Nghiên cứu tối ưu điều kiện thu nhận enzyme protease từ sò lụa và thử nghiệm thủy phân thịt cá

Đề tài này tiến hành tách chiết protease từ sò lụa và bước đầu thử nghiệm sử dụng enzyme thu được để thủy phân thịt cá. Kết quả nghiên cứu xác định được điều kiện tối ưu tách chiết protease thích hợp từ sò lụa là đệm phosphat pH 7 với tỷ lệ dung môi/mẫu là 1,8/1, nhiệt độ chiết tối ưu là 31oC và thời gian chiết tối ưu là 13 phút. Thu được CPE protease bằng phương pháp kết tủa với aceton 96%, tỷ lệ enzyme/dung môi là 1/2, thời gian tủa là 15 phút. Mời các bạn cùng tham khảo!

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ SÒ LỤA

VÀ THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN THỊT CÁ Trần Quốc Đảm * , Đào Thị Tuyết Mai

Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM

*Tác giả liên lạc: damtq@cntp.edu.vn

TÓM TẮT

Protease có khả năng thủy phân protein thành các peptid và acid amin hay còn gọi là dịch đạm thủy phân được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp Động vật thủy sản có chứa hệ enzyme protease có hoạt tính cao nên việc nghiên cứu thu nhận protease từ động vật thủy sản được rất nhiều nhà khoa học quan tâm Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết protease

từ sò lụa và bước đầu thử nghiệm sử dụng enzyme thu được để thủy phân thịt cá Kết quả nghiên cứu xác định được điều kiện tối ưu tách chiết protease thích hợp từ sò lụa là đệm phosphat pH

7 với tỷ lệ dung môi/mẫu là 1,8/1, nhiệt độ chiết tối ưu là 31 o C và thời gian chiết tối ưu là 13 phút Thu được CPE protease bằng phương pháp kết tủa với aceton 96%, tỷ lệ enzyme/dung môi là 1/2, thời gian tủa là 15 phút Thử nghiệm thủy phân thịt cá bằng CPE protease ở nhiệt

độ 55 o C, pH 6,0 và hiệu quả thủy phân thịt cá đạt được 33,38% sau thời gian thủy phân là 5 giờ

Từ khóa: Protease, nhuyễn thể 2 mảnh vỏ, sò lụa

STUDY ON OPTIMAL CONDITIONS FOR PRODUCTION OF PROTEASE

ENZYME FROM PAPHIA UNDULATA AND EXPERIMENT

ON FISH MEAT HYDROLYSIS Tran Quoc Dam * , Dao Thi Tuyet Mai

Ho Chi Minh city University of Food Industry

*Corresponding Author: damtq@cntp.edu.vn

ABSTRACT

Protease, known as a proteolytic enzyme which is used in many industries, is capable

of hydrolyzing proteins into peptides or amino acids Aquatic animals contain highly active proteolytic enzyme system, therefore the research on protease collection from aquatic species attracts much attention of various scientists In this study, we extracted protease from undulated surf clam (Paphia undulata) and initially made experiments using enzyme to hydrolyze fish meat The study result showed the optimal conditions for protease extraction rom Paphia undulate, including: phosphate buffer (pH 7) with a 1,8/1 ratio solvent/sample, the optimal extraction temperature and time was at 31 o C and 13 minutes, respectively Obtained protease by precipitation with acetone 96%, enzyme/solvent ratio of 1/2, the precipitation duration of 15 minutes Hydrolysis of fish meat with protease at 55 o C, pH 6.0 and efficiency of fish meat hydrolysis achieved 33,38% after 5 hours of hydrolysis

Keywords: Protease, shellfish, paphia undulata

ĐẶT VẤN ĐỀ

Protease là một trong những enzyme được ứng

dụng nhiều nhất hiện nay Trong công nghiệp

thực phẩm, protesase có vai trò quan trọng

trong quá trình sản xuất nước nắm, trong sản

xuất dịch đạm acid amin, sữa, phomai [2, 8]

