoàn thành lu

h c Thái Nguyên, Ban ch nhi m Khoa Công ngh sinh h c

quá trình làm lu

Tôi xin c m ình và b n bè luôn bên c nh ng h , khuy n khích,

ng viên t ng l tôi hoàn thành lu

Trong quá trình làm lu i nh ng sai sót, tôi mong

lu

Tác giả

Trần Thị Thu Trang

MỤC LỤC

L i

L I C ii

M C L C iii

DANH M C B NG vi

DANH M C HÌNH vii

M U 1

t v 1

2 M c tiêu nghiên c u 2

3 N i dung nghiên c u 3

NG QUAN TÀI LI U 4

1.1 Gi i thi u v lan m 4

1.1.1 Phân lo i lan Hài (Paphiopedilum) 4

5

6

u ki 7

8

m th c v t h c c m 12

14

1.2.1 Quy trình nhân gi ng in vitro [20] 14

1.2.2 m 16

1.3 Tình hình nghiên c u lan Hài trên th gi c 17

1.3.1 Trên th gi i 17

1.3.2 Tron c 22

T LI U 27

2.1 ng và v t li u nghiên c u 27

m và th i gian nghiên c u 28

2.3 Hóa ch t và thi t b nghiên c u 28

2.3.1 Hóa ch t 28

2.3.2 Thi t b 28

2.3.3 D ng c 29

u 29

pháp kh trùng ch i non 29

trùng qu m 30

2.4.3 Nghiên c u nh ng c ng t i kh y m m c a h t lan m 30

2.4.4 ch i in vitro 30

2.4.5 Nghiên c u ng c n kh c m 31

2.4.6 cây ra ngoài t nhiên 31

2.4.7 P sóc m i 32

lí s li u 32

T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 33

3.1 Nghiên c trùng m u 33

3.2 Nghiên c u ng c a tu i qu ng t i kh y m m c a h t l m 36

3.3 Nghiên c u ng c a m t s ch n kh nhân nhanh và s ng c a ch m 40

3.3.1 ng c a BAP k t h p v n kh sinh ng c a ch m non sau khi n y m m 40

3.3.2 ng c a n n kh i 44

3.4 Nghiên c u ng c n kh c m 49

3.5 Nghiên c 52

K T LU NGH 55

TÀI LI U THAM KH O 56

PH L C 67

VW: Vacin and Went

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái lan Hài m 13

Hình 2.1: ng và v t li u nghiên c u 29

thí nghi m 31

Hình 3.1: Tái sinh l m b ng t 42

Hình 3.2: ng c a BAP k t h p v ng c a ch i m non sau 50 ngày 47

Hình 3.3: Ch i lan Hài ng b sung BAP các n t 1 4mg/l sau 4 tu n 50

Hình 3.4: Ch ng b sung BAP các n t 1 4mg/l sau 8 tu n nuôi c y 51

Hình 3.5: ng c a NAA t i kh c m 56

Hình 3.6: Cây lan Hài ng và phát tri n nhà i 57

1 Đặt vấn đề

i bi n t r t s m kho ng hoa này c coi là m t trong nh nh cao ti n hóa c a các loài hoa Hi n nay, trên th gi i có kho ng 800 chi và 25.000 - 30.000 loài lan, h Lan (Orchidaceae) chi m v trí th hai sau h Cúc (Asteraceae) trong ngành th c v t

h t kín [30] Vì v y, hình thái, c u t th ng phân lo i c a h này

phong lan Vi ng v s loài, màu s c và ch ng lo i v i trên

các

c h u c a Vi t Nam không có b t k gi i, m i loài ch phân

b m t khu v c r t h p và bi t l p

áp hài V N

ng Anh l

và viên mãn

nhanh chóng

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhân gi ng thành công cây lan H m (

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về lan Hài và lan Hài Đốm

Hài (Paphiopedilum)

Lan Hài là m t nhóm r t khác bi t Chúng d c nh n ra b i hoa

ng v i hoa gi a d ng túi gi c hài (g i là môi hay cánh môi) n m v trí th p nh t c a hoa [3], [10], [18]

s ng vùng B c Á, châu Âu và châu M Nhóm 2 là chi

Chi

loài s ng Mexico, Trung và Nam M t tên và phân lo i chúng vào

có kho ng 6 loài sinh s ng Trung và Nam

ông Chi lan hài

Chi

B

,

- n qu c gia Ba B , khu b o t n Na Hang, H u Liên, Pà C , Phong

o t n loài

1.1.6

[28], [30]

chùm t 1- 3 chi c r a chúng th t nh nhàng thanh khi t ngây ng t lòng khách lãng du

Phân lo i:

B : Phong lan Orchidales

H : Phong lan (Orchidaceae)

Chi:

