Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây dương đồng (adinandra sp)

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thí nghiệm Khoa Sinh học - Trường

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHAN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO CÂY DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra sp.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thu Ngà

Thái Nguyên, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020

Tác giả luận văn

Phan Thị Mai

XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

TS Nguyễn Thị Thu Ngà

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

TS Nguyễn Thị Thu Ngà, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thí nghiệm Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020

Tác giả luận văn

Phan Thị Mai

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học 4

1.1.3 Giá trị dược liệu của chi Dương đồng 4

1.2 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật 5

1.2.1 Một số thành tựu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật 7

1.2.2 Một số thành tựu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại các loài thuộc họ Chè (Theaceae) 9

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

1.3.2 Một số thành tựu trong nuôi cấy in vitro 11

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 18

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 20

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21

2.2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Nghiên cứu định danh mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng DNA barcode 26

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 26

3.2.2 Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen sử dụng cặp mồi ITS2 và ITS4 26

3.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro mẫu cây thuộc chi Dương đồng 30

3.2.1 Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch 30

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng 36

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng 43

3.2.4 Nghiên cứu khả năng tạo rễ cây Dương đồng 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

1 Kết luận 51

2 Kiến nghị 51

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam 3

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm định danh loài 19

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 19

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân cặp mồi ITS2 và ITS4 21

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 21

Bảng 3.1 Danh sách các vùng gen ITS sử dụng trong nghiên cứu với mẫu cây Dương đồng 29

Bảng 3.2 Kết quả tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn thân mang chồi nách 31

Bảng 3.3 Kết quả tạo nguồn vật liệu ban đầu từ hạt cây Dương đồng 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng 37

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng 39

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BAP và nước dừa đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng 42

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của GA3 đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng 44

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Dương đồng 46

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ cây Dương đồng 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh vùng gen ITS 7

Hình 1.2 Cặp mồi ITS2 và ITS4 sử dụng để khuếch đại khu vực ITS 7

Hình 2.1 Thân, quả và hạt cây Dương đồng thu thập tại Lào Cai 18

Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số 26

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR vùng gen ITS 26

Hình 3.3 Trình tự nucleotide của vùng gen sử dụng mồi ITS2 phân lập từ mẫu cây Dương đồng thu thập tại tỉnh Lào Cai 27

Hình 3.4 Trình tự nucleotide của vùng gen sử dụng mồi ITS4 phân lập từ mẫu cây Dương đồng thu thập tại tỉnh Lào Cai 27

Hình 3.5 Kết quả BLAST trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS2 28

Hình 3.6 Kết quả BLAST trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS4 28

Hình 3.7 Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền một số loài thuộc chi Adinandra dựa trên trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS2 29

Hình 3.8 Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền một số loài thuộc chi Adinandra dựa trên trình tự vùng gen sử dụng mồi ITS4 30

Hình 3.9 Đoạn thân mang chồi nách khử trùng bằng Javen 60% 32

Hình 3.10 Hạt cây Dương đồng khử trùng 35

Hình 3.11 Cây Dương đồng trên môi trường BAP 38

Hình 3.12 Cây Dương đồng trong môi trường nước dừa 40

Hình 3.13 Cây Dương đồng trong môi trường BAP và nước dừa 41

Hình 3.14 Cây Dương đồng trên môi trường GA3 45

Hình 3.15 Cây Dương đồng ở môi trường IBA 47

Hình 3.16 Cây Dương đồng trên môi trường IAA 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APG II An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the

ordors and families of flowering plants (Hệ thống phân loại thực vật) BAP 6-Benzyl Amino Purin

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Etylen diamin tetraxetic Acid

IAA Indoly Acetic Acid

IBA Indoly Butyric Acid

ITS Internal transcribed space (Vùng gen ITS)

MS Murashige - Skoog (1962)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Chi Dương đồng (Adinandra) thuộc họ chè (Theaceae), gồm một số loài khác nhau như: Adinandra annamensis Gagnep (Dương đồng, Súm đỏ, Xúm, Hồng đạm trung bộ), Adinandra bockiana Pritz ex Diels (Dương đồng bốc, Hồng đạm tam đảo),

Adinandra var acutifolia (Hand.-Mazz.) Kobuski (Dương đồng bốc lá nhọn, Hồng

đạm lá nhọn), Adinandra caudata Gagnep (Dương đồng đuôi, Sum đuôi, Sô lô, Ko sa num, Hồng đạm đuôi) và Adinandra glischroloma Hand.-Mazz var hirta (Gagnep.)

Kobuski (Sum lông, Hồng đạm lông)

Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm, phân bố

hẹp ở một số tỉnh như Lào Cai, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Hà Giang, Lâm Đồng Các hợp

chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng để chữa bệnh như giảm huyết

áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau Ngoài ra, các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học Nhờ các hợp chất có

trong cây mà từ xưa y học cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra làm thuốc điều trị bệnh ung thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn, Cây Sum millett (A millettii) được sử dụng điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A integerrima được dùng để trị bong gân, rắn cắn Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A Hainanensis (A

rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng [4] Loài Adinandra glischroloma đã được xác định có ở một số tỉnh thuộc Trung Quốc và Việt

Nam Loài này đã được đưa vào sách đỏ ở mức độ bị đe dọa cấp T và cần được bảo vệ

Loài Adinandra megaphylla Hu cũng được đưa vào sách đỏ Việt Nam ở mức độ sẽ

nguy cấp (VU) và cần được bảo vệ [1]

Với những giá trị về dược liệu đáng quý của các loài thuộc chi Dương đồng thì việc bảo tồn và phát triển để tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào nhằm phục vụ việc khai thác dược liệu quý là vấn đề rất cần thiết Việc bảo tồn các giống cây dược liệu nói chung và các loài thuộc chi Dương đồng nói riêng có thể thực hiện bằng nhiều biện pháp truyền thống như chiết cành, ghép cành và gieo hạt Tuy nhiên hiệu quả đạt được chưa cao, khó khăn trong chọn cành chiết - ghép, tỉ lệ hạt nảy mầm yếu… Thực trạng trên đang đặt ra những vấn đề cần giải quyết