Việc sử dụng chế phẩm enzyme (CPE) góp

phần nâng cao chất lượng sản phẩm và giảm

thiểu tác động gây ô nhiễm môi trường rất

nhiều so với việc sử dụng chất hóa học Chính

vì thế, CPE ngày càng được sử dụng phổ biến

hơn Có rất nhiều CPE được thương mại hóa

và mang lại giá trị kinh tế khá lớn ở nhiều quốc gia

Ngày nay, nghiên cứu thu nhận enzyme từ nguyên liệu thủy sản đã và đang rất được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm [8] Nội tạng động vật thủy sản có chứa nhiều loại enzyme khác nhau và protease là loại có hoạt tính cao Phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung thu nhận protease từ hai đối tượng là cá, tôm và mực Trong thực tế, nhuyễn thể 2 mảnh vỏ

cũng có chứa hệ enzyme protease có hoạt tính

cao [4, 10] Hệ enzyme protease phân bố phần

lớn ở nội tạng của động vật thủy sản Do đó

việc tận dụng nguồn phế liệu thủy sản để thu

nhận enzyme protease mang ý nghĩa to lớn

[8]

Nhuyễn thể 2 mảnh vỏ sử dụng thức ăn theo

cơ chế lọc nên khả năng tích lũy cát sạn, tạp

chất độc tố trong cơ thể nói chung và nội tạng

nhuyễn thể nói riêng là rất lớn Như vậy, việc

loại bỏ nội tạng nhuyễn thể là cần thiết để

đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng khi sử

dụng các sản phẩm từ đối tượng này [7]

Tổng sản lượng nhuyễn thể 2 mảnh vỏ hằng

năm khoảng 400.000 tấn, trong đó sò 54.280

tấn (Tổng Cục thủy sản, 2016) Bên cạnh việc

khai thác từ tự nhiên, một số nhuyễn thể 2

mảnh vỏ cũng đã được nuôi ở nhiều tỉnh ven

biển nên sản lượng thu được hàng năm là rất

ổn định

Để thu nhận enzyme protease có hoạt tính cao

thì việc lựa chọn nhuyễn thể 2 mảnh vỏ và

nghiên cứu điều kiện tách chiết là cần thiết

Ngoài ra, hoạt động của enzyme thì phụ thuộc

vào điều kiện môi trường mà nó xúc tác [2,

11] Do đó, việc xác định điều kiện hoạt động

thích hợp của enzyme là cơ sở cho việc ứng

dụng enzyme đạt hiệu quả hơn

Mục tiêu của nghiên cứu này là lựa chọn loại

nhuyễn thể 2 mảnh vỏ chứa protease có hoạt

tính cao để thu nhận và thử nghiệm ứng dụng

enzyme này vào thủy phân thịt cá

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

Vật liệu

Sò lụa

Sò lụa nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu

được mua dạng còn sống đưa về phòng thí

nghiệm Sò được xử thu nội tạng và bảo quản

ở nhiệt độ -20oC Thời gian bảo quản nội tạng

sò càng ngắn càng tốt để tránh hiện tượng

enzyme bị biến tính

Dung môi chiết enzyme

Đệm phosphat pH 7, đệm tris – HCl pH 7,

nước muối sinh lý và nước cất được sử dụng

làm dung môi chiết enzyme Các hóa chất sử

dụng được sản xuất từ Trung Quốc

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp xử lý mẫu sò lụa

Sò lụa được tách bỏ phần vỏ và thu phần thịt

Sau đó tiếp tục tách lấy phần nội tạng từ phần

thịt sò Phần nội tạng sò được bổ sung một ít

nước cất và đưa đi nghiền nhuyễn Hỗn hợp nội tạng sò được đưa đi ủ ở 35oC trong thời gian khoảng 30 phút trước khi tách chiết enzyme [5, 8]

Phương pháp thu nhận dịch protease thô từ

sò lụa

Nội tạng sò được chiết với dung môi theo tỷ lệ mẫu/dung môi là 1/2, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 15 phút Sau khi chiết đủ thời gian tiến hành đưa mẫu chiết đi ly tâm lạnh với tốc

độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút Sau khi ly tâm, thu phần dịch lỏng có chứa protease bên trên và loại bỏ phần kết tủa bên dưới Phần dịch lỏng này được gọi là dịch protease thô [5, 8]

