LUẬN văn đề tài NGHIÊN cứu xác ĐỊNH cây NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ BẰNG kĩ THUẬT PCR và ĐÁNH GIÁ đa DẠNG DI TRUYỀN tập đoàn NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ

LUẬN văn đề tài NGHIÊN cứu xác ĐỊNH cây NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ BẰNG kĩ THUẬT PCR và ĐÁNH GIÁ đa DẠNG DI TRUYỀN tập đoàn NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ

Khoa công nghệ sinh học

F G

KHểA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ

HÀ NỘI - 2008

Phần I: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề

Đầu những năm 80 thế kỷ XX xuất hiện những công bố đầu tiên về cây chuyển gen và từ đó mở ra một ra chân trời mới, chứa đựng một tương lai đầy hứa hẹn về cải tiến cây trồng Nhiều giống cây trồng đã được chuyển gen để tạo

ra các đặc tính ưu việt, giúp cải thiện năng suất, chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn, lạnh, tăng chất lượng và cải thiện môi trường Từ đó kỹ thuật gen trở thành công

cụ hữu hiệu được ứng dụng trong cải tiến giống cây trồng

Sự phát triển nhanh chóng của Công nghệ Sinh học đã đưa các thực vật chuyển gen và các sản phẩm của chúng đến với thị trường tiêu dùng Và kể từ khi kỹ thuật gen thực vật được thiết lập, thử nghiệm thành công thì những ứng dụng của nó đã được đầu tư và được tiến hành một cách rộng rãi để giải quyết các vấn đề còn tồn tại của Nông nghiệp Vì vậy thực vật chuyển gen đã được trồng phổ biến trên đồng ruộng để làm tăng tính kháng bệnh, kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ trong hệ thống canh tác Từ cuối năm 1997, các cây trồng biến đổi gen và các sản phẩm của chúng đã được chấp nhận thương mại hoá ở một số quốc gia Ngày nay việc sản xuất và sử dụng cây trồng chuyển gen đang ngày một gia tăng, và khẳng định tầm quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp và một số nghành khác Năm 2007 diện tích trồng tiếp tục tăng 2 con số, đạt 12% tương đương với 12,3 triệu hecta (30 triệu mẫu Trong đó tổng diện tích trồng trong 12 năm (1996-2007) đạt 690 triệu héc-ta (1,7 tỷ mẫu) Với mức tăng chưa từng thấy gấp 67 lần từ 1996-2007, trở thành công nghệ cây trồng được áp dụng nhanh nhất trong thời gian gần đây

Ngày nay, cây chuyển gen được trồng ngày càng rộng rãi ở rất nhiều nước trên thế giới Nhưng câu hỏi về sự an toàn trong việc sử dụng các sản phẩm của cây chuyển gen cũng đồng thời được đặt ra và trở thành một vấn đề nóng bỏng với hàng loạt các vấn đề liên quan xoay quanh nó, liệu chúng được sử dụng dưới

dạng nào và khả năng rủi ro đến với sức khoẻ con người, với sự đa dạng sinh học, tiềm ẩn ô nhiễm môi trường ở Việt Nam, đến nay vẫn đang trong thời gian xây dựng và hoàn thiện các quy chế về quản lý an toàn sinh học các cây chuyển gen và kiểm soát các sản phẩm biến đổi gen Tuy nhiên, để đưa nhanh các cây chuyển gen vào sản xuất tại Việt Nam thì việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen, trồng thử nghiệm và kiểm soát cây trồng biến đổi gen cần phải tiến hành trước một bước Trong số các cây trồng biến đổi gen đang thử nghiệm thì cây ngô đang rất được quan tâm nhất đặc biệt là ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ

Để đáp ứng các chỉ tiêu kỹ thuật trong việc phát hiện chính xác ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và nhanh chóng sử dụng các dòng ngô này phục

vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ của Việt Nam Chúng tôi đã

thực hiện đề tài “Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ

bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ”

1.2 Mục đích

– Thu thập dữ liệu về cây trồng biến đổi gen và tìm hiểu một cách tổng quan về cây ngô chuyển gen

– Bước đầu làm quen với các kỹ thuật nghiên cứu về cây chuyển gen

– Xác định đoạn trình tự đặc trưng của promoter CaMV-35S (195bp) có trong ngô chuyển gen

– Xác định gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) là gen kháng thuốc trừ cỏ glufosinate có trong ngô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

– Đánh giá đặc điểm hình thái, chỉ tiêu nông sinh học chính và đa dạng di truyền ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RAPD của một số dòng ngô thuần mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô ưu

việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ

Phần II: Tổng QUAN Tμi Liệu 2.1 Giới thiệu về cây ngô

2.1.1 Vài nét sơ lược về cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ

Gramineae Từ thế kỷ 16 khi Colombus mang hạt giống từ châu Mỹ về thì sản

xuất ngô đã lan tràn khắp thế giới và trở thành loại cây ngũ cốc quan trọng cung cấp lương thực cho loài người Hiện trên thế giới đang tồn tại hai hệ thống phân

loại đối với loại Zea

Nhóm Euchleana

Z penrennis (Hitch) Reeves & Mangelsdorf

Z mexicana (Schrader) Kuntze

Z diploperennis Iltis Doebly & Guzman

Z perennis Hitch Reeves & Mangelsdorf

Nhóm Zea

Z mays subsp Parviglumis Iltis & Doebly Var Huchuetenangensis Iltis & Doebly Var Parviglumis Iltis & Doebly subsp Mexicana (Schrader) Iltis

Nòi Chalco Nòi Cao nguyên trung phần Nòi Nobogame

Z mays subsp mays

Từ loài Zea mays L, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt được phân thành các loài phụ, sau đó dựa vào màu hạt và màu lõi để phân các thứ (varieta)

Những loài phụ chính bao gồm:

Zea mays Subsp indurata - ngô đá

Zea mays Subsp indentata - ngô răng ngựa

Zea mays Subsp ceratina - ngô nếp

Zea mays Subsp saccharata - ngô nếp

Zea mays Subsp everta - ngô bột

Zea mays Subsp amylacea - ngô bột

Zea mays Subsp tunecata - ngô bọc

Ngô có nguồn gốc từ Trung Mỹ song cây ngô đã thích nghi nhanh với những điều kiện sinh thái rất khác nhau ở Bắc bán cầu, ngô có thể trồng ở Đan Mạch đến vĩ tuyến 55P

o

-56P

o

, còn ở Liên Xô cũ và Canada tới vỹ tuyến 58P

o

ở Nam bán cầu, ngô được trồng ở New Zealand đến vĩ tuyến 42P

o

-43P

o

(Humlam John, 1942, Necula GH và cs, 1957) Ngô cũng là cây trồng thích ứng rộng Theo Necula G H (1957) ngô có thể trồng ở độ cao 3900m Tuy nhiên càng xa khỏi xích đạo thì độ cao càng giảm Ví dụ như Peru (16P

o

nam) ngô trồng được ở

độ cao 3900m, ở Bắc Carolia (34P

o

-37P

o

bắc) trồng được ở 1200m, ở Châu á như thung lũng Kasmir ở 2000m, còn ở Châu Âu (khoảng 45P

o

-48P

o

bắc) ở độ cao 500-800m

Trên phạm vi thế giới, các nhà khoa học đã chia sinh thái cây ngô thành 4 vùng chính:

– Ôn đới

– Cận nhiệt đới

– Nhiệt đới cao (trên độ cao 2000m so với mặt biển)

– Nhiệt đới thấp (dưới 2000m)

Theo phân loại này, Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp Các bộ giống từ vùng nhiệt đới thấp biểu hiện sự thích ứng hơn cả thông qua khả năng chống chịu và năng suất, kể cả ở các thảo nguyên cao phía Bắc hoặc

vụ đông ở Đồng bằng Bắc Bộ

2.1.2 Nguồn gen và đa dạng di truyền cây ngô

Ngô là cây trồng được thu thập, mô tả và bảo tồn rất tốt từ các trung tâm

đa dạng di truyền Từ năm 1943, quỹ Rockefeller hợp tác với các nước Mỹ La tinh đã thu thập nguồn gen ngô từ những trung tâm đa dạng chính, tạo cơ sở cho

các tập đoàn ngô ở Mexico, Colombia và Brazil Ngày nay có khoảng 15.000 mẫu giống ngô đã được thu thập từ các nước khác nhau trên thế giới

ở Việt Nam, nguồn gen ngô được bảo tồn tại Viện nghiên cứu ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự do và 3.000 dòng [10]

Tập đoàn ngô Mexico – trung tâm xuất của ngô có sự đa dạng tối đa ở

đây có bốn nòi chính được xác lập đó là:

