BÁO CÁO KHCN: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ GẮN HAI MÀU (Dual-ISH) BẰNG MÁY NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN HER2 TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 25-30% số bệnh nhân UTV có khuếch đại gen HER2, một tiền gen nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể thứ 17, dẫn đến biểu hiện quá mức thụ thể HER2 và đ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

Cơ quan chủ trì đề tài:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC - ĐẠI HỌC HUẾ

Chủ nhiệm đề tài:

PGS.TS ĐẶNG CÔNG THUẬN

Huế, tháng 8 năm 2019

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư thường gặp nhất và là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở phụ nữ trên toàn thế giới cũng như tại Việt Nam

Tỷ lệ mắc bệnh UTV có xu hướng tăng trên toàn thế giới nhưng tỷ lệ

tử vong vẫn từng bước giảm dần nhờ những thành tựu đạt được trong phòng bệnh, phát hiện sớm, chẩn đoán và điều trị

HER2 (thụ thể yếu tố phát triển biểu bì người, Human Epidermal Receptor) là một trong bốn thành viên của họ các thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR) Chúng là các thụ thể tyrosine kinase xuyên màng có liên quan chặt chẽ với nhau Các thụ thể tyrosine kinase giữ vai trò quan trọng trong điều hòa dẫn truyền tín hiệu của yếu tố tăng trưởng Sự rối loạn hoạt động của chúng sẽ ảnh hưởng lên các quá trình tế bào như tăng sinh, tân sinh mạch máu, chu kỳ

tế bào, sự sống sót và quá trình tế bào chết theo chương trình làm cho tế bào trở nên ác tính

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 25-30% số bệnh nhân UTV

có khuếch đại gen HER2, một tiền gen nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể thứ 17, dẫn đến biểu hiện quá mức thụ thể HER2 và điều này có liên quan mật thiết đến diễn tiến xâm lấn và tiên lượng xấu trên lâm sàng, bao gồm nguy cơ cao của tái phát, di căn, phát triển nhanh của khối u và thời gian sống thêm của bệnh nhân giảm đi

Ứng dụng lâm sàng quan trọng nhất của xét nghiệm HER2 là lựa chọn bệnh nhân cho việc điều trị đích bằng trastuzumab (Herceptin) - một loại kháng thể đơn dòng Herceptin đã được Uỷ ban thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận dùng điều trị UTV giai đoạn muộn có HER2 dương tính từ năm 1997

Để xác định tình trạng HER2, kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Fluorescent insitu hybridization - FISH) được xem như là tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh quang trong phòng xét nghiệm chuyên biệt, hơn nữa là các tiêu bản huỳnh quang không thể lưu trữ được lâu dài để xem xét lại vì tín hiệu huỳnh quang sẽ mất dần và giá thành xét nghiệm khá đắt

Hiện nay, kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu (Dual-ISH) bằng cách gắn enzym có thể thay thế được kỹ thuật FISH để đánh giá cả sự khuếch đại gen HER2 và của nhiễm sắc thể 17 trên cùng một tiêu bản Phương pháp

này khắc phục được các nhược điểm của FISH Tháng 6 năm 2011, FDA

đã cấp phép sử dụng kỹ thuật xét nghiệm Dual-ISH để xác định tình trạng khuếch đại của gen HER2 trong UTV Kỹ thuật này đã và đang được sử dụng ngày càng rộng rãi trên thế giới

Do kỹ thuật Dual-ISH là một kỹ thuật hiện đại và được phép sử dụng trong thực hành lâm sàng từ năm 2011 nên chưa được đầu tư, triển khai thực hiện rộng rãi ở Việt Nam

Nhằm mục đích triển khai kỹ thuật chẩn đoán mới để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTV tại khu vực Miền Trung - Tây Nguyên

và góp phần nâng cao chất lượng điều trị đích phân tử và cải thiện tiên lượng bệnh UTV trong khu vực; chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm 2 mục tiêu sau:

1- Hoàn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát hiện

sự khuếch đại gen HER2 trong ung thư biểu mô tuyến vú tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế

2- Xác định sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu, mối liên quan với sự biểu lộ protein HER2, tình trạng thụ thể nội tiết và các yếu tố tiên lượng kinh điển trong ung thư biểu mô tuyến vú

Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo của đề tài:

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở miền Trung - Tây Nguyên áp dụng

kỹ thuật Dual-ISH để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTV với số lượng mẫu khá lớn