Phương pháp tối ưu hóa

Tối ưu hóa các điều kiện tách chiết protease từ

sò là theo quy hoạch thực nghiệm Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu tối ưu bằng phần mềm Design-Expert 10 (DX10)

Phương pháp xác định hoạt độ của protease

Hoạt độ protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến

Hoạt độ protease được xác định dựa vào lượng

µg tyrosin hình thành trong quá trình thủy phân casein Một đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme thủy phân casein tạo thành 1 µg tyrosin trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [2]

Định lượng nitơ amin, nitơ amoniac và nitơ

tổng số

Hàm lượng nitơ amin được xác định dựa vào hàm lượng nitơ amin-amoniac (Xf) và hàm lượng nitơ amoniac (X NH3)

Đạm nitơ amin (Xaa) được tính như sau:

X aa = X f – X NH3

- Hàm lượng nitơ amin-amoniac được xác định bằng phương pháp formol (TCVN 3707-90)

- Hàm lượng nitơ amoniac được xác định bằng phương pháp chưng cất (TCVN 2626-98)

- Hàm lượng nitơ tổng số được xác định bằng phương pháp kjeldah (TCVN 3705-90)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả xác định ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hoạt độ protease từ sò lụa

Hoạt độ protease thu được phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tách chiết enzyme [5, 6, 8] Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định một

số điều kiện phù hợp để tách chiêt protease từ

sò lụa như: loại và tỷ lệ dung môi, nhiệt độ

chiết và thời gian chiết

Ảnh hưởng của loại và tỷ lệ dung môi chiết

Loại và tỷ lệ dung môi chiết ảnh hưởng rất lớn

đến hoạt độ enzyme thu được Dung môi chiết

ảnh hưởng đến trạng thái ion của enzyme từ

đó ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Để xác

định loại và tỷ lệ dung môi thích hợp chiết

protease từ sò lụa, tiến hành chiết mẫu sò lần

lượt với các dung môi nước cất, nước muối

sinh lý, đệm phosphat pH 7 và đệm tris-HCl

pH 7 ở các tỷ lệ mẫu chiết/dung môi là 1/1,

1/2, 1/3, 1/4 và 1/5

Hình 1 Ảnh hưởng của loại và tỷ lệ dung

môi đến hoạt độ dịch chiết protease thu được

từ sò lụa Kết quả nghiên cứu cho thấy, loại và tỷ lệ

dung môi chiết khác nhau thì hoạt độ protease

trong dịch chiết thu được từ sò lụa là khác

nhau như Hình 1 Tách chiết protease từ sò lụa

bằng đệm phosphat thì có hoạt độ cao hơn so

với chiết bằng đệm Tris-HCl, nước muối sinh

lý và nước cất Hoạt độ cao nhất của enzyme

protease từ sò lụa khi chiết bằng đệm phosphat

là 0,499 UI/ml, trong khi đó chiết bằng

tris-HCl là 0,449 UI/ml, nước cất là 0,207 UI/ml

và nước muối sinh lý là 0,181UI/ml Điều này

có thể do trong môi trường đệm phosphat thì

enzyme protease từ sò lụa đạt trạng thái ion

hóa tốt hơn trong đệm tris-HCl, nước muối

sinh lý và nước cất nên enzyme thu được có

hoạt tính cao hơn Như vậy, loại và tỷ lệ dung

môi phù hợp để tách chiết enzyme protease từ

sò lụa là đệm phosphat pH 7 với tỷ lệ

mẫu/dung môi là 1/2

Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

Nhiệt độ chiết enzyme ảnh hưởng đến quá

trình chiết rút enzyme từ mẫu Để khảo sát

nhiệt độ phù hợp để chiết enzyme protease từ

sò lụa, tiến hành chiết mẫu sò lụa ở các nhiệt

độ khác nhau từ 30oC÷50oC

Kết quả nghiên cứucho thấy nhiệt độ chiết khác nhau thì hoạt độ protease trong dịch chiết thu được là khác nhau như Hình 2 Nhiệt độ chiết protease từ sò lụa có hoạt tính cao nhất

là khoảng 35oC với hoạt độ thu được là 0,5654 UI/ml Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ chiết lên từ 40÷50oC thì hoạt độ protease thu được giảm Điều này có thể do nhiệt độ chiết lúc này tác đông bất lợi lên enzyme nên enzyme bị giảm hoạt tính Như vậy, nhiệt độ phù hợp để chiết protease từ sò lụa là 50oC

