Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây diệp hạ châu đắng (phyllanthus amarus)

Ở Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú, chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học. Ngày nay, trong nền y học thế giới nói chung, xu hướng sử dụng các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật để phòng và trị bệnh đang trở nên phổ biến và có hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên vì tính an toàn, có thể sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ khi sử dụng thuốc tổng hợp hóa học. Dựa trên các nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm dân gian, “ Cây Diệp hạ châu đắng” ngày càng được dùng nhiều trong công nghiệp dược. Các nghiên cứu cho thấy hoạt chất phyllanthin và hypophyllanthin có mặt trong thành phần chính của cây Phyllanthus amarus. Các chất này có tác dụng làm gia tăng lượng glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan. Làm giảm men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B [9]. Vì vậy cây Diệp hạ châu đắng có tác dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc men gan do uống rượu bia… Với những công dụng thiết thực của cây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ” để làm rõ 2 mục tiêu sau đây: 1. Tìm hiểu được thành phần hóa học của cây Diệp hạ châu đắng. 2. Tìm hiểu được tác dụng sinh học và hoạt tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus của cây Diệp hạ châu đắng.

Trường đại học Duy Tân

ĐÀ NẴNG – 2021

Để có thể hoàn thành đồ án này, trong thời gian nghiên cứu bộ môn PBL 496Đặc biệt chúng em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô bộ môn Thựchành

Dược khoa và Kĩ năng nghề đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa và giúp đỡ rất nhiềutrong quá trình làm và hoàn thành đồ án

Cuối cùng xin cảm ơn các thành viên trong nhóm đã đóng góp ý kiến và côngsức để hoàn thành đồ án này

Mặc dù đã cố gắng rất nhiều nhưng đồ án vẫn không tránh khỏi sự sai sót,nhóm chúng em mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp của quýthầy cô cùng các bạn

Đà Nẵng, ngày 25 tháng 4 năm

2021 Người thực hiện:

Nhóm 12 - PHM 496 B

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ DANH MỤC ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về thực vật học 2

1.1.1.Vị trí phân loại của chi/loài 2

1.1.2.Giới thiệu về loài 2

1.2.Thành phần hóa học 4

1.2.1.Lignan 4

1.2.2.Alcaloid 6

1.2.3.Tanin 6

1.2.4.Flavonoid 6

1.2.5.Saponin 6

1.2.6.Các chất khác 6

1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của cây Diệp hạ châu đắng 7

1.3.1.Hoạt tính sinh học 7

1.3.2.Công dụng 7

1.4 Một số công trình nghiên cứu của cây Diệp hạ châu hiện nay 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Thời gian và đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Phương pháp nghiên cứu cây Diệp hạ châu đắng 10

2.2.1.Định tính 10

2.2.2 Định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 12

2.2.3 Phương pháp định lượng phyllanthin 13

2.3 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học của cây Diệp hạ châu đắng 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1.Khảo sát thành phần hóa học 20

3.1.1.Kết quả định tính 20

3.1.2.Thử tinh khiết 21

3.1.3.Khảo sát dung môi chiết 21

3.1.4.Khảo sát phương pháp chiết 22

3.1.5.Khảo sát lần chiết 23

3.1.6.Khảo sát tỉ lệ dung môi 24

3.1.7.Khảo sát tốc độ dòng 26

3.1.8 Quy trình chiết phyllanthin từ P amarus 27

3.1.9 Xây dựng quy trình định lượng phyllathin 29

3.1.10 Định lượng các loài thuộc chi Phyllanthus thu thập được 36

3.1.11 Quy trình định lượng lignan từ P amarus 37

3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cây Diệp hạ châu đắng 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

HPLC High Pressure Liquid

HP-TLC High Pressure- Thin Layer

Chromatography

Phương pháp sắc ký lớp mỏnghiệu năng cao

MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểuMIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu

P amarus Phyllanthus amarus Cây Diệp hạ châu đắng

P urinaria Phyllanthus urinaria Diệp hạ châu ngọt

Số hiệu bảng Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Bảng định tính các bộ phận trong cây được chiết xuất

thành công với 4 dung môi

20

Bảng 3.2 Bảng số liệu định lượng ( đơn vị mg/g ) 21Bảng 3.3 Kết quả thử tinh khiết các loài Diệp hạ châu 21

