Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.).

Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.).Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.).Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.).Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.).

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Lại Hợp Hiếu

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA LÁ CÂY GIÁ (Excoecaria agallocha L.) VÀ CÂY ĐƠN LÁ ĐỎ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2021

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Ngô Đại Quang

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Văn Thanh

Phản biện 1: ………Phản biện 2: ……….Phản biện 3: ………

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấpHọc viện họp tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam

Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại:

-Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam

-Thư viện Quốc gia

ra trở nên vô hiệu.

Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại Giá trịcủa chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà vì còn

có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện vàphát triển nhiều dược phẩm mới Trong việc nỗ lực điều tra, nghiên cứu vàtìm kiếm nguồn dược liệu phục vụ cho các chương trình chăm sóc sức khỏecộng đồng, việc thực hiện các nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồngốc từ thiên nhiên có hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của tế bàoung thư, các nguồn kháng sinh thế hệ mới… để ứng dụng trong phòng ngừa,chữa trị các bệnh ung thư, kháng sinh, kháng lao… là một trong những nhiệm

vụ đặc biệt quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nướcquan tâm Bên cạnh các nguồn tài nguyên thực vật có mạch trên đất liền,nguồn tài nguyên sinh vật biển, nguồn tài nguyên thực vật rừng ngập mặn vàthực vật tham gia ngập mặn đã và đang trở thành đối tượng thu hút nhiều sựquan tâm của các nhà khoa học trong lĩnh vực y sinh-dược học Nhiệm vụđiều tra, tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học trong các loài thực vật thuộcrừng ngập mặn đã và đang được triển khai, đang được nhiều cơ sở nghiên cứuquan tâm và theo đuổi nghiên cứu

Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh

học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)” được thực hiện nhằm mục tiêu phát

hiện được các hoạt chất có tiềm năng từ cây Giá và Đơn lá đỏ góp phần làm

rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ truyền đồng thời làm tănggiá trị khoa học của các cây này ở Việt Nam.

 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây Giá (Excoecaria

agallocha) và Đơn lá đỏ (E cochinchinensis).

 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tínhkháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết tổng và các hợp chất phân lập đượcnhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học chonhững nghiên cứu tiếp theo

 Phân lập các hợp chất từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ bằng các phươngpháp sắc ký kết hợp Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lậpđược bằng các phương pháp vật lý, hóa học

 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tínhkháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếmcác hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứutiếp theo

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học của cây Giá (E agallocha) và cây Đơn lá đỏ (E.

cochinchinensis).

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1.Đối tượng nghiên cứu

Hình II.1 Tiêu bản cây Giá Hình II.2 Tiêu bản cây Đơn lá đỏ

Mẫu thực vật được TS Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tàinguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xácđịnh tên khoa học, tiêu bản lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

và Viện Hóa sinh biển

II.2.Phương pháp nghiên cứu

II.2.1. Phương pháp ngâm chiết

Mẫu thực vật được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm sau đó đượcxay nhỏ, chiết siêu âm/hoặc ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol Dịchchiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol.Cặn chiết này được hoà với nước rồi chiết lỏng lỏng với chloroform thuđược cặn chiết CHCl3 và phần dịch nước

II.2.2. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất

Việc ngâm chiết, phân lập, tinh chế các phần dịch chiết của câyGiá và Đơn lá đỏ được thực hiện bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng(TLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với các cỡ hạt khác nhau, sắc kýcột pha đảo RP-18 và sephadex LH-20

II.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa cácthông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại: điểm nóng chảy (Mp),

độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phun mù điện tử MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân:phổ một chiều (1H NMR, 13C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (COSY,HSQC, HMBC và NOESY/ROESY)

(ESI-II.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

 Hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư người: tế bào ungthư vú ở người (MCF-7), ung thư phổi người (LU-1) và ung thư biểu môngười (KB) sử dụng phương pháp MTT và SBR

 Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bàoRAW264.7 kích thích bởi LPS

 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trênphương pháp pha loãng đa nồng độ Tám chủng vi sinh vật kiểm định thử

nghiệm là: hai chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli ATCC 25922

và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), hai chủng Gram (+) (Bacillus subtillis ATCC 11774 và Staphylococcus aureus ATCC 11632), hai chủng nấm sợi (Aspergillus niger 439 và Fusarium oxysporum M42)

và hai chủng nấm men (Candida albicans ATCC 7754 và Saccharomyces

cerevisiae SH 20).