Hình 2 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt

độ dịch chiết protease thu được từ sò lụa

Ảnh hưởng của thời gian chiết

Thời gian chiết ảnh hưởng đến lượng enzyme khuếch tán ra khỏi mẫu chiết từ đó ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme thu được Tiến hành khảo sát thời gian chiết protease từ sò lụa trong các khoảng thời gian khác nhau từ 5÷25 phút Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian chiết khác nhau thì hoạt độ protease trong dịch chiết thu được là khác nhau như Hình 3 Thời gian chiết protease từ sò lụa có hoạt độ cao nhất là

10 phút và hoạt độ thu được là 0,418 UI/ml Tuy nhiên, khi tiếp tục kéo dài thời gian chiết

từ 15÷25 phút thì hoạt độ protease dịch chiết thu được giảm Điều này có thể do ở khoảng thời gian 10 phút thì lượng protease đã khuếch tán hết vào dịch chiết và khi kéo dài thêm thời gian chiết thì lúc này các yếu tố bên ngoài tác động bất lợi đến protease nên làm giảm hoạt tính protease theo thời gian, từ đó hoạt độ protease trong dịch chiết thu được giảm Như vậy, thời gian thích hợp để chiết protease từ sò lụa là khoảng 10 phút

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

muối sinh lý

Đệm

Dung môi

0.415

0.5654 0.4696 0.4026 0.3465

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Nhiệt độ

Hình 3 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt

độ dịch chiết protease thu được từ sò lụa

Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết enzyme

protease từ sò lụa

Từ kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến

quá trình chiết protease từ sò lụa đã đưa ra

miền giá trị cho thí nghiệm tối ưu hóa của các

yếu tố trình bày trong Bảng 1

Bảng 1 Miền nghiên cứu tối ưu hóa các yếu

tố chiết enzyme protease protease từ sò lụa

Biến nghiên cứu Biến mã

Mã hóa các mức -1 0 1

Tỷ lệ dung

Thời gian (phút) X3 5 10 15

Kết quả thí nghiệm tối ưu điều kiện tách chiết

protease từ sò lụa được trình bày trong Bảng

2 và được phân tích bằng phần mềm DX10

Kết quả phân tích xác định phương trình hồi

quy biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt độ

protease từ sò lụa và các yếu tố tách chiết có

dạng bậc 2 Kết quả phân tích cũng cho thấy

mô hình thu được có ý nghĩa và có tính phù

hợp cao Các yếu tố gồm A, B, C, và các biến

tương tác AB, AC, A2 và C2 là có ý nghĩa trong

mô hình tối ưu

Phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ

giữa hoạt độ protease từ sò lụa và các yếu tố

tách chiết như sau :

Y^ = 0,67 - 0,14X 1 + 0,02X 2 + 0.073X 3 +

0,038X 1 X 2 – 0,057X 1 X 3 – 0,11X 1 –

0,077X 3 (1)

Trong đó Y^ là hoạt độ protease dự đoán và

A, B, C, X1,X2,X3 lần lượt là giá trị thực và giá

trị mã hóa của nhiệt độ chiết, tỷ lệ dung môi

chiết và thời gian chiết

Dựa vào các hệ số từ phương trình cho thấy

hoạt độ protease thu được từ sò lụa tỷ lệ thuận

với tỷ lệ dung môi chiết (X2), thời gian chiết

(X3) và biến tương tác giữa nhiệt độ chiết và

tỷ lệ dung môi chiết (X1X2) Ngược lại, hoạt

độ protease thu được tỷ lệ nghịch với nhiệt độ chiết (X1), biến tương tác giữa nhiệt độ và thời gian chiết (X1X3), biến tương của nhiệt độ chiết bình phương (X1) và biến tương tác của thời gian chiết bình phương (X3) Trong số các biến, thì ảnh hưởng của biến nhiệt độ chiết với hệ số tương ứng 0,14 là lớn nhất; tiếp theo

là ảnh hưởng của các biến bình phương nhiệt

độ và bình phương thời gian chiết với hệ số tương ứng là 0,11 và 0,077

Bảng 2 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa điều

kiện thu nhận protease từ sò lụa

STT

Nhiệt

độ ( 0 C)