Bảng 3.12 Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 29

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử 35Bảng 3.24 Đường kính của vùng ức chế của hai loại dịch chiết 39

Số hiệu hình Tên hình Trang

Hình 1.1 Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 3

Hình 3.25 Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của P.amarus khô 39Hình 3.26 Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của P.amarus tươi 40

Số hiệu đồ thị Tên đồ thị Trang

Biểu đồ 3.4 Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo dung môi chiết 22Biểu đồ 3.6 Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo số lần chiết 30Biểu đồ 3.13 Đồ thị đường cong chuẩn của phyllanthin 29

Dựa trên các nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm dân gian, “ Cây Diệp hạchâu đắng” ngày càng được dùng nhiều trong công nghiệp dược Các nghiên cứucho thấy hoạt chất phyllanthin và hypophyllanthin có mặt trong thành phần chính

của cây Phyllanthus amarus Các chất này có tác dụng làm gia tăng lượng

glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan Làm giảm men gan do ức chế menADN polymerase của virus viêm gan B [9] Vì vậy cây Diệp hạ châu đắng có tácdụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giảiđộc men gan do uống rượu bia… Với những công dụng thiết thực của cây, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ” để làm rõ 2 mục tiêu sau

đây:

1 Tìm hiểu được thành phần hóa học của cây Diệp hạ châu đắng

2 Tìm hiểu được tác dụng sinh học và hoạt tính kháng khuẩn Vibrio

parahaemolyticus của cây Diệp hạ châu đắng.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thực vật học

1.1.1 Vị trí phân loại của chi/loài

1.1.1.1 Tên gọi

Diệp hạ châu, Chó đẻ, Cam kiềm, Me đất

Tên khoa học: Phyllanthus amarus, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus sp.

1.1.1.2 Vị trí phân loại

Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) là một họ lớn phong phú với khoảng 700 loài, trong

đó khoảng 500 loài phân bố chủ yếu ở các sứ nhiệt đới, trung tâm phân bố của họ là ởNam Mỹ nhiệt đới, Châu Phi nhiệt đới và Đông Nam Á Có một số đại diện của họthuộc thân thảo cũng xuất hiện ở những vùng ôn đới và hàn đới Ở Việt Nam có khoảng

Phân lớp: Ngọc lan (Magnoliidae)

(Euphorbiaceae)

(Euphorbiaceae) Chi:

Phyllanthus

Loài: amarus, urinaria

1.1.2 Giới thiệu về loài

1.1.2.1 Sinh thái phân bố [7]

Chi Phyllanthus L có nhiều loài Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong đó đáng chú ý là 2 loài Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria có hình

dáng gần giống nhau, mọc rải rác ở khắp nơi, trừ vùng núi cao lạnh Trên thế giớicác loài này cũng có vùng phân bố rộng rãi ở một số nước nhiệt đới châu Á khácnhư Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào và ở cả Trung Quốc

Cây Diệp hạ châu là cây ưa ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu bóng, thườngmọc lẫn trong các bãi cỏ, ở ruộng cao (đất trồng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi

giữa mùa thu Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, hạt giống phát tán gần nên cây thường mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả các loài cỏ dại và cây trồng khác.Mùa hoa tháng 4-6 và mùa quả tháng 7-9.

Bộ phận dùng toàn cây Diệp hạ châu bỏ rễ, rửa sạch, dùng tươi hoặc sấy khô

Hình 1.1 Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)

Cây thảo, mọc đứng, cao 20-40 cm, phân nhánh đều từ gốc lên ngọn Thân tiếtdiện tròn màu xanh lục tươi, nhẵn, không có nhựa mủ Cành mang lá dài 6-10 cm,màu xanh lục tươi, hai bên gốc cành có hai vảy nhỏ, rời, hình tam giác, màu nâu

Lá đơn, màu lục nhạt, mọc cách trên cành trông giống lá kép lông chim Phiến

lá hình bầu dục, mặt trên xanh, mặt dưới mặt dưới mốc hơi trắng Mép lá nguyên,gốc lá đối xứng, gân lá kiểu lông chim Cuống lá rất ngắn chỉ khoảng 0,5 mm, màuxanh