Với sự phát triển trong lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nhân

giống in vitro cho phép tạo ra lượng cây con lớn trong thời gian ngắn Việc sử dụng kỹ

thuật nuôi cấy mô đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nhân giống nhằm bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý Tuy nhiên, hiện nay các công trình về nuôi cấy

in vitro đối với các loài thuộc họ Chè nói chung cũng như chi Dương đồng nói riêng

còn hạn chế

Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại thực vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như là nhiều loài thực vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau) Ngược lại nhiều loài thực vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Gần đây, nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép các nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài Từ đó có thể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ Vì vậy, chúng

tôi lựa chọn sử dụng chỉ thị phân tử DNA để định danh loài trước khi nuôi cấy in vitro

Do ở Việt Nam, các loài thực vật thuộc chi Dương đồng có sự phân bố hẹp, hình thái có nhiều điểm tương tự nên việc tiến hành định danh loài thực vật trước khi sử dụng nuôi

cấy in vitro để xác định mẫu nghiên cứu có thuộc chi Dương đồng hay không

Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nuôi

cấy in vitro cây Dương đồng (Adinandra sp.)” nhằm bảo tồn và phát triển nguồn thực

vật mang gen quý

2 Mục tiêu nghiên cứu

Định danh được mẫu nghiên cứu bằng DNA barcode và xác định được môi trường

nuôi cấy in vitro phù hợp với mẫu cây thuộc chi Dương đồng (Adinandra)

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu định danh mẫu bằng DNA barcode

- Nghiên cứu tạo vật liệu sạch phục vụ nuôi cấy in vitro

- Nghiên cứu môi trường tạo đa chồi ở mẫu cấy

- Nghiên cứu môi trường tạo rễ cây trong ống nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra)

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Chi Dương đồng (Adinandra) thuộc họ Chè (Theaceae), bộ Theales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [44]

Các loài thuộc chi Adinandra thường là cây bụi hay cây nhỡ, có khoảng 85 loài

phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Srilanka, Banglades và

một số nước Đông Nam Á [43] Ở Việt Nam, chi Adinandra đã được tìm thấy có 13

loài, phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon

Tum, Lâm Đồng và Gia Lai (Bảng 1.1) [8] Loài Sum Liên Adinandra lienii là loài bản địa được tìm thấy năm 1986 nhưng mới được công nhận vào năm 2012 Loài Sum Hòn Giao Adinandra hongiaoensis mới được phát hiện ở Hòn Giao Lâm Đồng năm 2014 [30]

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam [8]

1 Adinandra annaenzymesis Sum đỏ Quảng Trị

2 Adinandra caudta Sum đuôi Bạch Mã

3 Adinandra donnaiensis Sum đồng nai Đồng Nai

4 Adinandra glischochroma Sum lông Sapa

5 Adinandra hainanensis Sum Hải Nam Hải Ninh

6 Adinandra integerrima Sum nguyên Miền Trung

7 Adinandra microcarpa Sum trái nhỏ Hòn Bà

8 Adinandra millettii Sum millett Sapa, Tam Đảo

9 Adinandra petelotii Sum petelot Sapa

10 Adinandra poilanei Sum poilan Lâm Đồng

11 Adinandra rubropunctata Sum điểm đỏ Tiên Yên, Quảng Trị

12 Adinandra lienii Sum Liên Lào Cai

13 Adinandra hongiaoensis Sum Hòn Giao Lâm Đồng

Các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm, phân bố hẹp ở một số tỉnh Việt

Nam như Lào Cai, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Hà Giang, Lâm Đồng Hiện nay, một số loài

thuộc chi Dương đồng gồm Adinandra bockiana Pritz ex Diels (được thu ở Tam Đảo),

Adinandra glischroloma Hand.-Mazz var hirta (Gagnep.) Kobuski và Adinandra megaphylla Hu (được thu tại Lào Cai), Adinandra lienii N H Hien & Yakovl (được

thu tại Hà Giang), Adinandra microcarpa A Chev ex Gagnep (được thu tại Khánh

Hoa mọc đơn độc ở nách lá, lưỡng tính, mẫu 5 Cánh hoa không có lông hay chỉ

có lông ở mặt ngoài Nhị nhiều, tới 25 Bao phấn có lông ngắn hay dài và có mũi nhọn Bầu trên, không lông hay có lông mềm; noãn nhiều

Quả khô không tự mở, hạt nhiều, nhỏ [44]

1.1.3 Giá trị dược liệu của chi Dương đồng

Các hợp chất có trong các loài cây thuộc chi Dương đồng có nhiều tác dụng để

chữa bệnh như giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau

Đặc biệt, flavonoid đã được tìm thấy trong lá của loài Adinandra nitida, có hoạt

tính chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh

Loài A nitida (thuộc chi Dương đồng, họ Chè) đã được nghiên cứu các tác dụng

sinh học khác nhau như chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển (ACE giảm huyết áp)

và chống ung thư [31], [33], [34], [35]

Năm 2010, Liu và cs đã thử tác dụng chống oxy hóa, tác dụng ức chế enzyme chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất chính camellianin A, camellianin B và apigenin Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất flavonoid kém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH trong phép thử DPPH và Rancimat (khoảng 100 lần) Kết quả cho thấy tác dụng

chống oxy hóa của lá cây A nitida có thể phụ thuộc vào các thành phần hóa học khác

[35]

Đối với tác dụng giảm huyết áp, ức chế enzyme chuyển (angiotensin converting enzyme ACE) các hợp chất flavonoid camellianin A, camellianin B và apigenin có tác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH Hoạt tính ức chế enzyme chuyển của dịch chiết EtOH

có lẽ phụ thuộc nhiều vào các hợp chất flavonoid [35]

Do lá cây A nitida được sử dụng để làm chè uống với tác dụng chống ung thư, hợp chất chính là camellianin A Trong nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng

mật độ tế bào ở giai đoạn G0/G1 Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giai đoạn đầu của quá trình chết tế bào được phát hiện Như vậy, camellianin A không chỉ ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩy các tế bào đi vào chu trình chết tế bào (apotosis) [33]

Nghiên cứu của Chen Y và cs (2015) khi so sánh thành phần phenolic của 4 loài

thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A nitida, A glischroloma var jubata, A

millettii, A latifolia về tác dụng chống oxy hóa và khả năng chống ung thư của 4

loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 cho thấy: Hàm lượng các hợp

chất phenolic trong A nitida cao nhất Loài A latifolia có hàm lượng phenolic ít nhất Tương tự, thành phần flavonoid có trong loài A nitida là cao nhất Loài A

latifolia có hàm lượng flavonoid ít nhất Do vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra

nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A nitida và A

millettii có tác dụng tốt hơn so với loài A jubata và A latifolia Dịch chiết của các

loài Adinandra có các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư [31]