Tên khác: Hài M Giày, V i m Hài

1 7cm,

và cây

nam

loài cây, t l nhân nhanh kho

n d soma

1.3 Tình hình nghiên cứu lan Hài trên th giới và trong nước

Tuy nhiên t l h t n y m m trong

t nhiên l i r t th p vì h t lan Hài quá nh , không ch a ch t d tr và ch có m t

t , ho c 80,6% trong s t t c các nghiên c u Tuy nhiên, vi c x lý h t

gi ng và t l n y m m c a nhi u loài/cây Paphiopedilum là r t th p

,

(Huang, 1988; Stewart & Button, 1975) [63]

h t gi t 200 ngày tu i t l n y m m c a h t cao nh t trong khi t l

n y m m c a h t sau th ph n 300 ngày là th p nh u này là do sau khi th

l t o ra các kh i mô s o c a lan Hài t n g

protocorm, mô s o, ch i, h ch ng t r ng lan Hài lai d

b ng cách t o ra s c ng sinh c a h thu n l i cho s n y m m c a h t trong nuôi c y mô [26], [32], [34]

K t qu nghiên c u c a Lee (1998), Ding và c ng s (2004) cho th y nh

ng c a s ng thành h t gi n s n y m m ph thu c vào loài S

phôi t s khô h n S hình thành c a m t l p bi u bì trên b m t phôi có th

u ki n v t lý Tuy nhiên l p bi u bì làm gi m t l n y m m c a h t trong

ng nghi m [48], [53] Theo Lee (1998) s n y m m c a loài t

t i th m 150 ngày sau th ph n (68%), t l n y m m gi m m nh khi h t thu

210 ngày sau th ph n do khi này h 150 ngày sau th

bình t các m nh c t lá Trong con lai PH60, 4,52 M 2,4-D c ng v i 0,45 M

y s hình thành ch i tr c ti p t các m nh c t lá Cây con kh e

trong 22 tháng Nh c thích nghi trong nhà kính và phát tri n t t v i t l s ng 100% [35]

Các k t qu nghiên c u v thành ph n mô ng nuôi c n s n y m m

c a h t lan Hài c a Lee và c ng s y có m i quan h gi a

và s phân chia nhân c a th c v c trên VW l

c h p thu b i

sung glucose và cao g p 2 l n so v ng có saccarose [36]

Theo Ng CY và Saleh NM (2011), s nhân gi ng c a

c thông qua s hình thành c a các protocorm th c p (PLB) t

p phát tri n t mô s o có ngu n g c t thân P c nuôi c y trên

c b sung v i các n khác nhau (1,0, 2,0, 3,0 và 4,0

c b sung kinetin 4,0 M, v i trung bình 4,1 PLB trên m i m u sau 8 tu n nuôi c y Các PLB th c p ti p t c sinh sôi n y n a và hình thành 9,5 12,1 PLB m i trên m i PLB th c p sau

th c v c b sung d ch chi t chu i 60 g / L chu i (BH) Nh ng PLB b c ba

c nuôi c ng có ch a các ch t ph gia h

con Trong s các ch t ph gia h c th nghi m, vi c b sung 20% CW

n t l tái sinh cây con trung bình t t nh t t

t 67,9% sau 8 tu n nuôi c y [57]

,

Tuy nhiên,

1] Theo nghiên c u c a Luan VQ và c ng s (2012)

m m c a h t ng thành: v h t không th c do s có m t

h p, phôi bào t c a h u h t các h t ng thành hoàn toàn có v h t có

th không b hóa g , cho phép nó có th th m th c và các ch t dinh

ng, trong khi các h ng thành có th có kh ng và b o

t h t 180 ngày sau th ph n (DAP) là phù h p H t n y m m (72,67%) trên

ng có ch a NAA 0,5 mg/ c d a 10%, than ho t tính 1,0 g/l Môi

5,0 mg/ l và TDZ 1,0 mg/ l

kinetin 5,0 mg/l, BA 2,0 1,0 mg/

var (Rchb F.) Pfitzer t nguyên li u là qu tu i t 150

ng khác nhau, có b sung các ngu n

1: 1: 1: 1) Các cây c c chuy n sang các b u ch a giá th h n h p v i

Pfitzer) b a c a Vi t Nam (2009), tác gi Khu t H u Trung và

v hình thái K t qu phân tích

b ng k thu t RAPD PCR ch ra h s ng di truy n c a các m u Hài

tác b o t n, khai thác và s d ng m t cách có hi u qu các ngu n gen lan Hài

b a c a Vi t Nam [30]