Kỹ thuật này sẽ là minh chứng cho tính sáng tạo, năng động của đội ngũ giảng viên, kỹ thuật viên của Trường ĐHYD Huế luôn đi đầu trong ứng dụng công nghệ mới, kỹ thuật hiện đại trong đào tạo, chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu này cũng sẽ là minh chứng rằng việc ứng dụng kỹ thuật Dual-ISH để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 sẽ cho kết quả khách quan hơn, thuận tiện hơn và giá thành thấp hơn so với kỹ thuật FISH nên sẽ là lựa chọn hàng đầu cho các cơ sở y tế muốn áp dụng

kỹ thuật lai tại chỗ trong tương lai

Kết quả nghiên cứu này có thể được chuyển giao, áp dụng cho các bệnh viện tuyến Trung ương, tuyến Tỉnh nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán, phát hiện sự khuếch đại gen HER2 và lựa chọn bệnh nhân cho việc điều trị đích phân tử, góp phần cải thiện chất lượng sống và tiên lượng bệnh cho bệnh nhân UTV

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DỊCH TỄ HỌC VÀ YẾU TỐ NGUY CƠ BỆNH UTV

1.1.1 Dịch tễ học

Tại Việt Nam, theo ghi nhận ung thư giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV ở các tỉnh miền Bắc là 19,6/100.000 dân, đứng đầu trong các loại ung thư ở nữ và ở các tỉnh phía Nam là 16,3/100.000 đứng hàng thứ 2 sau ung thư cổ tử cung Cụ thể tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở Hà Nội

là 29,7/100.000, tại Thừa Thiên Huế là 9,4/100.000, tại TP Hồ Chí Minh năm 2003 là 19,4/100.000 Theo Nguyễn Bá Đức nhìn chung tỷ lệ mắc UTV ở Việt Nam từ 2001-2007 có xu hướng tăng rõ

1.1.2 Yếu tố nguy cơ:

Các yếu tố nguy cơ của UTV nhìn chung được chia thành 2 loại: những yếu tố nguy cơ có thể kiểm soát được và những yếu tố nguy cơ không kiểm soát được

1.1.2.1 Một số yếu tố nguy cơ không kiểm soát được:

- Giới nữ: Nữ giới có nguy cao mắc bệnh UTV gấp hơn 100 lần so với nam giới

- Tuổi cao: Hầu hết các trường hợp UTV được phát hiện ở phụ nữ trên 55 tuổi

- Gen: Khoảng 5-10% UTV liên quan tới gen

- Chủng tộc: Phụ nữ da trắng có tỷ lệ mắc UTV cao hơn phụ nữ Mỹ gốc Phi Tỷ lệ mắc và chết vì UTV ở phụ nữ châu Á, Tây Ban Nha thường thấp hơn

- Tiền sử bản thân hay gia đình mắc UTV: Người có mẹ hoặc chị em gái ruột mắc bệnh UTV có nguy cơ mắc bệnh UTV gấp hai lần phụ nữ không có tiền sử gia đình

- Mô vú đặc: Phụ nữ có vú với tỷ lệ mô tuyến và mô sợi nhiều, ít mô

mỡ có nguy cơ gấp 1,5-2 lần người có mật độ vú trung bình

- Bệnh vú lành tính: Phụ nữ có u tăng sản biểu mô không điển hình

có nguy cơ mắc bệnh UTV cao hơn 4 - 5 lần so với những người không

có sự thay đổi tăng sinh ở vú

- Tuổi có kinh lần đầu sớm (đặc biệt trước 12 tuổi) và mãn kinh chậm (sau 55 tuổi) làm tăng nguy cơ UTV hơn do thời gian tiếp xúc với estrogen, progesterone dài hơn

- Nhiễm xạ khi <40 tuổi (khi tuyến vú còn đang phát triển) làm tăng

tỷ lệ mắc UTV

- Sử dụng thuốc Diethyl-stibestrol (DES): được dùng ngừa sẩy thai

1.1.2.2 Một số yếu tố có thể kiểm soát:

- Rượu: Những người uống 2-3 ly rượu hàng ngày tăng nguy cơ mắc UTV lên 20%

- Thừa cân và béo phì trước mãn kinh làm tăng nguy cơ mắc UTV típ

bộ ba âm tính

- Ít vận động: Có thể liên quan tới cân nặng, nhiễm trùng hoặc thay đổi hoóc môn

- Không có con hoặc có con muộn (sau 30 tuổi)