Tỷ lệ (Photphat/

mẫu)

Thời gian (phút)

Hoạt độ protease (UI/ml)

0.355

0.418

0.392 0.325 0.287

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

Thời gian (phút)

Hình 4 Biểu đồ 3D mô tả tương tác của của

các yếu tố đến hoạt độ protase từ sò lụa

Ảnh hưởng độc lập của các yếu tố tách chiết

đến hoạt độ protease thu được từ sò lụa được

thể hiện qua các đồ thị không ba chiều như

Hình 4 Vùng giá trị hoạt độ dự đoán tối ưu

được xác định bởi các bề mặt giới hạn trong

hình elip nhỏ nhất trong sơ đồ đường đồng

mức

Chế độ chiết tối ưu protease từ sò lụa được đề

xuất từ phần mềm DX10 là nhiệt độ chiết

31°C, tỷ dung môi chiết/mẫu là 1,8 và thời

gian chiết là 13 phút với hoạt độ protease thu

được là 0.76 UI/ml

Kết quả xác định ảnh hưởng của điều kiện

thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật từ sò

lụa bằng phương pháp kết tủa

Điều kiện kết tủa enzyme ảnh hưởng hoạt tính

CPE thu được Theo nhiều nghiên cứu thì tác

nhân kết tủa, nồng độ kết tủa và thời gian kết

tủa là 3 yếu tố có sự ảnh hưởng lớn đến CPE

thu được [1, 9, 12]

Kết quả xác định ảnh hưởng của tác nhân và

nồng độ kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm

protease từ sò lụa

Mỗi enzyme sẽ có loại tác nhân kết tủa thích

hợp ở nồng độ nhất định, khi đó CPE thu được

sẽ có hoạt tính cao nhất Tiến hành kết tủa dịch

protease thô lần lượt với các tác nhân là:

aceton 96%, Amonium sulfat bảo hòa và

ethanol tuyệt đối Mỗi tác nhân sẽ thực hiện

tủa enzyme với các tỷ lệ giữa dịch enzyme/tác

nhân kết tủa lần lượt là 1/1 1/2 , 1/3 và 1/4

Hình 5 Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa

và nồng độ của các tác nhân kết tủa đến hoạt

độ của CPE gelatinase thu được Kết quả khảo sát cho thấy mỗi loại dung môi kết tủa và với mỗi nồng độ kết tủa khác nhau thì CPE protease thu được từ sò lụa là khác nhau như Hình 5 Khi kết tủa protease bằng aceton thì thu được CPE có hoạt độ cao hơn khi tủa bằng ethanol và amonium sulfat Hoạt

độ CPE protease thu được cao nhất khi tủa bằng aceton là 0,404 UI/ml ở tỷ lệ 1/2 và giữ được hoạt độ tương đối so với trước kết tủa là 75% Trong khi sử dụng ethanol và amonium sulfat hoạt độ cao nhất của CPE protease thu được khi chiết ở tỷ lệ 1/3 lần lượt là 0,364 UI/ml, 0,341 UI/ml và hoạt độ tương đối còn lại là 67,41% và 63,15% Khi kết tủa dịch enzyme bằng amonium sulfat emzyme có hoạt

độ thấp nhất có thể là do muối này còn lẫn nhiều trong CPE từ đó ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme thu được Đối với ethanol thì khó bay hơi hơn aceton nên có thời gian tiếp xúc với CPE dài hơn aceton nên có thể làm giảm hoạt

độ enzyme nhiều hơn Như vậy, aceton là tác nhân phù hợp để kết tủa protease với tỉ lệ enzyme/dung môi là 1/2 để thu CPE protease