Cụm hoa mọc thành chụm 2 hoa ở nách lá, gồm 1 hoa đực và 1 hoa cái, hoacái hơi to hơn hoa đực và đôi khi mọc riêng lẻ

Quả nang nằm dưới lá, hình cầu nhẵn, hơi dẹp, mang lá đài tồn tại phủ 1/3quả, chia thành 3 mảnh vỏ, mỗi mảnh có 2 van chứa 2 hạt Hạt màu nâu, có 5-6 rãnhdọc ở mặt lưng [8]

Lignan được chia làm 3 nhóm chính: lignan, neolignan, oxyneolignan.

1.2.1.2 Cấu trúc

Cấu tạo cơ bản của lignan:

Lignan là hợp chất tạo thành bởi sự nối giữa β- β’ của carbon trung tâm 2đơn vị từ 1-phenylpropan (cầu nối ở vị trí 8-8’)

Từ nhóm này có 3 nhóm phụ được phân biệt bởi vị trí cầu nối sẽ được đọc theocách số carbon của cầu nối nào nhỏ hơn sẽ được đọc trước

Phân loại:

Lignan: nếu 2 đơn vị C6C3 được nối bởi cầu nối 8-8’(β- β’) của khung lignan

cơ bản

Propenyl Benzene Classical Lignan

Neolignan: 2 đơn vị C6C3 nối với nhau bởi dây nối ở vị trí khác dây nối 8-8’(β- β’).Oxyneolignan: 2 đơn vị C6C3 được nối bởi 1 nguyên tử oxy của ether và khôngnối trực tiếp khung cơ bản.

1.2.1.3 Phân bố trong thực vật

Lignan phân bố rộng rãi trong thế giới thực vật Vài trăm hợp chất đã đượcphân lập trong khoảng 70 họ thực vật

Lignan được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của cây Trong các thực vật

hạt trần Gymnosperms thường tìm thấy lignan trong gỗ như trường hợp oligolignan trong thân Cerbera mangha Apocynaceae, vài chất được tìm thấy trong vỏ thân như

vỏ thân Albissia myriophylla, Magnolia officinale, trong khi nhựa là nguồn chứa lignan khá phong phú như trong nhựa các loài Podophyllum, lignan cũng được tìm thấy trong rễ cây, trong lá như Phyllanthus Trong quả như quả cây Cannabis

sativa…, lignan còn được tìm thấy trong hạt như trong hạt Schisandra Trong một vài

trường hợp khi nuôi cấy mô một thời gian dài người ta cũng tìm thấy lignan

1.2.1.4 Tác dụng dược lý [7]

Tác dụng điều trị các bệnh đường tiêu hóa

Tác dụng giảm đau, hạ sốt

Tác dụng lợi tiểu

Tác dụng giải độc rắn cắn

Tác dụng trên hệ thống miễn dịch

Tác dụng điều trị viêm gan siêu vi trùng

B Tác dụng chữa đinh râu, mụn nhọt

Tác dụng khác…

1.2.1.5 Lignan trong chi Phyllanthus

Lignan là một hợp chất gặp trong các cây thuộc chi Phyllanthus, nhưng về tác

dụng sinh học nó có vai trò khá quan trọng trong cây Chỉ có khoảng 1/3 loài trêntổng số 23 loài đã được khảo sát hóa học thấy có sự hiện diện của lignan [15] Các

lignan của chi Phyllanthus cho thấy phần lớn thuộc nhóm lignan đơn giản.

1.2.2 Alcaloid

Các alcaloid của chi Phyllanthus phần lớn có khung sercurinan, ngoài ra có

một số alcaloid trong khung có biến đổi nên có khung nor-securinan

Theo tham khảo tài liệu cho thấy thành phần alcaloid của 2 loài P amarus và

P urinaria có những khác biệt Không thấy có báo cáo nào về thành phần alcaloid trong

P urinaria Tuy nhiên có nghiên cứu gần đây trên bộ môn Dược liệu, Đại học Y

Dược TP.HCM cho thấy trong P urinaria có nirurin, iso-bubbialine giống như

trong cây

P amarus và có phần alcaloid kém phân cực hơn khác hẳn trong cây P amarus.