Thành phần hợp chất flavonoid của loài A nitida có chứa camellianin A, camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài A milettii

chưa được phát hiện [31]

Ngoài ra, các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y học cổ truyền đã

sử dụng các loài thuộc chi Adinandra làm thuốc điều trị bệnh ung thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn, Cây Sum millett (A millettii) được sử dụng điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A integerrima được dùng để trị bong gân, rắn cắn Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A Hainanensis (A rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm,

ung thư vòm họng [4]

1.2 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật

Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại thực vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như là nhiều loài thực vật có hình thái rất

giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau) Ngược lại nhiều loài thực vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Mặt khác, phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái như là những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất, ở các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì không thể xác định được bằng chỉ thị hình thái Gần đây, nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung

và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép các nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài Từ đó có thể định danh được sinh vật

và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ Việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA sẽ nhanh chóng xác định được

sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật Trong đó, mã vạch DNA được xem như là một công cụ

để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài [41]

Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau

Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có chức

năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã Cấu trúc

vùng ITS gồm ITS1-5,8S-ITS2 Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS

bị cắt và nhanh chóng phân hủy Lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5,8S Vùng 5,8S khá bảo thủ, trên

thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành Do đó các locus

5,8S có thể phục vụ như là một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận diện Tiện ích của vùng bảo thủ như 5,8S tạo thuận

lợi cho việc so sánh cơ sở dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [39]

Hình 1.1 Hình ảnh vùng gen ITS

Hình 1.2 Cặp mồi ITS2 và ITS4 sử dụng để khuếch đại khu vực ITS

Nhận thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch DNA, ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầu tiếp cận

và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật, ) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

1.2.1 Một số thành tựu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật

Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triển khai ở một số cơ sở nghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trung trên một số đối tượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về mã vạch DNA Một số đề tài đã và đang được triển khai tại các Viện nghiên cứu và trường Đại học trong cả nước

Năm 2011, Dương Văn Tăng và cs đã sử dụng kỹ thuật DNA nghiên cứu và chỉ ra

rằng: “Một vùng trình tự đầy đủ ITS thuộc hệ gen nhân của ba loài gỗ quý: Trắc (D

cochinchinensis), Cẩm lai (D oliveri) và Sưa (D tonkinensis) ở Việt Nam đã được xác

định và bổ sung cho Ngân hàng trình tự DNA gen quốc tế Phân tích quan hệ di truyền

sử dụng trình tự ITS cho thấy D tonkinensis có họ hàng gần nhất với D sisso và nằm trong một nhóm lớn với các loài D frutescens, D decipularis, D brasiliensis và D

congestiflora Loài D cochinchinensis họ hàng gần nhất với D oliveri” [21]

Hoàng Đăng Hiếu và cs (2012), đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong

phân tích đa dạng và định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh,

kết quả nghiên cứu đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của 18 mẫu Dó Bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh; đã nhân

bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phương pháp

PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu Dó Bầu [6]

Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di

truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng

kỹ thuật DNA mã vạch, kết quả nghiên cứu đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS

và matK và phân tích được sự đa hình trên mỗi vùng gen [18]

Năm 2013, Trần Thu Hoa và cs đã tiến hành “Khảo sát đặc tính dược liệu và bước

đầu định danh bằng trình tự gen ITS và matK cho một mẫu Ngải mới tìm thấy ở vùng núi Cấm - An Giang” nhằm hướng đến ứng dụng trong việc điều chế các thuốc chữa

bệnh, nhóm nghiên cứu đã thu thập được hơn 20 mẫu cây họ Gừng có tên bắt đầu bằng chữ “Ngải” tại vùng núi Cấm Đặc điểm chung của các mẫu này là hình thái của chúng khá giống nhau Trong đó, loài “Ngải sậy củ lớn” (tên phổ thông thường gọi ở vùng núi Cấm, Tịnh Biên, An Giang) đã được chứng minh là cây thuốc có tiềm năng trị ung thư Nhóm nghiên cứu đã xây dựng cây phát sinh loài [7]

Hà Văn Huân (2014) đã lựa chọn gen matK để làm mã vạch phục vụ cho các nghiên

cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam Trên cơ sở các thông tin của gen

matK đã công bố, một cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế để nhân dòng gen matK từ

DNA tổng số của 3 mẫu Sến mật trồng tại Thanh Hóa (S1, S2 và S3) Kết quả nghiên

cứu đã chỉ ra rằng: Trình tự nucleotit của gen matK phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 dài

1521 nucleotit, trong đó, trình tự nucleotit của gen matK ở mẫu S1 và S3 giống nhau

100%, trình tự nucleotit của mẫu S2 có sai khác với hai mẫu S1 và S3 duy nhất 1

nucleotit ở vị trí 877 (C được thay thế bằng G) Trình tự nucleotit của gen matK phân

lập từ mẫu S1, S2 và S3 (được ký hiệu là Senthanhh) có sự tương đồng đến 98,43% so

với trình tự nucleotit của gen matK ở cây Sến lá to (Madhuca macrophyll) đã công bố

trên GenBank (mã số: DQ924091.1) [10]

Lê Thanh Hương và cs (2017) đã nghiên cứu “Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định

loại loài một số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm (Panax L.)” Trong nghiên cứu này, 5 mã

vạch phân tử tiềm năng là 18S, ITS, matK, psbA - trnH và rbcL được sử dụng để đánh

giá khả năng phân biệt loài của 11 mẫu sâm nghiên cứu Phân tích so sánh các trình tự

nhận được với 41 trình tự của 9 loài thuộc chi Nhân sâm (Panax L.) đã được công bố

trên Ngân hàng Gen quốc tế cho thấy vùng 18S có độ tương đồng giữa các cặp trình tự

cao nhất, trình tự của các loài tương đồng trung bình đạt 99,87 % Tiếp đến là vùng rbcL,

matK và psbA - trnH với tỷ lệ tương đồng trung bình lần lượt là 99,27 %, 98,66 % và