Hình 6 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ CPE protease thu được

Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm protease

0.290

0.053

0.254

0.404

0.240

0.341 0.294

0.364

0.279 0.251

0.171

0.124

0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500

Tác nhân tủa

0.303

0.379

0.431

0.311

0.219

0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500

Thời gian kết tủa (h)

từ sò lụa

Thời gian kết tủa dài hay ngắn sẽ ảnh hưởng

đến hoạt tính cũng như lượng CPE thu được

Do đó, trong quá trình kết tủa enzyme cần

nghiên cứu thời gian kết tủa để thu CPE

protease có hoạt độ cao nhất Tiến hành kết tủa

dịch protease thô từ sò lụa trong các khoảng thời

gian khác nhau từ 5÷20 phút

Kết quả thí nghiệm cho thấy, thời gian kết tủa

có ảnh hưởng đến hoạt tính CPE protease thu

được từ sò lụa như Hình 6 Thời gian kết tủa

thu được CPE protease có hoạt độ cao nhất là

15 phút với hoạt độ thu được là 0,431 UI/ml

Như vậy, có thể sau 15 phút lượng enzyme

protease đã được kết tủa nhiều nhất nên hoạt

tính CPE thu được đạt cực đại Do đó, khi tiếp

tục kéo dài thời gian kết tủa là 20, 25 phút thì

hoạt độ CPE protease thu được giảm Điều

này do thời gian tiếp xúc của enzyme với tác

nhân tủa kéo dài nên có thể là làm biến tính

dần CPE nên giảm hoạt tính Như vậy, thời

gian kết tủa protease từ sò lụa bằng aceton

thích hợp là 15 phút

Kết quả xác định điều kiện thủy phân thịt

cá bằng chế phẩm protease thu được từ sò

lụa

Hoạt động xúc tác của enzyme thì phụ thuộc

vào điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH của

môi trường, đặc tính cơ chất, … [2, 5, 13]

Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định một

số điều kiện hoạt động thích hợp của CPE

protease từ sò lụa như: nhiệt độ, pH, nồng độ

cơ chất… để thủy phân thịt cá

Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân thịt cá

thích hợp bằng chế phẩm protease từ sò lụa

Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng mạnh mẽ đến

hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi enzyme có

một nhiệt độ phản ứng thích hợp Để xác định

nhiệt độ thủy phân thịt cá thích hợp, thực hiện

phản ứng thủy phân thịt cá bằng CPE protease

ở các nhiệt độ khác nhau từ 30÷70oC

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ thủy

phân khác nhau thì khả năng thủy phân thịt cá

của CPE protease từ sò lụa là khác nhau như

Hình 7 Trong dãy nhiệt độ khảo sát thủy phân

thịt cá thì ở 55oC CPE protease đạt được khả

năng thủy phân lớn nhất Khi tiếp tục tăng

nhiệt độ thủy phân lên từ 60÷70oC thì hoạt

tính protease giảm xuống Điều này có thể do

ở nhiệt độ từ 60÷70oC protease dần bị biến

tính và biến tính mạnh ở 70oC, từ đó làm giảm

hoạt tính của protease Như vậy, nhiệt độ thích

hợp để thủy phân thịt cá bằng CPE protease từ

sò lùa là 55oC

Hình 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

đến hoạt tính của protease từ sò lụa

Kết quả xác định pH ban đầu thủy phân thịt

cá thích hợp bằng chế phẩm protease từ sò lụa

Độ pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến tốc

độ phản ứng của enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động tốt tại một trị số pH xác định gọi là

pH hoạt động tối thích của enzyme Tùy thuộc vào bản chất enzyme mà pH enzyme hoạt động thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid [2] Để xác định pH thích hợp để thủy phân thịt cá bằng CPE protease từ sò lụa, thực hiện phản ứng giữa CPE protease với thịt cá ở điều kiện pH ban đầu khác nhau từ 4÷9

Hình 8 Ảnh hưởng của pH phản ứng đến

hoạt tính protease từ sò lụa Kết quả thí nghiệm cho thấy, pH thủy phân khác nhau thì khả năng thủy phân thịt cá của CPE protease từ sò lụa là khác nhau như Hình