- Không nuôi con bằng sữa mẹ: Cho con bú 1-2 năm sau sinh làm giảm nguy cơ UTV

- Thuốc tránh thai và liệu pháp thay thế hormone sau mãn kinh

1.2 PHÂN LOẠI, PHÂN ĐỘ, GIAI ĐOẠN UNG THƯ VÚ

1.2.1 Phân loại ung thư biểu mô tuyến vú

Kể từ phân loại mô bệnh học đầu tiên của WHO năm 1968, đến nay

đã có nhiều bản sửa đổi và bổ sung Mới đây năm 2012, ấn bản lần 4 của WHO về hệ thống phân loại mô bệnh học UTV có nhiều điểm thay đổi

và bổ sung quan trọng

1.2.2 Phân độ mô học ung thư biểu mô tuyến vú

Từ những ngày đầu nghiên cứu về bệnh học vi thể, người ta đã nhận

ra rằng, những u ác tính có sự khác nhau về mức độ ác tính và điều này được biểu hiện trên hình thái (Hanseman 1890 và Dennis 1891)

Bảng 1.2 Đánh giá độ mô học UTBM ống xâm nhập theo hệ thống phân độ Scaff-Bloom-Richardson (SBR) cải biên [13]

- Độ 1: 3-5 điểm, biệt hóa cao

- Độ 2: 6-7 điểm, biệt hóa vừa

- Độ 3: 8-9 điểm, biệt hóa kém

Hiện nay, hầu hết các cơ sở y tế trong nước đều phân độ mô học trong chẩn đoán UTV

1.2.3 Phân loại theo TNM và xếp nhóm giai đoạn

1.2.3.1 Phân loại theo TNM (TCYTTG 2003)

1.2.3.2 Xếp giai đoạn theo Tổ chức Y tế Thế giới 2003

1.3 HÓA MÔ MIỄN DỊCH VÀ HER2 TRONG UNG THƯ VÚ 1.3.1 Hóa mô miễn dịch trong ung thư vú

Trong thời gian gần đây, nhiều dấu chứng sinh học của tế bào u đã được đề nghị sử dụng để bổ sung vào vào danh sách các yếu tố dự đoán tiên lượng cũng như dự đoán đáp ứng hoá trị cho bệnh nhân UTV

1.3.2 Gen Her-2/neu (c-erbB-2) trong ung thư vú

Sản phẩm của Her-2/neu là một loại glycoprotein thuộc màng tế bào trong họ thụ thể của yếu tố phát triển thượng bì, được tổng hợp từ proto-oncogen Her-2/neu nằm tại vị trí 21 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 17 (ký hiệu 17q21)

Protein c-erbB-2 là sản phẩm của gen Her-2/neu, có trọng lượng phân tử 185kd, được biểu hiện ở mức độ thấp ở các tế bào biểu mô và cơ biểu mô của mô tuyến vú bình thường Bên cạnh chức năng là một thụ thể của yếu tố phát triển thượng bì, Her-2/neu còn có vai trò quan trọng trong các cơ chế biệt hoá tế bào, sự kết dính và di chuyển của tế bào, vì vậy có thể góp phần vào vào khả năng xâm lấn và di căn của tế bào ung thư

Hầu hết các nghiên cứu về vai trò của Her-2/neu trong UTV đều dựa vào mức độ biểu hiện của sản phẩm gen Her-2/neu bằng phương pháp HMMD Một số nghiên cứu khác dựa vào sự khuếch đại gen và nhận thấy rằng sự gia tăng số lượng bản sao của gen Her-2/neu có liên quan với tăng mức độ biểu hiện của sản phẩm protein Có khoảng 20-30% các trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn có sự biểu hiện quá mức của Her-2/neu

Trong 48 nghiên cứu về vai trò tiên lượng của Her-2/neu thực hiện ở 15.000 bệnh nhân UTV, đa số nghiên cứu đều kết luận rằng sự khuếch đại gen hoặc sự biểu hiện quá mức của Her-2/neu có liên quan với tiên lượng xấu, nhất là ở bệnh nhân UTV có di căn hạch

Ở Châu Á, tháng 1 năm 2016, Tang MC và cộng sự của Đại học Y Hồng Kông đã công bố một nghiên cứu trên 99 bệnh nhân UTBM vú xâm nhập cho thấy tỷ lệ khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật Dual-ISH

là 19,2% và tỷ lệ tương hợp với kỹ thuật FISH là 96%, phù hợp với khuyến cáo của ASCO/CAP 2013 Tác giả kết luận rằng: Dual-ISH là một xét nghiệm HER2 đáng tin cậy và là lựa chọn hữu ích trong UTV Một số nghiên cứu cho rằng mức độ biểu hiện của Her-2/neu còn có thể giúp dự đoán sự đáp ứng với liệu pháp nội tiết Trong những trường hợp UTV giai đoạn muộn, tế bào có Her-2/neu biểu hiện càng nhiều thì đáp ứng với tamoxifen càng kém và kém hơn những trường hợp biểu hiện Her-2/neu mức độ thấp