Trong lá của P amarus có securinine, phyllanthine, 6-isobubbialine, nirurin

[16]

1.2.3 Tanin

Có một số tanin như acid gallic, acid ellagic,

corilagin… Và có tanin thuộc nhóm cấu trúc ellagitanin

Từ một chế phẩm trà của P amarus, các tác giả Nhật đã phân lập được geraniin, một tanin thủy phân được và chất này cũng được tìm thấy trong P.

urinaria.

1.2.4 Flavonoid

Từ P amarus và P urinaria người ta đã tách được 5 flavonoid bao gồm:

quercetin, astragalin, quercitrin, isoquercitrin và rutin Các flavoloid này được coi lànhững hợp chất có tác dụng ngăn chặn gốc tự do

1.2.5 Saponin

Saponin là một nhóm các glycosid có phần genin có cấu trúc triterpen haysteroid 27 cacbon gặp rộng rãi trong thực vật, cũng được tìm thấy trong động vậtthân mềm ở biển như Hải sâm, Sao biển [3]

1.2.6 Các chất khác

Các acid hữu cơ như acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanic Ngoài racòn có, acid dehydrochebulic methyl ester, acid triacontanic, n-octadecan,stigmasterol, phylanthurinolacton, methyl brevifolincarboxylat

1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của cây Diệp hạ châu đắng

1.3.1 Hoạt tính sinh học [22]

Các hợp chất chiết từ các loài cây Diệp hạ châu đắng (P amarus), cây Diệp

hạ châu thân đỏ (P urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng khuẩn.

Các nghiên cứu khác cũng chứng minh rằng có nhiều loại thảo mộc như: lá ổi(Psidium guajava), lá trầu không (Piper trầu L.), cây Diệp hạ châu và hạt cây tầm bóp

(Rhodomyrtus tomentosa) có tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn V parahaemolyticus.

Hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất thảo dược: Hoạt tính diệt khuẩn củachất chiết xuất được kiểm tra bằng thử nghiệm khuếch tán đĩa, còn được gọi làphương pháp Kirby-Bauer Thử nghiệm được thực hiện trong Labcaire VLF-R vôtrùng Huyền phù chứa chủng vi khuẩn (100µL, 106CFU/mL) được phân bố đềutrên đĩa thạch có chứa môi trường pepton kiềm đặc Đĩa giấy vô trùng (d=0,6 mm)được đặt trên bề mặt đĩa thạch (gồm 4 mẫu và 1 mẫu đối chứng âm tính (nước cất

vô trùng) 50µL dịch chiết thực vật với nồng độ 1000; 750; 500 và 250mg/mL đượcđưa vào đĩa giấy Sau đó, chúng được bảo quản ở 4°C trong 8 giờ để dịch chiết lantỏa trên bề mặt đĩa giấy với 4 lần lặp lại Đường kính của vùng ức chế được đo sau24; 48; 72 và 96 giờ

1.3.2 Công dụng

1.3.2.1 Công dụng trong y học cổ truyền

Trong dân gian thường dùng lẫn lộn giữa 2 loài Diệp hạ châu nên việc phânbiệt trong việc sử dụng không rõ và không được chính thức

Cây Diệp hạ châu được dùng chữa đau, viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm

da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má Ngoài ra còn dùngchữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn, và dùng cây tươi giã đắp, hoặc dịch ép cây tươi bôingoài, liều lượng không hạn chế [7]

Ở Đông Nam Á cây Diệp hạ châu đắng được ưa dùng hơn Từ Hải Nam đến

Indonesia, P amarus dưới dạng thuốc sắc hoặc chè được dùng uống để lợi tiểu và

điều trị bệnh về thận và gan, cơn đau bụng và bệnh hoa liễu, làm thuốc long đờm trị

ho, thuốc hạ sốt, điều kinh và trị tiêu chảy [7]

1.4.Một số công trình nghiên cứu của cây Diệp hạ châu hiện nay [19]

Điều trị viêm gan

Tại Việt Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gancủa cây Diệp hạ châu đã được tiến hành, chẳng hạn: nhóm nghiên cứu của Lê VõĐịnh Tường, Học Viện Quân Y(1990-1996) đã thành công với chế phẩm

Hepamarin từ Phyllanthus amarus.