tái sinh ch i t vi c s d ng các h t lan sáu tháng tu c nuôi c y trên môi

loài lan hài quý: Hài H ng c h u Vi t Nam) và Hài c h u

b ng pháp gieo h t trong ng nghi m [8] và k thu t gây v t

ng nghi m Hai loài lan này nhân gi ng r t khó vì h t

nh , dài ch ng 1 2 mm, r ng ch ng 1mm, ch a r t ít và h có ch t

t u ki n cho h t n y m u gieo h t trong môi

t h t r t d b m t mát và khó n y m m T nh ng k t qu c, nhóm nghiên c c qui trình nhân gi ng hai loài lan Hài quý

trên b ieo h t trong ng nghi ng th i h

t bi n pháp b nhân gi ng Hài H ng và

Trong nghiên c u c c Lu n và c ng s (2014) v lan Hài H ng

sung BA 0,5 mg/l; NAA 0,5 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 9,0 g/l; than ho t tính

h p di p l c t ng c n thi t cho cây K t qu cho th y các ch i

c kéo dài trung bình 10,5 cm, v i s lá m i hình thành trung bình 5

u ki n chi u sáng 60 ngày, các ch i non ti p

t c hình thành lá m i tuy nhiên không nh n th y có s t Sau 180 ngày nuôi c y các ch c c t riêng bi t v i 1 lá và 1 r , riêng ph nh

4 cm, có t 3 4 lá, 4 5 r [5]

Vi t Nam, nhóm tác gi Averyanov, Phillip Cribb, Phan K L c và Nguy n Ti n Hi p (2004) ng nghiên v m t th c v t h i v i lan Hài Vi t Nam thông qua nh ng chuy n kh o sát th c t Trong cu

1,0 mg/l, cho kho ng 2,85 ch i/m ng thích h p nh tái sinh và nhân ch i Ngoài ra, k t qu ra r ng NAA 0,5 mg/l và THT 1,0 g/l cho

kh o r t t nh t (88,89%) [28]

[43]

2.1 Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu

Khoa h c Thái Nguyên

- V t li u nghiên c u: V t li u cho nhân gi ng g m hai lo i là: (1)

Ch i non kho ng 2 tháng tu i m i tái sinh t r cây lan Hài m; (2) Qu lan

C

Hình 2.1 ng và v t li u nghiên c u

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- m: Thí nghi c ti n hành t i phòng Nuôi c y mô t bào th c

v t, Khoa Công ngh sinh h c i h c Khoa h c i h c Thái Nguyên

n, gi y th m, bình nuôi c y, túi nilon

2.4 Phương pháp nghiên cứu

m i l n kh trùng r a l i m u b c c t kh trùng nhi u l n Sau khi kh

iá hi u qu kh trùng và kh ng

m ng và phát tri n c a m u

2.4

phát tri n c a qu Qu s c thu hái t n 200 ngày sau th ph n

ngâm trong xà phòng loãng kho ng 5 phút, ti p theo r a s ch xà phòng và tráng

m u b c c t, mang vào box c kh trùng b ng HgCl2 0,1% trong 15

than ho t tính 1 g/l, agar 7 g/l, c d a 150 ml/l có b sung các ch t kích thích

- Nghiên c u ng c a BAP k t h p v i NAA t i kh

nhanh ch i B sung BAP v i n 1,0; 2,0 mg/l k t h p v i b sung NAA các n : 0; 0,25; 0,5; 1,0 mg/l vào m ng MS n n b sung sucrose 30 g/l, than ho t tính 1 g/l, agar 7 g/l, c d a 150 ml/l

Các ch tiêu theo dõi trong các thí nghi m này bao g m h s nhân (s

ch i/m u), s lá/ch dài lá, chi u cao ch i (cm), s r , ch ng ch i

2.4.5 N

agar 7 g/l, và b sung ch t kích ng NAA v i n 0; 0,25;

Ch tiêu theo dõi: T l ch i ra r , s r /ch i, s lá, chi u cao cây, ch ng r

u ki n ánh sáng và nhi t nhiên, không cho ánh sáng chi u tr c ti p vào bình nuôi c y Th i gian này kéo dài kho ng 10 ngày,

c m n c vào ngâm 15 phút, l c nh

th ch r i ra kh i r , dùng panh g p nh các cây ra kh i bình d p nát

b nh phát tri n ho c côn trùng t cây ch râm mát r

tr ng vào giá th

c a lan Hài, chúng tôi ti n hành nghiên c u trên trên các lo i giá th khác nhau

Lan Hài sau khi c tr ng vào các ch t nung ho c ch u nh a có ch a

th i ti t mát m i 2 l n/ ngày vào bu i sáng và chi u mát vào nh ng ngày

1,8DD theo cách luân phiên ho c ph i h p 2 tu n m t l n

máy tính b ng ph n m m Microsoft Excel và trình ng d ng Statgraphics centurion XVI S li u trong các b ng s li u ph n k t qu nghiên c u là giá tr trung bình ( l ch chu n ( ) Các giá tr trung bình theo sau b i các ch

t c t bi u th s sai khác có ý

ng kê theo phép ki nh Duncan v i p < 0,05

Range Test

3.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu

khu n và nhi m n m c a các m u có ngu n g c t và s phát tri n kém

nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nh n th y có nhi u nh t ch t hóa h c

có ho t tính di t n m và vi khu n m Calcium hypochlorid Ca(OCl)2

2), hydroxid (H2O2), Tuy nhiên HgCl2 c nhi u nhà nghiên c u s d ng b i chúng có ho t tính kh trùng t t, cho t l m u