1.4 NGHIÊN CỨU PHÂN NHÓM PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ

VÚ

1.4.1 Phân nhóm phân tử ung thư vú bằng hóa mô miễn dịch

Năm 2004, Nielsen và cs đưa ra bảng phân nhóm phân tử UTV gồm

3 nhóm phân tử, dựa vào 5 dấu ấn HMMD là thụ thể nội tiết, HER2, CK5/6 và EGFR với tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng typ

Năm 2006, theo Carey và cs chia UTV thành 4 nhóm phân tử dựa vào sự bộc lộ của các dấu ấn HMMD

Năm 2009, Tang P, Kristin A.S, David GH đã nghiên cứu và đưa ra một bảng phân nhóm phân tử UTV theo các tiêu chuẩn HMMD

Năm 2010, Hsiao Y.H và cs nghiên cứu dựa trên các kiểu hình miễn dịch

Hội nghị UTV Quốc tế lần thứ 12 năm 2011 tại St Gallen, Thụy Sĩ đã đưa ra bảng tiêu chuẩn phân nhóm phân tử UTV

Năm 2013, Engstrom và cs [22] sử dụng các dấu ấn HMMD: ER, PR, HER2, Ki67, CK5/6 và EGFR để phân nhóm phân tử UTV

1.4.2 Các typ phân tử ung thư biểu mô tuyến vú

1.4.2.1 Typ lòng ống A và B

1.4.2.2 Typ HER2

1.4.2.3 Ung thư biểu mô ba âm tính và typ dạng đáy

1.4.2.4 Typ lòng ống A và B lai HER2

1.4.3 Vai trò của typ phân tử trong điều trị và tiên lượng ung thư biểu

mô tuyến vú

Trong nhiều năm, khoảng 30% các bệnh nhân điều trị thất bại, do đó cần tránh điều trị quá mức hoặc điều trị chưa đủ Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khi UTV được phân typ mô bệnh học và đánh giá theo các thông số kinh điển sẽ có một tỷ lệ nhất định các bệnh nhân được điều trị chưa chính xác Hội nghị UTV Quốc tế lần thứ 12 năm 2011 tại St Gallen, Thụy Sĩ đã đề cập tới phân nhóm phân tử để đi đến các khuyến nghị về điều trị UTV, như sau: LUMA chỉ cần điều trị nội tiết đơn thuần, trong khi đó typ LUMB có thể kết hợp điều trị nội tiết và hóa chất; typ

dạng đáy chỉ điều trị bằng hóa chất và typ HER2 kết hợp giữa điều trị hóa chất và nhắm trúng đích (trastuzumab), đối với typ LAHH và LBHH được điều trị bằng sự kết hợp giữa nội tiết, hóa chất và nhắm trúng đích Trong một nghiên cứu lớn, đã chỉ ra rằng các khối u dạng đáy và HER2 nhạy cảm với hóa trị bổ trợ dựa vào anthracycline hơn các typ lòng ống Hơn 45% khối u dạng đáy đáp ứng hoàn toàn sau 12 tuần điều trị paclitaxel tiếp theo bằng 5-fluorouracil, doxorubicin và cyclophosphamide Theo nghiên cứu này, các typ dạng đáy và HER2 kết hợp với tỷ lệ đáp ứng bệnh học hoàn toàn cao nhất (cả 2 là 45%) và typ lòng ống có tỷ lệ đáp ứng thấp hơn (6%) Ở typ giống vú bình thường, không có sự đáp ứng hoàn toàn

1.5 CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG KINH ĐIỂN TRONG UNG THƯ

VÚ

1.5.1 Kích thước u

Kích thước u là một trong những yếu tố tiên lượng độc lập quan trọng nhất, kích thước u được sử dụng là một trong các yếu tố đánh giá giai đoạn bệnh