Tác dụng trên hệ thống miễn dịch

- Vào năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá tác dụng ức

chế sự phát triển HIV-1 của cao lỏng Phyllanthus niruri thông qua sự kìm hãm quá

trình nhân lên của virus HIV

- Năm 1996, Viện nghiên cứu Dược học Bristol Myezs Squibb cũng đã chiếtxuất từ cây Diệp hạ châu được một hoạt chất có tác dụng này và đặt tên là

“Nuruside”

Tác dụng giải độc

- Người Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc dùng cây Diệp hạ châu để trị cácchứng mụn nhọt, lở loét, đinh râu, rắn cắn, giun Nhân dân Java, Ấn Độ dùng đểchữa bệnh lậu Theo kinh nghiệm dân gian Malaysia, cây Diệp hạ châu có thể dùng

để trị các chứng viêm da, viêm đường tiết niệu, giang mai, viêm âm đạo,

- Công trình nghiên cứu tại Viện Dược liệu - Việt Nam (1987-2000) cho thấykhi dùng liều 10 – 50g/kg, cây Diệp hạ châu có tác dụng chống viêm cấp trên chuộtthí nghiệm

Điều trị các bệnh đường tiêu hóa

Cây thuốc có khả năng kích thích ăn ngon, kích thích trung tiện Người Ấn Độdùng để chữa các bệnh viêm gan, vàng da, kiết lỵ, táo bón, thương hàn, viêm đạitràng Nhân dân vùng Haiti, Java dùng cây thuốc này trị chứng đau dạ dày, rối loạn tiêuhóa,…

Bệnh đường hô hấp

Người Ấn Độ sử dụng cây Diệp hạ châu để trị ho, viêm phế quản, hen phế quản,

Tác dụng giảm đau

Kenneth Jones và các nhà nghiên cứu Brazil đã khám phá tác dụng giảm đau

mạnh và bền vững của một vài loại Phyllanthus, trong đó có cây Diệp hạ châu Tác

dụng giảm đau của cây Diệp hạ châu mạnh hơn indomethacin gấp 4 lần và mạnhhơn 3 lần so với morphin Tác dụng này được chứng minh là do sự hiện diện củaacid gallic, ester ethyl và hỗn hợp steroid (beta sitosterol và stigmasterol) có trongcây Diệp hạ châu.

Tác dụng lợi tiểu

Y học cổ truyền một số nước đã sử dụng cây Diệp hạ châu làm thuốc lợi tiểu.Một nghiên cứu của trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil-1984) đã phát hiệnmột alcaloid của cây Diệp hạ châu có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, cácnhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mậtcủa cây thuốc

Điều trị tiểu đường

Tác dụng giảm đường huyết của cây Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri) đã

được kết luận vào năm 1995, đường huyết đã giảm một cách đáng kể trên nhữngbệnh nhân tiểu đường khi cho uống thuốc này trong 10 ngày

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và đối tượng nghiên cứu

- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ 1/1 đến 1/4 năm 2021

- Địa điểm: phòng thí nghiệm–Khoa Dược–Trường Đại Học Duy Tân–Thànhphố Đà Nẵng

- Đối tượng nghiên cứu:

Cây Diệp hạ châu đắng (phyllanthus amarus) họ thầu dầu (euphorbiaceae) thu

hái vào tháng 1 năm 2021, dược liệu hái về được nhận dạng và so sánh với các mô

tả trong tài liệu dược thư quốc gia Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu cây Diệp hạ châu đắng

2.2.1 Định tính

Theo DĐVN V thì có thêm chuyên luận về cây Diệp hạ châu đắng (P amarus)

với các tiêu chuẩn điển hình của dược liệu: mô tả vi học, độ tro, định tính [4]

Một số tiêu chuẩn phân tích P amarus theo WHO:

Tro không tan trong acid: tối đa 4,5%

Hàm lượng chất chiết được trong cồn: 12-20% kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong ether dầu hỏa: 1,5-3,2%

kl/kl Hàm lượng chất chiết được trong chloroform: 0,3-1,0%

kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong methanol: 10,0 – 18,0% kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong cồn: 12-20% kl/kl

