Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19

Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19 Phương pháp PCR trong định lượng định tính covid 19

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

TIỂU LUẬN MÔN GENOMIC PHÂN TỬ

Nhóm : 04

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

1 Tổng quan về RealTime PCR 3

2 Real time RT-PCR là gì ? 4

2.1 Realtime PCR làm việc với COVID - 19 5

2.2 Thành phần Real time PCR 6

2.3 Material 6

3 Phương pháp 8

3.1 Công nghệ phân tích Real-time PCR 8

3.2 Phân tích định lượng bằng RT-qPCR 8

3.2.1 Định nghĩa qPCR 8

3.2.2 Phản ứng 9

3.2.3 Ưu điểm 10

3.2.4 Nhược điểm 10

3.3 Phân tích định lượng bằng ddPCR 10

3.3.1 Định nghĩa ddPCR 10

3.3.2 Phản ứng 11

3.3.3 Ưu điểm 12

3.3.4 Nhược điểm 12

3.4 Kết quả 13

3.5 qPCR 13

3.6 ddPCR 14

3.7 Compararision 14

3.7.1 Phát hiện đột biến, SNP, allen bổ trợ 15

3.7.2 Biểu hiện gene 15

3.7.3 Chỉnh sửa gen 16

3.7.4 Số lượng bản sao chép 16

3.8 Chọn phương pháp PCR phù hợp với từng ứng dụng 17

4 Reference 17

MỤC LỤC HÌNH ẢN

Hình 1 Máy Real-time PCR 4

Hình 2 Công thức hóa chất nhuộm SYBR® Green I 6

Hình 3 Tạo tín hiệu trong suốt quá trình kiểm tra RT-qPCR 9

Hình 4 Quy trình phản ứng ddPCR 11

Hình 5 Các giai đoạn khuyết đại qPCR 13

Hình 6 Kết quả của PCR vi giọt kỹ thuật số cho 6 phản ứng khác nhau 14

Hình 7 So sánh ddPCR và qPCR 14

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DNA acid deoxyribonucleic

RNA acid ribonucleic

RT - PCR Real Time Polymerase Chain Reaction

dd PCR Droplet Digital Polymerase Chain

Reaction SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome

corona virus 2 qPCR qualitattive PCR

dPCR digital PCR

RT Reverse Transcriptase

1 Tổng quan về RealTime PCR

Bùng phát vào cuối tháng 12/2019, bắt nguồn từ một chợ hải sản ở Hồ Nam,

Vũ Hán, miền Trung Trung Quốc, virus Corona ban đầu được xác nhận là một loạibệnh “viêm phổi lạ” hoặc “viêm phổi không rõ nguyên nhân” Các nhà khoa học đãtiến hành nghiên cứu và phân lập được một chủng corona virus mới, được Tổ chức Y

tế Thế giới (WHO) tạm thời gọi là SARS-CoV-2 có trình tự gen giống với SARS-CoVtrước đây, với mức tương đồng lên tới 79,5%

Đây là dạng virus mới nên con người chưa từng có miễn dịch, kể cả miễn dịchchéo trước đó Khi virus xâm nhập vào cơ thể, nó đi vào trong một số tế bào và chiếmlấy bộ máy tế bào (gây tổn thương viêm đặc hiệu ở đường hô hấp), đồng thời viruschuyển hướng bộ máy đó để phục vụ cho chính nó, tạo ra virus mới và nhiễm tiếpngười khác

Xét nghiệm sinh học phân tử realtime RT-PCR là một phương pháp xét nghiệmxác định sự hiện diện của virus thông qua phát hiện vật liệu di truyền của virus SARS-CoV-2, đây là phương pháp có độ chính xác cao Xét nghiệm realtime RT-PCR có thểcho ra kết quả định lượng nồng độ virus tại thời điểm xét nghiệm Kết quả có thể giúpbác sĩ tiên lượng tiến triển bệnh, cũng như đánh giá được hiệu quả điều trị

Hiện đã có nhiều bộ xét nghiệm khác nhau dựa trên kỹ thuật qPCR, cho việcphát hiện virus, các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới đã điều chỉnh các xét nghiệmPCRs cho SARS-CoV-2 của họ qua việc sử dụng các đoạn mồi khác nhau nhắm vàocác phần khác nhau của trình tự gen virus Các xét nghiệm RT-PCR mới nhắm vàoRNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp)/helicase, protein gai (spike) vànucleocapsid của SARS-CoV-2 có thể giúp cải thiện chẩn đoán COVID-19 trongphòng xét nghiệm