Đánh giá mối liên quan giữa kích thước u với tỷ lệ sống thêm của bệnh nhân cũng được Rosen và cộng sự (1993) nghiên cứu trên 767 bệnh nhân UTV giai đoạn T1N0M0/T2N0M0 và cho thấy bệnh nhân UTBM thể ống xâm nhập hoặc tiểu thuỳ xâm nhập, hạch nách âm tính, kích thước u ≤ 1 cm thì tỷ lệ sống thêm không tái phát sau 10 năm và 20 năm

là 91% và 87%, trong khi đó với các u > 1 cm tỷ lệ này giảm xuống còn 73% và 68% Nghiên cứu của Carter và cộng sự (1989) cho thấy kích thước u tương quan với số lượng hạch nách

1.5.2 Di căn hạch

Tình trạng hạch là yếu tố tiên lượng độc lập có giá trị bậc nhất trong UTV, có nhiều bằng chứng chứng minh thời gian sống giảm khi số lượng hạch tăng Trong nghiên cứu lớn trên dữ liệu 24.740 trường hợp UTV (chương trình SEER của Viện ung thư Quốc gia) đưa ra kết quả với u kích thước < 2cm và hạch âm tính hoặc từ 1-3 hạch hoặc trên 4 hạch thì tỷ lệ sống 5 năm tương ứng là 96,3%, 87,4% và 66,0%

1.5.2.1 Hạch nách

Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất liên quan đến tỷ lệ tái phát và thời gian sống thêm Tỷ lệ sống thêm, tái phát, thời gian tái phát, thất bại trong điều trị đều liên quan với số lượng hạch di căn Tỷ lệ di căn hạch nách là khoảng 40,1% trong UTV giai đoạn I, II; di căn hạch nách tương quan với kích thước u, độ mô học, loại

mô học, giai đoạn bệnh [6]

1.5.2.2 Hạch vú trong

Các ung thư ở vị trí trung tâm và trên trong thường di căn hạch vú trong hơn các hạch vị trí khác Hạch vú trong ít được đánh giá nhưng di căn vào hạch này đứng thứ hai sau di căn hạch nách và ý nghĩa tiên lượng của nó cũng giống hạch nách Hầu hết bệnh nhân có di căn hạch

1.5.4 Độ mô học

Độ mô học là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù

nó không được sử dụng như một thông số để đánh giá giai đoạn ung thư

Có nhiều hệ thống phân độ mô học nhưng hiện nay phân độ của Scarff – Bloom – Richardson, sửa đổi bởi Elston và Ellis được đánh giá là có hiệu quả nổi bật trong tiên lượng bệnh, được áp dụng rộng rãi Đây có thể coi là một yếu tố tiên lượng độc lập Nghiên cứu trên 1244 trường hợp UTV, Shetty đưa ra kết quả UTV có độ mô học I thì tỷ lệ hạch dương tính 3%, độ mô học II và III là 11% và 19%[8]

1.5.5 Các yếu tố tiên lượng khác trong ung thư vú

1.5.5.1 Tuổi phát hiện

1.5.5.2 Loại mô học

1.6 CÁC XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH PROTEIN HER2 VÀ GEN HER2

1.6.1 Hóa mô miễn dịch

Kỹ thuật này cho phép quan sát được sự hiện diện của kháng nguyên (KN) trên tế bào và mô, nhờ đó có thể đánh giá được cả về hình thái học

và kiểu hình miễn dịch của tế bào u Ngoài ra, HMMD còn giúp xác định

sự biểu lộ của các dấu ấn KN quan trọng trên tế bào u, giúp lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp, đặc biệt là liệu pháp điều trị nhắm trúng đích (target therapy), đồng thời giúp tiên lượng bệnh nhân tốt hơn

Theo hướng dẫn của ASCO/CAP 2007 và 2013, để lựa chọn bệnh nhân điều trị đích phân tử với trastuzumab (Herceptin), nhóm có kết quả HER2 (2+) cần xác định lại những trường hợp có khuếch đại gen HER2 mới là nhóm đích, còn lại những trường hợp không có khuếch đại gen thì không phải là nhóm đích của điều trị đích phân tử trong UTV [60]

1.6.2 Lai tại chỗ huỳnh quang (FISH- Fluorescent In Situ Hybridization)

FISH sẽ phát hiện số lượng các bản sao gen HER2 trong tế bào ung thư FISH là một phương pháp nhạy và đặc hiệu, xác định số bản sao gen HER2 thường kết hợp và xác định số bản sao trung đoạn trên nhiễm sắc thể 17 (CEP17) Kỹ thuật FISH cũng sử dụng mẫu mô vùi nến, được

cố định bằng formol và lát cắt chuẩn 4 đến 5μm Kết quả phép lai này thường được biểu diễn dưới hai dạng là dương tính và âm tính, tương đương với việc có sự khuếch đại của gen HER2 hay không Nếu lượng gen HER2 càng nhiều thì nguy cơ các tế bào UTV phát triển càng mạnh Hiện nay, FISH có 3 hạn chế: phải có kính hiển vi huỳnh quang Thứ hai, tiêu bản FISH không thể lưu được lâu do sự thoái hóa của các tín hiệu huỳnh quang Cuối cùng, kính hiển vi huỳnh quang giới hạn khả năng quan sát cấu trúc của mô và đánh giá sự xâm nhập