96,82 % Mức độ đa hình thể hiện rõ trên vùng ITS với tỷ lệ tương đồng trung bình thấp

nhất, chỉ đạt 96,50 % Các biểu đồ hình cây về mối quan hệ phát sinh loài cho thấy có 4

trong 11 mẫu sâm là Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và 3 mẫu là Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) [13]

1.2.2 Một số thành tựu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại các loài thuộc

họ Chè (Theaceae)

Năm 2015, Hà Văn Huân và cs đã tiến hành “Xác định đoạn mã vạch DNA cho Trà

hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) loài cây đặc hữu của Việt Nam” Nghiên

cứu đã nhân bản thành công đoạn gen matK từ nguồn DNA tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR Đã xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen matK của

các mẫu sản phẩm PCR có kích thước 951 bp Kết quả so sánh cho thấy trình tự

nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng Tam Đảo so với ở cây Trà vàng lá

dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng petêlô

(Camellia petelotii) thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613 [11] Theo nghiên cứu “Xác định các đoạn mã vạch DNA (DNA Barcode) cho loài Hải

đường vàng (Camellia tienii Ninh): phục vụ giám định loài” của tác giả Hoàng Minh

Trang và cs (2016) đã tiến hành phân lập và xác định trình tự nucleotit của năm đoạn

DNA mã vạch là matK, rbcL, trnH-psbA, ITS và ITS2 Đã nhân bản thành công các

đoạn trình tự quan tâm từ DNA tổng số của loài Hải đường vàng bằng kỹ thuật PCR Kết quả xác định trình tự nucleotit của các đoạn DNA nhân bản được, sau khi xử lý,

phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng thu được kết quả như sau: đoạn gen matK

có chiều dài 951 nucleotit, đoạn rbcL có chiều dài 599 nucleotit, đoạn trnH-psbA là

502 nucleotit, đoạn ITS2 là 397 nucleotit và đoạn ITS có chiều dài 900 nucleotit So

sánh trình tự nucleotit của các đoạn trên với các trình tự nucleotit tương ứng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI, chọn trình tự của loài có độ tương đồng cao nhất như sau:

đoạn gen matK có độ tương đồng 100% so với loài Trà hoa vàng tam đảo (Camellia

tamdaoensis), đoạn rbcL tương đồng 99,83% so với loài Camellia sinensis, đoạn psbA tương đồng 99% so với loài Camellia oleifera, đoạn ITS2 tương đồng 99,11% so

trnH-với loài Camellia parvimuricata, đoạn ITS tương đồng 97,96% so trnH-với loài Camellia

acuticalyx [25]

Năm 2019, tác giả Nguyễn Hữu Quân và cs đã nghiên cứu “Sử dụng mã vạch DNA

matK để định danh mẫu Sum liên thu tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam” Nghiên cứu đã phân lập

được đoạn gen matK từ mẫu Sum liên với kích thước là 867 nucleotide Dựa trên trình tự

đoạn gen matK bằng BLAST trong NCBI đã chứng minh được mẫu Sum liên thu tại tỉnh

Lào Cai, Việt Nam là loài Adinandra lienii thuộc chi Adinandra Đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại dựa trên phần mềm MegAlign trên khung đọc gen matK xác định được mối quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Adinandra [20]

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn và quản

lý thương mại nguồn tài nguyên Chè nói riêng và sinh vật nói chung ở nước ta

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902 Theo quan niệm sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân

hóa của tế bào Trong đó: Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa

tế bào ngược lại với sự phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa

là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa

Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [3], [16], [28]

1.3.2 Một số thành tựu trong nuôi cấy in vitro

1.3.2.1 Thành tựu trong bảo tồn nguồn gen cây dược liệu

Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đó cây thuốc chiếm một vị trí với vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng Đến nay Việt Nam được ghi nhận có 5117 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm thuốc [26] Nguồn dược liệu nước ta không những đa dạng

về thành phần loài, chủng, giống mà còn đa dạng theo từng vùng sinh thái Tính hiệu quả của các cây thuốc được người dân thực nghiệm và truyền lại qua các bài thuốc dân gian, kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc, đồng bào trên các vùng miền cả nước Với

sự phát triển của tri thức nhân loại, Việt Nam đã và đang tiếp nhận những tri thức, thông tin về ứng dụng cây dược liệu trong lĩnh vực y học hiện đại, không chỉ ở việc duy trì bảo tồn cây dược liệu của Việt Nam mà còn hướng đến phát triển nguồn dược

liệu trong tương lai

Tuy nhiên, cho đến nay do khai thác nhiều năm liên tục, khai thác nhưng lại không chú ý đến bảo vệ tái sinh và nhiều nguyên nhân tác động khác đã làm cho cây thuốc ở Việt Nam suy giảm nghiêm trọng Một số loài cây thuốc vốn hiếm gặp, do bị tìm kiếm

khai thác gay gắt dẫn đến việc có nguy cơ dần biến mất ở Việt Nam Diện tích những vùng trồng cây thuốc truyền thống cũng bị thu hẹp đáng kể Nhiều cây thuốc nam bản địa như Hồng bạch, Hương nhu tía, Đậu ván trắng, Ý dĩ, Ngải máu, Tam thất gừng…, đang có xu hướng bị lãng quên Nhiều giống và loài cây thuốc nhập nội đã từng đưa vào sản xuất đại trà ở nước ta đã và đang bị mất giống dần Do nguồn nguyên liệu dược chủ yếu dựa vào khai thác tự nhiên nên cho đến nay phần lớn nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng và dược liệu cho y học cổ truyền của nước ta dựa

vào nguồn nhập khẩu [22]

Phương pháp nhân giống in vitro là phương pháp nhân giống hiện đại đáp ứng được

yêu cầu cấp thiết tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát

triển và năng suất cao Đã có những triển khai nghiên cứu bảo tồn in vitro 15 loài, tập trung vào loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng, các loài có giá trị kinh tế như Ba kích (Morinda

offcinalis), Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl), Đinh lăng (Polyscias fruticosa), Vân

mộc hương (Saussurea lappa C.B Clarke), Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora), Xuyên khung (Ligusticum wallichii franch), Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), Bách hợp (Ligusticum F.E.Br ex Miellez),… Các nghiên cứu tập trung hoàn thiện quy trình bảo tồn

in vitro, xác định môi trường nhân nhanh làm tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu và

sản xuất giống có năng suất chất lượng cao [22]

