Biến nập và bước đầu phân tích biểu hiện gen ACF35H từ cây ô đầu ở cây thuốc lá

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Thadthasine PHOMMASENG BIẾN NẠP VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN AcF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Thadthasine PHOMMASENG

BIẾN NẠP VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN

GEN ACF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Thadthasine PHOMMASENG

BIẾN NẠP VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN

GEN AcF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy

THÁI NGUYÊN - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫncủa PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực vàchưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Thadthasine PHOMMASENG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy đã tận tìnhhướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thựchiện nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh luận văn

Tôi cũng xin được trân trọng cảm ơn ThS Trần Thị Hồng, Trường Đại học Sưphạm Thái Nguyên luôn theo dõi và hướng dẫn chu đáo để tôi tiến hành thực nghiệmluận văn này

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài cấp Bộ Giáo dục và Đào tạo, mã số

B2020-TNA-11 do TS Nguyễn Thị Ngọc Lan, Khoa Sinh học làm chủ nhiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Công nghệsinh học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuậnlợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện luận văn Tôixin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ bộ phận đào tạo Sau đạihọc, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này

Qua đây, tôi biết ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn độngviên, khích lệ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập vànghiên cứu, tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn tốtnghiệp

Tác giả luận văn

Thadthasine PHOMMASENG

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục ký hiệu, các từ và chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đ t vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá 3

1.1.1 Phân loại cây thuốc lá 3

1.1.2 Vai trò của cây thuốc lá 5

1.1.3 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá 6

1.1.4 Các đ c điểm thực vật học cây thuốc lá 6

1.2 Cây Ô đầu và con đường tổng hợp flavonoid ở cây Ô đầu 7

1.2.1 Cây Ô đầu 7

1.2.2 Con đường tổng hợp flavonoid ở cây Ô đầu 8

1.3 Gen mã hóa enzyme F3’5’H và các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H

10 1.3.1 Gen mã hóa enzyme F3’5’H 10

1.3.2 Các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H 10

1.4 Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 11

1.4.1 Vi khuẩn Agrobacterium 11

1.4.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14

1.5 Đánh giá sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 19

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Hóa chất 19

2.1.3 Thiết bị 19

2.2 Địa điểm và thời gian 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 21

2.3.2 Phương pháp biến nạp gen 23

2.3.3 Phương pháp tái sinh cây thuốc lá biến nạp gen 23

2.3.4 Phương pháp phân tích sự có m t của gen chuyển trong cây thuốc lá biến nạp 24

2.3.5 Phương pháp phân tích sự biểu hiện của gen chuyển 26

2.4 Phương pháp phân tích số liệu 26

CHƯƠNG 3 ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Đ c điểm của cấu trúc vector pCB301_AcF3'5'H 27

3.2 Kết quả tạo cây thuốc lá biến nạp gen 28

3.2.1 Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá thông qua A tumefaciens 28

3.2.2 Kết quả tái sinh cây từ mảnh lá của cây thuốc lá 30

3.2.3 Kết quả ra cây ngoài vườn ươm 31

3.3 Kết quả phân tích sự có m t của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 34

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 34

3.3.2 Kết quả nhân gen AcF3’5’H bằng kỹ thuật PCR 36

3.4 Kết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 37

ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM HẢO 40

DANH MỤC Ý HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

GM Môi trường tái sinh chồi

GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng độ 50mg/l

OD Optical density = mật độ quang học

PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymeraseRNA Ribo Nucleic Acid

IBA Indole_3_butiric acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) 21

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy cây thuốc lá 22

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens 22

Bảng 2.4 Trình tự c p mồi nhân gen AcF3’5’H 25

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 25

Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 25

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp cấu trúc 35S_AcF3’5’H_cmyc_KDE trong vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) 4

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp flavonoid [14] 9

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3D của protein F3’5’H 10

Hình 1.4 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens [41] 15

Hình 1.5 Các mức độ đánh giá sinh vật chuyển gen 17

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây thuốc lá 20

Hình 3.1 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H 27

Hình 3.2 Hình ảnh mô tả quá trình chuẩn bị và biến nạp gen vào cây thuốc lá

29 Hình 3.3 Hình ảnh mô tả quá trình tái sinh cây 31

Hình 3.4 Hình ảnh cây thuốc lá chuyển gen in vitro ngoài vườn ươm 32

Hình 3.5 Hình ảnh kết quả điện di DNA tổng số 35

Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen AcF3’5’H từ các cây thuốc lá chuyển gen T0 36

Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả RT-PCR khuếch đại gen AcF3’5’H (cDNA) từ các cây thuốc lá biến nạp 37

MỞ ĐẦU

1 Đ t v n ề

Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) là những vị thuốc quý, được dùng

phổ biến trong y dược học cổ truyền phương Đông Củ Ô đầu chứa nhiều loại dượcchất quý, trong đó có flavonoid Flavonoid là chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đếnmột số khía cạnh của sự phát triển và bảo vệ thực vật Chúng tạo màu cho hoa và quả,tạo điều kiện cho hạt và phấn phát tán, đồng thời góp phần giúp cây trồng thích nghivới các điều kiện môi trường như áp lực lạnh ho c tia cực tím, và sự tấn công củamầm bệnh Flavonoid là chất quan trọng có tác dụng chống oxy hóa, chống tăng sinh

tế bào và đ c biệt là chống ung thư Những năm gần đây các nhà khoa học trên thế

giới quan tâm tới nhóm chất flavonoid trong chi Aconitum nhằm phát triển các dược

phẩm theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng một số loài thuộc chi này trongphòng và điều trị bệnh Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid trong Ô đầu lại rất thấp, dovậy, việc lựa chọn công nghệ làm tăng hàm lượng flavonoid trong củ Ô đầu là vấn đề

đ t ra cho nghiên cứu dược chất từ Ô đầu

Con đường sinh tổng hợp flavonoid, có nhiều loại enzyme tham gia Trong đó,

có hai loại enzyme monooxygenase thuộc họ P450 tham gia, đó là flavonoid hydroxylase (F3’H) và flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H) Enzyme F3’ 5’H giữ

3’-vai trò đ c biệt quan trọng trong việc tạo thành sản phẩm cuối của con đường sinhtổng hợp flavonoid ở thực vật Vì vậy, khi tăng hàm lượng và hoạt tính củaenzyme F3’5’H sẽ làm tăng tổng hợp và tích lũy hàm lượng flavonoid

Cây thuốc lá là thực vật 2 lá mầm, có thời gian phân hóa từ mô đến cây hoànchỉnh tương đối ngắn Thuốc lá cũng được lựa chọn làm cây mô hình để chuyểnnhiều gen có giá trị với cây trồng Chính vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mã hóaflavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H) phân lập từ cây Ô đầu vào cây thuốc lá làm cơ

sở để tạo cây Ô đầu chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao là rất cần thiết Xuất

phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Biến nạp và bước đầu phân tích biểu hiện

gen AcF3'5'H từ cây Ô đầu ở cây thuốc lá”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Biến nạp và phân tích được sự biểu hiện gen AcF3'5'H ở mô lá cây thuốc lá

biến nạp

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu đ c điểm của cấu trúc vector pCB301_AcF3’5’H;

3.2 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc

lá thông qua Agrobacterium tumefaciens;

3.3 Nghiên cứu xác định sự có m t của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

3.4 Nghiên cứu sự biểu hiện hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá

1.1.1 Phân loại cây thuốc lá

Theo Reed S M (1993),cây thuốc lá được phân loại thuộc giới thực vật(Plantae), ngành thực vật hạt kín (Angiosperms), lớp 2 lá mầm (Eudicots), bộ Cà

(Solanales), họ Cà (Solanaceae), chi Thuốc lá (Nicotiana), loài Thuốc lá (Nicotiana

chứa lượng cacbo h y d r a t rất lớn rất có giá trị không chỉ với chính bản thân cây này màcon người cũng sử dụng để thu nạp thêm năng lượng Tuy nhiên, củ khoai tây có thểtrở thành chứa chất độc nếu nó đang nảy mầm Các vùng vỏ có màu xanh chỉ ra rằng

củ khoai tây đang chuẩn bị nảy mầm, đồng thời nó cũng là chỉ thị của sự có m t củacác chất như chaconin hay solan i n Các hợp chất glycoside này khi tích lũy nhiềutrong củ có thể gây ngộ độc cho con người Một số chi thì quả là nguồn cung cấp dinhdưỡng đáng kể ví dụ như cà chua, c à t í m (cà dái dê) hay cà bát, cà pháo ho c ớt lànguồn thực phẩm khá quen thuộc của người dân Việt Nam [38]

Chi Nicotiana có 50-70 loài, đa số là dạng thân cỏ, một số dạng thân đứng, hầu

hết là các dạng dại phụ Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta phân chia

thành 4 loại chính Theo đó, loài Nicotiana tabacum L có hoa màu hồng hay đỏ tươi.