1.6.3 Kỹ thuật lai tại chỗ gắn màu (Chromogenic In Situ Hybridization, CISH)

Kỹ thuật này tương đương với phép lai FISH, là kỹ thuật cải tiến của phương pháp FISH, nó phát hiện việc có quá nhiều bản sao gen HER2 trong tế bào ung thư Kỹ thuật mới sử dụng peroxidase enzyme để phát hiện nhiễm sắc thể thay vì sử dụng huỳnh quang, cho phép đọc kết quả bằng kính hiển quang học thông thường Như vậy, hình thái, đặc điểm

mô bệnh học của tiêu bản có thể được đánh giá song song Hơn nữa, tín hiệu không phân hủy theo thời gian [38] Kết quả của xét nghiệm thường được ghi dưới dạng âm tính (không có sự khuếch đại gen HER2) và dương tính (có sự khuếch đại gen HER2)

CISH để phát hiện khuếch đại gen HER2 Có 2 loại CISH:

+ CISH tiêu chuẩn: chỉ dùng một đầu dò HER2

+ CISH hai màu (dual-color CISH: dc-CISH), sử dụng một đầu dò HER2 và một đầu dò CEP17

1.6.4 Xét nghiệm lai tại chỗ gắn hai màu DISH (Dual In Situ Hybridization)

Tương tự như hai xét nghiệm ở trên, xét nghiệm này phát hiện sự khuếch đại của gen HER2 và cũng được trả lời dưới dạng kết quả khuếch đại và không khuếch đại

Thực chất DISH chính là kỹ thuật CISH hai màu nhưng đầu dò HER2 được gắn bạc nên sẽ nhuộm màu đen trong khi đầu dò CEP17 nhuộm màu đỏ Kỹ thuật này thực hiện nhanh và dễ dàng hơn so với FISH, cần một kính hiển vi quang học, làm cho nó đặc biệt phù hợp với thói quen sử dụng trong các phòng thí nghiệm

Kỹ thuật DISH có các ưu điểm sau so với kỹ thuật FISH:

- Ưu điểm lớn nhất của phương pháp DISH là có thể đánh giá

số lượng bản sao gen HER2, CEP17 và các đặc điểm mô bệnh học cùng một lúc vì vậy việc xác định chính xác vùng tế bào ung thư xâm lấn dễ dàng hơn

- Các tín hiệu không bị phân hủy theo thời gian, do đó tiêu bản

có thể được lưu trữ trong một thời gian dài ở nhiệt độ phòng, có thể xem xét lại khi cần thiết và có thể nhiều người khảo sát cùng lúc dưới kính hiển vi quang học

- DISH có giá thành rẻ hơn, thời gian thực hiện ngắn hơn

1.7 NỘI DUNG CỦA HƯỚNG DẪN VÀ KHUYẾN CÁO DÀNH CHO XÉT NGHIỆM HER2 CỦA ASCO/CAP 2013

1.7.1 Các khuyến cáo chính cho các chuyên gia ung thư

1.7.2 Các khuyến nghị chính cho BS Giải phẫu bệnh

1.7.3 Các lưu đồ sử dụng trong xét nghiệm HER2 dành cho ung thư

vú theo hướng dẫn của ASCO/CAP 2013

Sơ đồ 1.1 Lưu đồ thực hiện xét nghiệm HER2 bằng hoá mô miễn dịch

1.8 THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH VÀ HÓA TRỊ BỔ TRỢ TRONG UNG THƯ VÚ CÓ THỤ THỂ HER2 DƯƠNG TÍNH

1.8.1 Liệu pháp điều trị đích trong ung thư vú

1.8.1.1 Khái niệm về điều trị đích

1.8.1.2 Phân nhóm thuốc điều trị đích

1.8.1.3 Các thuốc điều trị đích trong ung thư vú

-Trastuzumab (Herceptin): Đây là một kháng thể đơn dòng Nó

thường được phối hợp cùng với hóa chất, nhưng nó cũng có thể được sử dụng đơn độc Trastuzumab có thể được sử dụng để điều trị cả UTV ở giai đoạn sớm và giai đoạn muộn Khi bắt đầu trước hoặc sau phẫu thuật

