Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và hoạt tính sinh học của cao chiết từ loài adinandra bockiana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÂN THỊ KIM PHƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

THÂN THỊ KIM PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, tháng 12/2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

THÂN THỊ KIM PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, tháng 12/2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020

Tác giả luận văn

Thân Thị Kim Phượng

XÁC NHẬN

CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

PGS.TS Nguyễn Hữu Quân

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Văn Khang, giảng viên Khoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Thực vật học thuộc Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm

- Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Khoa Sinh học và các thầy

cô giáo thuộc bộ phận sau đại học, Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Quỹ Nafosted “Phân tích thành phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm

từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở Việt Nam”, mã số

106.02-2018.338

Tác giả luận văn

Thân Thị Kim Phượng

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 3

1.1.1 Chi Dương đồng (Adinandra) 3

1.1.2 Loài Adinandra bockiana 5

1.2 Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi Adinandra 6

1.2.1 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 6

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 9

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 12

2.1.1 Vật liệu và môi trường nuôi cấy 12

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 12

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Phương pháp phân loại hình thái 14

2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật 14

2.2.3 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính 15

2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 16

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa DPPH 16

2.2.6 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư nuôi cấy dạng đơn lớp 16

2.2.7 Phương pháp định tính cao chiết 17

2.2.8 Phân lập các hợp chất 19

2.2.9 Phương pháp xử lý và phân tích kết quả 20

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra bockiana 21

3.1.1 Đặc điểm hình thái của loài Adinandra bockiana 21

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu của loài Adinandra bockiana 22

3.2 Hoạt tính sinh học của cao chiết từ loài Adinandra bockiana 25

3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài A bockiana 25

3.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết loài A.bockiana 28

3.2.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của cao chiết ethanol từ loài A bockiana 30

3.3 Khảo sát các hợp chất có trong dịch chiết của cây A bockiana 31

3.3.1 Định tính polyphenol 31

3.3.2 Định tính tanin 31

3.3.3 Định tính các flavonoid 32

3.3.4 Định tính các coumarin 32

3.3.5 Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A bockiana 33

3.4 Kết quả tách chiết một số hợp chất có trong dịch chiết cây A bockiana 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

KẾT LUẬN 35

KIẾN NGHỊ 35

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng việt

DMSO Dimethyl sulfoxide

Hep G2 Hepatocellular carcinoma

human

Ung thư gan ở người

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể ISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sự sai khác di truyền

ở thực vật

sinh vật MCF-7 Ardeno carcinoma Ung thư vú

MIC Minimalinhibitory

concentration

Nồng độ tối thiểu ức chế

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

TTC Triphenyl tetrazolium chloride Chỉ thị màu

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra phân bố tại Việt Nam 3

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 12

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 13

Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài A bockiana 25

Bảng 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết 29

Bảng 3.3 Tác động gây độc tế bào ung thư của cao chiết 30

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một số loài thuộc chi Adinandra 4

Hình 1.2 Mẫu cây A bockiana phát hiện tại Trung Quốc [28] 6

Hình 1.3 Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A nitida 9

Hình 1.4 Các hợp chất saponin thuộc loài A.nitida 10

Hình 2.1 Một số thiết bị sử dụng trong các thí nghiệm 13

Hình 2.2 Quy trình điều chế mẫu cao chiết loài A.bockiana 15

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các chất 20

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của loài A bockiana thu tại xã Liêm Phú, huyện Văn Bàn, tỉnh Lào Cai 21

Hình 3.2 Giải phẫu cắt ngang thân cây A bockiana 23

Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang lá cây A.bockiana 25

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với vi khuẩn B subtilis 26

Hình 3.5 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L Plantarum 26

Hình 3.6 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli 27

Hình 3.7 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S marcescens 27

Hình 3.8 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S lutea 28

Hình 3.9 Màu sắc của mẫu khử gốc tự do DPPH trước khi đo của cao ethanol 30

Hình 3.10 Phản ứng với muối sắt (III) (A) và với dung dịch H2SO4 đặc (B) 31

Hình 3.11 Định tính tanin bằng phản ứng với thuốc thử vanilin/H2SO4 (A) và định tính flavonoid (B) 32