PCR định lượng, hoặc real time PCR, (qPCR) và PCR phiên mã ngược PCR) sử dụng tuyến tính của khuếch đại DNA để xác định số lượng tuyệt đối hoặctương đối của một chuỗi đã biết trong mẫu Bằng cách sử dụng một phóng viên huỳnhquang trong phản ứng, có thể đo tạo DNA trong xét nghiệm qPCR

(RT-2 Real time RT-PCR là gì ?

Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại (amplicon) được phát hiện bằngphân tích điểm cuối (end-point), bằng cách chạy DNA trên gel agarose sau khi phảnứng kết thúc Ngược lại, Real time RT-PCR cho phép phát hiện và đo lường sự tích tụcủa sản phẩm khuếch đại như sự tiến triển phản ứng, nghĩa là trong "thời gian thực"

Kỹ thuật realtime PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại phân

tử DNA in vitro Tuy nhiên, Realtime PCR khác phản ứng PCR thông thường ở chỗ

nó có khả năng phát hiện và định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ củaphản ứng Phương pháp này đòi hỏi một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường

độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình phần mềm cho phép

xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứngkhuếch đại

Hình 1 Máy Real-time PCR

Ưu điểm chính của Real time PCR so với PCR truyền thống là Real time PCRcho phép bạn xác định số bản sao mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một dảiđộng rộng Kết quả Real time PCR có thể là định tính (sự hiện diện hoặc vắng mặt củatrình tự) hoặc định lượng (số lượng bản sao DNA) Real time PCR được định lượngcòn được gọi là qPCR Ngược lại, PCR thông thường là bán định lượng tốt nhất.Ngoài ra, dữ liệu Real time PCR có thể được đánh giá mà không cần điện di gel, dẫnđến giảm thời gian thí nghiệm và tăng thông lượng Cuối cùng, vì các phản ứng được

chạy và dữ liệu được đánh giá trong một hệ thống ống kín, cơ hội ô nhiễm được giảm

và nhu cầu thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ

2.1 Realtime PCR làm việc với COVID - 19

Một mẫu được lấy từ các bộ phận của cơ thể nơi tập trung virus COVID-19,chẳng hạn như mũi hoặc cổ họng của một người Mẫu được xử lý bằng một số dungdịch hóa học loại bỏ các chất như protein và chất béo và chỉ chiết xuất RNA có trongmẫu RNA chiết xuất này là sự pha trộn của vật liệu di truyền của chính người đó và,nếu có, RNA của virus

RNA được sao chép ngược thành DNA bằng cách sử dụng một enzyme cụ thể(Phương pháp Reverse Transcription PCR) Sau đó, các nhà khoa học thêm các mảnhDNA ngắn bổ sung cho các phần cụ thể của DNA virus được phiên mã Nếu virus cótrong mẫu, những mảnh vỡ này tự gắn vào các phần mục tiêu của DNA virus Một sốmảnh di truyền được thêm vào được sử dụng để xây dựng các sợi DNA trong quátrình khuếch đại, trong khi các mảnh khác được sử dụng để xây dựng DNA và thêmnhãn đánh dấu vào các sợi, sau đó được sử dụng để phát hiện virus Đây cũng là cách

mà người ta dung để định tính COVID-19 virus

Hỗn hợp sau đó được đặt trong máy real time RT-PCR Máy chu kỳ qua nhiệt

độ làm nóng và làm mát hỗn hợp để kích hoạt các phản ứng hóa học cụ thể tạo ra cácbản sao mới, giống hệt nhau của các phần mục tiêu của DNA virus Chu kỳ được lặp

đi lặp lại nhiều lần để tiếp tục sao chép các phần mục tiêu của DNA virus Mỗi chu kỳtăng gấp đôi số trước đó: hai bản trở thành bốn, bốn bản trở thành tám, v.v Một thiếtlập real time RT-Real time PCR tiêu chuẩn thường trải qua 35 chu kỳ, có nghĩa là, vàocuối quá trình, khoảng 35 tỷ bản sao mới của các phần DNA virus được tạo ra từ mỗisợi virus có trong mẫu

