Tài liệu PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CÁC CHẤT TỪ THỰC VẬT docx

Tách enzym Có thể sử dụng nhiều phương pháp như: Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính

MỤC LỤC

PHẦN I: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM THỰC VẬT

II Phương pháp thu nhận enzym từ thực vật trang 3

III.Những tiêu chuẩn tinh khiết của enzym trang 13

PHẦN II: THU NHẬN BROMELIN TỪ DỨA

PHẦN III: THU NHẬN PAPAIN TỪ ĐU ĐỦ

3 Nghiên cứu phương pháp mới thu nhận papain trang 39

PHẦN 1:

PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN

ENZYM THỰC VẬT

http://www.sarisegar.com/product.php

I NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN ENZYM [1]:

Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hoá họcnên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học Mặc dù enzym có trong tất cả các cơquan, mô của động, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzym nhất làtách với quy mô công nghiệp một cách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành trong nhữngtrường hợp nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzym với hiệu suất cao

Trong tay con người có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quanđộng vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

1 Từ động vật:

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày,tim … những phế liệu của công nghiệp thịt – dùng để tách enzym rất tiện lợi Dịch tụy cóchứa amilase, lipase, protese, ribonuclease và một số enzym khác

Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê nghé người ta thu chế phẩm renin để làm đông sữa trongsản xuất phomat Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật Khác với pepsin, renin cókhả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein Renin là chế phẩm enzym cógiá trị lớn trong công nghiệp

Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân,protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thuenzym không lớn lắm

2 Từ thực vật:

Người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân như papain, bromelin,ficin Đó là các protease thực vật Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cáchkhuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấy khô nghiền nhỏ.Bromelin thu từ thân dứa Sau khi hái quả người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dungmôi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus

Thực vật (malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác) cũng là nguồn enzym có truyềnthống được dùng trong công nghệ rượu, bia, bánh kẹo Malt chủ yếu có chứa amylase hoạtđộng, còn các enzym thuỷ phân khác hoạt động yếu Tuy thế, thu các chế phẩm enzym thuầnkhiết từ malt không phổ biến và không kinh tế, bởi lẽ khi tách enzym tinh khiết từ malt thìnhững chất không hoà tan quí giá (tinh bột, protid) sẽ không được sử dụng Mặt khác, malt là

nguyên liệu đắt tiền Lượng enzym thu được từ thực vật là không lớn lắm so với lượng nhiênliệu tiêu hao.

3 Từ vi sinh vật:

Sau khi đã điểm qua các nguồn nguyên liệu động thực vật chính có thể từ đó chiết xuấtcác chế phẩm enzym, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu đó vì nguyên nhân nào khác(về công nghệ hay kinh tế ) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô côngnghiệp lớn các chế phẩm enzym nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân Nhưvậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầyhứa hẹn, vì dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzym sẽ khắcphục được những khó khăn và hạn chế trên

Ta có thể thu enzym từ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Đây là nguồn nguyên liệu vôtận để sản xuất một lượng enzym lớn, việc thu chế phẩm dễ dàng bên cạnh đó enzym của visinh vật có hoạt tính mạnh

II PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [1], [2]:

2 Thuyết minh quy trình công nghệ:

a Phá vỡ tế bào

Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhânmicroxom, mitochrondri …) của tế bào Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màngcủa tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào Do đó để có thể chiết rút cácenzym nội bào, trước hết cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào Có thể phá vỡ cấu trúc của

tế bào bằng các biện pháp:

• Xay nhuyễn

• Nghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch …

• Đồng hóa: dùng áp cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ đó làm giảm độ nhớt củadịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà không làm biến tính chúng Điều nàycũng tạo thuận lợi khi ta sử dụng phương pháp siêu lọc để làm tinh sạch enzym

• Sử dụng sóng siêu âm

• Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine

b Thu dịch enzym thô

Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịchđệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính

Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly

c Tách enzym

Có thể sử dụng nhiều phương pháp như:

Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh

lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết hợp vớiđầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương Điều này làm cho cảntrở sự kết tủa của chúng Enzym có bản chất protein, do đó để kết tủa được enzym phải phá

vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dung dịch enzym các dung môi hoặc các hóachất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein,giúp cho protein tủa xuống

Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở nồng độ caonhư ammonium sulphate

Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là:

- Nồng độ của ammonium sulphate

pháp siêu lọc để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn protein enzym đồng thời cô đặcenzym.

Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng Trong mỗi sợi rỗng lại có chứa nhiềusợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua.Các sợi này được chế tạo từ các loại polimer bền như fluoro polimer (FS), cellulose acetate(CA), polysulphone(GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thíchhợp Ví dụ, cô đặc protein: dùng màng FS, GR, cô đặc enzym: dùng màng GR

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc

- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sử dụng Khichọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quátrình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng

- Ap suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất chođến khi đạt giá trị cực đại Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm

Các kiểu siêu lọc:

Kiểu một bước

Hình II.2c.1: Kiểu lọc một bước

Kiểu lô: chất lỏng chảy tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậuchứa đạt được như yêu cầu

Chậu chứa

Cô đặcThấm qua màn

Hình II.2c.2: Kiểu lô

Kiểu thể tích không đổi: dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ở trongchậu chứa không thay đổi và chất lỏng tuần hoàn qua màn đến nồng độ của dịch cô đặc ởtrong chậu chứa đạt được như yêu cầu

Hình II.2c.3: Kiểu thể tích không đổi

Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc:

- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể

- Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính

- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym Trong quá trình thựchiện nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao

- Trong quá trình siêu lọc nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzym, do

đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất màkhông làm mất hoạt tính enzym càng cao Trong quá trình siêu lọc có thể thực hiệntốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC)

Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịch enzym) hoặc trêncột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym Hấp phụ chọn lọcenzym có thể thực hiện bằng một trong 2 cách – chất hấp phụ protein tạp hoặc chất hấp phụenzym Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC Enzym sau đó được chiết sau đóbằng các dung môi thích hợp

d Tinh sạch

Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài

Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính

Chậu chứa Thể tích không đổi

bơm

Cô đặcThấm qua màng

enzym, cần tiến hành nhanh quá trình trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn, môitrường có pH thích hợp và không có mặt các chất gây biến tính.

Bốn phương pháp chính và cổ điển thường được áp dụng khi tinh chế enzym là:

- Hấp phụ trên gel

- Phương pháp thẩm tích

- Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose)

- Kết tủa phân đoạn

- Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Để tinh chế enzym một cách hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau

Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách:

- Hấp phụ âm tính: dùng chất hấp phụ để tách tạp chất ra khỏi dung dịch enzym

- Hấp phụ dương tính: enzym được hấp phụ và được tách ra khỏi những cấu tử kháctrong dung dịch, sau đó được rửa giải khỏi chất hấp phụ bởi dung dịch đệm pHkiềm hoặc các dung dịch đệm khác có khả năng rửa giải enzym Sau khi ly tâm đểloại các hợp chất không tan, dung dịch enzym có thể được thẩm tách để loại dungdịch đệm

Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau:

- Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%

- Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1

- Môi trường hơi acid, pH = 5 - 6

- Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch Sự tồn tại của bất kì một lượngmuối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ Vì thế một lượng lớn hơnchất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả mong muốn

- Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0oC trong lúc trộn dung dịchvới chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng Đây là một phương pháp nhanh, sựcân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịch hình thành rất sớm và chỉ sau vàiphút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ

Quá trình được tiến hành tuần tự như sau:

- Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp

- Trộn đều

- Quay lắng

- Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào

Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụ phải đượcđiều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy đi khoảng 10%enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại 10% enzym trong dung dịch.

Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ Nếu enzym không đượcrửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâm lại Trong sản xuất, đểgel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải có cánh khuấy với tốc độ cao Giảihấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch đệm base nhẹ (pH = 7,6) Quá trình càng hiệu quảvới dung dịch (NH4)2SO4 10% Thể tích dung dịch rửa giải không nên quá lớn, thường là íthơn thể tích gel ly tâm Tốt hơn nên tiến hành rửa giải nhiều lần với thể tích nhỏ hơn là mộtlần với một lượng lớn

Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đã hòa tan thìcho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịch đệm ban đầu Túicellophane được chuẩn bị bằng cách: trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm trên.Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu có thể thì nên thay dung dịch đệm bênngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằngmột máy khuấy từ

Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vậntốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt quamức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mốitương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính củaenzym do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp

Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinh khiết Quátrình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử Nhưng trênthực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá trình trên

Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm với cột traođổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải (grdient muối) vớinồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi cột các enzymvừa liên kết với nhựa Khi đó enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏinhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khácnhau, trong đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất

Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặc biệt làamberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose như diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC) Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thuđược hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm đẳngđiện trong vùng kiềm, đồng thời việc rửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặpkhông ít khó khăn Vì thế DEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi hơn do cókhả năng loại bỏ được các tạp chất acid nucleic

Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau:

- Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một lần quacột để loại muối ra khỏi dung dịch protein.

- Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích của

- Tăng nồng độ các dung dịch đệm

- Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch

- Thay đổi pH của dung dịch tách

Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạn chứa enzymcần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làm khô) bằng cách loại hơi ẩmtrong chân không ở nhiệt độ thấp

Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợp protein

và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa Nhờ đó, người ta đãloại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩm enzym thuần nhất về điện ly

Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym và cũng làphương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein Gần đây, phương pháp nàyđược áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzym cuối cùng

Nguyên tắc:

Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base Nếu các phân tử proteinenzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương)thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển trong điện trường ở những điềukiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau Do đó, hỗn hợp protein được phântách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt

Những phân đoạn enzym thu được được xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzym và biểudiễn trên biểu đồ để thấy rõ

Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh Tuy nhiên, kết tinhkhông có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết Hoạt độ riêng của tinh thể tăng khi các enzymtái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần cho đến khi hoạt độ riêng tăng đếnmột giá trị cao nhất, không tăng được nữa

Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như là mộtphương pháp phân đoạn protein có giá trị Vì thế, tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như làmột phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sử dụng ở những giai đoạn tinh thểcuối cùng

Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium sulfat Để thuđược những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc tuần

Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch enzym đậm đặc cho đến khi bắtđầu thấy đục rõ Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông quaống mao quản hay màng thẩm tích ( trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩmtích đối với dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giảnđược làm bay hơi chậm Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vàingày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muốn Khi thêm nồng

độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình Ngoài ra cần thử thực nghiệmnhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh Thay vào đó, quá trình kết tinh được tiếnhành ở những nồng độ muối xác định bằng cách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ.Nếu trước khi kết tinh mà thấy dung dịch enzym loãng thìa cần cô đặc dung dịch trước

Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là quá trìnhphân đoạn với dung môi hữu cơ Những tinh thể lắng xuống đựơc tách riêng và được tái kếttinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng Sự tái kết tinh được làm đi làm lại nhiều lần chotới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa

Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phân đoạn khácnhau phải được xác định Trình tự hiệu quả nhất được xác định thông qua thực nghiệm, nhưngcần lưu ý một số điểm sau:

- Hiển nhiên quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng

- Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng một phầnđáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá những lượng lớn dịchchiết ban đầu

- Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặc kết tủabằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên, khi đó ta có nhữngthể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng tách riêng protein tủa xuống

- Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên aluminumhydroxide hoặc calcium phosphate Những tủa thu được khi đó dễ tách biệt bằngcách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ

- Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích do enzym rất kémbền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thông thường nhất (trừ khi sửdụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế có trong nước như Cu Enzymthường có ái lực cao đối với những enzym này ngay cả khi nồng độ của chúngtrong nước rất thấp Điều này không quá nghiêm trọng đối với các chế phẩm thônhư trong các giai đoạn sau này

Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích Cột chứajela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn toàn khỏi những thể tíchdung dịch lớn Các phương pháp sử dụng cột thường không tiện lợi khi áp dụng trong phạm visản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho những giai đoạn sau của quá trình tinh chế So vớicác phương pháp khác, những phương pháp sử dụng cột tiêu hao một không gian đáng kể choviệc lắp cột, rửa và rửa giải cột, đồng thời sự hoà tan enzym trong quá trình rửa giải có thểxảy ra

Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những enzym không có hoạttính Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số enzym, do đó hoạt tính của enzym chỉ tăng lênrất ít.

Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không khí từ quạt máy vàodung dịch đựng trong các túi cellophane, làm đông đặc bằng cách làm bốc hơi chân không,làm đông khô,… thường gây biến tính enzym và ngoài sự cô đặc enzym còn xảy ra sự giatăng nồng độ muối Tốt nhất để cô đặc dung dịch protein-enzym, ta tiến hành siêu ly tâm hoặc

xử lý bằng huyền phù dextran sephadex khô

Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn chứa một lượng nhỏprotein không hoạt động, thì điện di có thể đưa lại những kết quả mỹ mãn về mặt làm giàuenzym Muốn vậy ta cần có enzym với thể tích nhỏ

Phương pháp sắc kí trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể được sử dụng để chiếtxuất sơ bộ các enzym Từ hỗn hợp protein phức tạp, ta có thể tách riêng từng phân đoạnprotein enzym Vì thế phương pháp này cùng với sự sử dụng các chất trao đổi ion khác nhau

có thể được sử dụng trước khi điện di hoặc sau khi điện di

Ở bất kì giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết ra dưới dạng khô bằngcách đông khô Thế nhưng, cùng với việc tinh chế loại trừ những chất lẫn theo, tính dễ hỏngcủa enzym cũng tăng lên Các chế phẩm enzym thô có thể được duy trì khá lâu ở 40oC

Ngoài những phương chính kể trên còn có một số phương pháp khác sử dụng cho từngtrường hợp riêng cụ thể và được áp dụng khi các phương pháp nêu trên không đem lạihiệu quả cao Có thể kể đến ba phương pháp sau:

Làm biến tính bởi chloroform (còn gọi là phương pháp Tsuchihashi): lắc dung dịch enzymvới hỗn hợp cồn và chloroform để tách các protein không hoạt động ra trước

Sử dụng các chất gây tủa khác: thêm vào thận trọng một lượng xác định muối kim loạinặng (Pb) ở giai đoạn đầu để loại bỏ những protein không mong muốn mà không làmgiảm hoạt độ enzym

Cô đặc: đối với những trường hợp chất hấp phụ có ái lực cao với enzym thì nước giải hấpchỉ chứa enzym với nồng độ thấp, do đó nếu ta cô đặc dung dịch enzym tới một lượng nhỏhơn sẽ đạt được hiệu quả tinh chế cao hơn Có thể sử dụng các cách sau:

- Đông lạnh dung dịch enzym và tách bỏ đá

- Đặt dung dịch enzym vào ống thẩm tích và để nó trong dòng không khí ấm

- Làm đông khô (thường được sử dụng, cô đặc cả enzym và muối)

- Cô đặc dung dịch bằng siêu lọc: muối và nước chảy qua màng lọc, còn enzym bịgiữ lại, sau đó rửa màng lọc thu nhận enzym

- Thêm sephadex khô vào giúp giữ lại cả muối và nước và làm tăng nồng độ enzymtrong dung dịch

Trong tất cả các phương pháp phân đoạn enzym (điện di, sắc kí…), cần phải loại trừnhững ion kim loại nặng, chất oxi hóa… độc đối với enzym có trong dung dịch muối trongnước hoặc những pha rắn bất động bằng cách dùng thuốc thử tiolic, các chất khử thích hợp(EDTA, mercaptoethanol, unitiol), complexon…

III NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM [2]:

Để xác định xem enzym được chiết ra có phải là tinh khiết không hay còn lẫn cácprotein không hoạt động khác, ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên tính chất vật

lý của protein

- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy siêu lytâm: nếu phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất, tuy nhiên kếtquả không chính xác lắm vì những protein có phân tử lượng bằng nhau sẽ lắng vớitốc độ như nhau và cho cùng một đỉnh chung

- Điện di: dung dịch enzym khi được điện di khu vực trong jela tinh bột hoặc thạchchỉ ra một đỉnh cân đối là enzym thuần khiết, tuy nhiên khi hàm lượng nhữngprotein tạp nhỏ (<1%) thì khó phát hiện ra đúng

- Xác định hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang phổ đặctrưng cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc hiệu

- Kết hợp phân tích điện di và những phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệtđiện di trên thạch theo grabar Phương pháp này khá nhạy

- Xác định độ hòa tan của enzym theo norchrop: ít nhạy nhưng có triển vọng

- Thường để xét độ thuần nhất của enzym thì phải dựa trên sự so sánh các kết quảthu được từ một vài phương pháp khác nhau

- Cần lưu ý rằng, những chế phẩm enzym càng tinh khiết thì càng dễ hỏng và khibảo quản các dung dịch ở 4oC đều nhanh chóng mất hoạt tính Vì thế, khi tái kếttinh enzym lặp lại, ta thường thấy có sự giảm hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ônhiễm bởi phần enzym bị ức chế