Hình 3.12 Định tính coumarin phản ứng với NaOH (A) và HCl đặc (B) 32

Hình 3.13 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (T), cao chiết ethyl acetate (E) và cao chiết dichloromethane (D) 33

Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng một số đoạn của cao chiết 34

Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng so sánh cao tổng số và chất A1 34

vụ cho cuộc sống của con người

Xu hướng sử dụng các hợp chất thiên nhiên có sẵn trong cây để điều chế dược phẩm, thực phẩm hiện đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Trong số các hợp chất thu được, có những hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư, một số khác lại thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật Tác dụng chữa bệnh, tăng cường

và bảo vệ sức khỏe con người ở nhiều loài thực vật chủ yếu là do các hợp chất tự nhiên mà chúng đã sinh tổng hợp, tích luỹ trong quá trình sinh trưởng và phát triển Trên thế giới đã có một số công trình công bố về thành phần hóa học và tác

dụng sinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra), họ Chè

(Theaceae) Kết quả của những nghiên cứu đã chỉ ra nhiều hợp chất phân lập từ loài

Adinandra nitida đã thể hiện hoạt tính kháng rộng như kháng viêm, chống oxi hóa,

diệt trừ các gốc tự do, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây

bệnh Ở Việt Nam, những nghiên cứu về chi Adinandra đã bước đầu tập trung ở việc thống kê danh sách thành phần loài, ngoại trừ loài Adinandra lienii đã được

công bố về đặc điểm giải phẫu, hoạt tính sinh học của cao chiết và trình tự đoạn gen

matK Trong khi loài Adinandra bockiana chưa có công bố nào về đặc điểm thực

vật học, hoạt tính sinh học cũng như thành phần hóa học Do đó, nghiên cứu về các đặc tính sinh học cũng như tìm ra được cấu trúc hóa học, thành phần các hợp chất mới và hoạt tính sinh học của các hợp chất mới của loài này là rất cần thiết Xuất

phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

thực vật học và hoạt tính sinh học của cao chiết từ loài Adinandra bockiana”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân tích được đặc điểm thực vật học của loài A.bockiana thu thập được

2

- Phân lập, tinh sạch và xác định được hoạt tính sinh học của một số hợp chất

tách chiết từ loài A.bockiana làm cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu của loài A bockiana

- Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa và hoạt tính chống tế bào ung thư của cao chiết từ loài

A bockiana

- Tinh sạch một số chất thu được từ cao chiết của loài A bockiana

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về thực vật thuộc chi Dương đồng ( Adinandra )

1.1.1 Chi Dương đồng (Adinandra)

Chi Dương đồng (Adinandra) thuộc họ chè (Theaceae), bộ Theales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta và giới thực vật [27] Trên thế giới có khoảng

85 loài thuộc chi Adinandra phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản,

Ấn Độ, Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [26] Ở Trung Quốc, chi

Adinandra có khoảng 22 loài, trong đó có 17 loài là đặc hữu Ở Việt Nam, đã thống

kê được chi Adinandra có khoảng 13 loài, phân bố rải rác ở các tỉnh Lào Cai, Cao

Bằng, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia Lai như

loài Adinandra glischroloma, Adinandra millettii, Adinandra petelotii, Adinandra lienii, Adinandra bockiana, Adinandra annamesis, Adinandra megaphylla, Adinandra hongiaoensis, [2], [20]

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra phân bố tại Việt Nam

TT Tên khoa học Tên khác Phân bố Công dụng

1 Adinandra annamesis Sum đỏ Quảng trị

2 Adinandra caudata Sum đuôi Bạch Mã

3 Adinandra donnaiensis Sum đồng nai Đồng Nai

4 A.glischochroma Sum lông Sapa

5 Adinandra hainanensis Súm đỏ Quảng Ninh,

Quảng Trị, Kon Tum, Gia Lai

Dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng

6 Adinandra integerrima Sum nguyên Lâm Đồng Trị bong gân,

rắn cắn

7 Adinandra microcarpa Sum trái nhỏ Hòn Bà

8 Adinandra millettii Sum millett Sapa, Tam

Đảo

Điều trị đau

dạ dày

9 Adinandra petelotii Sum petelot Sa Pa

10 Adinandra poilanei Sum poilan Lâm Đồng

11 Adinandra megaphylla Sum lá lớn Lào Cai

12 Adinandra lienii Sum Liên Lào Cai

13 Adinandra hongiaoensis Sum Hòn

Giao

Lâm Đồng

4

Theo sách đỏ Việt Nam, các loài trong chi Adinandra là nguồn gen hiếm Các hợp chất có trong cây thuộc chi Adinandra có nhiều tác dụng để chữa bệnh như