Đây là loại phổ biến nhất chiếm 90 diện tích thuốc lá trên thế giới Loài thứ 2 có tên

là Nicotiana rustica L có hoa màu vàng, chiếm khoảng 10 diện tích thuốc lá trên thế giới Loài Nicotiana petunioide L có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím Thường

chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dư trữ gen cho lai tạo, ít được dùng trong

sản xuất Loài thứ 3 Nicotiana polidiede L có hoa màu trắng Loài này cũng ít được

dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số quốc gia

Hình 1.1 Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)

(Nguồn: h t tps:// a mp.t ha y t huoccua b an.c o m / vi t huoc/thuo c la.h tm ) [38]

Trên thế giới, cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh táckhoảng 2.500.000 ha, Châu Mĩ là 1.600.000 ha và Châu Phi khoảng 326.000ha vớinhiều loại thuốc lá khác nhau Trong đó, giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùngtrồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nước Mĩ, Cu

Ba, Ấn Độ [37] Tại Việt Nam cây thuốc lá được canh tác từ Bắc đến Nam Tuynhiên cũng có nhiều ở các vùng trọng điểm như: Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vựcphía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Đắc Lắc (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khuvực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực phía Nam) [37]

Chi Nicotiana được chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong

đó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi.Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài làcây bụi thân gỗ Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại

nhưng lại được trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N tabacum) và N.

Rustica [27].

1.1.2 Vai trò của cây thuốc lá

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm

quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ đối với trên 33 triệunông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhàmáy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêuthụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho câythuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [9], [11] Với tổng diện tích trồng trọtkhoảng 4,0-5,5 triệu ha trải khắp từ 60o vĩ Bắc đến 40o vĩ Nam và tổng sản lượngnguyên liệu thu được khoảng 6,5-8,5 triệu tấn(trong đó khoảng 3,5-4,5 triệu tấn thuốc

lá vàng; khoảng 0,6-1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental;còn lại là các loại khác để sản xuất khoảng 6.000 tỷ điếu hàng năm [12], [32]

Loài N tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội (Dihaploid =

4n), có biến động lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc đóng lá so với thân, kiểu taicuống lá, mầu sắc lá Hoa tự chùm lưỡng tính mọc trên đỉnh sinh trưởng, hoa dài

khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng đến đỏ (N tabacum) hay màu vàng đến vàng hơi xanh (N rustica) Hoa thường tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn

đến 95% Mỗi cây có thể cho 200-400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000-4000 hạt Trong hạt chứa 32-42% dầu (chủ yếu là linoleic acid và oleic acid), 20-30% protein Trong 1 gam hạt có từ 10.000-15.000 hạt và hạt có khả năng sống rấtlâu [9], [11], [12]

Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm chính

là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thếgiới Ngoài ra, thuốc lá còn được sử dụng vào một số mục đích khác như: Trồng

nhóm Nicotiana rustica để chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ 4-5 để sản xuất

thuốc trừ sâu Sulfat nicotin Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất được sclareol và 13 sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ đậu Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùngcho công nghiệp dược phẩm Hạt thuốc lá chiết xuất 34-40 dầu phục vụ trong côngnghiệp, sử dụng trong thực phẩm Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao Hoachiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá Một số phát hiện mới hiện nay, cácnhà nghiên cứu đã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin

epi-Protein thuốc lá chứa nhiều amino acid quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cảphomat, protein trong sữa [1].

Cây thuốc lá có thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh tương đối ngắn

Vì vậy ở nhiều phòng thí nghiệm, cây thuốc lá thường được dùng làm cây mô hình đểchuyển gen trước khi chuyển gen vào cây đích

1.1.3 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá

Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 nămtrước công nguyên và được sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh[9], [12] Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt đới và Á nhiệt đới, hương vị

đ c biệt của nó đã được biết đến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách đây trên hai nghìn năm

và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [9], [11]

Lịch sử viết về cây thuốc lá bắt đầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khiChristopher Columbus đ t chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn Độ Dương Cácthổ dân ở đó đã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khichúng được châm hút để mời đoàn thám hiểm [9], [11]

Người Tây Ban Nha bắt đầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với nguồnhạt giống từ Mexico và sau đó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn đảo lân cậnkhác Trồng trọt thuốc lá bắt đầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau đó phát triển sangGuiana, Brazil [11] Và dần dần phát triển trên các châu lục khác Một số tài liệuđáng tin cậy cho rằng thuốc lá được trồng từ thời vua Lê Thần Tông (1660) bằngnguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ởViệt Nam chính thức khởi sự tại Gia Định, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc

lá điếu bắt đầu được sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này Năm 1935, giống thuốc

lá vàng sấy Blond cash đầu tiên được du nhập và trồng thử ở An Khê, đến năm 1940trồng thử ở Tuyên Quang, Ninh Bình [12]

1.1.4 Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá

1.1.4.1 Rễ thuốc lá

Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấpthu Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát m t đất Rễ trụđược hình thành từ phôi rễ Rễ nhánh được phát sinh từ trục của rễ cái, thường có độ

xiên 30- 40o Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấpnước và dinh dưỡng cho cây Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sátgốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ ẩm không khí cao Rễ thuốc lá tập trung dày đ c

ở lớp đất 0-30 cm, phát triển theo các hướng Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợpnicotin Nicotin được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá [6]

1.1.4.2 Thân cây

Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thâncây có thể đạt từ 1-3 m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá Đường kính thânđạt 2-4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách Có 2 loại chồinách: chồi nách chính và chồi nách phụ [6]

1.1.4.3 Lá thuốc lá

Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá Số lượng lá trên cây thay đổi tuỳtheo giống Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip,hình mũi mác Độ dày, màu sắc lá có thể thay đổi Lớp ngoài của biểu bì có tầngcutin trong suốt và có lớp phấn sáp Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấutrúc lá quyết định độ dày mỏng, độ đàn hồi của lá thuốc Ở trên m t lá còn có nhiềutuyến lông đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau Các tuyến này chứa nhựa,hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín Trên m t lá có gân chính vànhiều gân phụ [6]

1.2 Cây Ô ầu và con ường tổng hợp flavonoid ở cây Ô ầu

1.2.1 Cây Ô đầu

Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) chứa dược chất aconitin thuộc loại

thuốc độc bảng A, có độc tính cao nhưng vẫn được cho là những vị thuốc quý, đượcdùng phổ biến trong y dược học cổ truyền phương Đông [13] Những năm gần đây

các nhà khoa học trên thế giới quan tâm tới nhóm chất flavonoid trong chi Aconitum

nhằm phát triển các dược phẩm theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng một

số loài thuộc chi này trong phòng và điều trị bệnh Nhiều flavonoid đã được phân lập

và thử hoạt tính sinh học [16] Flavonoid là chất chống oxy hóa polyphenol được tìmthấy tự nhiên trong thực vật, có các hoạt động dược lý quan trọng, bao gồm tác dụngchống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư Ở Việt Nam, cây Ô đầu được tìm thấy

trong tự nhiên tại các địa phương như: Nghĩa Lộ (Yên Bái), Hà Giang, Lai Châu, LaoCai và được trồng thu củ ở Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu từ những năm 70 của thế kỷ

XX [13] Hiện nay, Ô đầu được trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang)[8] Trong báo cáo phân tích hàm lượng flavonid toàn phần trong Ô đầu thu ở Quản

Bạ, Hà Giang tính theo quercetin bằng phương pháp đo quang là rất thấp, chỉ đạt1,60% [20], do vậy cách tiếp cận nghiên cứu làm tăng hàm lượng flavonid trong Ôđầu được đ t ra để cải thiện hàm lượng dược chất quan trọng này trong cây Ô đầu

Đ c điểm về cấu trúc vòng B của flavonoid là yếu tố quyết định chính của hoạtđộng chống oxy hóa của flavonoid Trong con đường sinh tổng hợp flavonoid, kiểuhydroxyl hóa của vòng B được xác định bởi hai loại enzyme monooxygenase thuộc

họ P450, đó là flavonoid 3’-hydroxylase (F3’H) và Flavonoid 3' 5' hydroxylase(F3’5’H) Hydroxyl hóa vị trí 5’ bởi F3’5’H là phản ứng đ c biệt quan trọng, xác địnhsản phẩm cuối trong con đường sinh tổng hợp flavonoid ở thực vật [34]

F3’5’H là enzyme chìa khóa tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chấtflavonoid Sự tăng hoạt động của F3'5'H cho phép tổng hợp anthocyanin và các loại

flavonoid khác [30] Vì vậy, tăng cường biểu hiện gen F3’5’H sẽ làm tăng hàm lượng

và hoạt tính enzyme F3’5’H và sẽ làm tăng tích lũy hàm lượng flavonoid trong cây Ô

đầu Chính vì vậy, gen Aconitum carmichaelii F3’5’H (AcF3’5’H) được chọn làm đối

tượng tác động và kỹ thuật chuyển gen được áp dụng nhằm làm tăng hàm lượngflavonoid trong chiến lược tạo cây Ô đầu có hàm lượng dược chất cao

1.2.2 Con đường tổng hợp flavonoid ở cây Ô đầu

Con đường sinh tổng hợp flavonoid là một trong những lĩnh vực được nghiêncứu nhiều nhất của các hợp chất phenolic ở thực vật Flavonoid được chia thành cácphân nhóm (flavanone, flavon, flavonol, leucoanthocyanidin, anthocyanin vàisoflavonoid) [28] Hợp chất flavonoid được tổng hợp theo con đườngphenylpropanoid, đây chính là con đường tổng hợp các hợp chất thứ cấp chủ yếu củathực vật bậc cao (Hình 1.2)

H nh 1.2 Con đường sinh tổng hợp flavonoid [14].

Nguyên liệu đầu tiên là amino acid L-phenylalanine (L-Phe) ho c trong vàitrường hợp là L-tyrosine (L-Tyr) được chuyển hóa hành 4-coumaroyl CoA (ho c mộteste thiol tương ứng với sự xuất hiện của 4- hydroxycinnamate khác) Sau đó, nhữngeste này được sử dụng như là tiền chất để tổng hợp các hợp chất như: flavonoid,lignin, lignan, coumarin, furanocoumarin và stilbene [2] Các giai đoạn của conđường phenylpropanoid được xúc tác bởi hệ thống các enzyme chủ chốt như:phenylalanine ammonia- lyase (PAL), cinnamate 4-hydroxylase (C4H), 4-coumarateCoA ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavonesynthase II ((FNS II), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonol synthase (FLS),dihydroxyflavonol 4-reductase (DFR), leucoanthocyanidin oxygenase (LDOX),isoflavone synthase và isoflavone reductase (IFS), các enzyme này được mã hóa bởi

hệ thống gen tương ứng [14] Sơ đồ hình 1.2 cho thấy F3’ 5’H và F3’H là hai loại

enzyme tham gia vào các phản ứng để hình thành các loại flavonoid

1.3 Gen mã hóa enzyme F3’5’H và các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H

1.3.1 Gen mã hóa enzyme F3’5’H

Theo nghiên cứu của Gracia Zabala và đtg (2006), gen AcF3’5’H được phân

lập từ cây Ô đầu có 1,521 bp mã hóa 506 amino acid Protein F3’5’H là 3',5'-hydroxylase có vùng Cytochrome P450 với 501 amino acid Cấu trúc không gian

flavonoid-của protein F3’ 5’H của cây Ô đầu gồm 9 chuỗi alpha và 3 chuỗi beta (Hình 1.3-A).

Trình tự gen AcF3’5’H phân lập từ cây Ô đầu Hà Giang cũng có 1,521 bp mã hóa

506 amino acid So với trình tự amino acid suy diễn từ gen F3’5’H mang mã số JN635708.1 trên GenBank, protein suy diễn từ đoạn mã hóa của gen AcF3’5’H phân

lập từ cây Ô đầu Quản Bạ, Hà Giang có sự sai khác ở 7 amino acid ở các vị trí 246,

280, 317, 325, 459, 481, 505 Cấu trúc không gian 3D của protein F3’5’H suy diễn từgen AcF3’5’H phân lập từ cây Ô đầu Hà Giang (Hình 1.3B) [15]

A B

H nh 1.3 Cấu trúc không gian 3D của protein F3’5’H

(A) Protein F3’5’H được thiết lập từ trình tự amino acid của protein F3’5’H mang mã số AEY80043.1.

(B) Protein suy diễn từ gen AcF3’5’H phân lập từ cây Ô đầu Hà Giang [19].

1.3.2 Các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H

Cho đến nay mới chỉ có một số ít nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H ở một vài loài thực vật như cây chè (Camellia sinensis).Theo nghiên cứu của Su Young Lee và đtg (2016), khi bảy cây chè được chuyển gen ClF3′5'H ra hoa có sự thay đổi về màu

sắc: m t trên của ống tràng hoa chuyển từ đỏ sang đỏ sẫm, m t trong của ống tràng

hoa chuyển từ đỏ tím sang đỏ tím sẫm ho c từ màu tím và màu của đầu nhụy chuyển

từ vàng xanh sang tím Bên cạnh đó, phân tích PCR định lượng phiên mã ngược đã

chỉ ra rằng sự biểu hiện của gen ClF3′5'H chuyển đã góp phần vào sự biến đổi kiểu hình ở bảy cây chuyển gen ClF3′5′H [19] Theo nghiên cứu của Kanako Ishiguro và

đtg (2012), các enzyme flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) và flavonoid 3 ', hydroxylase (F3'5'H) đóng một vai trò quan trọng trong hình thành màu sắc hoa

5'-F3'5'H cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các anthocyanins mang lại màu tím ho c

xanh lam cho hầu hết các loài thực vật [17] Đối với cây Ô đầu hiện tại chưa có báo

cáo nào về kết quả nghiên cứu biểu hiện gen AcF3’5’H.

1.4 Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

1.4.1 Vi khuẩn Agrobacterium

Có hai nhóm phương pháp chuyển gen là chuyển gen trực tiếp và chuyển gengián tiếp Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật

là vi khuẩn A tumefaciens Chi Agrobacterium là nhóm vi khuẩn Gram âm, gây ra các

khối u ở những vị trí khác nhau trên cây Theo đó, Khối u xuất hiện ở rễ là do vi

khuẩn Agrobacterium zhirogenes Khối u xuất hiện trên thân cây là do vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Khối u xuất hiện trên cây dâu đất, cây mâm xôi… là vi

khuẩn Agrobacterium rubi.

Chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens được nghiên cứu từ những năm 1960 -1970 Việc phát hiện ra A.tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu

những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng củacông nghệ sinh học thực vật với những ưu điểm nổi trội Đó là số bản sao của genbiến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp và ổn định, ít hình thành thể khảm, kỹthuật đơn giản dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền Phương pháp này đã khắcphục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp, nhưthường thu nhận được cây trồng có nhiều bản sao của một gen, DNA ngoại lai khôngbền vững và ổn định trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, nhiều thể khám và giáthành cao [10]

Phương pháp gián tiếp đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của cácphương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản

sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật,tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa làchỉ mang gen ở một số vị trí trên cây

Đ c biệt là khi nhược điểm của A tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá

mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và

được ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được

ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới

Chuyển gen vào thực vật thông qua A tumefaciens được xem là phương pháp

có nhiều ưu điểm nhất, nhất là đối với cây hai lá mầm, dựa vào khả năng chuyển gen

tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium Vector dựa trên plasmid Ti của

Agrobacterium là hệ thống tốt nhất cho chuyển gen thực vật bởi sự đơn giản, hiệu

suất cao của sự chuyển và chèn chính xác gen chuyển với một bản chèn copy, tỷ lệcâm gen thấp và khả năng chuyển được những đoạn DNA dài [10], [33]

Pal và đtg (1991) là những người đầu tiên thu được những cây chuyển gen trên

môi trường chọn lọc kanamycin từ lá mầm V radiata ủ với A Tumefaciens [23] Cây

chuyển gen được xác nhận bằng kỹ thuật dot blot Tuy nhiên, không có bằng chứng

nào được chỉ ra cho sự di truyền ổn định của gen chuyển Phogat và đtg (1999) đã tái

sinh các mô sẹo chuyển gen trên môi trường chọn lọc kanamycin (100mg/l) từ các

mô lá non được đồng nuôi cấy với A Tumefaciens [24] Các mô sẹo chuyển gen được

tìm thấy là kháng với kanamycin 750mg/1, đã biểu hiện hoạt tính B-glucurosidase và

chỉ ra sự chèn gen nptll bằng phân tích Southern blot Tuy nhiên, không thể được các

cây chuyền gen từ mô sẹo Jaival và đtg (2001) đã thu được các cây chuyển gen từ

các mẫu mô nách lá mầm ủ với Agrobacterium trên môi trường chọn lọc có

kanamycin đạt tỷ lệ 0,9 Phân tích phân tử các cây chuyển gen đã chỉ ra sự dunghợp gen chuyển vào hệ gen của cây chủ và gen chuyển được biểu hiện, nhưng không

có số liệu về sự di truyền của gen chuyển đến thế hệ sau [18], Mahalakshmi và đtg

(2006) đã phát triển cây đậu xanh chuyên gen từ các mẫu lá ban đầu trên môi trườngchọn lọc hygromycin và đạt tỷ lệ 2 Sự chèn gen chỉ thị ở thế hệ TO và T1 đã đượcchứng minh [21]

Sản xuất đậu xanh thường bị ảnh hưởng bởi côn trùng gây hại khác nhau Vìvậy, chọn tạo giống bằng kỹ thuật chuyển gen đã thu được các kết quả đáng ghi nhận.Suranippong (2002) thực hiện một thử nghiệm để chuyển gen từ mô đậu xanh từ 2

chủng vi khuẩn khác nhau là A rhizogenes K599 và A tumefaciens EHA 105 mang

plasmid DCAMBIA 1301 chứa gen Oxidase cholesterol (Choa), mã hóa một proteindiệt côn trùng, hoạt động mạnh chống lại ấu trùng một quả bông [25] Tazeen vàMirza (2004) đã nghiên cứu các nhân tố khác nhau để tối ưu hóa quá trình biến nạp

gen vào cây đậu xanh (V Radiata) nhờ A tumefaciens chủng C58C1 mang vector nhị thế p35SGUSINT chứa gen chỉ thị nptlI Tái sinh mô sẹo đã được sàng lọc bởi gen

gus trong môi trường chọn lọc có chứa kanamycin và ổn định biểu hiện đạt tới 70 ở

pH 5,8 sau 3 ngày kể từ ngày đồng nuôi cấy [29]

Việc thiếu một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và đáng tin cậy cho sự phát triển

của cây đậu xanh in vitro đã làm ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen ở đậu xanh và

được quan tâm nghiên cứu Mahalakshmi và đtg (2006) đã thu thập những cây đậuxanh chuyển gen đầu tiên, sau đó phát triển một kiểu gen độc lập, tần số cao khi táisinh cây từ mẫu lá chính [21] Cây chuyển gen kháng hygromycin này có hình tháitương tự như cây nảy mầm từ hạt Sự dung hợp của gen chuyển trong cây chuyển gen

và di truyền ổn định cho thế hệ sau đã được khẳng định thông qua phân tích PCR vàlại Southern

Thành công tạo cây đậu xanh chuyển gen có kiểu hình bình thường có khảnăng kháng sâu được báo cáo lần đầu tiên bởi Saini và đtg (2007) [31] Các tác giả

thực hiện lây nhiễm nhờ A tumefaciens EHA105 qua nách lá mầm nhờ mang gen mã

hóa protein ức chế α-amylase phân lập từ cây Phaseolus vulgaris, kết quả thu đượccác cây chuyển gen thông qua tái sinh chổi trực tiếp Gen ức chế α-amylase cũngđược kiểm tra bằng phản ứng Southern blot Sự dung hợp ổn định và sự biểu hiện của

gen bar trong cây ở thế hệ 10 được kiểm tra bằng PCR và lại Southern Trong số các

điều kiện khác nhau, gây tổn thương các mẫu biến nạp, sử dụng acetosyringone vàkháng sinh chọn lọc trong đồng nuôi cấy đóng vai trò quan trọng để đạt được hiệusuất chuyển gen là 7,81

1.4.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Theo Smith và Townsend (1907), A tumefaciens nằm trong hệ thống phân loại

như sau:

Giới Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales

Họ: Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Loài: A tumefaciens [40]

A tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử

dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho

chúng A tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân,

gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây-crown gall disease), khi đó các tế bào khối

u ở thực vật có gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn Khi phân tích khối u cho thấy trongkhối u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octopine goi chung làopine Các chất này không hề có trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường.Như vậy vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây

và tác nhân này có bản chất là vật chất di truyền

Các nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens đều thực hiện chuyển

gen qua vết thương

H nh 1.4 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens [41].

Plasmid của vi khuẩn khác được cắt T-DNA bằng enzyme giới hạn, DNAngoại lai được cắt bởi cùng enzyme, DNA ngoại lai được chèn vào T-DNA củaplasmid, plasmid được chèn vào lại vi khuẩn, vi khuẩn được dùng để chèn T-DNAmang gen ngoại lai vào NST của tế bào thực vật

Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở cây thuốc lá:

Gen GmCHI1A là viết tắt của cụm từ Glycine max chalcone isomerase 1A Gen GmCHI1A được phần là từ mRNA của cây đầu tương có kích thước 657

nucleotide, mã hóa 218 amino acid được thiết kế thành vector chuyển gen trong

A.tumefaciens để truyển vào cây đâu tương nhăm nâng cao hàm lượng isoflavone

trong mầm hạt đậu tương [35] Chuyển gen GmCHI1A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumefaciens là mô hình chuyển gen hiệu quả để thực hiện chuyển gen vào

cây đậu tương của nhóm tác giả Lê Thị Hồng Trang và đtg thực hiện năm 2019 [7]

Gen gus mã hóa cho enzyme β-glucuronidase được phân lập từ chủng E.coli

RA201 Enzyme β-glucuronidase là enzyme thủy phân xúc tác cho sự phân giải cácβ-glucuronide tạo sản phẩm phân giải có màu xanh lam đ c trưng, dễ nhận biết β-glucuronidase thường dùng dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tổn tại của gen

gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) Dung dịch X-gluc

không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam

Nhờ đ c điểm này, mà các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển

gen để làm chỉ thị dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển Tác giả Vì