Nghiên cứu nhân giống Ba kích tím (Anoectochilus setaceus Blume) bằng phương pháp in vitro Ba kích có vị cay, ngọt, tính ấm Tác dụng của cây ba kích bổ thận, tráng

dương cường gân cốt, khử phong thấp,… Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt với bệnh nhân tuổi già, suy nhược cơ thể, mệt mỏi, ăn ngủ kém Ngoài ra còn có tác dụng giảm các triệu chứng đau khớp của các bệnh nhân đau khớp Trong Đông y, Ba kích còn là cây thuốc nam trị yếu sinh lý hiệu quả, tính ấm, vị hơi cay Nó có tác dụng ôn thận, mạnh gân cốt, trợ dương, trừ phong thấp Theo như các y gia xưa thường dùng rượu

Ba kích thay cho thuốc trị bệnh yếu sinh lý ở nam giới, chữa di tinh, lưng gối mỏi đau, gân cốt yếu mềm Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống Ba Kích tím tạo ra số lượng cây giống sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, giữ được đặc tính ưu việt của cây mẹ và đặc biệt hệ số nhân lớn đáp ứng được

nhu cầu sản xuất đại trà trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc như: Thái Nguyên,

Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Cao Bằng,… [45]

Hà thủ ô được biết đến như một loại bổ phẩm trường sinh, nhóm các loại thảo dược cung cấp năng lượng và sức mạnh Hà thủ ô đỏ có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm Theo Đông y, ngoài công dụng làm đen tóc, Hà thủ ô đỏ còn có tác dụng bổ máu, an thần, dưỡng can, ích thận, cố tinh, nhuận tràng, chữa sốt rét Nó là vị thuốc bổ gan thận,

bổ máu, chữa đau lưng mỏi gối, uống lâu làm đen râu tóc Theo Tây y, Hà thủ ô đỏ có thể chữa suy nhược thần kinh và các bệnh về thần kinh, bổ tim, giúp sinh huyết dịch, kích thích co bóp ruột, kích thích tiêu hóa, cải thiện dinh dưỡng, có tác dụng kiểu oestrogen và progesteron nhẹ Nó cũng giúp tăng tiết sữa, chống co thắt phế quản, chống viêm Nước sắc Hà thủ ô đỏ 1/100 có thể ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao Còn cồn Hà thủ ô đỏ có thể phòng xơ vữa động mạch, làm giảm cholesterol và triglycerid huyết thanh, ức chế tăng lipid máu Hiện nay, viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp

đã sản xuất ổn định cây giống Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro

và cho xuất vườn với số lượng lớn [46]

Năm 2018, Trần Việt Hà và cs đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống cây Gừng gió (Zingiber zerumbet) thành công Kết quả nghiên cứu cho thấy: sát

khuẩn bề mặt chồi bằng cồn 70o trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 9 phút và nuôi mẫu trên môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,2 mg/l BAP và 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu sạch 76,98%, tái sinh chồi 75,64%, chồi vươn cao, thân và

lá xanh đậm Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường khoáng MS có bổ sung 1,2 mg/l BAP; 0,5 mg/l Kinetin; 0,2 mg/l NAA và 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi 100% với hệ số nhân đạt 4,08 lần/chu kì, sau 5 tuần nuôi cấy Chồi ra rễ 100%, số rễ trung bình 5,7 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 5,05 cm khi nuôi trên môi trường khoáng MS bổ sung 0,2 mg/l NAA và 30 g/l sucrose sau 5 tuần nuôi cấy Cây non hoàn chỉnh, được huấn luyện và chuyển ra trồng trên giá thể 50% đất, 25% trấu hun và 25% bột xơ dừa, cho tỷ lệ sống đạt 95,78% Quy trình vi nhân giống này có thể áp dụng để sản xuất hàng loạt cây giống Gừng gió chất lượng tốt, đáp ứng nguồn giống cho thị

trường [5]

Cây thuốc hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk) được sử dụng

rộng rãi trong dân gian do có chứa nhiều chất khoáng, axit amin và các chất có hoạt tính sinh học nhóm flavonoid, terpenoid, saponnin, điều trị bệnh về tiêu hóa, tuyến tiền liệt, u

xơ, ung thư giai đoạn đầu, xơ gan, ổn định thần kinh, điều hòa huyết áp, phục hồi sức khỏe Năm 2018, Lê Hoài Hương và cs đã thành công trong việc nuôi cấy mô tế bào thực vật

trong nghiên cứu cây hoàn ngọc [12]

Râu hùm tía (Tacca chantrieri André) được biết là cây dược liệu quý, chủ yếu sống

dưới tán rừng ẩm hoặc núi đá vôi, không chỉ có giá trị làm thuốc mà còn có giá trị làm cảnh vì có hoa đẹp Năm 2018, Nguyễn Thị Thơ và cs đã thành công tạo ra số lượng cây giống lớn, chất lượng tốt cung ứng cho nhu cầu trồng và phát triển loài cây dược

liệu quý này bằng phương pháp in vitro [24]

Lê Thị Như Thảo và cs (2018) đã nghiên cứu thành công bước đầu của quy trình nhân

nhanh in vitro Cây Đinh Lăng lá nhỏ (Polyscias Fruticosa L Harms), sử dụng lá đinh lăng

được nuôi cấy phát sinh tạo mô sẹo Mô sẹo được sử dụng làm vật liệu cho nuôi cấy dịch

huyền phù và thu nhận saponin [23]

Năm 2018, Lê Thị Tâm Hồng và cs đã ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

thực vật trong bảo tồn và phát triển cây Xạ Đen (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi )

để phát triển nguồn dược liệu quý [9]

1.3.2.2 Thành tựu trong nuôi cấy in vitro các mẫu cây thuộc họ Chè (Theaceae)

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu in vitro về thực vật họ Chè (Theaceae) nói chung cũng như chi Dương đồng (Adinandra) nói riêng còn hạn chế

Năm 2007, Nguyễn Thanh Mai, Nguyễn Sỹ Tuấn đã nghiên cứu “Ảnh hưởng của

ABA trong môi trường nuôi cấy lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy mẫu lá cây chè (Camellia sinensin L.)” cho thấy: Sự tái sinh chồi bất định thông qua mô sẹo từ mô

lá in vitro được công bố lần đầu tiên ở cây chè Mô sẹo được hình thành trên môi trường