8 Trong dãy pH khảo sát thủy phân thịt cá thì

ở pH 6,0 CPE protease đạt được khả năng thủy phân cao nhất Điều này, có thể do ở pH 6,0 thì enzyme và cơ chất ở trạng thái ion hóa thích hợp nhất cho sự kết hợp với nhau cho nên enzyme đạt hoạt độ xúc tác lớn nhất Khi tiếp tục tăng pH thủy phân thịt cá lên thì khả năng thủy phân của CPE protease từ sò lụa giảm Ở các giá trị pH ngoài vùng pH tối ưu, hoạt độ của protease giảm có thể do các

0.141 0.182

0.3890.404 0.340 0.283

0.121

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450

30 35 40 45 50 55 60 65 70

Nhiệt độ ( o C)

0.3650.387

0.3228 0.211 0.178 0.084 0.047 0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

4,0 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 9,0

pH ban đầu

nguyên nhân sau: trạng thái ion hóa của

enzyme và cơ chất còn thấp, mức độ kết hợp

enzyme cơ chất thấp; pH cao hay thấp cũng có

thể làm biến tính enzyme nên là giảm hoạt độ

xúc tác của enzyme đó Như vậy, pH thủy

phân thịt cá thích hợp bằng CPE protease là

6,0

Kết quả xác định nồng độ chế phẩm enzyme

protease thích hợp để thủy phân thịt cá

Việc nghiên cứu nồng độ enzyme/cơ chất giúp

thực hiện phản ứng thủy phân bằng enzyme

một cách nhanh nhất với lượng enzyme phù

hợp không thừa hay thiếu Để xác định nồng

độ CPE protease thủy phân thịt cá thích hợp,

tiến hành thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng chế

phẩm protease với tỷ lệ hoạt độ CPE

protease/thịt cá (UI/g) tăng dần từ 0,2 UI/g

÷1,6 UI/g với bước nhay là 0,2 UI

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ CPE

protease ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân

thịt cá dựa vào lượng tyrosin hình thành như

Hình 9 Trong dãy nồng độ khảo sát thì nồng

độ CPE protease là 1UI/g thịt cá là phù hợp vì

lúc này sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất là

cực đại Khi tiếp tục tăng nồng độ CPE

protease thì hiệu quả thủy phân không tăng

Điều này có thể do lượng cơ chất đã kết hợp

hết với lượng enzyme cho vào nên khi tăng

nồng độ enzyme thì vẫn không tăng lượng

tyrosin hình thành Do đó, có thể chọn nồng

độ enzyme protease để thủy phân mẫu thịt cá

là 1,0 UI/g thịt cá

Hình 9 Ảnh hưởng của nồng độ CPE

protease đến khả năng thủy phân thịt cá

Kết quả đánh giá mức độ thủy phân thịt cá

bằng chế phẩm enzyme protease thu được

từ sò lụa

Việc nghiên cứu thử nghiệm khả năng thủy

phân của enzyme là cần thiết cho việc ứng

dụng hiệu quả về sau Mức độ thủy phân là

một trong các thông số đánh giá hiệu quả thủy

phân cơ chất của enzyme Mức độ thủy phân

được xác định bằng tỷ lệ đạm acid amin trên

hàm lượng đạm tổng số Để xác định mức độ thủy phân thịt cá của CPE protease từ sò lụa, tiến hành thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng CPE

ở điều kiện thích hợp theo thời gian

Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Hình

10 và Bảng 3 Kết quả cho thấy, trong khoảng thời gian từ 0-4 giờ thủy phân, hàm lượng acid amin tạo thành khá nhanh từ 0÷2,225 mg/ml tương đương mức độ thủy phân là 30,77%

Khi tiếp tục kéo dài thêm thời gian thủy phân lên 5÷6giờ thì hàm lượng acid amin tăng chậm

từ 2,414-2,438 mg/ml tương ứng với mức độ thủy phân là 33,38% ÷ 33,71% Có thể thấy sự gia tăng hàm lượng acid amin lúc này là không đáng kể và có thể kết thúc phản ứng thủy phân