PHẦN 2:

THU NHẬN BROMELIN TỪ DỨA

I TỔNG QUAN VỀ ENZYM BROMELIN [2]:

1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu:

Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromecliaceae có nguồn gốc từNam Mỹ Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusus được sửdụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzym và ngoài ra còn được sửdụng trong một số lĩnh vực khác như dược, mỹ phẩm……Phần thân, chồi và lá sau khi thu

hoạch quả có thể được sử dụng để thu nhận enzym bromelin làm giấy, lấy sợi hoặc làm phânbón.

Hình I.1.1: Chồi dứa Hình I.1.2: Cây dứa

2 Đặc điểm enzym bromelin:

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm –SH, có khả năngphân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân, chồi, trái,vỏ)

Trước đây, cây dứa được sử dụng như một loại cây làm thuốc Năm 1957, Heinickenhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelin và ngưới ta bắt đầu tìm cách chiếttách nó Tuỳ theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin quả vàbromelin thân là nhóm enzym có giá trị kinh tế Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa,bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau

Bromelin là enzym thuỷ phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật Mộttrong những lợi ích của nó là làm chất giúp cho tiêu hoá vì nó hoạt động trong môi trườngacid của dạ dày và cả môi trường kiềm của ruột non Bromelin có thể thay thế được cả enzymtiêu hoá khác như pepsin và trypsin Bromelin có tác dụng kháng viêm, kháng sưng bằng cáchngăn cản những tiềm chất gây viêm

Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa Nó có khả năng thuỷ phân khá mạnh vàhoạt động tốt ở pH từ 6 - 8, trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da (lớn gấp 1,5 lần so vớipapain)

Thịt quả chỉ có hoạt tính enzym bromelin kể từ ba tháng trước khi chín, trong đó hoạttính enzym cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảmxuống nhưng không mất hẳn

Bromelin có thể thu được trong thân dứa: trung bình có thể thu được 3,6 kg bromelin

từ 378L dịch từ thân cây dứa

3 Tính chất enzym bromelin:

Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thuỷ giải protein Trongdịch chiết bromelin còn có chứa một ít peroxydase, phosphatase và chất ức chế protease Phầnlớn các hoạt động sinh lý của bromelin không chỉ phụ thuộc vào phân đoạn có hoạt tính thuỷphân protein mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác trong bromelin

Hiện tại người ta ghi nhận được bromelin trong thân dứa có 8 thành phần cơ bản cóhoạt tính thuỷ phân protein Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5 Phân đoạn có tínhmạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số Người ta ước tính rằng khoảng 50%protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate pH tối thích củacác phân đoạn F4 và F5 là 4,0 –4,5 và của F9 thì gần với pH trung tính Dịch chiết bromelintoàn phần có hoạt động trong khảng pH 4,5 – 9,8 Bromelin được chiết tách từ các phần khácnhau trên cây dứa và bromelin từ các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhaunhưng hoạt tính thuỷ phân protein thì giống nhau Bromelin không ổn định với nhiệt độ do đócác hoạt động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu như quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quảnkhông thích hợp

Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật Nồng độ cao nhấtcủa bromelin được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ Tuy nhiên hoạt động thuỷ phânprotein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội sinh và yếu tố

2 macroglobulin

Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác nhưpapain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử glycan gồm 3 manose, 2 glucoamin, 1xylose và 1 fructose Sợi hydrate cacbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide Trong sợihydrate cacbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử

Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thì tuỳ theophương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khácnhau Bromelin có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 321-144 amino acid vàbromelin quả là 283-161 amino acid

Bromelin thân là một sợi polypepide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầucacbonhydrate là glycin, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanin

Bảng I.3.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin.(mg/100g protein)

Cấu trúc không gian của bromelin:

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cách sắp xếpamino acid trong phân tử bromelin như sau:

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

-Gly – Cys – Lys - Bromelin là một protease trong tâm hoạt hoạt động có chứa cysteine và hai sợipolypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắpxếp phức tạp

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạttính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra, trong phân tử còn cócác ion Zn2 + có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym

Bromelin tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu cơ.Cũng như papain, bromelin hoạt động tốt nhất ở vùng pH trung tính, nhiệt độ 700C Vì tâmhoạt động của bromelin có chứa nhóm -SH nên dễ dàng bị ức chế bởi chất oxi hóa như H202,metyl bromua, ion kim loại …và được hoạt hóa bởi chất khử (cystein, sunfit, bisunfit,cyanid…)

Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi và cộng sựnghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:

Bảng I.3.2: Những tính chất vật lý của protein thân:

 Hoạt tính phân giải của bromelin:

Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase Bromelin thân cónhiều cơ chất tự nhiện và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp

Bảng I.3.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin

Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn bromelin quảxanh và bromelin quả chín

Bảng I.3.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin

Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

* : ở điều kiện nhiệt độ 5oC và pH 6,0

BAA: Benzoyl-L-Arginine amide

BAEE : Benzoyl-L-Arginine ethyl ester

BAEM : Benzoyl-L-Arginine methyl ester

Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân và bromelinquả chín So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao hơn gấp 140 lần

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin

Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như

cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức,phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch

 Anh hưởng bởi cơ chất :

Trên những loại cơ chất khác nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau Nếu cơ chất làhemoglobin thì bromelin mạnh gấp 4 lần papain, với casein tương đương, với cơ chất nhưBAA, BAEE thì thấp hơn

 Anh hưởng bởi nhiệt độ:

Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụngcàng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng độenzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym

Ở dịch chiết quả (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn còn hoạt tínhnhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ Ở 5oC, pH 6,1 thì enzym bị mất 50% hoạttính trong vòng 20 phút Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính

 Anh hưởng của độ pH:

pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym pH tối thíchcủa bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ

cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt.Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là amonium sulfate hoặcmolypdenum carbonate thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH 4,6 – 5,4.Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6,0 và pH 8,0, ổn định

ở pH 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63oC Enzym bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60-70% hoạt tính.Enzym bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thích của enzym là 5-8 tuỳ thuộcvào cơ chất

 Anh hưởng bởi ion kim loại:

Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym do chúng thường gắn vào trungtâm hoạt động của enzyme Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính củaenzym bromelin và mức độ kiềm hãm thay đổi tuỳ thuộc nồng độ muối Ngoài ra còn cónhững chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm -SH của trung tâm phảnứng của enzyme

 Anh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản:

Bảng I.4.1: Anh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin

Điều kiện bảo quản Hoạt tính (UI/mg protein)

II PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN BROMELIN [2]:

Quy trình công nghệ:

Chồi, thân, lá dứa

1 Phá vỡ tế bào

- Quả, thân hoặc chồi dứa được xay nhuyễn để phá vỡ tế bào mô dứa

- Ta có thể dùng phương pháp đồng hóa để vừa phá vỡ tế bào vừa giảm độ nhớtcủa dịch chiết

2 Thu dịch enzym tho

Tiến hành: quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, lytâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịchchiết có chứa bromelin

3 Tách enzym

Ta có thể sử dụng các phương pháp:

 Phương pháp kết tủa

dung dịch nước dứa sau ly tâm Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-4oC Ly tâm hỗn hợp với tốc

độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa Thêm hai thể tích acetone lạnh vào, để 1 giờ ở

0-4oC, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh

tỷ lệ 4 nước dứa : 1 cồn, trộn đều, để ở nhiệt độ 0oC trong 3-4 giờ Ly tâm hỗn hợp với tốc độ

6000 vòng/phút trong 5 phút Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa

từ 532g ammonium sulphate vào và khuấy đều (dung dịch đạt bão hòa là 70%) Để yên ởnhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 5 phút để thu nhậntủa

 Phương pháp hấp phụ:

Có thể sử dung kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin

Cấu tạo kaolin: kaolin có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do đó chúng cótính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo hình kết dính Một tính chất quan trọng là kaolin có độphân tán cao nên có tính hấp phụ tốt Kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện tích tiếp xúctăng lên rất nhiều Một lý do khác dẫn đến khả năng hấp phụ của kaolin cao là do trên bề mặtkaolin có chứa rất nhiều ion OH- và O2-, những ion này có khả năng liên kết tương đối bềnvững với các chất bị hấp phụ

Tiến hành: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau

ly tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/mL dung dịch nước dứa Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó

ly tâm để thu tủa Tủa thu được gọi là bromelin-kaolin

 Phương pháp siêu lọc: