Slide bài giảng XÁC ĐỊNH COLIFORMS TỔNG SỐVÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNHBẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

TẠI SAO CẦN KIỂM TRA COLIFORMS TỔNG SỐ?- Vi sinh vật chỉ thị mức độ ATVSTP và nước: - Không chỉ thị mức độ ATVSTP và nước cho các yếu tố hóa học Coliform bacteria are microbes found in t

TẠI SAO CẦN KIỂM TRA COLIFORMS TỔNG SỐ?

- Vi sinh vật chỉ thị mức độ ATVSTP và nước:

- Không chỉ thị mức độ ATVSTP và nước cho các yếu tố hóa học

Coliform bacteria are microbes found in the digestive systems of warm-blooded

animals, in soil, on plants, and in surface water These microbes typically do

not make you sick; however, because microbes that do cause disease are hard

to test for in the water, "total coliforms" are tested instead If the total coliform count is high, then it is very possible that harmful germs like viruses, bacteria,

and parasites might also be found in the water

http://www.cdc.gov/healthywater/drinking/private/wells/testing.html

Hơn 90% coliforms phân là Escherichia (E.coli)

American Public Health Association Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater, 18th Edition, 1992 Table 9225:I, p 9-66

ESCHERICHIA COLI (E.COLI)

http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli

- Hình que, Gram-âm, không sinh bào tử

- Lên men đường lactose sinh hơi và acid ở 44oC

khẳng định sự nhiễm khuẩn từ phân

MỤC TIÊU HỌC TẬP

Sau khi học, học viên có khả năng:

- Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN

- Trình bày được phạm vi áp dụng, nguyên tắc và các bước tiến hành xác định Coliforms tổng số và định

lượng E.coli giả định trong thực phẩm.

- Nhận định được kết quả

NỘI DUNG BÀI GIẢNG

1 Phạm vi áp dụng & nguyên lý phương pháp

2 Phương pháp MPN

3 Chuẩn bị thí nghiệm

4 Các bước tiến hành

5 Đọc kết quả

Phạm vi áp dụng

Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Các mẫu môi trường khu vực sản xuất và

E.coli: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí và tạo thành Indol

từ tryptophan khi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh chọn lọc ở 44 o C

bằng phương pháp tính số có xác suất lớn nhất (Most Probable number -MPN)

PHƯƠNG PHÁP MPN

 Nguyên tắc: xác suất thống kê sự phân bố VSV

trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu

 Mỗi độ pha loãng được lặp lại nhiều lần (3 lần)

 Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và âm tính

 Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu

PHƯƠNG PHÁP MPN

10 ml môi trường

PHƯƠNG PHÁP MPN

1. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng

PHƯƠNG PHÁP MPN

2. Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

PHƯƠNG PHÁP MPN

3. Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp

PHƯƠNG PHÁP MPN

4. Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của VSV cần kiểm định

PHƯƠNG PHÁP MPN

5. Ghi nhận số ống dương tính ở từng độ pha loãng

4 Chỉ nồng độ đầu tiền có ống (+)  chọn thêm 2 nồng

độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi 2 nồng

độ này không có ống (+) nào Ví dụ 6, 7

Lựa chọn các độ pha loãng để tính kết quả

Kết quả:

Số VSV (MPN/ml) = kết quả tra bảng x (f/10)Trong đó:

f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)

PHƯƠNG PHÁP MPN

Số VSV = 70 MPN/ml

Thuốc thử Indol (Kovacs)

Bước 1: Đồng nhất mẫu

Cân 10 g/10ml mẫu + 90 ml dd peptone trong bình tam giác

 nồng độ 10-1

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Bước 2: Pha loãng mẫu

Hút 1ml mẫu + 9ml dd peptone trong ống nghiệm  nồng độ

10-2 Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ 10-3 và 10-4 …

Bước 3: Nuôi cấy trên môi trường tăng sinh/chọn lọc 1

Đổ 1ml mẫu + 9ml dd Tryptose Lauryl Sunfat trong ống

nghiệm  nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h

kết quả (+): sử dụng lactose sinh khí

Bước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2

Cấy chuyển từ ống LTS (+) sang:

Coliforms: Canh thang mật lactose lục sáng (mật bò khô)

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Bước 5: Thử sinh hóa khẳng định cho E.coli

Cấy chuyển từ ống dd EC (+) sang trypton  nuôi cấy ở

44oC/48h  nhỏ 0.5ml dd Kovacs vào ống nuôi cấy

kết quả (+): sử dụng lactose sinh khí

kết quả (+): tạo vòng Indol màu đỏ

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

44oC / 24h

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Sơ đồ các bước xác định coliforms tổng số

Sơ đồ các bước định lượng E.coli

ĐỌC KẾT QUẢ

Coliforms/E.coli trong MT LTS

ĐỌC KẾT QUẢ

Coliforms trong MT mật lactose lục sáng

(+) (-)

(-)

E.coli trong MT EC

ĐỌC KẾT QUẢ

E.coli sinh Indol