Thị Xuân Thủy và đtg đã thành công trong việc chuyển gen gus vào phôi non ở giống ngô LVN99 nhờ vi khuẩn A.tumefaciens Đối với phôi non của giống ngô LVN99 thì hiệu quả biến nạp gen gus cao nhất khi nồng độ vi khuẩn A Tumefacciens thích hợp

ở giá trị OD660nm=0,8, thời gian nhiễm khuẩn tối ưu là 30 phút, bổ sungacetosyringone 150 µM, tuổi phôi từ 10-12 ngày tuổi (kích thước 0,9-1,3 mm) tối ưucho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycinđối với phôi chuyển gen là 50mg/l [5]

GmDREB6 là viết tắt Glyine max Dehydration- Responsive Element Binding.

Gen GmDREB6 có chức năng kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học [34] Gen GmDREB6 dược phân lập từ mRNA của cây đậu

tương và thiết kế thành vector [22] pBI121_GmDREB6 chuyển vào cây đậu tương

giống đậu tương ĐT22 nhờ vi khuẩn A.tumefaciens [3].

1.5 Đánh giá sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Trong sinh học, các phân tử có giá trị trong nghiên cứu được chia ra thànhnhiều loại căn cứ vào bản chất hóa học của chúng Sự ra đời của cấu trúc DNA nhờOatson và Cric (1953) là tiền đề trong nghiên cứu sinh học phân tử Cùng với đó, cácphân tử như RNA, protein…cũng là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học

Đánh giá sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử có nhiều mức độkhác nhau Mức độ thứ nhất xác định sự có m t của gen trong tế bào cây chuyển genđược tiến hành bằng kỹ thuật PCR, với c p mồi đ c hiệu của gen chuyển và DNAdòng cây cần kiểm tra Xác định gen chuyển được gắn vào hệ gen cây tái sinh haykhông phải thực hiện phép lai phân tử Southern mà mẫu dò là đoạn gen chuyển đượcđánh dấu huỳnh quang còn DNA nhân cao phân tử được tách từ mô của cây chuyềngen Xác định gen chuyển có được phiên mã thành mRNA hay không, tức là có được

bộ máy sinh tổng hợp protein chấp nhận hay không được thực hiện bằng kỹ thuật laiNorthern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang và RNA toànphần của mô cây chuyển gen Và bước cuối cùng là xác định gen chuyển có biểu hiện

và tạo ra sản phẩm cuối cùng của nó là protein bằng kỹ thuật lai Western giữa proteincủa cây chuyển gen và kháng thể đ c hiệu với protein đó được tinh sạch từ nguồn

khác M t khác, hoạt tính gen chuyển còn được thử bằng các phép thử chỉ thị như thửtính kháng kháng sinh, thử tính diệt sâu, nhưng ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mônhà lưới.

Điểm tiếp theo là phải xác định phương thức và đ c điểm di truyền của genchuyển và tính trạng được gen chuyển mã hoá đồng thời kiểm tra mức độ đồng hợp tửcủa thế hệ con cái chúng bằng cách lai chéo hay tự phối và phép thử tính khángkháng sinh

Có thể mô tả khái quát các thí nghiệm thường dùng hiện nay trong phân tíchsinh vật chuyển gen ở sơ đồ hình 1.5

NGUYÊN LIỆU SAU BIẾN NẠP

Ỹ THUẬT

LAI NORTHERN

REAL-TIME PCR

XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA GEN

XÁC ĐỊNH BIỂU HIỆN GEN

XÁC ĐỊNH CHỨC NĂNG SINH HỌC GEN CHUYỂN

RT-PCR

LAI NORTHERN

LAI WESTHERN ELISA

PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN

H nh 1.5 Các mức độ đánh giá sinh vật chuyển gen

PCR (polymerase chain rection) là kỹ thuật khuếch đại đoạn DNA mong muốnkhi có m t của đoạn DNA đó nằm trong bất kỳ vị trí nào của tế bào Với vai trò đánhgiá sự có m t của gen cần chuyển ở cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR chỉ cần môhay tế bào của mẫu nghiên cứu có phân tử DNA mang gen mong muốn, có c p mồi

đ c hiệu, DNA polymerase, dATP và dung dịch đệm Hỗn hợp các thành phần củaphản ứng PCR được nhân lên trong thiết bị tự động cài đ t phần mềm biến đổi nhiệt.Sau một số chu kỳ l p lại ta kiểm tra kết quả đoạn nhân lên bằng gel agarose để tìmđoạn có kích thước như mong muốn