MS có bổ sung các nồng độ khác nhau của BA, IBA Các phát thể chồi bất định phát triển từ mô giai đoạn nuôi cấy kéo dài trong 8 tuần trên môi trường có bổ sung 0,05 mg/l IBA, 2,0 mg/l BA và 1,0 mg/l ABA Các phát thể chồi phát triển từ mô sẹo, chỉ khi ABA được thêm vào môi trường nuôi cấy nhằm gây ức chế và chuyển hóa Các chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường MS3 có bổ sung 3,0 mg/l IBA và 1,0 g/l than hoạt tính và môi trường MS4 có bổ sung 5,0 mg/l IBA và không có agar Sau 4 tuần nuôi cấy, các rễ bất định được hình thành Cây con sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài vườn ươm [17]

Nguyễn Văn Kết và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu “Khảo sát khả năng nhân

giống cây Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro” cho thấy:

Tỷ lệ nảy mầm của hạt Trà my hoa đỏ đạt cao nhất ở độ tuổi 30 ngày Môi trường khoáng thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển các chồi cây Trà my hoa đỏ

in vitro là môi trường WPM có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1 g/l than hoạt

tính Môi trường thích hợp nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi Trà my hoa đỏ in

vitro là môi trường WPM có bổ sung 2 mg/l TDZ Môi trường thích hợp nhất cho

giai đoạn tạo rễ cây Trà my hoa đỏ in vitro là môi trường WPM có bổ sung 5 mg/l

IBA và 0,5 NAA [15]

Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hải Yến, Trần Thị Thu Hương (2014),

nghiên cứu về khả năng tái sinh in vitro của cây chè, cho thấy: Hạt chè tách vỏ trước

khử trùng sẽ cho tỷ lệ nảy mầm kém, ảnh hưởng mạnh tới phôi Hạt chè tách vỏ sau khử trùng cho khả năng nảy mầm cao hơn hạt chè tách vỏ trước khử trùng và không tách vỏ 2,4-D phù hợp hơn NAA trong thí nghiệm tạo mô sẹo từ mẫu thân và lá chè

Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D cao đồng thời kích thước khối mô to

và chắc hơn Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo từ lá cây chè và môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo từ thân cây chè Các đoạn thân không chứa nách và mảnh lá không tái sinh trên môi trường

MS có bổ sung BAP Các nồng độ khác nhau của BAP trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác nhau đến khả năng tái sinh chồi từ thân mầm mang nách lá, môi trường

MS bổ sung 1 mg/l BAP thích hợp cho tái sinh đa chồi [29]

Theo SBC Việt Nam (2015) nghiên cứu về “Nhân giống in vitro cây chè

(Camellia sinensis (L) O Kuntze) từ những mẫu chè khác nhau” Nghiên cứu này đã

được thực hiện để thiết lập một quy trình vi nhân giống thích hợp để nhân giống quy

mô lớn cây chè thông qua nuôi cấy mô từ hạt, chồi đỉnh và các đoạn đốt thân Hạt có lớp vỏ và không có lớp vỏ được cấy vào môi trường MS bổ sung các chất điều chỉnh tăng trưởng khác nhau Việc loại bỏ lớp vỏ hạt cho thấy phản ứng sớm đối với sự hình thành chồi Sự hình thành chồi cao nhất (75%) thu được từ hạt không có lớp vỏ nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản + 1,5 mg/l BAP trong khi chỉ sử dụng mỗi KIN không thấy phản ứng đối với sự hình thành chồi Tuy nhiên, trong trường hợp vi nhân giống từ BT2, BT5, TV23 thông qua chồi đỉnh và các đoạn đốt thân, mẫu cấy

được nuôi cấy trong MS với 30 mg/l BAP và các nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin Trong số các nồng độ thì ở 3,0 mg/l BAP và 0,05 mg/l IAA, (75% chồi đỉnh và 66,67% các đoạn đốt thân ở BT2) phản ứng với sự hình thành chồi cao nhất

Sự kéo dài chồi cũng được quan sát thấy trong cùng một môi trường khi các chồi tái sinh được nuôi cấy thứ cấp trong khoảng 20-30 ngày Chiều dài trung bình cao nhất của chồi/mẫu cấy đối với chồi đỉnh (3,5 cm) và các đoạn đốt thân (3,2 cm) đã đạt được trên môi trường MS bán rắn bổ sung với 3,0 mg/l BAP và 0,05 mg/l IAA Thêm 0,5mg/l GA3 vào môi trường kéo dài chồi có kết quả tối ưu Hơn nữa, 48% hình thành

rễ từ những vi chồi của BT2 được xử lý bằng 300 mg/l IBA sau 30 phút và sau đó chuyển sang chậu đất trồng và giữ cho môi trường tự nhiên Sau khi cây con đã cứng cáp thì được chuyển sang đồng ruộng và tỷ lệ cây con sống sót là 32% [42]

Theo nghiên cứu của Đặng Quang Bích và cs (2017) về quy trình nhân giống của

Trà hoa vàng (Camellia sp.) thu tại Ba Chẽ, Quảng Ninh, đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro cây Trà hoa vàng Vật liệu khử trùng tốt nhất là quả chưa tách

vỏ Công thức khử trùng tốt nhất là sử dụng dung dịch NaClO 7% trong thời gian 30 phút cho tỷ lệ sống đạt 100% Hạt được tách ra từ quả Trà hoa vàng đã khử trùng được cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA và 3 mg/l GA3 là phù hợp cho sự nảy mầm, tạo nguồn vật liệu ban đầu Môi trường MS có bổ sung 5 mg/l BA, 1 mg/l GA3, 300 ml/l nước dừa, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar là môi trường nhân nhanh tối ưu cho hệ số nhân 4,7 lần/chồi, chiều cao chồi đạt 3,4 cm/chồi và số lá mới 7,2 lá/chồi Môi trường

¼ MS có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA, 2 mg/l IBA, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar là môi trường

ra rễ tốt nhất, đạt tỷ lệ ra rễ 100%, 14 rễ/chồi, chiều dài trung bình rễ đạt 3,4 cm/chồi Giá thể ra cây phù hợp cho tỷ lệ cây song cao nhất là giá thể cát đạt tỷ lệ 93,75% [2]

Theo nghiên cứu về “Nhân giống cây Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia

tamdaoensis Ninh et Hakada) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro” của tác giả Nguyễn Thị