ở thời điểm 4÷5 giờ Hàm lượng đạm acid amin không tăng có thể do enzyme lúc này mất hoạt tính xúc tác Như vậy, mức độ thủy phân thịt cá của CPE protease từ sò lụa đạt được khoảng 33% trong thời khoảng 4÷5 giờ

Bước đầu có thể ứng dụng enzyme này kết hợp với tác nhân thủy phân khác để đạt hiệu quả thủy phân cao hơn

Hình 10 Sự thay đổi hàm lượng đạm acid

amin theo thời gian thủy phân hỗn hợp thịt cá

bằng CPE protease từ sò lụa

Bảng 3 Sự thay đổi hàm lượng đạm acid

amin theo thời gian và hiệu quả thủy phân hỗn hợp thịt cá bằng CPE protease từ sò lụa

Thời gian thủy phân (h)

Hàm lượng đạm tổng số (mg/ml)

Hàm lượng đạm acid amin (mg/ml)

Mức độ thủy phân (%)

1

0

0.536

0.861

1.593 2.033 2.5172.5822.5042.558

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nồng độ enzyme/thịt cá (UI/g)

0.663 0.994 1.373

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000

Thời gian thủy phân (h)

KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu này cho phép đi đến một

số kết luận sau:

So với sò lông và sò điệp thì sò lụa có chứa hệ

protease có hoạt tính cao nhất

- Điều kiện tối ưu để chiết protease từ sò lụa

là: dung môi chiết là đệm phosphat pH = 7 với

tỷ lệ dung môi/mẫu là 1,8; nhiệt độ chiết là

31oC và thời gian chiết là 13 phút

- Điều kiện kết tủa thích hợp để thu hồi CPE

protease là aceton 96% với tỷ lệ dịch enzyme/dịch aceton là 1/2 trong thời gian 15 phút

- Điều kiện hoạt động xúc tác phản ứng thủy phân thịt cá thích hợp của CPE protease từ sò lụa là: nhiệt độ thích hợp là 55oC, pH thích hợp 6,0 và thời gian thủy phân thích hợp là 5h

- Mức độ thủy phân thịt cá của CPE protease thu được từ sò lụa là là 33,4%

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Adinarayana K, Ellaiah P, Prasad D S - Purification and partial characterization of

thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-11,

AAPS Pharm Sci Tech 2003, Article 56 (2003) 9p

Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến - Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 1998

Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng - Nguyên liệu chế biến thủy sản, tập 1, NXB Nông nghiệp

TP Hồ Chí Minh, 2006

Nguyễn Lệ Hà - Một số enzyme từ động vật thủy sản, Tạp chí khoa học – Công nghệ thủy sản,

Số 3/2013, Trang 183-189

Lâm Tuyết Hận – Nghiên cứu thu chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá chẽm (Lates calcarifer) và ứng dụng sản xuất bột cá thực phẩm, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, trường Đại

học Nha Trang , 2009

Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột

cá basa (pangasius bocourti), Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, tập 9,

số11/2006, trang 59-67

Nguyễn Quang Hùng - Đa dạng sinh học và nguồn lợi động vật thâm mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia) vùng biển Cát Bà và Cô Tô, Viện nghiên cứu hải sản - Tuyển tập các công trình nghiên cứu nghề cá Biển (tập III), NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2005 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Lệ Hà - Sản xuất các chế phẩm

kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2016

Roe S - Protein purification techniques, Oxford University press (2001) 262p

Sriket, C - Proteases in fish and shellfish: Role on muscle softening and prevention, International Food Research Journal 21 (2014), 433-445

Lê Ngọc Tú, La Văn Chư, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Dững, Lê Đoàn Diên - Hóa sinh học công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

Thangam E B and Rajkumar G S - Purification and characterization of alkaline protease

from Alcaligenes faecalis, Biochem 35 (2002), pp149-154

Wisuthiphaet, N, Klinchan, Kongruang, S - Fish protein hydrolysate production by acid and enzymatic hydrolysis, KMUTNB Int J Appl technol, vol 9, no 4 (2016), pp 261-270