Khi các bản sao mới của các phần DNA virus được xây dựng, các nhãn đánhdấu gắn vào các sợi DNA và sau đó giải phóng thuốc nhuộm huỳnh quang, được đobằng máy tính của máy và được trình bày trong thời gian thực trên màn hình Máytính theo dõi lượng huỳnh quang trong mẫu sau mỗi chu kỳ Khi một mức huỳnhquang nhất định bị vượt qua, điều này xác nhận rằng virus có mặt Các nhà khoa họccũng theo dõi cần bao nhiêu chu kỳ để đạt đến mức này để ước tính mức độ nghiêmtrọng của nhiễm trùng: chu kỳ càng ít, nhiễm virus càng nghiêm trọng

2.2 Thành phần Real time PCR

Thời gian thực phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng cách bao gồmtrong phản ứng một phân tử huỳnh quang báo cáo sự gia tăng lượng DNA với sự giatăng tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang Các hóa chất huỳnh quang được sử dụng cho mụcđích này bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và đầu dò đánh dấu cụ thể các trình tựđược nhãn huỳnh quang hoặc các probe Các bộ tuần hoàn nhiệt chuyên dụng đượctrang bị các mô-đun phát hiện huỳnh quang được sử dụng để theo dõi huỳnh quangkhi quá trình khuếch đại xảy ra Huỳnh quang đo được phản ánh lượng sản phẩmkhuếch đại trong mỗi chu kỳ

2.3 Material

Chìa khoá kỹ thuật chính trong kỹ thuật realtime PCR chính là hai loại hóa chấtđược sử dụng để phát hiện các sản phẩm PCR trên thiết bị Real time PCR:

Hóa chất nhuộm SYBR ® Green I

Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này làm cho sợi đôi phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Do đó, máy sẽ xác định được cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng

Hình 2 Công thức hóa chất nhuộm SYBR ® Green I

Đây là phương pháp phát hiện thứ nhất Người ta sử dụng thuốc nhuộm xen kẽkết hợp vào DNA sợi kép Trong số các thuốc nhuộm huỳnh quang này, thuốc nhuộm

SYBR® Green I được sử dụng phổ biến nhất Phương pháp phát hiện này phù hợp khimột amplicon duy nhất đang được nghiên cứu, vì thuốc nhuộm sẽ xen kẽ vào bất kỳDNA sợi kép nào được tạo ra.

Bất kể phương pháp liên kết, có ít nhất hai yêu cầu đối với DNA thuốc nhuộm liên kết để phát hiện thời gian thực các sản phẩm PCR:

 Tăng huỳnh quang khi bị ràng buộc với DNA sợi kép

 Không ức chế PCR

Các điều kiện trên cho phép sử dụng SYBR® Green I tồn tại trong PCR màkhông có sự ức chế PCR và tăng độ nhạy phát hiện so với Ethidium bromide

Đầu dò phát huỳnh quang (Taqman ® probes)

Là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung vớimột trình tự đặc hiệu trên DNA đích Đầu dò oligonucleotide này được gắn các phân

tử có thể phát huỳnh quang Sự phát quang này thông thường xuất hiện khi có mặt sựkết cặp của đầu dò (probe) với phân tử DNA đích Vì vậy cường độ phát quang sẽthay đổi sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR Qua đó máy Realtime giúp định lượngđược số bản sao được nhân lên tại mỗi thời điểm Ngoài ra còn nhiều cơ chế phátquang được các nhà nghiên cứu phát triển nữa Nhưng nhìn chung đều dựa vào sựthay đổi cường độ huỳnh quang sau mỗi chu kỳ phản ứng, do phân tử DNA đích đượctạo ra nhiều hơn

Phương pháp phát hiện thứ hai sử dụng Primer hoặc oligonucleotide mục tiêuđặc hiệu, như TaqMan® probes, Molecular Beacons hoặc Scorpion primers.Oligonucleotide được dán nhãn bằng thuốc nhuộm huỳnh quang và Quencher Bảnthân oligonucleotide không có huỳnh quang đáng kể, nhưng sẽ phát huỳnh quang khi

ủ vào mẫu (như trong Molecular Beacons) hoặc khi thuốc nhuộm được cắt từ oligotrong quá trình mở rộng (như trong đầu dò TaqMan)

TaqMan Probe sử dụng một đầu dò phát huỳnh quang để cho phép phát hiện một sản phẩm PCR cụ thể như nó tích lũy trong chu kỳ PCR Thiết kế đầu dò phát huỳnh quang được chế tạo bằng cách kết hợp thuốc nhuộm Reporter ở đầu 5′ và thuốc

nhuộm Quencher ở đầu 3′, đã đơn giản hóa đáng kể thiết kế và tổng hợp hiệu quả các đầu dò 5’ nuclease phát huỳnh quang được thử nghiệm

3 Phương pháp

3.1 Công nghệ phân tích Real-time PCR

Tổng số 56 bệnh nhân nhập viện (nhập viện từ ngày 21 tháng 1 đến ngày 12tháng 2 năm 2020) đã được xác nhận nhiễm SARS-CoV-2 tại 3 chi nhánh (Hán Khẩu,Thành phố mới Trung-Pháp và Thung lũng Quang học) của Bệnh viện Đồng Tế tạiBệnh viện Đồng Tế thuộc Đại học Hoa Trung của Khoa học và Công nghệ ở Vũ Hán,Trung Quốc, đã được đưa vào nghiên cứu này Tất cả các bệnh nhân tham gia đã đượcchẩn đoán xác định về COVID-19 theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đối vớiSARS-CoV-2 của Ủy ban Y tế Quốc gia Trung Quốc và hướng dẫn tạm thời củaTrung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Mẫu ngoáy họng hoặc mẫu ngoáymũi sâu được thu thập từ các bệnh nhân vào các ngày khác nhau sau khi bắt đầu xuấthiện các triệu chứng SARS-CoV-2 được phát hiện bằng xét nghiệm RT-Real timePCR sử dụng bộ phát hiện acid nucleic COVID-19 theo quy trình của nhà sản xuất(Shanghai Huirui Biotechnology Co, Ltd) Cụ thể, 2 gen mục tiêu, bao gồm khung đọc

mở 1ab (ORF1ab) và protein nucleocapsid (N), đã được kiểm tra trong thử nghiệmRT-Real time PCR Nếu 2 kết quả âm tính liên tiếp đạt được, khoảng thời gian từ khibắt đầu triệu chứng đến ngày có kết quả xét nghiệm RT-PCR âm tính đầu tiên đượcxác định là thời gian chuyển đổi acid nucleic của virus Tất cả dữ liệu (ngày xétnghiệm và kết quả xét nghiệm RT-PCR) được thu thập đến ngày theo dõi cuối cùng(ngày 3 tháng 3 năm 2020)

3.2 Phân tích định tính bằng RT-qPCR

3.2.1 Kiểm tra RT-qPCR là gì?

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp đặc hiệu và có độ nhạycao để khuếch đại và phát hiện acid deoxyribonucleic (DNA) Sự đơn giản về mặtkhái niệm đã khiến nó trở nên rộng rãi nhất kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân

tử và về lý thuyết, nó có thể phát hiện ra rất ít như một đoạn DNA đơn lẻ.Do đó, nó

được sử dụng rộng rãi như một xét nghiệm chẩn đoán cho một loạt các vi khuẩn, nấm,virú và ký sinh trùng mầm bệnh Tuy nhiên, bộ gen của coronavirus bao gồm acidribonucleic (RNA) chứ không phải DNA Trong khi RNA tương tự như DNA, nó đủkhác biệt với Taq polymerase, enzyme tiêu chuẩn được sử dụng để khuếch đại DNA,chỉ sao chép nó rất kém hiệu quả Do đó, RNA được phát hiện bởi một biến thể củathử nghiệm PCR, được gọi là phiên mã ngược (RT) -PCR Điều này bao gồm hai bướcphương pháp, thường bao gồm hai enzym; bước đầu tiên sử dụng DNA polymerasephụ thuộc RNA, còn được gọi là enzyme sao chép ngược, để sao chép RNA thànhDNA (cDNA), bước thứ hai sau đó chuyển sử dụng Taq polymerase, khuếch đạicDNA như trong xét nghiệm PCR tiêu chuẩn

Bước phiên mã ngược được thực hiện ở 50°C trong 15 phút, tiếp theo là vôhiệu hóa RT trong 3 phút và bước kích hoạt Taq polymerase Tiếp theo là giai đoạnPCR, bao gồm bước biến tính 5 giây, trong đó các sợi DNA phân tách thành các sợiđơn, và ủ nhiệt / polyme hóa 45 giây 60°C , trong đó mồi khuếch đại (và đầu dò pháthiện) lai với sợi đơn(cDNA) Khuôn mẫu DNA và cho phép polymerase sao chépkhuôn mẫu, tạo ra DNA sợi kép Trong quá trình polyme hóa thành công, đầu dò đượcdịch chuyển và thủy phân, tách fluorophore(một hợp chất hóa học huỳnh quang có thểphát lại ánh sáng khi bị kích thích bởi ánh sáng.) và dập tắt và giải phóng huỳnhquang Quá trình này được lặp lại, thường khoảng 40 lần (40 chu kỳ) Một lần chạyRT-qPCR điển hình, như được ví dụ ở đây, được hoàn thành trong khoảng 1 giờ 27phút Vì đây là RT-qPCR, định lượng đạt được bằng cách đo cường độ của tín hiệuhuỳnh quang ở cuối mỗi chu kỳ để suy ra lượng sản phẩm PCR được tạo ra

3.2.2 Phản ứng

Tạo tín hiệu trong quá trình kiểm tra RT-qPCR Thuốc thử kiểm tra bao gồmmột chất đệm, cả các enzyme, đoạn mồi DNA cụ thể mục tiêu và một đầu dò DNA cụHình 3.2.11 Cấu hình nhiệt của thử nghiệm RT-qPCR điển hình chạy trên thiết bị BioRad CFX qPCR

thể mục tiêu được đánh dấu ở một đầu bằng nhãn huỳnh quang và ở đầu kia bằng chấtdập tắt Các mẫu bên trái và bên phải chứa cùng một đoạn mồi và mẫu dò, nhưng mẫubên trái chứa RNA mục tiêu, trong khi mẫu bên phải thì không.

A RT: Các mẫu được ủ ở nhiệt độ khoảng 50°C, dẫn đến RT phiên mã cDNAđích cụ thể từ một trong các mồi đặc hiệu sợi ở bên trái, không có phiên mã ngược ởbên phải

B Biến tính: Mẫu được đun nóng đến 95°C, làm biến tính RNA nhưng vẫn giữnguyên cDNA

C Ủ: nhiệt độ được hạ xuống khoảng 60°C, với nhiệt độ thực tế phụ thuộc vàokhảo nghiệm Điều này cho phép cả mồi và đầu dò mục tiêu cụ thể liên kết với mụctiêu tương ứng của chúng ở bên trái, trong khi mồi và đầu dò vẫn không bị ràng buộc

ở bên phải

D Polyme hóa: bước này có thể kết hợp với bước ủ

Ở bên trái, polymerase mở rộng quá trình tổng hợp DNA, ban đầu chỉ từ mộtmồi, nhưng sau chu kỳ đầu tiên từ cả hai, và thay thế và thủy phân bất kỳ mẫu dò liênkết nào Điều này tách fluorophore và chất dập tắt và dẫn đến phát ra ánh sáng nếufluorophore được kích thích ở bước sóng thích hợp

Ở bên phải, không có điều này xảy ra và không có ánh sáng nào được phát ra.Chu kỳ đầu tiên này được theo sau bởi một số chu kỳ xa hơn, do người dùng xác định,được biểu thị bằng mũi tên cố định dẫn trở lại bước B

E Biểu đồ khuếch đại thu được đối với mỗi mẫu theo dõi sự phát xạ ánh sángngày càng tăng đặc tính của kết quả dương tính từ mẫu bên trái (ô màu xanh lá cây),trong khi mẫu không có mục tiêu khuếch đại ở bên phải ghi lại không có phát xạ ánhsáng và kết quả âm tính

3.2.3 Ưu điểm

Một trong những ưu điểm có giá trị của RT-qPCR là dễ dàng định lượng RNAnói chung và tải lượng virus nói riêng, nếu các thông số xét nghiệm đầy đủ được thiếtlập và các đối chứng thích hợp được đưa vào Chu kỳ định lượng (Cq) là trọng tâm

Hình 3 Tạo tín hiệu trong suốt quá trình kiểm tra RT-qPCR