Hường, Nguyễn Văn Việt (2017) cho kết quả là: Điều kiện khử trùng tốt nhất mẫu quả Trà hoa vàng là khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong 13 phút (lần 1: 7 phút; lần 2: 6 phút) Nuôi cấy trên môi trường: WPM + 30 g/l sucrose + 5 g/l agar đạt tỷ lệ mẫu sạch cao nhất, tỷ lệ tái sinh 86% với thời gian tái sinh chồi là 21 ngày Nhân nhanh chồi Trà hoa vàng in vitro trên môi trường WPM + 0,3 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 100 ml/l nước dừa + 5 g/l agar + 30 g/l sucrose tỷ lệ mẫu tái sinh chồi là 95,56%, số chồi trung

bình trên mẫu 4,33 chồi, chiều cao chồi 1,97 cm Các chồi trên môi trường này cao,

mập, lá màu xanh đậm Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Trà hoa vàng in vitro trên môi trường:

WPM + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA + 100 ml/l nước dừa + 5 g/l agar + 30 g/l sucrose

tỷ lệ ra rễ đạt 88,89%, số rễ trung bình trên mẫu 3,67 rễ và chiều dài rễ trung bình 3,17 [14]

Năm 2018, Nguyễn Văn Việt, Trần Việt Hà, Khương Thị Thu Hương đã tiến hành

nghiên cứu “Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi đến nhân giống in vitro cây

Trà hoa vàng (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda)” Kết quả nghiên cứu cho thấy,

sát trùng bề mặt bằng cồn 70o trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong

13 phút và nuôi cấy trên môi trường khởi đầu WPM bổ sung 0,2 mg/l BAP và 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu sạch 90,13%, mẫu nảy chồi 84,04% sau 21 ngày nuôi cấy Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường WPM bổ sung 0,4 mg/l BAP, 0,2 mg/l kinetin, 0,2 mg/l α- NAA, 30 g/l đường sucrose và 100 ml/l nước dừa cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi

và hệ số nhân chồi đạt cao nhất (94,06% và 4,15) Chồi ra rễ đạt 87,24%, số rễ trung bình 3,71 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 3,3 cm trên môi trường WPM bổ sung 0,2 mg/l IBA, 0,2 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và 100 ml/l nước dừa sau 6 tuần nuôi cấy [27]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng mẫu thân, lá và hạt cây Dương Đồng thu thập tại tỉnh Lào Cai

Hình 2.1 Thân, quả và hạt cây Dương đồng thu thập tại Lào Cai

A Thân cây Dương đồng; B Hạt cây Dương đồng

C Quả cây Dương đồng khi xanh; D Quả cây Dương đồng khi chín

(Ảnh chụp của học viên và cộng sự thu tại Lào Cai, tháng 8, năm 2019)

2.1.2 Hóa chất, thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

a Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu định danh loài

Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết và được cung cấp bởi các hãng khác nhau được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm định danh loài

Acrylamide, chloroform, isoamyl alcohol, EDTA Invitrogen

b Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962), cồn tuyệt đối 90°, cồn 70°, Javen, HgCl2, thạch agar, đường sucrose, nước cất khử trùng

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam như các chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin, IBA, IAA,

GA3,…

2.1.2.2 Thiết bị

Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ chính xác cao thuộc các phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật và Công nghệ gen thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Cân phân tích AB 240, Máy chuẩn pH tự động Thụy Sỹ

Máy li tâm lạnh Eppendof 524, Máy soi gel, Bể ổn nhiệt, Tủ

ấm Binder, Máy PCR, Cân điện tử

Đức

Máy quang phổ UV-1800, Nồi khử trùng, Tủ lạnh Nhật Bản

Bộ đồ cấy: Dao cấy, que cấy, đĩa cấy, bình tam giác 250 ml, 500 ml, pipet, ca nhựa, ống đong, ống falcon 15ml, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm, phễu thủy tinh

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 4 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020 tại phòng Công nghệ tế bào thực vật và Công nghệ gen - Khoa Sinh học - Trường Đại học

Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử

Mẫu được lựa chọn là mẫu lá bánh tẻ không bị sâu bệnh nấm mốc Sau khi thu, mẫu được bảo quản trong túi nilon có chứa hạt silicagel hút ẩm, ghi đầy đủ thông tin mẫu và được giữ ở -80°C để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu

Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá của cây Dương đồng

(1) DNA tổng số được phân lập từ lá non dựa trên phương pháp của Shaghai

và cs (1984) [38] 0,8 g lá cây tươi mỗi giống được nghiền trong nitơ lỏng sau đó

bổ sung 6 ml đệm rửa (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH2PO4

0,4%; sorbitol 350 mM; H2O) lắc đều chia đều dịch sang các ống nhỏ và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, loại dịch để thu cặn (lặp lại thao tác này 1 lần)

(2) Bổ sung 700µl đệm chiết (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM, pH 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; H20) vào mỗi ống, đảo đều và ủ 60 phút ở 65°C, từ 5-10 phút đảo nhẹ ống 1 lần, để ở nhiệt độ phòng 5 phút và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch sang ống mới

(3) Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu; đảo nhẹ ống 2-3 lần và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch pha trên sang ống mới

(4) Bổ sung phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu; đảo nhẹ ống 2-3 lần và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch pha trên sang ống mới

(5) Tủa DNA với isopropanol tỷ lệ 1:1 về thể tích, giữ -20°C trong 2 giờ và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C thu tủa và rửa bằng 500µl ethanol 70%, sau đó

ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C và thu tủa, để khô ở 37C Sau đó, tủa được hòa trong 30 μl TE và 0,25 μl RNase và ủ 15 phút ở 37C

Nhân bản cặp mồi ITS2 và ITS4 bằng phản ứng PCR: Cặp mồi ITS2 và ITS4

được nhân bản với cặp mồi đặc hiệu tương ứng bằng phản ứng PCR có thành phần như trong bảng 2.3 và chu trình nhiệt trong bảng 2.4

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân cặp mồi ITS2 và ITS4

Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV) và chụp ảnh Sản phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn của kit tinh sạch sản phẩm PCR của Norgen, Canada

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi đi để giải trình tự Trình tự nucleotide của đoạn DNA được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.2.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy

Môi trường cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS (Murashige

và Skoog, 1962)

Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần và hàm

lượng các chất phù hợp Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không kết tủa Môi trường có

bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được

dễ dàng Khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1 atm - 1,2 atm, trong thời gian 20 phút

Sau khi khử trùng để nguội, ổn định sau 2-3 ngày và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng [19]

2.2.2.2 Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch

 Tạo mẫu sạch in vitro từ thân cây Dương đồng

Cây ngoài tự nhiên được cắt bỏ lá, cho vào cốc rửa sạch dưới vòi nước máy và sau

đó rửa với nước xà phòng loãng trong 20 - 30 phút, tiếp tục rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy

Các bước cơ bản để khử trùng mẫu cấy bao gồm:

Bước 1: Đưa mẫu vào bình sạch, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 2 lần

Bước 2: Khử trùng bằng cồn 700 lắc đều trong 1 phút Sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng 2 - 3 lần

Bước 3: Tiến hành khử trùng mẫu

Phương pháp 1: Khử trùng mẫu bằng Javen 60% ở các ngưỡng thời gian khác nhau (10; 15; 20; 25; 30 phút)

Phương pháp 2: Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1 % trong các ngưỡng thời gian khác nhau (10; 15; 20; 25; 30 phút)

Phương pháp 3: Khử trùng mẫu bằng H2O2 15% trong các ngưỡng thời gian khác nhau (10; 15; 20; 25; 30 phút) [2]

Bước 4: Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm

Bước 5: Cấy mẫu vào môi trường MS cơ bản

Các bước khử trùng thực hiện trong môi trường vô trùng (box cấy) [21]

Theo dõi các chỉ tiêu như: Tỉ lệ mẫu sạch (%), tỉ lệ mẫu bị nhiễm (%), tỉ lệ mẫu nảy mầm (%); chất lượng chồi từ các mẫu nuôi cấy

 Tạo mẫu sạch in vitro từ hạt cây Dương đồng

- Phương pháp khử trùng bằng HgCl2 0,1%; Javen 60%

Bước 1: Tách bỏ vỏ cứng, lấy hạt bên trong quả

Bước 2: Đưa mẫu vào ống falcon 15ml đã khử trùng, rửa lại mẫu bằng nước cất khử trùng 1-2 lần

Bước 3: Khử trùng bằng cồn 700 lắc đều trong 1 phút Sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng 2 - 3 lần

Bước 4: Tiến hành khử trùng mẫu

Phương pháp 1: Khử trùng mẫu với HgCl2 0,1% lắc đều trong thời gian 8, 10, 12,

Bước 6: Cấy mẫu vào môi trường MS cơ bản

Các bước khử trùng thực hiện trong môi trường vô trùng (box cấy) [19]

- Phương pháp khử trùng bằng khí Clo

Bước 1: Tách bỏ vỏ cứng, lấy hạt bên trong quả đặt vào giấy thấm

Bước 2: Đưa mẫu vào trong bình hút chân không

Bước 3: Dùng cốc thủy tinh thể tích 50 ml, lấy 25 ml Javen đổ vào cốc thủy tinh, sau đó đưa cốc thủy tinh chứa Javen vào bình hút chân không, đậy nắp bình

Bước 4: Dùng pipet lấy 5 ml HCl đặc nhỏ từ từ vào cốc thủy tinh chứa Javen trong bình hút chân không

Bước 5: Đậy nhanh bình hút chân không, dán kín miệng bình bằng giấy paraffin Bước 6: Sau ngưỡng thời gian khử trùng (3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ), lấy mẫu vào ống falcon đã khử trùng, đậy nắp và đưa vào box cấy

Bước 7: Tiến hành gieo hạt trong box

Theo dõi các chỉ tiêu như: Tỉ lệ mẫu sạch (%), tỉ lệ mẫu bị nhiễm (%), tỉ lệ mẫu nảy mầm (%); chất lượng chồi từ các mẫu nuôi cấy

2.2.2.3 Phương pháp tạo đa chồi từ nguồn mẫu sạch thu được

a Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương

đồng

Để thăm dò ảnh hưởng của nước dừa đến sự sinh trưởng của cây Dương đồng, tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung 30 g/l đường sucrose + 9 g/l agar và nước dừa với hàm lượng thay đổi (0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 0,9 ml/l) Công thức đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + 30 g/l đường sucrose + 9 g/l agar, không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 mẫu cấy Theo dõi, đánh giá kết quả

Các chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu; Chiều cao chồi (cm); Chất lượng chồi

Số chồi trung bình = Tổng số chồi

150 ml/l; 200 ml/l) Công thức đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + 30 g/l đường sucrose + 9 g/l agar, không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 mẫu cấy Theo dõi, đánh giá kết quả

Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi (cm); Chất lượng chồi

Chiều cao chồi trung bình = Tổng kích thước của các chồi

giá kết quả

Các chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu; Chiều cao chồi (cm); Chất lượng chồi

Số chồi trung bình = Tổng số chồi

Tổng số mẫu thí nghiệm

Chiều cao chồi trung bình = Tổng kích thước của các chồi

Tổng số mẫu thí nghiệm

2.2.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của GA 3 đến sự sinh trưởng của mẫu cây Dương đồng

Để thăm dò ảnh hưởng của GA3 đến sự sinh trưởng của cây Dương đồng, tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung 30 g/l đường sucrose + 9 g/l agar và GA3 với nồng độ thay đổi từ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l Công thức đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + 30 g/l đường sucrose + 9 g/l agar, không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành

trên 30 mẫu cấy Theo dõi, đánh giá kết quả Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao mẫu (cm); Chất lượng mẫu

Chiều cao trung bình = Tổng kích thước của các mẫu

Tổng số mẫu thí nghiệm

2.2.2.5 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi đạt chiều cao 2 - 3 cm và có 3 - 5 lá được cấy chuyển sang môi trường

ra rễ Môi trường thí nghiệm thăm dò là MS cơ bản có bổ sung IAA thay đổi 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l và IBA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 mẫu cấy Theo dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy Các chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/chồi; Chiều dài rễ (cm); Chất lượng rễ

Số lượng rễ trung bình = Tổng số rễ

Tổng số mẫu theo dõi

Chiều dài rễ trung bình = Tổng kích thước của các rễ

Tổng số mẫu theo dõi

2.2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được phân tích và xử lý bằng thống kê với phần mềm hỗ trợ trên máy tính (excel)

Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05 Các số liệu được xử lí trên máy tính bằng chương trình Excel Phương pháp được sử dụng là phương pháp phân tích phương sai một nhân tố