Phân tích thành phần hóa học: phyllanthin > 0,3% và hypophyllanthin

> 0,3% kl/kl bằng HPLC [17]

Bột dược liệu

Dịch chiết CHCl3

Tiến hành:

Bằng phản ứng hóa học:

Định tính thành phần hóa học trong bốn bộ phận của phyllanthus amarus: thân

cây, lá cây, rễ, quả được chiết xuất thành công với bốn dung môi: H2O, MeOH, EA, PE

2.2.1.1 Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm đối với dược liệu alcaloid

- Kiềm hóa bằng NH 4 OH đậm đặc (vừa đủ ẩm)

Định tính bằng phương pháp sắc ký

Bốc hơi tới cắn khô

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Hình 2.1 Sơ đồ Chiết xuất dược liệu alcaloid

Cắn alcaloid baseDịch chiết CHCl3

Dịch chiết nước

2.2.1.2 Định tính saponin bằng thử nghiệm tạo bọt

Dược liệu được chiết bằng dung môi thích hợp Bốc hơi dung môi và hòa tanlại trong một ít nước Lấy dung dịch này cho vào một ống nghiệm 16x160mm.Thêm nước cất, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiềudọc ống nghiệm trong 1 phút (=30 lần lắc) Quan sát lớp bọt sau 15 phút, nếu ốngnghiệm còn bọt trên bề mặt dung dịch chứng tỏ có saponin [3]

2.2.1.3 Định tính tanin

+ Kết tủa với gelatin: Dung dịch tanin (0,5–1%) khi thêm vào dung dịch gelatin1% có chứa 10% natri chlorid sẽ có tủa Acid gallic và các pseudotanin khác cũnglàm kết tủa gelatin nhưng với dung dịch tương đối đậm đặc [3]

+ Kết tủa với muối kim loại: Tanin cho tủa với các muối kim loại nặng nhưchì, thủy ngân, kẽm, sắt, đồng [3]

2.2.1.4 Định tính flavonoid với chì acetat trung tính

Phản ứng thực hiện trên giấy thấm; Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chìacetat trung tính tạo tủa với hầu hết các flavonoid có nhóm chức phenol [3]

2.2.2 Định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.2.1 Định nghĩa

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứacác hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố củachúng giữa các pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với phatĩnh và pha động [6]

2.2.2.2 Cấu tạo cơ bản

Nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [1]:

Hình 2.2 Cấu tạo máy HPLC

2.2.2.3 Ứng dụng HPLC trong kiểm nghiệm, nghiên cứu, dược liệu và hợp chất

tự nhiên

Xác định độ tinh khiết:

Nhờ độ phân giải và độ tin cậy cao, cùng với các bộ phận phát hiện cung cấpcác thông tin về cấu trúc, HPLC là một công cụ rất hữu ích trong việc xác định độtinh khiết của các chất nói chung và hợp chất tự nhiên nói riêng

Khi tiến hành HPLC phân tích, nếu một chất chỉ cho 1 đỉnh đối xứng, táchriêng biệt không bị chồng phủ với các đỉnh kế cận thì nó có khả năng là chất tinhkhiết Việc xác định sẽ chắc chắn hơn nếu hệ thống có trang bị detector cung cácthông tin về cấu trúc như detector dãy diod quang detector MS, IR…[2]

Các chỉ tiêu về độ ẩm, độ tro và tro không tan trong acid được xác định theocác phụ lục trong DĐVN V [20]

Xác định tro toàn phần không quá 20% (Phụ lục 9.8)

Độ ẩm của dược liệu không quá 12% (Phụ lục 9.6, 1g, 105oC, 4 giờ)

Tro không tan trong acid không quá 4.5% (Phụ lục 9.8)

2.2.3 Phương pháp định lượng phyllanthin

Tìm hiểu thành phần Lignan trong chi Phyllanthus:

Lignan là một hợp chất thường gặp trong các cây thuộc chi Phyllanthus Các lignan của chi Phyllanthus cho thấy phần lớn thuộc nhóm lignan đơn giản

dibenzylbutan hoặc nhóm 2,7’cyclolignan, có nối hay không nối vòng carboxyclic(gọi là cyclolignan) và các dẫn xuất thuộc nhóm này Theo các tài liệu nghiên cứuđây chính là khung của những chất có tác dụng trị ung thư, kháng khuẩn và đặc biệt

là tác dụng trên siêu vi gây viêm gan [14]