để điều trị UTV giai đoạn sớm, thuốc này thường được dùng trong một năm Đối với UTV tiến triển, điều trị thường được dùng cho tới khi bệnh tiến triển Thuốc này được đưa vào tĩnh mạch

-Pertuzumab (Perjeta): kháng thể đơn dòng này có thể được sử

dụng cùng với trastuzumab và hóa trị, trước khi phẫu thuật để điều trị UTV giai đoạn sớm, hoặc để điều trị UTV tiến triển Thuốc này được dùng bằng đường tĩnh mạch

-Ado-trastuzumab emtansine (Kadcyla, còn gọi là TDM-1): Đây

là một kháng thể đơn dòng gắn liền với một loại thuốc hóa trị liệu Nó

XÉT NGHIỆM HER2 BẰNG Dual-ISH

Phải thực hiện IHC trên cùng mẫu, xét nghiệm ISH thay

thế hoặc mẫu mới (IHC hoặc ISH)

Tỉ lệ HER2/CEP17 <2

Trung bình tín hiệu HER2 ≥4 và <6/TB

Trung bình tín hiệu HER2 ≥ 6/TB

Trung bình tín hiệu HER2 <4/TB Trung bình tín hiệu

HER2<4/TB

Sơ đồ 1.2 Lưu đồ xét nghiệm lai tại chỗ gắn hai màu (đoạn dò kép)

được sử dụng để điều trị UTV tiến triển ở những phụ nữ đã được điều trị bằng trastuzumab và hóa trị Thuốc này cũng được cho trong tĩnh mạch

-Lapatinib (Tykerb): Đây là chất ức chế kinase Dùng bằng đường

uống Lapatinib được sử dụng để điều trị UTV tiến triển, và có thể được

sử dụng cùng với một số loại thuốc hóa trị liệu, trastuzumab hoặc thuốc nội tiết

-Neratinib (Nerlynx): Đây là một chất ức chế kinase Dùng bằng

đường uống Neratinib được sử dụng để điều trị UTV giai đoạn sớm sau khi một người phụ nữ đã hoàn thành một năm trastuzumab và thường được cho một năm Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy nó cũng có thể

có hiệu quả trong UTV tiến triển

Trong các thuốc điều trị nhắm trúng đích kể trên, Trastuzumab là thuốc đầu tiên được FDA cho phép áp ụng trong UTV có thụ thể Her2 dương tính vào năm 1998 Những tác nhân khác như pertuzumab, lapatibin không cho thấy tác dụng miễn dịch đối với cơ chế đề kháng và

tác dụng phụ đáng kể đối với bệnh nhân

1.8.2 Hóa trị bổ trợ trong ung thư vú có thụ thể her2 +

1.8.2.1 Các thử nghiệm bổ trợ trong trong ung thư vú có thụ thể HER2+

- Thử nghiệm NSABP-B31 và NCCTG N9831

- Thử nghiệm BCIRG 006

- Nghiên cứu Hera

- Nghiên cứu FinHer

- Thử nghiệm PACS04

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là 100 bệnh nhân đến khám và điều trị UTV tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế

từ tháng 03 năm 2017 đến tháng 06 năm 2018

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh

- Có khối u tuyến vú với các triệu chứng nghi ngờ UTV khi khám lâm sàng

- Có các đặc điểm nghi ngờ UTV trên hình ảnh siêu âm, chụp hình vú

- Có kết quả tế bào học hoặc mô bệnh học mảnh sinh thiết trước mổ

là UTBM tuyến vú

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân được chẩn đoán MBH sau phẫu thuật là UTV tại chỗ

- Bệnh nhân UTV xâm nhập nhưng không có chỉ định phẫu thuật (quá giai đoạn phẫu thuật)

- Bệnh nhân UTV đã điều trị trước đó (phẫu thuật, xạ trị, hóa trị )

2.1.3 Cỡ mẫu:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn mẫu thuận tiện với số lượng là

100 bệnh nhân, lấy trong thời gian 16 tháng, từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Các bước tiến hành nghiên cứu

- Chọn đối tượng nghiên cứu

- Ghi nhận các dữ kiện hành chính, bệnh sử và triệu chứng lâm sàng

- Siêu âm vú, chụp hình vú, xét nghiệm tế bào học, sinh thiết để xét nghiệm mô bệnh học và ghi nhận kết quả