giảm huyết áp, kháng viêm, chống độc và giảm đau Đặc biệt, flavonoid tìm thấy

trong lá của loài A nitida có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chống

viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, trong các cây thuộc họ chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y học

cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị bệnh ung

thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn, [22] Cụ thể công dụng của một số loài tìm thấy

ở Việt Nam được mô tả trong bảng 1.1

Hình 1.1 Một số loài thuộc chi Adinandra

A A hongiaoensis, B A integerrima, C A millettii, D A glischroloma

( Hình ảnh từ Internet)

5

Những loài thuộc chi Adinandra thường là cây thân gỗ ít khi là cây bụi, nhánh

non có lông nhung Lá đơn, mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn Hoa mọc đơn độc ở nách lá, lưỡng tính, hoa mẫu 5 Lá đài có lông mềm hay lông ráp Cánh hoa không lông hay chỉ có lông ở mặt ngoài Nhị nhiều, số lượng lên tới 25 nhị trong 1 hoa Bao phấn có lông ngắn hay dài và có mũi nhọn Bầu trên, không lông hoặc có lông mềm; noãn nhiều Quả khô không tự mở; hạt nhiều và nhỏ [27] Hình

thái ngoài của một số loài thuộc chi Adinandra được thể hiện ở hình 1.1

1.1.2 Loài Adinandra bockiana

Loài A bockiana là loài thực vật có hoa thuộc chi Dương đồng (Adinandra) Theo

mô tả của Pritzel (1900) loài A bockiana trồng tại Trung Quốc là cây bụi hoặc cây gỗ,

cao từ 2-9 m Thân màu xanh thẫm, cành non màu nâu đen, nhẵn hoặc phớt Cuống lá

có màu nâu vàng đậm, dài 5-7 mm Phiến lá thuôn dài hình trứng thuôn, màu xanh lục đậm, kích thước khoảng 9-13 × 3-4 cm, không có lông Hoa mọc ở nách lá, đơn độc Các lá đài rộng hình bầu dục hoặc hình trứng Cánh hoa màu trắng, hình trứng rộng, kích thước khoảng 6-7 × 4-5 mm, bên ngoài có màu nâu vàng dọc theo phần giữa, đỉnh tròn

và nhầy Nhị hoa nhiều từ 25-30 nhị, dài 5 mm Quả màu đen tím khi trưởng thành Hạt nhiều, màu nâu đỏ, sáng bóng Hàng năm, cây ra hoa từ tháng 6 đến tháng 8 và quả chín vào tháng 9 đến tháng 11 Cây thường mọc trên sườn núi hoặc trong thung lũng, nơi có

độ cao từ 200-1500 m (Hình 1.2) Tại Trung Quốc, loài A.bockiana phân bố tại các tỉnh

Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Nam và Tứ Xuyên [26] Tại Việt

Nam, loài A bockiana được tìm thấy ở tỉnh Lào Cai và Vĩnh Phúc

6

Hình 1.2 Mẫu cây A bockiana phát hiện tại Trung Quốc [28]

1.2 Hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi Adinandra

1.2.1 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu về loài A nitida đã được công bố có nhiều tác dụng sinh học

khác nhau như chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE) và chống ung thư [13], [14], [17]

Liu và cộng sự (2008) đã tiến hành nghiên cứu khả năng chống oxy hóa, tác dụng ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin của dịch chiết EtOH, hợp chất

camellianin A, camellianin B và apigenin từ loài A nitida Kết quả nghiên cứu nhận

thấy: (1) Dịch chiết EtOH, camellianin A, camellianin B và apigenin có khả năng chống oxy hóa với giá trị IC50 tương ứng lần lượt là 14,74 μg/ml; 1,62 mg/ml; 1,8 mg/ml và 0,95 mg/ml; (2) khả năng chống oxy hóa theo phương pháp thử DPPH và Rancimat của các hợp chất flavonoid thấp hơn nhiều lần so với dịch chiết EtOH

(khoảng 100 lần); (3) tác dụng chống oxy hóa của loài A nitida phụ thuộc vào các

chất có trong lá [16]

Cùng hướng nghiên cứu này, Liu và cộng sự (2010) nhận thấy, các hợp chất flavonoid thuộc nhóm camellianin A, camellianin B và apigenin có tác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH Ở nồng 500 μg/ml, tác dụng ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenin lần lượt là 29,7; 30,16; 40,68 và 30,27% Hoạt tính ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin của dịch chiết EtOH phụ thuộc nhiều vào thành phần nhóm chất flavonoid [17]

7

Lá của loài A nitida được sử dụng để làm chè uống có tác dụng chống ung

thư Hợp chất camellianin A được chứng minh có hoạt tính chống ung thư trên dòng

tế bào ung thư Hep-G2 và dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Ở nồng độ 200μM, camellianin A ức chế tế bào ung thư MCF-7 và Hep-G2 với tỉ lệ ức chế lần lượt là 33,8 và 8,7% Như vậy, tác dụng gây độc tế bào của camellianin A là khá yếu Tuy nhiên, khi nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăng mật độ tế bào ở giai đoạn G0/G1 Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7 trong giai đoạn đầu quá trình chết của tế bào đã được phát hiện Như vậy, camellianin A không chỉ ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩy các tế bào đi vào chu trình chết tế bào (apoptosis) [14]

Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2015) đã so sánh thành phần phenolic của 4

loài A nitida, A glischroloma var jubata, A millettii và A latifolia ở Trung Quốc

về tác dụng chống oxy hóa và khả năng chống ung thư của 4 loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 Nghiên cứu nhận thấy, hàm lượng các hợp chất

phenolic trong loài A nitida cao nhất đạt 140,54 mg/g, tiếp đến loài A millettii (125,96 mg/g), loài A glischroloma var jubata (84,14 mg/g) Loài A latifolia có

hàm lượng phenolic thấp nhất đạt 71,29 mg/g Thành phần flavonoid có trong loài

A nitida là cao nhất đạt 88,72 mg/g; tiếp đến là loài A glischroloma var jubata đạt 44,74 mg/g và loài A millettii đạt 43,54 mg/g Loài A latifolia có hàm lượng flavonoid thấp nhất đạt 19,13 mg/g Như vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A nitida và A millettii tốt hơn so với loài A jubata và A latifolia Dịch chiết của các loài Adinandra chứa các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư Các dịch chiết có thể ức chế với giá trị EC50 từ 1,05-6,44 mg/ml

trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và giá trị EC50 từ 2,26-8,02 mg/ml trên dòng

tế bào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2)

Thành phần hợp chất flavonoid của loài A nitida có chứa camellianin A,

camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài

A milettii chưa được phát hiện [13]

8

Bảng 1.2 Tác dụng chống ung thư của các hợp chất phenolic tự do

trên 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 và MCF-7

Năm 2019, Yuan và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học và xác định các

hợp chất chống ung thư có trong trà Shiya (Adinandra nitida) Nghiên cứu đã phát

hiện ra 5 hợp chất có tác dụng ức chế quá trình tạo mỡ cũng như tác dụng chống ung thư Bốn hợp chất saponin triterpenoid (1-4), bao gồm một hợp chất mới (2α, 3α - dihydroxyursolic acid 28 - O – β - d - glucopyranosyl ester, 1) và flavonoid (5)

đã được xác định bằng cách sử dụng NMR (1D và 2D NMR) và sắc ký lỏng (LC) Hợp chất (1), thành phần chính chống vi khuẩn có giá trị IC50 là 27,6 μg/ml, đã được xác định lần đầu tiên trong trà Shiya Để hiểu được mối quan hệ hoạt động của cấu trúc, người ta đã thu được ba hợp chất thủy phân (1s, 2 và 5s) để cung cấp hiệu ứng

ức chế tích lũy lipid trong quá trình biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1 Tác dụng ức chế của triterpenoid (1s) không có nhóm đường giảm đáng kể, trong khi flavonoid (5s) cũng không có nhóm đường cho thấy hoạt động tăng lên Ngoài ra, vị trí nhóm hydroxyl cũng có thể đóng một vai trò trong hiệu quả ức chế [24]

Ở Việt Nam, nghiên cứu đầu tiên về loài Adinandra rubropunctata do Lê

Nguyễn Thành và Vũ Thị Kim Oanh thực hiện Nghiên cứu đã phát hiện ra lớp chất

triterpen vòng ursan (ursolic acid) và vòng lupan (betulinic acid) từ thân của loài A rubropunctata, các hợp chất betulinic acid, ursolic acid thường có hoạt tính chống

ung thư tốt

Như vậy, ở Việt Nam và trên thế giới chưa có công bố nào về hoạt tính sinh

học từ loài A bockiana

9

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra thành phần hóa

học của loài A nitida thuộc các nhóm chất là flavonoid, flavonoid glycoside và

triterpene saponin Năm 2003, Wang và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất từ loài

A nitida là apigenin (1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1 (4),

nigaichigoside F2 (5), và peduncloside (6) (Hình 1.3) [22]

Bằng phương pháp sắc ký cột, Wang và cộng sự (2008) đã phân tích được

thành phần hóa học của loài A nitida Nghiên cứu đã phân lập và xác định được cấu

trúc của các hợp chất saponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin, sericoside; glucosyl tormentate; nigaichigoside F1 và arjunglucoside I Trong đó chất 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D-glucopyranoside là hợp chất mới; các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát hiện

19alpha-trong loài A nitida [23]

10

Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại camellianin

A từ lá của loài A nitida Merr ex Li bằng phương pháp HPLC và chứng minh được

khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằng phương pháp DPPH và các gốc tự do Cùng hướng nghiên cứu này, Liu và cộng sự (2013) đã phân lập, tối

ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và thu được camellianin A từ lá của loài

A nitida; đồng thời chứng minh được khả năng chống oxy hóa của flavonoid ở nồng

độ 0,02 mg/ml Như vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra flavonoid như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin A và camellianin B có hoạt tính sinh học và có khả năng chống oxy hóa [16]

Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2010), Zhang và cộng sự (2006) đã xác định

được thành phần flavonoid trong lá của loài A nitida chiếm hàm lượng lớn > 20%

và camellianin A được xác định là thành phần chính [17], [25] Theo Liu và cộng

sự (2010), hàm lượng camellianin A, camellianin B và phần aglycon apigenin trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ lần lượt là 41,98; 2,67 và 1,73% [17] Hàm lượng flavonoid chiếm hơn 45% trong dịch chiết EtOH

chủ yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14) và aglycon apigenin (1) [16]

Camellianin A (2) Rhoifolin (13)

Camellianin B (14) Epicatechin (12)

Hình 1.5 Các hợp chất flavonoid từ A nitida

Bằng phương pháp sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân tích

thành phần hóa học đã chỉ ra hơn 57 chất trong dịch chiết MeOH từ lá của loài A

nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin (13),

camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu, khối lượng

phân tử và phổ MS/MS (Hình 1.5) [25]

Như vậy, chưa có công bố nào nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học từ loài A bockiana

12

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu và môi trường nuôi cấy

Loài Adinandra bockiana sử dụng trong nghiên cứu được thu tại xã Liêm Phú,

huyện Văn Bàn, tỉnh Lào Cai, Việt Nam

Các loài vi khuẩn kiểm định: Bacillus subtilis, Serratia macescens, Escherichia coli, Sarcina lutea, Lactobacillus plantanum do Khoa Sinh học,

Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cung cấp để nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn từ cao chiết của loài A bockiana

Các dòng tế bào ung thư gồm: ung thư vú (MDA-MB-231), ung thư dạ dày (AGS) và ung thư phổi (A549) do GS Pezzuto, Trường Đại học Long Island, Mỹ và

GS Jeanette Maier, Trường Đại học Milan, Italia cung cấp để xác định hoạt tính gây

độc tế bào từ cao chiết của loài A bockiana

Môi trường LB được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn kiểm định có thành phần gồm cao nấm men 0,5%; NaCl 1,0%; pepton 1,0% Môi trường LB đặc bổ sung 2,0% thạch agar

Cao nấm men, pepton, axit triclo axetic Sigma

Thuốc thử DMSO, Javen, axit axetic, xanh metylen,

carmine, NaCl, agar

Trung Quốc

13

2.1.2.2 Thiết bị

Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ chính xác cao thuộc các phòng thí nghiệm thuộc Khoa Sinh học và Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên (Bảng 2.2 và Hình 2.1)

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Cân phân tích AB 240, Máy chuẩn pH tự động Thụy Sỹ

Máy quang phổ UV-1800, Nồi khử trùng, Tủ lạnh Nhật Bản

La men, lam kính, dao lam, pipet, ống eppendof, ống sinh

hàn, phễu chiết, đĩa petri, bình đựng dung môi, giá đỡ

Trung Quốc

Hình 2.1 Một số thiết bị sử dụng trong các thí nghiệm

A Máy chiết hồi lưu và hệ thống sinh hàn; B Máy cất quay chân không; C Cột

sắc ký sắt; D Máy nuôi cấy lắc ổn nhiệt

14

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Luận văn được thực hiện tại Trường Đại học Sư Phạm

- Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2019 đến tháng 9/2020

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân loại hình thái

Mẫu tiêu bản (cành mang lá và hoa) của loài A bockiana được thu thập, mang

về phòng thí nghiệm để ép khô xác định tên khoa học, nghiên cứu sự phân bố và sinh thái

Tên khoa học của loài A bockiana được xác định bằng phương pháp hình thái

so sánh theo các tài liệu chuyên khảo: Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (1999) [2] và Thực vật chí Trung Quốc của Min & Bruce (2015)[26]

2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật

Cấu tạo giải phẫu loài A bockiana được thực hiện theo hướng dẫn của Hoàng

Thị Sản và Nguyễn Phương Nga (2008) [9]

- Mẫu thân và lá sau khi thu về được cắt thành những lát mỏng bằng dao lam Các lát cắt được ngâm vào nước cất trong đĩa petri Sau đó tiến hành nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm kép với các bước như sau:

Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch javen trong thời gian từ 15-30 phút

để tẩy sạch nội chất của tế bào

Bước 2: Rửa sạch lát cắt đã được ngâm trong javen bằng nước cất

Bước 3: Tẩy sạch hết javen còn dính trên lát cắt bằng cách ngâm vào dung dịch axit axetic

Bước 4: Rửa sạch mẫu bằng nước cất (2 lần)

Bước 5: Nhuộm mẫu bằng dung dịch carmine trong khoảng 25-30 phút Bước 6: Rửa mẫu trong nước cất

Bước 7: Mẫu được nhuộm trong dung dịch xanh methylen loãng khoảng 20 giây

Bước 8: Rửa sạch mẫu bằng nước cất

Bước 9: Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật và đậy la men Quan sát lát cắt trên kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 4-10 lần để thu kết quả

2.2.3 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính

Lá của loài A bockiana sau khi thu hái được rửa sạch và thái nhỏ, phơi trong

bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 50°C đến khối lượng không đổi, sau đó đem nghiền nhỏ Mẫu nghiền được ngâm chiết hai lần bằng ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt

độ phòng Dịch tổng số được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ <50ºC

và thu được cao chiết ethanol Cao chiết ethanol được chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là dichlomethane và ethyl acetate Sau khi cất đuổi dung môi thu được cao chiết dichlomethane, ethyl acetate và cặn chiết còn lại Các cao chiết thu được sẽ sấy khô ở nhiệt độ 50ºC và thu được cao sấy khô tương ứng Các cao chiết được cho vào bình thủy tinh, có ghi nhãn, đậy kín và bảo quản ở nhiệt độ thường để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo Quy trình điều chế mẫu được trình bày tóm tắt ở hình 2.2

Hình 2.2 Quy trình điều chế mẫu cao chiết loài A.bockiana