MeO MeO

Lignan đơn giản dibenzylbutane 2,7’-cyclolignan

Phyllanthin và hypophyllanthin có trong lá P amarus chính là hai lignan đại

diện cho hai nhóm trên Chúng được nhiều tài liệu công bố có tác dụng sinh họcđáng chú ý như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm, đặc biệt là trị viêm gan[13]

MeO CH 2 OCH 3

MeO CH 2 OCH 3

OMe OMe

MeO CH 2 OCH 3

O CH2 OCH3O

OMe OMe

OMe OMe

CH 2 OCH 3

OMe OMe

O O

2 OCH3OMe

OMe OMe

Nirtetralin Phyltetralin Lintetralin Niranthin

2.2.3.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất phyllanthin trong P amarus bằng HPLC

 Dung môi chiết:

Lựa chọn dung môi tốt nhất trong các dung môi cồn 25%, 45%, 70%, 96%, MeOH

 Phương pháp chiết:

Phương pháp chiết lignan từ dược liệu bằng đun hồi lưu trong dung môi hữu

cơ Phương pháp chiết lignan từ dược liệu bằng hỗ trợ siêu âm

 Khảo sát lần chiết:

Chuẩn bị một mẫu Chiết lần lượt 5 lần, mỗi lần 10ml MeOH Lấy 5ml chínhxác của mỗi lần chiết pha loãng trong bình 10ml Triển khai HPLC với các điềukiện đã khảo sát, tính toán hàm lượng phyllanthin có trong mỗi lần chiết So sánh sựthay đổi hàm lượng của các lần chiết sau với lần đầu để chọn số lần chiết phù hợp

2.2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát tốc độ dòng: triển khai trên cùng một mẫu thử với tốc độ dòng tăng dần từ 0,7ml/phút; 0,8ml/phút; 0,9ml/phút; 1ml/phút để lựa chọn tốc độ dòng phù hợp.Triển khai trên cùng một mẫu trong cùng điều kiện sắc ký với lần lượt các tỉ lệ dung môi thay đổi để chọn ra pha động có tỉ lệ thích hợp tách rõ các đỉnh cần định lượng

Các tỉ lệ dung môi pha động lần lượt được khảo sát có tỉ lệ nước giảm dần MeOH:H2O (30:70; 31:69; 32:68; 33:67; 35:65)

2.2.3.3 Phương pháp định lượng phyllanthin trong P amarus bằng HPLC Khảo sát độ tuyến tính

Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 10 mg chất chuẩn cho vào bình định mức10ml, thêm dung môi cho đủ thể tích bình Thu được dung dịch chuẩn có nồng độ1mg/ml Pha mẫu có nồng độ chất chuẩn từ 0,1; 0,125; 0,15; 0,175; 0,2; 0,25; và0,275mg/ml để xây dựng đường chuẩn, khảo sát khoảng tuyến tính

Khảo sát độ lặp lại

Chuẩn bị ít nhất 6 mẫu thử, tiến hành định lượng, tính kết quả đánh giá độlặp lại của quy trình chiết bằng các ứng dụng phân tích thống kê mô tả có trongphần mềm Excel

Khảo sát độ đúng

Thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào dược liệu đã được xác định hàm lượngphyllanthin chính Tiến hành chiết xuất và định lượng phyllanthin như đã nêu Tínhhàm lượng phần trăm chất chuẩn tìm lại được so với lượng ban đầu đã thêm vào

2.2.3.4 Định lượng các loài Phyllanthus thu thập được

Tiến hành chiết xuất và chuẩn bị mẫu 3 loài Phyllanthus thu thập được.

Tính toán kết quả định lượng có được hàm lượng Phyllanthus trong các loài này: P amarus, P urinaria, P sp.