- Phẫu tích bệnh phẩm UTV sau phẫu thuật, đánh giá và ghi nhận kích thước u, độ mô học, phân loại mô bệnh học, tình trạng di căn hạch nách, phân loại TNM và phân giai đoạn bệnh

- Xét nghiệm các dấu ấn miễn dịch ER, PR, Ki67 và HER2 bằng kỹ thuật HMMD

- Thực hiện thử nghiệm kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu cho một số trường hợp UTV có HER2 âm tính, dương tính (2+) và (3+)

- Điều chỉnh thời gian và chuẩn hóa các hóa chất, chất đệm, sinh phẩm thống nhất quy trình kỹ thuật chuẩn cho máy BenchMark GX của hãng Ventana, Roche tại Bộ môn/Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế

- Tiến hành kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu cho tất cả các trường hợp UTV

- Khảo sát mối liên quan giữa sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu với sự biểu lộ protein HER2, tình trạng thụ thể nội tiết, phân nhóm phân tử bằng kỹ thuật HMMD và với các yếu tố tiên lượng kinh điển

- Phân tích số liệu, viết báo cáo

2.2.3 Các kỹ thuật sử dụng và cách đánh giá

2.2.3.1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật lai tại chỗ gắn hai màu để phát hiện sự khuếch đại gen HER2 trong UTBM tuyến vú

- Tham khảo quy trình chuẩn về lai tại chỗ của nhà sản xuất

- Đối chiếu các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị thực tế của đơn vị phục vụ cho kỹ thuật lai tại chỗ trên máy hiện có

- Tiến hành lai 1 tiêu bản Xenograff (Mẫu chứng của hãng, nhằm kiểm tra sự hoạt động của máy móc và hóa chất)

- Tiến hành lai mẫu nghiên cứu có kết quả nhuộm HMMD với HER

âm tính, Her 2+, Her 3+ trên cùng một tiêu bản theo quy trình chuẩn, đánh giá sau mỗi lần thực hiện, điều chỉnh thời gian của các bước dựa trên thực tế kết quả sau mỗi lần lai, có tham khảo sự điều chỉnh của các bệnh viện khác

- Sau khi đã điều chỉnh và hoàn thiện quy trình, tiến hành lai tại chỗ cho 20 trường hợp mẫu nghiên cứu có kết quả HMMD với HER âm tính, Her 2+, Her 3+

- Thu thập đủ số mẫu nghiên cứu còn lại (80 trường hợp) và tiến hành lai tại chỗ theo quy trình đã hiệu chỉnh, hoàn thiện

2.2.3.2 Kỹ thuật chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (Fine Needle Aspiration, FNA)

2.2.3.3 Kỹ thuật sinh thiết lõi mô vú dưới hướng dẫn siêu âm để xét nghiệm mô bệnh học

2.2.3.4 Kỹ thuật xử lý bệnh phẩm để chẩn đoán mô bệnh học sau phẫu thuật

2.2.3.5 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch [3]:

Nguyên tắc kỹ thuật của xét nghiệm HMMD:

Thời gian nhuộm trong máy là 6 giờ

Đánh giá kết quả nhuộm HMMD theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất như sau:

Tiêu bản chứng:

- Mẫu chứng dương: Là các tiêu bản UTV đã được biết trước đó là dương cho mỗi dấu ấn sinh học Mỗi dấu ấn sinh học đều có mẫu chứng dương riêng

- Mẫu chứng âm: Cũng là mẫu UTV xâm lấn dùng cho chứng dương, tuy nhiên không cho ủ với kháng thể thứ nhất

* Cách đánh giá các dấu ấn sinh học trên tiêu bản HMMD:

- Đánh giá ER, PR:

+ Cách nhuộm màu: Nhuộm nhân tế bào

+ Cách đánh giá: theo thang điểm Allred, bảng 2.1 [3

Phản ứng dương tính khi tổng điểm ≥2

Âm tính <2 điểm 1+: 2-4 điểm 2+: 5-6 điểm 3+:7-8 điểm

- Đánh giá biểu hiện chỉ số phân bào Ki67:

+ Cách nhuộm màu: nhân tế bào u bắt màu nâu

+ Cách đánh giá: thấp (<14%), cao (≥14%)

- Đánh giá thụ thể HER2 trên tiêu bản HMMD:

+ Cách nhuộm màu: nhuộm màng tế bào

+ Cách đánh giá: