Đánh giá tình hình lưu hành vi rút cúm gia cầm tại khu vực lân cận thành phố hồ chí minh và khả năng bảo hộ của vắc xin navet fluvac 2 đối với vi rút cúm gia cầm clade 2 3 2 1

TÓM TẮT Đề tài “Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm tại khu vực lân cận Thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.

ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN

NAVET-FLUVAC 2 ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1

Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi

Mã số: 9.64.01.02

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

TP HCM - Năm 2021

ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN

NAVET-FLUVAC 2 ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1

Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi

Mã số: 9.64.01.02

DANH MỤC CÔNG TRÌNH TÁC GIẢ

TP HCM - Năm 2021

TÓM TẮT

Đề tài “Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm tại khu vực lân cận Thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1” được thực hiện nhằm đánh giá tình hình

lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận; xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và các chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2; đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc clade 2.3.2.1 Kết quả đạt được như sau:

Kết quả khảo sát 2.880 mẫu xét nghiệm tại cơ sở giết mổ trên đàn gia cầm có nguồn gốc từ 8 tỉnh gồm Đồng Nai, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang, Bến Tre và Thành phố Hồ Chí Minh và 1.800 mẫu xét nghiệm thu thập trên đàn gia cầm khỏe mạnh tại 5 huyện: Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh, Nhà Bè và Cần Giờ không phát hiện trường hợp dương tính vi-rút cúm A/H5N1 Nghiên cứu đã phát hiện 51/63 mẫu xét nghiệm dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1, từ các trường hợp nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm tại các hộ chăn nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận

Dấu hiệu lâm sàng phổ biến trên đàn gà, vịt mắc bệnh Cúm A/H5N1 gồm có ủ

rũ, bỏ ăn, phù đầu, thở khò khè, liệt chân, sả cánh, phân trắng xanh, xoay vòng vòng, co giật Dấu hiệu thần kinh trên vịt là điển hình Bệnh tích điển hình gồm có: não, phổi xuất huyết, xuất huyết lớp mỡ vành tim, gan và lách sưng xuất huyết, khí quản xuất huyết có thể sử dụng để chẩn đoán lâm sàng Da chân xuất huyết trên gà

là bệnh tích điển hình của bệnh Cúm gia cầm ở gà

Kết quả phân tích di truyền 26/51 chủng vi-rút Cúm A/H5N1 được chọn ngẫu nhiên trong giai đoạn 2013 - 2015 ghi nhận, có 22 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, 3 chủng thuộc clade 1.1.2 và 1 chủng thuộc clade 2.3.2.1a

Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1c trong nghiên cứu có sự tương đồng trình tự nucleotide rất cao với 2 chủng vi-rút sử dụng công cường độc A/chicken/DL/NAVET 0292(14)/2013 và A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-

17A261/2017 thuộc clade 2.3.2.1c, trong khoảng 96,1 - 99,1%; và với 2 chủng rút sử dụng trong vắc-xin, 95,0 - 96% với chủng A/reassortant/USCDC_RG30 và 91,3 - 92,2% với chủng A/reassortant/NIBRG-14

vi-Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thực địa thuộc clade 1.1.2 chỉ tương đồng di truyền ở mức 89,7 - 89,8% với chủng vi-rút sử dụng trong vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30, nhưng tương đồng cao hơn với chủng vi-rút trong vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 ở mức 93,3 - 93,4%

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt độ an toàn theo tiêu chuẩn sau khi tiêm phòng cho đàn gà, vịt và vịt trời, ngay cả khi tiêm với liều gấp đôi liều chỉ định

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có hiệu quả bảo hộ rất cao đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c trên gà, vịt và vịt trời Đối với gà chỉ cần tiêm 1 lần ở thời điểm 2 tuần tuổi; đối với vịt và vịt trời phải tiêm phòng lặp lại 2 lần ở thời điểm 14 ngày tuổi và tiêm lặp lại mũi tiêm thứ 2 sau 14 ngày kể từ ngày tiêm mũi 1

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng giảm mạnh sự bài thải chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 độc lực cao sau khi công độc Tỷ lệ bài thải vi-rút sau khi công cường độc 3 ngày, giữa gà, vịt được tiêm phòng và không được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, có ý nghĩa thống kê với P<0,05

Thời gian miễn dịch bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên đàn gà và vịt được tiêm phòng tối thiểu là 6 tháng với hiệu giá kháng thể HI trung bình đạt trên 6log2 ở gà và trên 4log2 ở vịt

Vắc-xin Navet-Fluvac 2 tạo được miễn dịch bảo hộ đối với công cường độc chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 độc lực cao không chỉ ở những vịt có hiệu giá kháng thể HI trung bình >4log2, mà cả ở những vịt có hiệu giá kháng thể HI thấp hơn 4log2

SUMMARY Thesis “Prevalence of Avian Influenza Virus in Ho Chi Minh region and evaluation of Navet-Fluvac 2 vaccine efficacy against Avian Influenza Virus clade 2.3.2.1 in poultry” was conducted in order to (i) determine the prevalence of

Avian Influenza Virus (AIV) in poultry in Ho Chi Minh region, (ii) analyze genetic relation of field and vaccine virus strains, and (iii) evaluate the protective efficacy

of Navet-Fluvac 2 for poultry against AIV clade 2.3.2.1 The results showed that: All of these 2,880 samples at slaughterhouses on poultry flocks originating from 8 provinces: Dong Nai, Binh Duong, Ba Ria Vung Tau, Tay Ninh, Long An, Tien Giang, Ben Tre, Ho Chi Minh City and 1,800 samples collected from healthy poultry flocks in 5 districts: Cu Chi, Hoc Mon, Binh Chanh, Nha Be and Can Gio were negative for influenza A/H5N1 virus by RT-PCR test However, from suspected cases of avian Influenza in livestock households in Ho Chi Minh City and neighboring provinces, the study detected 51/63 samples that were positive for Influenza A/H5N1 virus

The common clinical signs in chickens and ducks infected with influenza A/H5N1 were lethargy, anorexia, swollen head, wheezing, leg paralysis, drooping wings, greenish white feces, torticollis, incoordination Neurological signs in ducks are typical for AI Haemorrhage lesions were observed on brain and many visceral organs including lungs, coronary pericardium, liver, spleen, and trachea Haemorrhage on foot skin of chickens is a typical lesion of Avian Influenza in chickens

The results of genetic analysis of 26/51 strains of Influenza A/H5N1 virus randomly selected in the period 2013-2015 recorded 22 strains belonging to clade 2.3.2.1c, 3 strains of clade 1.1.2, and 1 strain of clade 1.1.2 belonging to clade 2.3.2.1a

Influenza A/H5N1 virus strains belonging to clade 2.3.2.1c in the study have very high nucleotide sequence similarity with 2 virus strains A/chicken/DL/NAVET 0292(14)/ 2013 and A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017 belong to clade 2.3.2.1c using in challenge, in the range of 96.1 - 99.1%; and with 2 vaccine

virus strains in the range of 95.0 - 96% with strain A/reassortant/USCDC_RG30 and 91.3 - 92.2% with strain A/reassortant/NIBRG-14

AIV clade 1.1.2 in this study were low homologous to those of vaccine virus strains A/reassortant/NIBRG-14 and A/reassortant/USCDC_RG30 with 93.3 – 93.4% and 89.7 – 89.8%, respectively

The results of study showed that Navet-Fluvac 2 vaccine was safety in vaccinated poultry (chicken, duck and mallard), even when injected with double dose Evaluation of Navet-Fluvac 2 vaccine efficacy in vaccinated poultry by virus challenge method was shown as follow:

The Navet-Fluvac 2 vaccine is highly effective against clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b and 2.3.2.1c Avian Influenza viruses in chickens, ducks and mallards For chickens, only 1 injection is needed at 2 weeks of age; ducks and mallards must be vaccinated twice, at 14 days of age and repeat the second injection 14 days after the first injection

Navet-Fluvac 2 vaccine has the ability to strongly reduce the shedding of highly virulent Avian Influenza A/H5N1 virus after challenge The rate of viral shedding after 3 days of challenge, between vaccinated and unvaccinated chickens and ducks with Navet-Fluvac 2 vaccine, was statistically significant with P<0.05

The duration of protective immunity of Navet-Fluvac 2 vaccine in vaccinated chickens and ducks is a minimum of 6 months with mean antibody titers above 6log2 in chickens and above 4log2 in ducks

Navet-Fluvac 2 vaccine confers protective immunity against highly virulent Avian Influenza A/H5N1 viruses not only in ducks with mean HI antibody titers >4log2, but also in those ducks with HI antibody titers lower than 4log2

MỤC LỤC

TRANG

Trang phụ bìa

TÓM TẮT iii

SUMMARY v

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH MỤC CÁC BẢNG xii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ xiv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu về vi-rút Cúm gia cầm 5

1.2 Các phương thức biến đổi kháng nguyên vi-rút Cúm 8

1.2.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift) 8

1.2.2 Hiện tượng trộn kháng nguyên 9

1.2.3 Hiện tượng glycosyl hóa 10

1.3 Độc lực vi-rút Cúm gia cầm 11

1.3.1 Protein HA 11

1.3.2 Protein NA 13

1.3.3 Protein NS1 14

1.3.4 Nhóm RNA-polymerase 14

1.3.5 Protein M2 và PB1-F2 14

1.4 Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm (H5) trên thế giới và tại Việt Nam 15

1.4.1 Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm phân type H5 trên thế giới 15

1.4.2 Tình hình lưu hành các nhánh vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam 16

1.5 Đặc điểm bệnh lý bệnh Cúm gia cầm 18

1.5.1 Dấu hiệu lâm sàng của gia cầm mắc bệnh 18

1.5.2 Bệnh tích trên gia cầm mắc bệnh 18

1.6 Miễn dịch đối với vi-rút Cúm gia cầm 19

1.6.1 Miễn dịch thụ động 19

1.6.2 Miễn dịch chủ động 20

1.6.3 Miễn dịch chéo đối với vi-rút Cúm gia cầm 25

1.6.4 Cơ chế né tránh miễn dịch của vi-rút Cúm gia cầm 26

1.7 Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam 28

1.7.1 Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới 28

1.7.2 Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm tại Việt Nam 33

1.7.3 Hiệu lực của vắc-xin Cúm gia cầm và phương pháp đánh giá 37

1.8 Tình hình bệnh và sử dụng vắc-xin Cúm gia cầm tại khu vực khảo sát 38

1.8.1 Tình hình chăn nuôi và bệnh Cúm gia cầm 38

1.8.2 Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm 40

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 42

2.1.1 Địa điểm 42

2.1.2 Thời gian: Từ tháng 01/2014 đến 12/2019 42

2.2 Đối tượng nghiên cứu 42

2.3 Nội dung nghiên cứu 43

2.4 Vật liệu, hóa chất 43

2.5 Phương pháp nghiên cứu 43

2.5.1 Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 43

2.5.2 Nghiên cứu phả hệ, so sánh sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm 46

2.5.3 Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1 50

2.6 Xử lý thống kê 60

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 61

3.1 Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 61

3.1.1 Khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm tại cơ sở giết mổ 61

3.1.2 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ Chí

Minh 64

3.1.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 đối với các trường hợp gia cầm nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm 66

3.1.4 Dấu hiệu lâm sàng ở gà, vịt bệnh dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1 68

3.2 Nghiên cứu phả hệ của vi-rút Cúm A/H5N1 77

3.2.1 Kết quả giải trình tự và phân tích gien HA 77

3.2.1.1 Xác định phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm theo trình tự gien HA 77

3.2.1.2 Phân tích trình tự axít amin tại điểm cắt protein HA thành HA1 và HA2 79

3.3 Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 90

3.3.1 Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 90

3.3.2 Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên gà 96

3.3.3 Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên vịt 106

3.3.4 Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời 114

3.3.5 Đánh giá khả năng bài thải vi-rút sau công độc 117

3.3.6 Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 125

4.1 Kết luận 125

4.2 Đề nghị 126

DANH MỤC 127

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO 128

PHỤ LỤC 141

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AI : Avian Influenza

AIV : Avian Influenza Virus

APC : Antigen Presenting Cell

BALT : Bronchus associated lymphoid tissues

BCR : B Cell Receptor

BNNPTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

CD : Cluster of Differenciation

CTL : Cytotoxic T lymphocyte

DC : Dendritic cell

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ECF : Eosinophil chemoratic factor

FAO : Food and Agriculture Organization

GP : Glycoprotein

GrA : Granzyme

GALT : Gut associated lymphoid tissues

GMT : Geometric Mean Titer

HA : Hemagglutination

HI : Hemagglutination Inhibition

HPAI : Highly Pathogienic Avian Influenza

IL : Interleukin

LPAI : Low Pathogienic Avian Influenza

MPAI : Medium Pathogienic Avian Influenza

MHC : Major Histocompatibility Complex

NA : Neuraminidase

OIE : World organisation for animal health

(Office Internationale dé Epizooties)

PCR : Polymerase Chain Reaction

PBS : Photphate Buffered Salin

RIG-1: : Retinoic acid inducible gene 1

RT-PCR : Reverse transcription- Polymerase Chain Reaction SPF : Specific Pathogens Free

TCR : T cell receptor

WHO : World Health Organization

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1 Hiệu quả của một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm 30

Bảng 1.2 Một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm được lưu hành tại Việt Nam 36

Bảng 2.1 Phân bổ số mẫu xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm thu tại cơ sở giết mổ gia cầm An Nhơn 44

Bảng 2.2 Phân bổ mẫu khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi 45

Bảng 2.3 Danh sách các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 tham khảo trong phân tích so sánh trình tự gien và mối quan hệ phả hệ 48

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà 50

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt 51

Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời 51

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 56

Bảng 2.8 Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 57

Bảng 2.9 Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt trời được tiêm vắc-xin Navet Fluvac 2 58

Bảng 2.10 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet Fluvac 2 59

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại cơ sở giết mổ 61

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ Chí Minh 64

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên vịt tại hộ chăn nuôi 65

ở Thành phố Hồ Chí Minh 65

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm đối với các trường hợp nghi ngờ 66

Bảng 3.5 Kết quả xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 theo loài trên gia cầm nghi ngờ

bệnh Cúm gia cầm 68

Bảng 3.6 Tần suất xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng trên gà, vịt (+) Cúm A/H5N1 69

Bảng 3.7 Tần suất xuất hiện các bệnh tích trên gà, vịt (+) với vi-rút Cúm A/H5N1 73

Bảng 3.8 Trình tự axít amin tại vị trí cắt gien HA (HA1-HA2) của các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong đề tài 80

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà 90

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt 91

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời 92

Bảng 3.12 Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng trên gà theo quy trình tiêm 1 mũi và 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2 96

Bảng 3.13 Kết quả công cường độc trên gà được tiêm xin và không tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 100

Bảng 3.14 Đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 106

Bảng 3.15 Kết quả công cường độc trên vịt được tiêm và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 110

Bảng 3.16 Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể trên vịt trời có và không có tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 114

Bảng 3.17 Kết quả công cường độc trên vịt trời có và không tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 116

Bảng 3.18 Kết quả kiểm tra bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 sau khi công cường độc trên gà, vịt được và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 118

Bảng 3.19 Đánh giá độ dài miễn dịch trên gà sau khi tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 120

Bảng 3.20 Đánh giá độ dài miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt 122

Bảng 3.21 Kết quả công cường độc trên vịt tại thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 123

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

TRANG

Hình 1.1 Các đoạn RNA của vi-rút Cúm gia cầm tuýp A và các protein tương ứng 6

Hình 1.2 Sơ đồ minh họa sự đột biến điểm của vi-rút Cúm gia cầm 9

Hình 1.3 Minh họa sự thay đổi di truyền của vi-rút Cúm 9

Hình 1.4 Trình diện kháng nguyên của vi-rút Cúm A qua MHC-I và cơ chế né tránh đáp ứng miễn dịch tế bào 27

Hình 2.1 Quy trình xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 (TCVN 8400-26:2014) 46

Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên gà sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 53

Sơ đồ 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 54

Hình 3.1 Gà ủ rũ, bỏ ăn, chết tại hộ chăn nuôi xã Tân Nhựt, huyện Bình Chánh, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2013 70

Hình 3.2 Vịt ủ rũ, chết tại hộ chăn nuôi xã Xuân Thới Thượng, huyện Hóc Môn, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2014 71

Hình 3.3 Gà mắc bệnh với dấu hiệu lâm sàng mồng, tích tím tái 71

Hình 3.4 Vịt mắc bệnh có dấu hiệu rối loạn thần kinh 72

Hình 3.5 Xuất huyết da chân 74

Hình 3.6 Khí quản xuất huyết 74

Hình 3.8 Phổi sung huyết, xuất huyết 75

Hình 3.9 Xuất huyết mỡ vành tim 76

Hình 3.10 Gan sưng, xuất huyết 76

Hình 3.11 Lách sưng, xuất huyết 77

Hình 3.12 Cây di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gien HA của các chủng AIV (Giá trị Bootstrap 1000 lần lặp lại) 86

Hình 3.13 Sự khác biệt trình tự gien của vi-rút Cúm A/H5N1 89

Hình 3.14 Tiêm phòng vắc xin Navet-Fluvac 2 cho đàn vịt thí nghiệm 93

Hình 3.15 Đàn vịt trời lô thí nghiệm và lô đối chứng vận động, ăn uống bình

thường sau tiêm phòng 93

Hình 3.16 Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin tại vị trí tiêm trên gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, liều 0,5ml/con sau 3 tuần 94

Hình 3.17 Mổ khám ghi nhận còn vài hạt lấm tấm vắc-xin tại vị trí tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà, liều 1ml/con sau 3 tuần 94

Hình 3.18 Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin trên vịt tại vị trí tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 tiêm phòng liều 0,5ml/con sau 3 tuần 95

Hình 3.19 Mổ khám ghi nhận vài chấm nhỏ lấm tấm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt tiêm phòng liều 1ml/con sau 3 tuần 95

Hình 3.20 Trung tâm Nghiên cứu Thú y, an toàn sinh học cấp độ 3 103

Hình 3.21 Công cường độc trên gà bằng cách nhỏ mắt, nhỏ mũi 103

Hình 3.22 Lô gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 không có biểu hiện bất thường sau công cường độc 104

Hình 3.23 Lô gà đối chứng được không tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 chết 3 ngày sau công cường độc 104

Hình 3.24 Bệnh tích xuất huyết bàn chân trên gà lô đối chứng khi công độc 105

Hình 3.25 Bệnh tích mồng, tích tím tái trên gà lô đối chứng khi công độc 105

Hình 3.26 Công cường độc qua đường nhỏ mắt, nhỏ mũi trên vịt 112

Hình 3.27 Vịt tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 khỏe mạnh bình thường 113

Hình 3.28 Vịt lô đối chứng chết sau 3 ngày công cường độc 113

MỞ ĐẦU

Bệnh Cúm gia cầm do vi-rút A/H5N1 thể độc lực cao là một bệnh nguy hiểm gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và đe dọa tới sức khỏe của

cộng đồng Vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, là RNA vi-rút, gồm 8

sợi đơn âm Vi-rút dạng đa hình thái, kích thước 80 - 120 nm Dựa trên cấu trúc kháng nguyên của hai protein bề mặt Hemaglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), vi-rút Cúm A được phân chia thành 18 subtype HA và 11 subtype NA, trong đó tác nhân gây bệnh Cúm ở gia cầm chủ yếu là subtype H5, H7 và H9 (CDC, 2020) Kết quả khảo sát sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 của Cục Thú y tại Việt Nam cho thấy, giai đoạn đầu tiên từ năm 2003 đến 2005, trong phạm vi cả nước, vi-rút Cúm gia cầm lưu hành thuộc nhánh 1 (Nguyễn Tiến Dũng, 2008); giai đoạn 2007 - 2009, tại miền Bắc xuất hiện nhánh mới 2.3.4 và nhánh 7 trên gà nhập trái phép qua biên giới, trong khi các tỉnh miền Nam chủ yếu là vi-rút nhánh 1 (Nguyễn Tùng, 2013); từ giữa năm 2010, nhánh 2.3.2.1 xuất hiện thay thế nhánh 2.3.4 ở phía Bắc; đến năm 2013 các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long vẫn tồn tại nhánh vi-rút 1.1, trong khi các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên lưu hành chủ yếu nhánh vi-rút 2.3.2.1 gồm 3 nhóm nhỏ gọi là nhóm a, b và c Nhóm a xuất hiện từ giữa năm 2010 đến đầu năm 2012 ở hầu hết các tỉnh, trừ các tỉnh thuộc Đồng bằng Sông Cửu Long Nhóm b phát hiện trong năm 2011 và 2012 ở Quảng Ninh, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Nam Định, Thái Bình, Sơn La, Ninh Bình, Nghệ An, rất độc với gà và vịt mẫn cảm Nhóm 2.3.2.1c được phát hiện

từ giữa năm 2012 ở hầu hết các ổ dịch tại các tỉnh từ Lạng Sơn đến Quảng Ngãi dọc theo quốc lộ 1A Giai đoạn 2010 - 2013, sự tiến hoá của vi-rút Cúm A/H5N1 dẫn đến làm thay đổi tính kháng nguyên ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vắc-xin Vi-rút Cúm A/H5N1 phân nhóm 2.3.2.1 với 3 phân nhóm nhỏ 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c tại các tỉnh phía Bắc có xu hướng di chuyển vào phía Nam, trong đó 2.3.2.1c vẫn lưu hành chủ yếu tại các tỉnh miền Đông và Tây Nam

Bộ (Cục Thú y, 2015)

Sự đa dạng lưu hành vi-rút Cúm gia cầm trong giai đoạn này làm cho dịch tễ bệnh Cúm gia cầm trở nên phức tạp, ảnh hưởng đến chiến lược sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm ở Việt Nam, trong đó có Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận Vì vậy bên cạnh các vắc-xin đã sử dụng trước đây (Re1 và Re5), trong năm 2014, Việt Nam đã nhập khẩu vắc-xin Re6 để phòng bệnh Cúm gia cầm Tuy nhiên các vắc-xin Re-1 và Re-5 chỉ bảo vệ được 1 phần vịt được tiêm vắc-xin chống lại vi-rút chủng H5N1 độc lực cao clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b (Nguyễn Văn Cảm, 2011) Vắc-xin Navet-Vifluvac với chủng NIBRG-14 bảo hộ được gia cầm chống lại clade 1 và 2.3.2.1a và 2.3.2.1c, nhưng không có hiệu quả đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc phân nhóm 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng và ctv, 2012)

Tổng đàn gia cầm tại 8 tỉnh, thành thực hiện khảo sát chiếm khoảng 18,25% tổng đàn gia cầm trong cả nước và cần thiết phải xây dựng vùng an toàn dịch bệnh đối với bệnh Cúm gia cầm Để xây dựng các biện pháp phòng, chống và kiểm soát tốt, hiệu quả đối với bệnh Cúm gia cầm đòi hỏi phải có thông tin cập nhật các chủng vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành và đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin đối với các chủng vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành trên thực địa Vắc-xin đa giá, phối hợp các chủng vi-rút khác nhau, là một giải pháp có thể gia tăng hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Cúm gia cầm đối với các biến chủng khác nhau, đối phó tình hình lưu hành phức tạp các biến chủng vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam, bao gồm các nhánh 1.1, 2.3.2.1 a, 2.3.2.1 b, 2.3.2.1 c và vi-rút Cúm A/H5N6

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài được thực hiện với:

Giới hạn nghiên cứu:

- Đánh giá tình hình lưu hành, kiểu di truyền và mối liên hệ di truyền giữa các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh lân cận (Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Long An, Tiền Giang, Bến Tre)

- Hiệu quả miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 trên gà, vịt và vịt trời

Mục tiêu nghiên cứu:

- Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh lân cận, phục vụ cho công tác quản lý, kiểm soát lây truyền vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong khu vực khảo sát;

- Xác định một số đặc điểm lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh Cúm gia cầm tuýp A H5N1 góp phần định hướng trong chẩn đoán lâm sàng và phi lâm sàng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1, giúp nâng cao hiệu quả công tác phòng chống bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- Xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và sự tương đồng di truyền với chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2, góp phần làm rõ hơn sự tiến hoá của vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, cung cấp cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu dịch tễ và vắc-xin phòng bệnh do vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, trong khu vực khảo sát, cũng như ở Việt Nam và trên thế giới;

- Đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 phục vụ cho chiến lược tiêm phòng kiểm soát bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 trên đàn gia cầm tại khu vực khảo sát

Navet-Ý nghĩa của Luận án

Đây là công trình nghiên cứu khoa học về tình hình lưu hành các chủng vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận giai đoạn 2013 - 2015; xác định tính tương đồng về di truyền giữa các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành với các chủng vi-rút sử dụng để làm vắc-xin Navet-Fluvac 2 Đánh giá được hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 trên gà, vịt và vịt trời Kết quả nghiên cứu của Luận

án đã góp phần khẳng định hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trong thực tiễn và

đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép lưu hành, sử dụng trong

cả nước

Những điểm mới của Luận án

- Xác định được phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm H5N1 lưu hành và gây bệnh tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận trong giai đoạn nghiên cứu chủ yếu thuộc nhánh 2.3.2.1c và 1.1

- Đánh giá được hiệu quả phòng bệnh Cúm gia cầm của vắc-xin Navet-Fluvac

2 trên đàn gia cầm đối với các chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao, phân nhóm mới hiện diện ở miền Nam Việt Nam: vi-rút Cúm gia cầm 2.3.2.1 phân nhóm a, b,

c, bằng phương pháp công cường độc và phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể

- Công trình đầu tiên nghiên cứu về khả năng bảo hộ của vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm trên vịt trời Vịt trời được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng phòng bệnh tốt với vi-rút Cúm gia cầm phân nhánh 2.3.2.1c, hiện đang lưu hành chủ yếu tại khu vực các tỉnh phía Nam

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về vi-rút Cúm gia cầm

Vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, là vi-rút RNA sợi âm, đa

hình thái, kích thước 80 - 120 nm Dựa trên cấu trúc kháng nguyên của protein bề mặt HA và NA, vi-rút Cúm A được phân chia thành 18 subtype HA và 11 subtype

NA, trong đó tác nhân gây bệnh Cúm ở gia cầm chủ yếu là các subtype H5, H7 và H9 (CDC, 2020) Kháng nguyên HA (Haemagglunitin) và NA (Neuraminidase) có vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi-rút Cúm A

HA và NA là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi-rút vào tế bào cảm nhiễm, phân bố không đồng đều trên bề mặt vỏ (tỉ lệ khoảng 1NA/ 4HA) HA là protein gây ngưng kết hồng cầu và NA có chức năng là enzyme phá hủy liên kết của vi-rút với thụ thể trên tế bào vật chủ

(Wagner và ctv., 2002)

Vật chất di truyền của vi-rút cúm A là RNA có độ dài 13.500 nucleotit với 8 phân đoạn riêng biệt (PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M và NS) mã hóa cho 11 protein của vi-rút, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein

là PB1 và PB1-F2 (Ito và ctv., 1998; Conenello và ctv., 2007)

Phân đoạn 1 (gien PB2 - polymerase basic 2) có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của vi-rút, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA Protein PB2 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí axít amin 627 ở protein PB2 (ở vi-rút Cúm gia cầm, vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở vi-rút cúm trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37oC) (Wasilenko

và ctv., 2008)

Hình 1.1 Các đoạn RNA của vi-rút Cúm gia cầm tuýp A và các protein tương ứng

(Breen và ctv., 2016)

Phân đoạn 2 (gien PB1 - polymerase basic 1) cũng có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1, đây là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA vi-rút, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996) Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết có lập trình) (Tumpey và ctv, 2002)

Phân đoạn 3 (gien PA - polymerase acidic) có kích thước 2.233 bp, là phân đoạn gien bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa (trên thực tế là 96 kDa) PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của vi-rút (Palese, 2007)

Phân đoạn 4 (gien HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng phân type vi-rút Cúm

A (A/H1N1 là 1.778 bp, H9N1 là 1.714 bp, H5N1 là khoảng 1.704 - 1.707 bp) Đây

là gien chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt vi-rút cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số axít amin mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, là điểm cắt của enzym protease, là vùng quyết định độc lực của vi-rút Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa (nếu không được glycosyl hóa) và 77 kDa (nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48 kDa và HA2 là 29 kDa) (Gambotto và ctv., 2008, Keawcharoen và ctv., 2005)

Phân đoạn 5 (gien NP) kích thước khoảng 1.556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương của tế bào chủ NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm vi-rút, tồn tại trong các hạt vi-rút ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử khoảng

50 - 60 kDa (Salzberg, 2007)

Phân đoạn 6 (gien NA) có chiều dài thay đổi theo từng chủng vi-rút Cúm A (A/H6N2 là 1.413 bp, A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1.350 – 1.410 bp) (Nguyễn Thị Bích Nga, 2006), mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của vi-rút, có khối lượng phân tử theo khoảng 50 - 60 kDa Các nghiên cứu phân tử gien

NA của vi-rút cúm cho thấy, phần đầu 5’- của gien này có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng vi-rút Cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng

và gây bệnh của vi-rút cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau (Wagner và ctv., 2002) Đặc trưng biến đổi của gien NA ở vi-rút Cúm A là hiện tượng đột biến trượt- xóa một đoạn gien là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn

có trước đây của NA(N1) là 1.410 bp còn 1.350 bp (Keawcharoen và ctv., 2005) Phân đoạn 7 (gien M) có kích thước khoảng 1.027 bp, mã hóa cho protein khung (matrix protein - M) của vi-rút Cùng với HA và NA, có khoảng 3.000 phân

tử MP trên bề mặt capsid của vi-rút Cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin (Scholtissek và ctv., 2002) Protein M1 là một protein nền, là thành

phần chính của vi-rút, có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nẩy chồi” của vi-rút Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử theo tính toán là 11 kDa (trên thực tế là 15 kDa), là protein chuyển màng - kênh ion (ion channel), cần thiết cho khả năng lây nhiễm của vi-rút, chịu trách nhiệm cởi vỏ capsid của vi-rút trình diện hệ gien ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Scholtissek và ctv., 2002)

Phân đoạn 8 (gien NS) là gien mã hóa protein không cấu trúc (non structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gien của vi-rút Cúm A, kích thước khoảng

890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP - nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gien của vi-rút, nếu thiếu chúng vi-rút sinh ra sẽ

bị thiểu năng (defective virus) (Chen và ctv., 2008; Zhu và ctv, 2008)

1.2 Các phương thức biến đổi kháng nguyên vi-rút Cúm

Vi-rút Cúm A không có gien mã hóa enzyme sửa chữa RNA, do vậy chúng dễ dàng bị đột biến điểm trong các phân đoạn gien trong quá trình sao chép, dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng vi-rút Cúm A mới Hiện tượng này được gọi là lệch kháng nguyên (antigenic drift) Mặt khác, khi trong cùng một

tế bào bị nhiễm hai chủng vi-rút khác nhau, do 8 sợi RNA của mỗi chủng được tổng hợp riêng biệt nên khi hình thành hạt vi-rút mới sẽ có thể có sự tổ hợp (reassortment) của các sợi RNA của cả hai chủng vào một hạt vi-rút Từ đó tạo ra một loại vi-rút mới và hiện tượng này được gọi là trượt kháng nguyên (antigenic shift) (Suarez và Schultz-Cherry, 2000) Sự thay đổi kháng nguyên giúp cho vi-rút lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều loài vật chủ khác nhau Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở vi-rút Cúm A (Wu và ctv., 2008)

1.2.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift)

Thực chất là các đột biến điểm xảy ra tại các phân đoạn gien/hệ gien của rút Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc

vi-RNA sẽ có thể “gài” thêm, làm mất đi hoặc thay thế (Lê Thanh Hòa, 2006) một hay

nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của

vi-rút (Conenello và ctv., 2011)

-RNA -RNA

Dịch mã Protein bị đột biến

Sao chép trong

tế bào chủ

Không có cơ chế sửa bản sao

đọc-Quá trình sao chép dưới xúc tác RNA polymerase

+ mRNA

Đột biến điểm

Hình 1.2 Sơ đồ minh họa sự đột biến điểm của vi-rút Cúm gia cầm

(Ô màu đỏ là mã bộ ba ribonucleotide bị thay đổi qua quá trình sao chép dưới xúc tác RNA polymerase; Ô màu tím là mã bộ ba ribonucleotide bị đột biến qua quá

trình sao chép trong tế bào chủ)

Tùy thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, có thể trực tiếp làm thay đổi các axít amin trong trình tự của protein được mã hóa, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc tích lũy trong phân đoạn gien xảy ra đột biến Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide, có 1 nucleotide sai khác (Webster, 1998)

1.2.2 Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hình 1.3 Minh họa sự thay đổi di truyền của vi-rút Cúm

Hiện tượng này còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp các gien kháng nguyên

(antigienic shift) chỉ có ở vi-rút cúm và rất ít ở một số vi-rút RNA gây bệnh gia cầm

khác, cho phép vi-rút có khả năng biến chủng rất cao

Trường hợp khi 2 chủng vi-rút Cúm A khác nhau đồng nhiễm trong một tế bào

có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort), hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gien của

chúng và trong quá trình kết hợp lại hệ gien, tạo ra các tổ hợp khác nhau của hệ gien của các hạt vi-rút mới từ hai hệ gien của những vi-rút ban đầu Kết quả tạo ra thế hệ vi-rút mới có các phân đoạn gien kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới, hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Chen và ctv., 2008)

1.2.3 Hiện tượng glycosyl hóa

Sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) với axít amin

asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của vi-rút cúm được gọi là hiện tượng glycosyl hoá Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho vi-rút thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể vật chủ và điều hoà sự nhân lên của vi-rút (Baigient và McCauley, 2001)

Sự hiện diện của các N-glycosylation cũng có tác động làm giảm đáp ứng miễn dịch của gia cầm đối với vi-rút Cúm gia cầm, hậu quả là làm giảm hiệu quả của vắc-xin với kháng nguyên là vi-rút có nhiều vị trí N-linked glycosylation trên protein HA, dù tỷ lệ tương đồng axít amin ở mức rất cao, chẳng hạn chủng vi-rút vắc-xin (2.1.3.2/Indo/05) trong nghiên cứu (Criado và ctv., 2020) Sự hiện diện của N-glycosylation ở HA có thể che dấu các tín hiệu kháng nguyên trên HA và làm giảm đáp ứng miễn dịch đối với HA

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của vi-

rút Cúm A khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại đối với vi-rút Cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù vi-

rút này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh được cho người, và rất có thể vi-rút Cúm A/H5N1 tái tổ hợp gien HA hay NA, hoặc cả hai gien với các chủng vi-rút Cúm A đã thích nghi ở người để tạo ra một biến chủng vi-rút mới thích ứng, lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới (Korteweg và ctv., 2008)

HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Protein HA vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định độc lực của vi-rút, là đích của miễn dịch trung hoà, đặc hiệu với từng subtype HA, nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi-rút ở cơ thể nhiễm và là cơ sở để sản xuất các vắc-xin phòng cúm hiện nay (Horimoto và Kawaoka, 2006)

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu sialic acid trên bề mặt màng tế bào khởi đầu quá trình xâm nhiễm của vi-rút trên vật chủ, giúp cho vi-rút xâm nhập, hòa màng và giải phóng hệ gien, thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm

Vị trí axít amin 226 (aa226) của đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu trên tế bào Ở hầu hết các chủng vi-rút Cúm A lưu hành trong tự nhiên, axít amin ở vị trí thứ 226 là glycine, vùng HA sẽ gắn với thụ

thể sialic acid α-2,3 galactose (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH)

của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm

HA đóng vai trò trung gian liên kết thụ thể cho phép xảy ra quá trình dung hợp

màng và giải phóng ribonucleprotein (RNP) vào bên trong tế bào Tuy nhiên, sự dung hợp chỉ xảy ra khi HA được các protease của tế bào vật chủ thủy phân thành HA1 và HA2 Như vậy, sự phân cắt thành HA1 và HA2 là điều kiện quyết định khả năng xâm nhập tế bào của vi-rút Khả năng HA bị phân cắt phụ thuộc vào trình tự axít amin tại vị trí cắt và các gốc carbohydrate gần kề Theo sự phân loại của OIE, dựa theo trình tự axít amin kiềm tại vị trí cắt của gien HA (HA1-HA2) có thể xác định chủng vi-rút Cúm gia cầm thuộc nhóm độc lực cao hay thấp Những chủng vi-rút cúm có trình tự axít amin tại vị trí cắt (cleavage site) của protein HA với sự lặp lại của những axít amin kiềm (arginine - R hoặc lysin-K) được xếp vào nhóm vi-rút cúm có độc lực cao (OIE, 2020) Cũng theo OIE (2020), số lượng axít amin kiềm tại vị trí cắt của HA ở vi-rút Cúm tuýp A độc lực cao có thể khác nhau tuỳ theo clade, trong khoảng 4 - 6 axít amin kiềm, ví dụ đối với clade 2.3.2 là từ 5 - 6 ( KRRKR ; RRRKR hoặc RRRRKR )

HA của các phân type (subtype) vi-rút Cúm gà có độc tính thấp bị phân cắt giới hạn ở một số loại tế bào nhất định như tế bào của hệ hô hấp và tiêu hóa Ngược lại, HA của các subtype vi-rút cúm độc lực cao (H5 và H7) có khả năng phân cắt thành HA1 và HA2 ở nhiều loại tế bào khác nhau, cả trong điều kiện không có các exo - protease (là enzyme rất cần thiết cho sự phân cắt HA của các subtype vi-rút có độc tính thấp) Điều này chứng minh rằng trình tự axít amin tại vị trí nhạy cảm với protease của HA có ảnh hưởng trực tiếp đến độc tính của vi-rút (Wagner và ctv., 2002)

Theo tổ chức dịch tễ thế giới (OIE, 2009) vi-rút Cúm gia cầm được xem là có độc lực cao (HPAI: High pathology avian influenza) khi thỏa mãn một trong các

điều kiện sau đây:

- Chủng vi-rút Cúm gia cầm được tiêm vào phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, thu hoạch lấy nước trứng và pha loãng 1/10 Sau đó dùng nước pha loãng này (với lượng 0,2 ml) tiêm vào tĩnh mạch cho gà mẫn cảm ở 4 - 8 tuần tuổi Vi-rút cúm độc lực cao (HPAI) sẽ gây chết 75% - 100% gà trong vòng 10 ngày sau khi tiêm

- Vi-rút Cúm gia cầm không thuộc subytpe H5 hoặc subtype H7 nhưng gây

chết từ 1 - 5 con gà trong số 8 con gà 4 - 8 tuần tuổi sau khi được tiêm giống như điều kiện ở trên, và gây bệnh tích tế bào khi nuôi cấy vi-rút trên tế bào không có bổ sung trypsin

- Tất cả vi-rút cúm thuộc subtype H5 và H7 có độc lực thấp và các vi-rút cúm khác, không phát triển và gây bệnh tích tế bào (CPE) khi nuôi cấy không bổ sung trypsin, nhưng có sự hiện diện lặp lại của các axít amin kiềm tại vị trí phân cắt HA

Bảng 1.1 Các kiểu trình tự axít amin tại điểm cắt protein HA của vi-rút Cúm H5N1 Loại vi-rút Trình tự axít amin ở điểm cắt (R = Arginine, K = Lysine)

và ctv., 2002) Có 11 phân tuýp (từ N1 đến N11) được phát hiện chủ yếu ở vi-rút Cúm gia cầm Hai phân tuýp N1 và N2 được tìm thấy ở vi-rút cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Murphy và Webster, 1996 ) Protein NA là một enzyme có vai trò cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt vi-rút ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của vi-rút trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp của các hạt vi-rút mới trên màng tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt

liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating”

giải phóng hệ gien của vi-rút vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình

nhân lên của vi-rút diễn ra nhanh hơn (Wagner và ctv., 2002) Ngoài ra, NA còn

phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid, làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho vi-rút nhanh chóng tiếp cận tế

bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Do đó, protein NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế vi-rút không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt vi-rút mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể (Castrucci và Kawaoka, 1993; Aoki và ctv., 2007)

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của vi-rút, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng vi-rút đương nhiễm, có tác dụng phong tỏa protein NA (Doherty và ctv., 2006 ) Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của vi-rút là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể vật chủ với vi-rút Cúm A và là cơ sở điều chế vắc-xin phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm (Suarez và Schultz-Cherry, 2000; Wu và ctv., 2008)

1.3.5 Protein M2 và PB1-F2

Các protein M2 và PB1-F2 có liên quan đến sự thích ứng của vi-rút H5N1 trên vật chủ mới, cũng như sự lây truyền giữa các loài Protein PB1-F2 làm tăng độc lực

của vi-rút Cúm A do gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các đại thực bào, do đó làm giảm đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ đối với sự lây nhiễm của vi-rút Cúm A (Conenello và ctv., 2011)

1.4 Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm (H5) trên thế giới và tại Việt Nam 1.4.1 Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm phân type H5 trên thế giới

Năm 1996, vi-rút Cúm A/H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) và chủng này được coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng vi-rút gây bệnh Cúm gia cầm trong những năm qua (Xu và ctv., 1999) Chủng vi-rút nguyên thủy này, cung cấp nguồn gien HA (H5) cho tiến trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm

1997 và là nguồn gien của vi-rút Cúm A/H5N1 Hồng Kông được kiến tạo từ vi-rút Cúm A có ở chim cút (Guan và ctv., 2002)

Trong các năm 1997 - 2002, một số biến chủng vi-rút Cúm A/H5N1 mang nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của subtype H5 được hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên clade 1, có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi biến mất trong những năm 2001 - 2002 (Guan và ctv., 2002; Lee và ctv., 2007) Tiếp tục, trong năm 2002 - 2003, gien HA (H5) có những đột biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift), tạo nên biến chủng có tính gây bệnh cực kỳ cao, đặc biệt đối với vịt và lây sang người (Guan và ctv., 2002; Sturm-Ramirez và ctv., 2005)

Cuối năm 2005, có nhiều dưới dòng (subclade) của vi-rút Cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), phân bố rộng khu vực châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng Kông , Việt Nam, Indonesia, Thái Lan (Lee và ctv., 2007; Sims và ctv., 2005 ; Simmons và ctv., 2007), Trung Á, châu Âu và châu Phi, có tính gây bệnh cao đối với người (Ducatez

và ctv., 2007)

Trong các năm 2006 - 2008, tuy bình diện dịch Cúm gia cầm không ác liệt như những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng A/H5N1 có biến động

kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học Cúm A/H5N1 có thể đã trở nên phức tạp hơn (Zhao và ctv., 2008; Gambotto và ctv., 2008)

Trong giai đoạn 1996-2001, vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1 chủ yếu chỉ lưu hành ở phía Nam Trung Quốc Giai đoạn này ghi nhận có 4 clade vi-rút A/H5N1 khác nhau là clade 0, clade 3, clade 5 và clade 9, trong đó clade 0 là vi-rút thuỷ tổ A/Goose/Guangdong/96 và những vi-rút khác cùng loại Có thể nhận thấy

sự biến đổi liên tục của vi-rút cúm, đặc biệt là có những clade vi-rút tiếp tục tiến hoá và hình thành các nhánh phụ như clade 2: Năm 2004 chỉ có 1 lớp clade 2; Năm

2005 clade 2 đã tiến hoá thành 5 nhánh phụ thuộc lớp thứ 2 từ clade 2.1 - 2.5, rồi đến năm 2008 chúng lại tiến hoá thành lớp thứ 3 Hiện nay các chuyên gia quốc tế đang tiếp tục tổng hợp và phân tích sự phát sinh loài của vi-rút cúm và có thể sự phát sinh loài còn đa dạng hơn nữa

Cho đến nay tất cả 10 clade của vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1 đã được phát hiện và phân lập ở khu vực Đông Á, có thể cùng hoặc ở các thời điểm khác nhau (Pfeiffer và ctv., 2011) Hầu hết các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 của khu vực Đông Á đều bắt nguồn từ Trung Quốc và Hồng Kông và cũng được tìm thấy tại Nhật Bản và Hàn Quốc

Một số clade không phát hiện thấy ở Đông Á là clade 2.1.2 và 2.1.3 Dường như chúng đã tiến hóa ở Indonesia sau khi tổ tiên của chúng xâm nhập từ tỉnh Hồ Nam của Trung Quốc năm 2002 - 2003 Một số clade cho đến nay chỉ mới phát hiện thấy ở Trung Quốc (ví dụ các clade 4, clade 6 và clade 9), trong khi các clade khác có liên quan đến các vụ dịch chính (clade 1 ở khu vực sông Mê Kông từ năm

2004 - 2005, clade 2.1 ở Indonesia năm 2004, clade 2.2 lan rộng từ châu Á sang châu Âu và châu Phi từ năm 2005, clade 2.3.4 đã tấn công các nước Việt Nam, Lào

và Thái Lan từ năm 2005) đều đã được phân lập ở Trung Quốc trước khi được phát hiện thấy ở những nơi khác Clade 7 cũng mới chỉ xuất hiện ở Trung Quốc từ năm

2007 trở về trước (Wang và ctv., 2008)

1.4.2 Tình hình lưu hành các nhánh vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam

Giai đoạn 2001 - 2007: Vi-rút Cúm A/H5N1 gây nên dịch Cúm gia cầm ở Việt

Nam từ cuối năm 2003 Tuy nhiên, qua điều tra, người ta đã từng phát hiện thấy rút A/H5N1 ở chợ gia cầm sống Việt Nam từ năm 2001 (Nguyễn Tùng, 2013) Phân tích phát sinh loài các vi-rút cúm tại Việt Nam từ năm 2001 - 2007 (Wallace và ctv., 2007) đã ghi nhận có ít nhất có 6 clade khác nhau của vi-rút Cúm A/H5N1 độc lực cao từng xuất hiện và lưu hành ở Việt Nam Sáu clade vi-rút này nằm cùng nhóm với các vi-rút tiền thân được phân lập trước đây tại Trung Quốc và Hồng Kông, các vi-rút tiền thân này có thể được coi là tổ tiên của các dòng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao xâm nhập vào Việt Nam (Wallace và ctv., 2007)

Giai đoạn 2008 - 2010: Khảo sát sự biến đổi trong giai đoạn này các chủng rút A/H5N1 ở Việt Nam, đặc biệt là ở phía Bắc, chủ yếu thuộc về clade 2.3.4, đồng thời các chủng vi-rút trong clade này tạo thành 1 lớp thứ tư với 4 nhóm (2.3.4.1- 2.3.4.4) Clade 1 chỉ còn lưu hành ở phía miền Nam Vi-rút A/H5N1 thuộc clade 2.3.2 cũng đã xuất hiện ở Việt Nam và về mặt di truyền những vi-rút này tương tự các vi-rút A/H5N1 ở chim hoang và gia cầm của nhiều nước ở Đông Âu, Hồng Kông, Trung Quốc, Hàn Quốc Một số chủng vi-rút A/H5N1 thuộc clade 7 được phân lập ở biên giới phía Bắc và một số chợ gia cầm sống ở phía Bắc Việt Nam (Nguyễn Tùng, 2010)

vi-Giai đoạn 2010-2013: Sự tiến hoá của vi-rút Cúm A/H5N1 dẫn đến làm thay đổi tính kháng nguyên ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vắc-xin Clade 1.1 tập trung ở phía Nam vùng Đồng bằng sông Cửu Long và phân nhóm 2.3.2.1 tại các tỉnh phía Bắc có xu hướng di chuyển vào phía Nam Phân tích chuyên sâu đã phát hiện vi-rút H5N1 phân nhánh 2.3.2.1 lại được chia làm 3 phân nhánh nhỏ hơn đó là 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c Sự đa dạng lưu hành vi-rút Cúm gia cầm trong giai đoạn này làm cho dịch tễ bệnh Cúm gia cầm trở nên phức tạp, ảnh hưởng đến chiến lược sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm ở Việt Nam (Creanga và ctv., 2013; Lê Thanh Hòa và Nguyễn Thị Bích Nga, 2012)

Từ năm 2014 đến nay, bệnh Cúm gia cầm xảy ra với quy mô dịch địa phương, trong đó chủ yếu vi-rút H5N1 gây bệnh tại các tỉnh Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long, vi-rút H5N6 chủ yếu gây bệnh ở các tỉnh phía Bắc Trong 6 tháng

đầu năm 2020 đã xảy ra 40 ổ dịch Cúm gia cầm, trong đó có 34 trường hợp do rút H5N6 và 6 trường hợp do vi-rút H5N1 (Cục Thú y, 2020)

vi-1.5 Đặc điểm bệnh lý bệnh Cúm gia cầm

1.5.1 Dấu hiệu lâm sàng của gia cầm mắc bệnh

Vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao gây bệnh với dấu hiệu lâm sàng rất trầm trọng, tỷ lệ tử vong cao trên gà Các loài thủy cầm có dấu hiệu lâm sàng ở mức độ thấp hơn và có thể là dạng mang trùng (Nguyễn Tùng, 2013)

Dấu hiệu lâm sàng trên gia cầm:

- Gà bệnh do vi-rút Cúm gia cầm có biểu hiện như: Chết đột ngột, tỷ lệ tử vong cao có thể đến 100%; ủ rũ, lông xơ xác, bỏ ăn; giảm năng suất đẻ trứng; phù thủng đầu và cổ; mào và tích sưng to hoặc có màu tím tái; tiêu chảy phân xanh trắng; xuất huyết da chân; có triệu chứng thần kinh, loạng choạng; chảy nước mũi, miệng

- Các loài thuỷ cầm bệnh do vi-rút Cúm gia cầm có một số biểu hiện lâm sàng bao gồm: Ủ rũ; bỏ ăn; có triệu chứng thần kinh, quay vòng vòng; mắt có màu khói, đục mắt; có thể chết đột ngột, tỷ lệ tử vong cũng có thể lên đến 100%, năng suất đẻ trứng giảm Những con khỏi bệnh yếu ớt, có thể đẻ lại sau vài tuần khỏi bệnh (Lê Văn Năm, 2004)

1.5.2 Bệnh tích trên gia cầm mắc bệnh

Trong cùng một ổ dịch, bệnh tích đại thể trên gà thường trầm trọng hơn các loài thủy cầm Đối với gà, bệnh tích thường gặp là mào tích sưng to, tím tái; phù quanh mí mắt; thể nhẹ bệnh tích ở các xoang cơ thể đặc trưng bởi viêm ca ta, lắng đọng fibrin Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẻ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ Xuất huyết điểm trên bề mặt niêm mạc Xuất huyết toàn bộ đường tiêu hóa, rõ nhất

là manh tràng và dạ dày tuyến (Alexander, 2007) Túi fabricius sung huyết và xuất huyết Bệnh tích ghi nhận trên loài thủy cầm tương tự như trên gà, nhưng tần suất biến đổi chủ yếu ở phổi, túi khí, buồng trứng và đường tiêu hóa (Lê Văn Năm, 2004)

Bệnh tích vi thể chủ yếu là sung huyết, xuất huyết, xâm nhiễm bạch cầu đơn nhân ở não và một số cơ quan khác Mạch máu các cơ quan như mào, tích, gan, lách, phổi, thận, cơ tim, cơ vân bị giãn rộng và xâm nhiễm tế bào xung quanh mạch quản (Beard, 1998)

1.6 Miễn dịch đối với vi-rút Cúm gia cầm

1.6.1 Miễn dịch thụ động

Kháng thể mẹ truyền giữ vai trò quan trọng bảo vệ thú non khỏi sự nhiễm trùng, tuy nhiên đây là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tiêm vắc-xin ở thú non Hiệu lực bảo hộ của kháng thể mẹ truyền ở gia cầm tương đối ngắn, chỉ kéo dài không quá 2 - 3 tuần (De Vriese và ctv., 2010) Gà con 11 ngày tuổi từ trứng của đàn gà mẹ đã được tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm, sẽ không được bảo hộ khi

bị công cường độc với chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 độc lực cao, với 83% gia cầm chết do công cường độc (De Vriese và ctv., 2010) Để có thể được bảo hộ khỏi

sự tấn công của vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao, gia cầm con cần có hiệu giá kháng thể HI ở mức cao hơn 4log2 Để gia cầm con có thể có hiệu giá HI kháng thể mẹ truyền ở mức 4log2, đàn gà mẹ cần phải có mức hiệu giá kháng thể HI cao hơn 7log2(De Vriese và ctv., 2010)

Ở vịt, kháng thể mẹ truyền chỉ duy trì trong vòng 2 tuần đầu, với giá trị GMT chỉ ở mức 2,13log2, dưới ngưỡng kháng thể bảo hộ HI (≥4log2) theo quy định của

Cục Thú y (Phan Chí Tạo và Trần Ngọc Bích, 2016)

Mặt khác, kháng thể mẹ truyền đặc hiệu với vi-rút Cúm gia cầm (H5N1) có tác động ức chế rõ đáp ứng tạo kháng thể ở gà khi được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm (Shaimaa Talat và ctv., 2020; De Vriese và ctv., 2010; Kim và ctv., 2010), ngay cả khi gà con có mức kháng thể mẹ truyền thấp (dưới 5log2 - 6log2) hoặc không phát

hiện được kháng thể trước khi tiêm vắc-xin (Riks Maas và ctv., 2011)

Hiệu quả bảo hộ của vắc-xin vô hoạt Cúm gia cầm H9N2 ở gà được tiêm lúc 7 ngày tuổi cao hơn rõ so với gà 1 ngày tuổi được tiêm vắc-xin Ảnh hưởng của kháng thể mẹ truyền đến hiệu quả miễn dịch ở gà con được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm H9N2 xảy ra rõ khi hiệu giá kháng thể HI ở mức cao (trung bình từ 6log2 -

8log2) Việc tăng liều kháng nguyên trong vắc-xin có thể khắc phục được tác động của kháng thể mẹ truyền đối với đáp ứng tạo kháng thể khi tiêm vắc-xin Cúm gia cầm ở gà con (Shaimaa Talat và ctv., 2020)

Nghiên cứu của De Vriese và ctv (2010) chỉ ra rằng, gà con có kháng thể mẹ truyền khi được tiêm vắc-xin Cúm gia cầm ở 1 ngày tuổi, dù có hay không kháng thể phát hiện được, đều đáp ứng miễn dịch bảo hộ rất kém chống lại công cường độc chủng vi-rút Cúm gia cầm H5N1 độc lực cao, so với gà con 10 ngày tuổi Vì vậy, khuyến cáo là nên tiêm vắc-xin Cúm gia cầm vào khoảng 5 - 7 ngày tuổi (Shaimaa Talat và ctv., 2020) hoặc 10 ngày tuổi cho gà con nở ra từ trứng của gà

mẹ đã được tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm (De Vriese và ctv., 2010) Hoặc có thể lựa chọn tiêm phòng vắc-xin Cúm gia cầm vector sống nhược độc có đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm vắc-xin không bị ức chế bởi kháng thể mẹ truyền (Bublot và

2 (M2) Các protein bề mặt là các kháng nguyên duy nhất có khả năng tạo ra kháng thể trung hòa và do đó tạo được miễn dịch bảo hộ Các subtype khác nhau có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với các chủng vi-rút khác trong cùng subtype HA hoặc NA, nhưng không phản ứng chéo với các vi-rút không cùng subtype Protein HA có hai chức năng chính đó là gắn kết vi-rút với thụ thể trên màng tế bào và gây ra sự hoà màng tế bào với vỏ vi- rút để giải phóng RNA của vi-rút vào tế bào chủ Protein HA

là một protein màng tích hợp glycosyl hóa tạo thành một homotrimer (ba phân tử

HA liên kết với nhau) trên bề mặt của vi-rút (Wiley và ctv.,1981)

Các kháng thể đặc hiệu với protein HA là yếu tố quyết định trong miễn dịch gia cầm chống lại vi-rút Cúm (Johansson và ctv.,1989) Chuẩn độ kháng thể đối với protein HA thường dùng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) Xét nghiệm HI

là một xét nghiệm đặc hiệu về subtype Hiệu giá HI của huyết thanh ở gia cầm có mối tương quan chặt chẽ với mức độ bảo hộ chống lại việc công cường độc bằng vi- rút thuộc cùng subtype HA

Protein NA có hoạt tính enzyme quan trọng trong việc tách axít sialic, giúp rút tách ra khỏi bề mặt tế bào nhiễm Protein NA cũng tạo ra kháng thể trung hòa ở

vi-gà, vắc-xin NA đặc hiệu subtype có thể bảo vệ chống lại thử thách cường độc với vi-rút HPAI (McNulty và ctv., 1986) Kháng thể kháng protein NA có tác dụng hỗ trợ tăng khả năng bảo hộ đối với vi-rút Cúm gia cầm Sự bảo hộ được tăng lên khi chuột được tiêm vắc-xin DNA bao gồm cả gien HA và NA (Chen và ctv., 1999) Chuột được tiêm vắc-xin chứa một mình protein NA chỉ có tác dụng làm giảm lượng vi-rút được giải phóng ra từ tế bào, trong khi đó, tiêm vắc-xin với protein HA

đã ngăn chặn hoàn toàn quá trình nhân lên của vi-rút (Johansson và ctv.,1989) Protein M2 là một protein màng tích hợp có chức năng như một kênh ion cho hạt vi-rút Khi hạt vi-rút gắn vào thụ thể tế bào chủ và bị ẩm bào, việc giảm pH trong thể nội bào (endosome) cũng làm giảm độ pH bên trong hạt vi-rút do kênh ion M2, từ đó kích hoạt protein HA tạo ra sự hoà màng (fusion) của màng (envelope) vi-rút với màng tế bào vật chủ Kháng thể kháng protein M2 ở chuột không bảo hộ chuột hoàn toàn chống lại vi-rút cúm, nhưng làm giảm lượng vi-rút thải ra và có tính bảo hộ từng phần (Frace và ctv., 1999) Ưu điểm chính của kháng thể kháng protein M2 có khả năng bảo hộ vật chủ chống lại tất cả vi-rút thuộc bất kỳ subtype

HA và NA nào Tuy nhiên, chưa có công trình nào được công bố để xác định xem kháng thể của gia cầm kháng protein M2 có bảo hộ được gia cầm chống vi-rút Cúm gia cầm (Slepushkin và ctv., 1995)

Phản ứng miễn dịch cũng tạo ra kháng thể chống lại các protein bên trong khác của vi-rút Cúm gia cầm, đặc biệt là các protein nucleoprotein (NP) và matrix 1 (M1) Cả hai loại protein này đều là kháng nguyên quan trọng và được sử dụng

trong các xét nghiệm chẩn đoán vì có tính bảo tồn cao về mặt di truyền Kháng thể kháng hai loại protein này đặc hiệu về tuýp vi-rút, được dùng để phân biệt vi-rút Cúm type A với vi-rút tuýp B và vi-rút Cúm tuýp C

Kháng thể tiết (IgA) trong đáp ứng miễn dịch niêm mạc có thể đóng một vai trò quan trọng trên gia cầm đã bị nhiễm bệnh và bảo vệ gia cầm khỏi sự tái nhiễm, đặc biệt là với vi-rút cúm gia cầm có độc lực trung bình (MPAI) chủ yếu gây ra nhiễm trùng niêm mạc Phản ứng miễn dịch niêm mạc có vai trò bảo vệ khỏi nhiễm trùng HPAI vì sự phơi nhiễm ban đầu với vi-rút là qua bề mặt niêm mạc Ở vịt, IgA kháng vi-rút cúm được phát hiện trong mật của những con vịt bị nhiễm vi-rút (Magor và ctv., 1998) Gà đã được chứng minh là tạo ra phản ứng miễn dịch IgA sau khi nhiễm vi-rút bệnh Newcastle và vi-rút viêm phế quản truyền nhiễm Hơn nữa, đã có bằng chứng về IgA chịu trách nhiệm phản ứng miễn dịch cục bộ bảo hộ vật chủ khi bị thử thách cường độc với các vi-rút (Russell và ctv., 1993)

Nhìn chung, hệ thống miễn dịch dịch thể tạo ra kháng thể kháng lại các kháng nguyên khác nhau của vi-rút cúm Kháng thể đặc hiệu kháng protein HA là quan trọng nhất đối với việc trung hòa vi-rút thông qua việc gắn kết với một đầu của kháng nguyên HA, ức chế gắn kết vi-rút vào các tế bào chủ Kháng thể đặc hiệu kháng protein HA cũng có thể liên kết với các thụ thể Fc tế bào bị nhiễm để tạo thuận lợi cho quá trình thực bào các hạt vi-rút Kháng thể kháng protein NA làm hạn chế sự lây lan của vi-rút cúm bằng cách ức chế hoạt động của enzym neuraminidase Kháng thể đặc hiệu kháng protein M2 được tạo ra ở mức độ hạn chế sau khi nhiễm vi-rút cúm tự nhiên, vì bản thân protein này có mặt ở nồng độ thấp trong các tế bào bị nhiễm Bên cạnh đó, các kháng thể đặc hiệu kháng protein NP cũng góp phần hạn chế sự lây nhiễm vi-rút cúm Các kháng thể này có thể kích hoạt

sự phân giải tế bào bị nhiễm qua trung gian bổ thể (Carragher và ctv., 2008)

Đường xâm nhập chính của vi-rút cúm là các mô niêm mạc Do đó, IgA và IgM có thể hoạt động như các kháng thể ở các mô niêm mạc, trung hòa vi-rút ở niêm mạc, ngăn chặn sự xâm nhập và sự nhân lên của vi-rút cúm Các kháng thể trung hòa, chủ yếu là dạng IgA, hoạt động đặc hiệu kháng lại protein HA và NA của

vi-rút cúm Sự kích thích của đáp ứng miễn dịch tiên phát xảy ra ở các tổ chức mô bạch huyết và đáp ứng miễn dịch thứ phát xảy ra ở trong máu Trong đáp ứng miễn dịch tiên phát, kháng thể IgM ban đầu chiếm ưu thế, còn kháng thể Ig Y chiếm ưu thế ở đáp ứng miễn dịch thứ phát Mức IgM cao hơn có thể kết hợp với vi-rút nhanh hơn, đáp ứng IgM tốt và sớm thường dẫn đến đáp ứng kháng thể IgY tốt hơn sau đó Điều này cho thấy rằng, có thể tồn tại một mối liên kết bẩm sinh giữa đáp ứng IgM sớm đặc hiệu với vi-rút Cúm A và sản xuất kháng thể IgY tiếp theo (Carolien và ctv., 2012)

1.6.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào

Các tế bào TCD4+ và TCD8+ được tạo ra khi nhiễm vi-rút cúm sẽ kích hoạt tế bào

T giúp đỡ CD4+ đặc hiệu vi-rút, các loại tế bào Th1 và Th2, các peptit liên kết MHC phân lớp II có nguồn gốc từ vi-rút trên các tế bào trình diện kháng nguyên; Ngoài ra, T helper 17 (Th17) và các tế bào T điều chỉnh (Tregs) kiểm soát đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại nhiễm vi-rút cúm đã được xác định Tế bào Th17 cải thiện phản ứng của T helper bằng cách sản xuất IL-6 ngăn ngừa chức năng của Tregs Tregs kiểm soát cả tế bào TCD8+ và tế bào T helper sau khi nhiễm vi-rút Bên cạnh đó, Tregs không có bất kỳ ảnh hưởng nào đối với đáp ứng của tế bào B, nhưng chúng có thể ngăn chặn đáp ứng của T helper (Campell và Koch, 2011) Hơn nữa, IL-35 tiết ra bởi Tregs, hoạt động như thuốc ức chế phản ứng viêm IL-35 đã được chứng minh trong viêm phế nang thứ phát sau khi nhiễm cúm (Chen và ctv., 2016) Các tế bào TH được chia thành hai nhóm phụ gồm các tế bào TH1 và TH2 dựa trên cấu trúc cytokine khác nhau của chúng Tế bào Th1 tạo ra IFN-γ và IL-2 và liên quan chủ yếu đến đáp ứng miễn dịch tế bào, trong khi các tế bào Th2 tạo ra IL-4 và IL-13 liên quan đến kích thích đáp ứng của tế bào B Phân nhóm tế bào TCD4+ đặc trưng có tên là tế bào T follicular helper (Tfh) có tác động hiệu quả đối với bộ nhớ miễn dịch và tiêm chủng (Kreijtz và ctv., 2011)

Khi nhiễm vi-rút cúm, epitopes vi-rút kết hợp với phân tử MHC lớp I kích hoạt các tế bào TCD8+ nguyên thủy trong các hạch bạch huyết Việc kích hoạt dẫn đến việc di chuyển của các tế bào này đến nơi chúng phát hiện các tế bào nhiễm vi-

rút cúm, loại bỏ chúng thông qua hoạt tính ly giải và ức chế sự sản sinh của vi-rút Hoạt động ly giải được thực hiện bởi các chất tiết perforin và granzyme Màng tế bào bị nhiễm sẽ bị chọc thủng bởi perforin, làm cho quá trình xâm nhập các granzymes vào các tế bào được dễ dàng, cuối cùng là quá trình chết theo chương trình - apoptosis GrA (Granzyme) ngăn chặn sự nhân lên của vi-rút thông qua sự tổng hợp protein của vi-rút và tế bào chủ (Domselaar và Bovenschen, 2011)

Tế bào T gây độc CTL (Cytotoxic T lymphocyte) đặc hiệu sau khi nhiễm rút được phát triển và bảo tồn theo sự điều tiết của các tế bào T, IL-17 và tế bào tua gai (Dendritic cell), các cơ quan bạch huyết và tại vị trí nhiễm trùng (Geurtsvan Kessel và ctv., 2009)

vi-Miễn dịch tế bào bẩm sinh tạo nên hàng rào bảo vệ nhanh và đầu tiên chống lại sự xâm nhập của vi-rút gây bệnh Hàng rào miễn dịch tế bào này có tác dụng làm chậm sự xâm nhiễm, giảm sự nhân lên của vi-rút, thúc đẩy miễn dịch thu được xảy

ra nhanh và mạnh hơn, giúp cơ thể nhanh chóng loại trừ vi-rút và hồi phục

Các nghiên cứu của Saranya và ctv (2013), Wang và ctv (2016), Hayward và ctv (2015) đều ghi nhận vai trò của miễn dịch tế bào ở người nhiễm vi-rút cúm Tế bào lympho T gây độc (cytotoxic T lymphocytes - CTLs) bảo vệ người nhiễm vi-rút cúm, làm giảm mức độ lâm sàng, tăng khả năng loại trừ vi-rút cúm khỏi cơ thể và giúp người bệnh nhanh hồi phục Saranya và ctv (2013) còn cho rằng các vắc-xin kích ứng được miễn dịch tế bào có thể tạo được miễn dịch chéo quan trọng ở vật chủ được tiêm vắc-xin

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, kháng thể không phải là yếu tố duy nhất bảo

vệ gia cầm chống vi-rút cúm (Leung và ctv., 2013); Nghiên cứu của Van der Goot

và ctv (2005) ghi nhận sự bảo hộ khi công cường độc liều cao vi-rút Cúm H7N7 độc lực cao ở những gia cầm đã được tiêm vắc-xin sau 1 tuần nhưng không phát hiện được kháng thể đo bằng kỹ thuật HI

Ngoài miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào cũng có vai trò bảo vệ gia cầm chống lại vi-rút Cúm gia cầm chủng độc lực cao Nghiên cứu của Seo và ctv.,(2001) ghi nhận, gà con được tiêm tế bào lympho T thu được từ gà đã được tiêm vắc-xin

Cúm gia cầm H9N2 vẫn sống sót sau khi bị công cường độc bởi chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1 Mặt khác, mức độ nhận diện các tế bào nhiễm vi-rút Cúm gia cầm H5N1 hoặc H9N2 tuỳ thuộc vào hàm lượng tế bào lympho T hoặc CD8+ Kết quả này cho thấy vai trò quan trọng của miễn dịch tế bào đối với bệnh Cúm gia cầm và khả năng miễn dịch chéo của các tế bào lympho T trong bảo vệ gà chống lại sự công cường độc chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao H5N1

1.6.3 Miễn dịch chéo đối với vi-rút Cúm gia cầm

Hiệu giá kháng thể HI thay đổi tuỳ theo loại kháng nguyên HA sử dụng trong chuẩn độ Nghiên cứu của Zeng và ctv (2016) ghi nhận hiệu giá kháng thể HI thấp hơn 4 và 8 lần khi chuẩn độ bằng vi-rút Cúm A khác chủng (chủng DK/DPRK/1/13

và chủng Swan/HeN/2/15) so với chủng gốc DK/GD/S1322/10 Điều này cho thấy hiệu giá kháng thể HI không phải là chỉ số chắc chắn cho việc đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin và cần cẩn thận khi giải thích kết quả chuẩn độ kháng thể bằng

kỹ thuật HI với hiệu quả bảo hộ của vắc-xin trên thực tế

Vắc-xin Cúm gia cầm có thể có bảo hộ chéo với các chủng vi-rút thuộc các clade, thậm chí các subtype khác nhau (Seo và ctv., 2001; Kang và ctv., 2020) Tuy nhiên mức độ bảo hộ chéo tuỳ thuộc vào mức độ tương đồng di truyền giữa chủng vi-rút vắc-xin và chủng vi-rút công cường độc hoặc thực địa

Nghiên cứu của Zeng và ctv (2016) đánh giá hiệu quả vắc-xin vô hoạt Re-6 dựa trên kháng nguyên HA và NA chủng vi-rút Cúm A/duck/Guangdong/S1322/10 (DK/GD/S1322/10), H5N1 clade 2.3.2.1, trong bảo vệ gia cầm khi công cường độc bằng các chủng vi-rút Cúm H5N1 clade 2.3.2.1, 2.3.4.4 và 7.2 đã ghi nhận hiệu quả bảo hộ hoàn toàn đối với các chủng công cường độc thuộc clade 2.3.2.1, kém hiệu quả hơn đối với clade 7.2 và hiệu quả rất kém đối với clade 2.3.4.4

Mặc dù vắc-xin vô hoạt dựa trên kháng nguyên HA và NA chủng vi-rút Cúm H5N1 clade 2.3.2.1 bảo hộ 80% gà bị công cường độc bởi chủng vi-rút Cúm A clade 2.3.4.4, 20% gà còn lại vẫn bài thải vi-rút sau công độc, nghĩa là vắc-xin không thể bảo hộ gà hoàn toàn khỏi nhiễm vi-rút Cúm A H5N1 clade 2.3.4.4, hay nói khác hơn vắc-xin với kháng nguyên của chủng vi-rút Cúm A clade 2.3.2.1