2.3 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học của cây Diệp hạ châu đắng

Một nghiên cứu cho thấy, 50% yếu tố lây truyền của virus viêm gan B trongmáu đã mất đi sau 30 ngày sử dụng loại cây này ( với liều 900mg/ngày ) Trong thờigian nghiên cứu, không có bất kỳ sự tương tác nào giữa Diệp hạ châu với các thuốckhác

Theo một nghiên cứu tiến hành năm 1995, cây thuốc này có tác dụng lợi tiểu,giảm huyết áp tâm thu ở người không bị tiểu đường và giảm đáng kể đường huyết ởbệnh nhân tiểu đường

Thí nghiệm trên chuột cống trắng cho thấy: Phyllanthin và hypophyllanthinchống lại tính độc hại tế bào gây ra bởi carbontetraclorid và galactosami; triterpentriacontanol có tác dụng bảo vệ gan chống lại tính độc hại tế bào gây ra bởigalactosamin

Trên in vitro: cây chó đẻ có tác dụng kháng virus viêm gan B Một loạt những

acid phenolic phân lập từ các loài Phyllanthus có tác dụng ức chế DNA polymerase

của virus viêm gan B

Cây chó đẻ có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh,

trực khuẩn E.coli, Shigella dysenteriae, S.flexneri, S.shigae, Moraxella, và kháng chế phẩm đối với Aspergillus fumigatus Acid galic chứa trong cây có tác dụng

kháng khuẩn yếu Một dẫn chất phenolic và một flavonoid phân lập từ cây chó đẻ

có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn và kháng chế phẩm rõ rệt

Cao chiết với cồn - nước từ cây chó đẻ có tác dụng giảm đau ở chuột nhắt trắng

và cao cồn methylic có tác dụng hạ đường huyết trên chuột cống trắng đái tháođường

Năm 1998, trên thế giới đã có nước công bố nghiên cứu thành công điều trị viêmgan do virus B bằng cây Diệp hạ châu đắng.

Bệnh viện Quân khu IV đã thử nghiệm lâm sàng điều trị viêm gan B mãn tínhvới hepaphyl có chứa bột cây Diệp hạ châu đắng của xí nghiệp dược phẩm TrungƯơng Sau 4 tháng theo dõi, kết quả cho thấy các bệnh nhân đã giảm hoặc mất cáctriệu chứng lâm sàng của viêm gan B, phục hồi nhanh chức năng gan

Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc thuộc Viện Dược liệu (Bộ

Y tế) cũng nghiên cứu thành công và đưa vào sản xuất đại trà "Trà Diệp hạ châu”.Loại trà này có tác dụng giải nhiệt, trợ giúp tiêu hóa, giải độc do rượu và bia [9]

2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cây Diệp hạ châu đắng

2.3.1.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch

Nguyên tắc: hợp chất có tính kháng khuẩn được tẩm vào các đĩa giấy(ϕ = 2 mm) tiệt trùng với hàm lượng nhất định Khi đĩa giấy được đặt lên bề mặtmôi trường thạch đĩa đặc biệt, hợp chất có tính kháng khuẩn sẽ khuếch tán ra xungquanh và ngăn cản không cho vi sinh vật mọc lên, tạo nên vòng vô khuẩn (trongtrường hợp vi sinh vật bị tác động bởi hợp chất có tính kháng khuẩn được thử).Phương pháp sử dụng môi trường mà hầu hết các vi sinh vật phát triển được và hợpchất có tính kháng khuẩn có thể dễ dàng khuếch tán ra môi trường Đánh giá kếtquả dựa trên việc đo đường kính vòng vô khuẩn (phạm vi vi khuẩn không mọc đượcxung quanh đĩa tẩm giấy có chứa hợp chất kháng khuẩn) xuất hiện trên đĩa

2.3.1.2 Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng

Phương pháp này được sử dụng để xác định sự nhạy cảm của vi sinh vật đốivới các loại hợp chất có tính kháng khuẩn, bên cạnh đó giúp xác định được giá trịMIC, MBC của một hợp chất có tính kháng khuẩn đối với từng loại vi khuẩn Môitrường sử dụng: môi trường canh dinh dưỡng Kết quả được đánh giá dựa trên sựphát triển của vi khuẩn trong môi trường Ghi nhận độ pha loãng hợp chất khángkhuẩn cao nhất mà ở đó vi khuẩn không mọc để xác định giá trị MIC