Tỷ lệ mẫu

ch t (%)

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sạch (%)

MS có ch a kháng sinh là carbenicillin ho c cefotaxime v i n 100-500

Liao et al (2011) báo cáo r ng nh ng lát c t ngang c a các gi ng

nh và tái sinh [51]

Bảng 3.2 Hi u qu c a ch kh i v i qu l m sau 4 tu n

Ch độ

Thời gian khử trùng bằng HgCl 2

0,1% (phút)

Hơ trên ngọn lửa đèn cồn

Tỷ lệ mẫu sạch (%)

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Khả năng nảy mầm

m

M i trường

Tuổi quả (ngày)

Thời gian hạt nảy mầm (ngày)

Tỷ lệ hạt nảy mầm (%)

Tỷ lệ hạt không nảy mầm (%)

Theo Rittirat và c ng s (2017), m t quy trình tái sinh cây c

nh m kích thích s phân chia t bào và phân hóa ch i t mô s o ho c t

auxin/cytokinin r t quan tr i v i s phát sinh hình thái trong các h th ng nuôi

c i v i s phát sinh phôi, s t o mô s o và r c n có t l auxin/cytokinin cao, trong khi ng h c l i s d n s sinh s n ch i và ch i nách [9]

l n sau 12 tu n nuôi c ng có b sung BA và NAA [40]

khác bi t nhau rõ r t so v i môi tr i ch ng (CT1) lên s ng c a ch i

m

i ch ng (CT1) không b sung BAP và NAA cho k t qu s

ch i/ m u t 1,0; s lá/ch t 1,8, dài lá 0,76 cm, chi u cao ch t 0,25cm, cây nh lá bé và vàng nh t

s lá t 2,0 lá/ch i, chi u dài lá t 0,93cm và chi u cao ch i t 0,39 cm, cây

v n i nh , lá bé, màu xanh nh t và vài cây lá b tr ng ng CT3,

ng t t S ch i/m t là 1,4 ch i/m u, s t 2,33 lá/ch i,

t 1,15cm, chi u cao ch i t là 0,61cm, p 2,44 l n so v i môi

i ch ng tuy nhiên lá có màu xanh nh t

BAP lên 2 mg/l (CT4 và CT5) k t h p v i NAA t 0,25

Môi

trườn

g

Số chồi/mẫu

Số lá/chồi (cái) Dài lá (cm)

Chiều cao chồi cm)

Đặc điểm chồi

h p s cho hi u qu nhân nhanh ch ng ch i t t nh t

T có th k t lu n, ng 5 b sung BAP 2,0 mg/l; NAA 0,5 mg/l phù h p cho nhân ch i v i s ch i/m u là1,25; chi u cao ch t 0,85 cm; s lá

là 3,5; dài lá là 1,35 cm, s ng c a ch m b o, ch ng ch i t t

A B

m non sau 50 ngày

ng NC1, b sung BAP 1 mg/l, sau 4 tu n n 8 tu n nuôi c y

v n không có s tái sinh ch i m i, ch i/m u i, h s nhân ch i là

BAP lên 2 mg/l, sau 4 tu n nuôi c y i, s ch i/m u t 1,33 sau 4

n 8 tu n Ch ng ch i khá, c ng t t, lá xanh

t 1,5 và ti p t lên s n 12 tu n, h s nhân ch i t 1,75 Ch t

có th b t m u) ng có s t i

n 8 tu n nuôi c y v n không có s i, h s nhân ch i 1,00 Cây

không có tác d ng kích thích tái sinh ch i l m

không b sung BAP cho ch ng ch i kém nh ng NC3 cho ch t

Phân tích th ng kê các ch c sau 4 tu n và 8 tu n cho th y, 4

tu n các ch ch i/m u và s lá/ch i gi a các công th c nghiên c u có

Dài lá (cm) số rễ (cái)

Sau 8

tu n

1,0 ± 0,0 a 3,0 ± 1,0 a 0,9 ± 0,26a 0,67±0,58aNC2 2,0 1,33±0,58ab 3,33 ±0,58a 1,33±0,59a 1,5±0,71ab