Chương III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

II.1.Phân lập các hợp chất

II.1.1. Phân lập các hợp chất từ cây Giá

A: Acetone CC: Cột sắc ký D: Dichloromethane M: Methanol

2. RP-18 CC, Methanol-H 2 O (1:2)

Sephadex LH-20 CC, Methanol-H 2 O (1:1)

Hình III.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc cây Giá

n-Hexane/60% Aq MeOH

n-Hexane, n-Hexane-acetone tăng dần độ phân cực 100:1, 70:1, 0:100

Cặn EtOAc (E, 7 g) Cặn MeOH (C, 14 g)

E-3C

(78 mg) E-3B

Hình III.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước cây Giá

II.3.2 Phân lập các hợp chất từ cây Đơn lá đỏ

Hình III.4 Sơ đồ phân bố các phân đoạn từ cặn MeOH cây Đơn lá đỏ

MeOH-H2O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v)

Silica gel CC, CHCl 3 -MeOH (30:1, 20:1, v/v)

Hình III.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phần nước của cây Đơn lá đỏ

III.1.3 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất

Phần này trình bày thông số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ

III.2.Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được

III.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Giá

Bảng III.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết MeOH

(µg/mL)

% ức chế

(µg/mL)

% ức chế

Phần nước

Silica gel CC, CHCl 3 -MeOH (50:1, 25:1, v/v)

W-3A W-2B

W-2A

YMC RP-C18 CC Acetone-H 2 O (1:3,5, v/v)

Silica gel CC, CH 2 Cl 2 -MeOH-H 2 O (5:1:0,1); YMC RP-C 18 , MeOH-H 2 O (1:1)

Silica gel CC, CH 2 Cl 2 -MeOH-H 2 O (6:1:0,05); Sephadex LH-20, MeOH-H 2 O (1:1)

Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH của câyGiá có khả năng ức chế lớn hơn 50% sự phát triển tế bào sống trên cả badòng tế bào ung thủ thử nghiệm là KB, LU-1 và MCF7 Chất đối chứngdương ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm Các kết quả trên làchính xác với r2 ≥ 0,99.

III.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cây Giá

Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH của cây Giá cho thấy chỉ có hoạt

tính kháng một VSVKĐ của vi khuẩn Gram dương B subtillis (MIC = 200

µg/mL) Các hợp chất phân lập được đã được thử hoạt tính kháng vi sinh vật

kiểm định trên tám chủng vi khuẩn bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (–): E.

coli, P aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+): B subtillis, S aureus, hai

chủng vi khuẩn nấm mốc: A niger, F oxysporum, hai chủng vi khuẩn nấm

men: S cerevisiae và C albicans Hợp chất blumenol A (EA-6) thể hiện hoạt

tính kháng VSVKĐ trên chủng F oxysporum (MIC = 50 µg/mL).

Bảng III.3 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của

các hợp chất và cặn chiết từ cây Giá

Ký hiệu mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (g/mL)

-# Nồng độ mẫu đầu tương đương với 0,1 mM; Streptomycin, nystatin và tetracyclin được sử dụng

như những kháng sinh chuẩn *Ec (Escherichia coli), Pa (Pseudomonas aeruginosa), Bc (Bacillus subtillis), Sa (Staphylococcus aureus), An (Aspergillus niger), Fo (Fusarium

oxysporum), Sc (Saccharomyces cerevisiae) và Ca (Candida albicans) (-) Không xác định.

III.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của cây Đơn lá đỏ

Bảng III.4 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế quá trình sản sinh nitric oxide

(NO) trên đại tế bào RAW264.7 của các hợp chất

0,3 33,89 ± 0,51 95,35 ±0,75

3

lần.

Cardamonin được sử dụng như chất chuẩn chứng Các thí nghiệm được lặp lại

Bảng II.5 Kết quả IC50 của các hợp chất thể hiện hoạt tính

CHƯƠNG IV THẢO LUẬN KẾT QUẢ

IV.1.Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cây Giá

IV.1.1. Hợp chất excoecarin L (EA-1, Chất mới)

IV.1.2.

Hình IV.1 Cấu trúc của EA-1, tương tác COSY, HMBC chính và chất tham

khảo

Hình IV.2 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EA-1

Hợp chất EA-1 phân lập từ phân đoạn chloroform, có dạng bột

màu trắng Phổ HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M + Na]+ tại m/z

343,1897 (tính toán theo lý thuyết C19H28NaO +, 343,1880), phù hợp vớicông thức phân tử C19H28O4 Trên phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tínhiệu cộng hưởng của 19 carbon, gồm bốn carbon không liên kết vớihydro, sáu nhóm methine, tám nhóm methylene và một nhóm methyl

Trong đó, các tín hiệu của hai carbon methine olefin [δC 135,5 (C-15) và

H-Hz, H-20a)/3,89 (1H, dd, J = 3,5, 9,5 H-Hz, H-20b), hai proton olefin thuộc một liên kết đôi hai lần thế tại δH 5,73 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-15)

và δH 5,66 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-16) (Bảng IV.1).

4

Hình IV.3 Phổ H NMR của hợp chất EA-1

Hình IV.4 Phổ 13C NMR của hợp chất EA-1

Hình IV.5 Phổ HSQC của hợp chất EA-1

Hình IV.6 Phổ HMBC của hợp chất EA-1 Hình IV.7 Phổ COSY của hợp chất EA-1

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HSQC, HMBC và COSY

cho thấy hợp chất EA-1 có cấu trúc phẳng tương tự như hợp chất agallochin

I (trước đó cũng được phân lập từ cây này), ngoại trừ sự có mặt thêm tín

hiệu của một nhóm hydroxy tại vị trí C-17 Các tương tác xa HMBC giữa δH

3,40/3,45 (H-17) với δC 28,0 12), 51,1 13), 56,6 14) và 135,2 16) cho thấy nhóm OH liên kết với C-17, trong khi đó các tương tác haichiều trên phổ COSY giữa proton H-18/H-4/H-5/H6/H-7 một lần nữa khẳngđịnh nhóm methyl liên kết với C-4 và nhóm hydroxy liên kết với C-6.Ngoài ra, sự dịch chuyển hóa học về phía trường yếu của carbon hemiketal

(C-tại δC 98,69 (C-3) kết hợp với các tương tác HMBC giữa δH 3,80/3,89

(H-20) với δC 32,7 (C-1), 98,6 (C-3), 57,9 (C-5) và 37,5 (C-10) cho phép khẳngđịnh liên kết cầu eter giữa C-20 với C-3 và nhóm hydroxy còn lại trongphân tử liên kết tại C-3 (Hình IV.5-IV.6)

Bảng IV.1 Số liệu phổ NMR (δ ppm) của EA-1 và hợp chất tham khảo

7a, 7b 17

a Đo trong CDCl 3 , b75MHz; cđo trong CD 3 OD, d125MHz, e500MHz #δδ C số liệu phổ của

agallochin I tham khảo tài liệu sô [35].

Cấu hình tương đối của hợp chất EA-1 được xác định dựa vào giá

trị hằng số tương tác (JH-H) và các tương tác trên phổ NOESY Các vị trí

H-5, H-6, H-7a và H-9 được xác định là axial do giá trị JH-H lớn (J = 11,0

-Hình IV.8 Các tương tác NOESY của hợp chất EA-1

Hình IV.9 Phổ NOESY của hợp chất EA-1

12,5 Hz) Thêm nữa, các tương tác NOESY giữa proton 5/9, 1a, 7a; H-7a/H-14a, H-9; H-20b/H-15; H-15/H-16 và H-20a/H-11a, H-1b, H-2axác nhận cấu hình khung beyer-15-ene diterpenoid Cuối cùng, các tương tácgiữa H-6/H-20b, H-15, H-4 và giữa H3-18/H-2b cho phép khẳng định cấu

H-hình β của H-6 và H-4 (Hình IV.8-IV.9) Từ các phân tích phổ nêu trên, hợp

chất EA-1 được xác định là

3β,20-epoxy-3,6α,17-trihydroxy-19-nor-beyer-15-ene, đây là một chất mới và cũng là hợp chất dạng 19-nor-beyerene

diterpenoid đầu tiên phân lập được từ cây E agallocha và được đặt tên là

excoecarin L

Chi tiết xác định cấu trúc 8 hợp chất còn lại trong Luận án và đượctóm tắt Hình IV.26 dưới đây:

Hình IV.26 Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cây Giá

IV.2.Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Đơn lá đỏ

IV.2.1. Hợp chất

6α,7α-epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-α,7α-epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15- dien-3-one 20-O-β-D-glucopyranoside (EC-1, Chất mới)

Hợp chất EC-1 phân lập được có dạng bột, màu trắng Phổ HR-

ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M - H]- tại m/z 541,2297 (tính toán theo

lý thuyết C26H37O -, 541,2291), 577,2063 [M + Cl]- (tính toán theo lýthuyết C26H38ClO12-, 577,2057) và 587,2346 [M + HCOO]- (tính toán theo lýthuyết C27H39O -, 587,2345), phù hợp với công thức phân tử C H O

(Hình IV.28).

Hình IV.27 Cấu trúc của EC-1 và hợp chất tham khảo

12

Hình IV.28 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EC-1

Hình IV.29 Phổ 1H NMR của hợp chất EC-1

Hình IV.30 Phổ 13C NMR của hợp chất EC-1

Phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 26 carbon,bao gồm sáu carbon không liên kết với hydro, 13 nhóm methine, bốn nhómmethylene và ba nhóm methyl Phân tích độ chuyển dịch hóa học của các tín

hiệu cho phép nhận dạng một nhóm carbonyl [δC 209,9 (C-3)], bốn carbon

olefin [δ C 163,0 (C-1), 134,7 (C-2), 145,9 (C-15) và 117,2 (C-16)], sáu

carbon thuộc một gốc đường glucose [δC 104,8 (carbon anome, H-1'), 75,2(C-2'), 78,0 (C-3'), 71,6 (C-4'), 78,0 (C-5') và 62,8 (C-6')], ba carbon không

mang hydro liên kết với oxy [δC 74,7 (C-4), 64,6 (C-6) và 77,3 (C-9)], ba

nhóm oxymethine [δC 68,1 (C-5) và 62,3 (C-7) và 71,4 (C-13)], cùng với một

nhóm oxymethylen [δC 74,2 (C-20)] Phổ 1H NMR cho tín hiệu của hai nhóm

methyl [δH 1,70 (3H, s, H-17) và 1,76 (3H, d, J = 2,0 Hz, H-19)], một nhóm methyl bậc hai [δH 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-18)], một proton olefin thuộc một liên kết đôi ba vị trí thế [δH 7,66 (1H, br s, H-1)], hai proton olefin khácthuộc một liên kết đôi dạng >C=CH2 [δH 4,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-16a)/5,04 (1H, br s, H-16b), một proton anome của gốc đường glucose có cấu hình β [δH 4,33 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1') và các tín hiệu của các nhóm oxymethine/oxymethylene trong vùng dịch chuyển hóa học từ δH 3,20 – 4,20

ppm (Hình IV.28-IV.29).

Hình IV.31 Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của EC-1

Hình IV.31 Phổ HSQC của hợp chất EC-1 Hình IV.32 Phổ HMBC của hợp chất EC-1

Hình III.33 Phổ COSY của hợp chất EC-1 Hình III.34 Phổ NOESY của hợp chất EC-1

Phân tích chi tiết các phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC,

COSY, HMBC cho thấy cấu trúc phần aglycon của EC-1 có nhiều vị trí tương đồng với hợp chất venenatin (EC-2) cũng được phân lập từ cây Đơn lá

đỏ (E cochinchinensis), ngoại trừ sự khác nhau ở các vị trí C-13 và C-14

(Bảng IV.9) Ở hợp chất EC-2, vị trí C-13 là carbon không liên kết với hydro

có hai nhóm thế là hydroxy và isopropenyl, vị trí C-14 có một nhóm hydroxy,

còn ở hợp chất EC-1 vị trí C-13 có 1 nhóm hydroxy và vị trí C-14 có một

nhóm isopropenyl Hơn nữa, các tương tác COSY giữa proton 14/H-13/H-12/H-11/H-8 và các tương tác HMBC giữa H-17 với C-14, C-15,C-16, giữa H-16 với C-14, C-15, C-17, giữa H-8 với C-9, C-11, C-13, C-14,C-15 đã khẳng định nhận định trên cũng như cấu trúc vòng C Gốc đườngglucose liên kết với aglycon ở vị trí C-20 nhờ các tương tác HMBC giữa H-1'với C-20 và H-20 với C-1' Ngoài ra, các tương tác COSY và HMBC kháctrong hình dưới đã khẳng định cấu trúc phẳng của vòng A và B trong phân tử