A Nhóm nòi bản địa cổ đại: Người ta cho rằng nhóm này xuất phát từ

ngô bọc nguyên thuỷ ở Mexico Các nòi ở nhóm này khác nhau bởi sự phát triển

độc lập ở những địa bàn và môi trường khác nhau tuy chúng cùng một tổ tiên

Bốn nòi chính trong nhóm này là Palomero toluqueno, Arrocillo amarillo,

Chapalote và Nal-tel

B Nhóm nhập nội tiền Columbus: Các nòi của nhóm này được nhập vào

Mexico từ Trung và Nam Mỹ vào thời tiền sử Bốn nòi này là: Cacahuacintle,

Harinoso de Ocho, Oloton và ngô ngọt

C Nhóm con lai tiền sử: Nhóm này bao gồm các nòi được coi là tạo ra từ

việc lai tạp giữa các nòi bản địa cổ đại với các nòi nhập nội tiền Columbus, hoặc giữa hai nhóm trên với Teosinte Hiện nay còn tám nòi là: Conico, Reventador,

Tablonicillo, Tehua, Tepecintla, Comiteco, Jala và Zapalote chico

D Nhóm hiện đại: Bao gồm các nòi phát triển gần đây và chưa đạt đến

trạng thái ổn định, tuy nhiên có những đặc điểm phân biệt xác định Có bốn nòi

được gọi là: Chalqueno, Celaya, Conico Norteno và Bolita

Từ đây ta thấy rõ sự biến dị to lớn đã được xảy ra như thế nào Đó là những nòi giống cơ bản sản sinh ra nguồn gen ngô thế giới và sự đa dạng di truyền của nó

Sự đa dạng di truyền của ngô được thể hiện ở tất cả các tính trạng của cây bông cờ và bắp ở các đặc điểm của cây, sự biến động thể hiện ở chiều cao cây, chiều cao đóng bắp và đặc điểm của lá (dài lá, chiều rộng lá, số lá trên cây, số lá

trên bắp), màu thân và dạng lóng Sự biến động ở cờ thể hiện ở độ dài bông cờ, cuống bông cờ, độ nhánh dài, số nhánh cấp hai và ba, đường kính bắp và số hàng hạt Đặc biệt sự biến động rất đa dạng ở nội nhũ hạt, từ đây ta phân biệt các dạng răng ngựa, đá rắn, bột, đường, nếp, nổ và bọc Sự biến động còn thể hiện ở kích thước hạt, màu hạt và chất lượng hạt

ở Việt Nam ngô là cây trồng nhập nội do vậy sự phong phú về nguồn gen

có hạn hẹp Theo các nghiên cứu phân loại ngô địa phương Việt Nam (GS.TS Ngô Hữu Tình, 1995) từ những năm 60 đến nay cho thấy, ngô Việt Nam tập trung chủ yếu vào hai loài phụ là đá rắn và nếp

Ngày nay để đánh giá sự đa dạng di truyền của một loài, người ta không chỉ dựa vào các đặc điểm thực vật học dễ nhận biết và riêng rẽ mà cần phân tích trên cơ sở nhiều tính trạng để phân biệt các nhóm cách biệt di truyền thông qua khoảng cách Ơclit hoặc khoảng cách Mahalanobis Gần đây công nghệ sinh học đã góp phần rất đắc lực trong việc xác định đa dạng di truyền thông qua kỹ thuật Isozyme hoặc “sự đa hình độ dài các phân đoạn cắt hạn chế” (RFLP – Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (Đa hình các đoạn khuếch

đại ngẫu nhiên)…

2.1.3 Đặc điểm hình thái cây ngô

Rễ: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ hòa thảo Ngô có

ba loại rễ chính: Rễ mầm, Rễ đốt (rễ phụ cố định), Rễ chân kiềng, chúng giúp cây ngô hút nước và các chất dinh dưỡng từ đất

Thân, lá: Ngô thuộc họ hòa thảo, song có thân khá chắc, có đường kính

từ 2-4cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc Thân có chiều cao khoảng 1,5-4m Thân ngô trưởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ Lá ngô được mọc từ các đốt của thân ngô, bẹ lá ôm chặt lấy thân và lưỡi lá (thìa lìa)

Bông cờ và bắp: Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc Hai cơ quan

sinh sản đực (bông cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây, song ở các vị trí khác nhau Hoa đực thường được gọi là bông cờ nằm ở đỉnh cây Hoa cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1-3 chồi khoảng giữa thân mới tạo thành bắp

Hạt: Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm năm phần chính: vỏ hạt, lớp

alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ hạt bao quanh hạt, là một màng nhẵn Lớp alơron nằm dưới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng Nội nhũ có hai phần: nội nhũ bột và nội

nhũ sừng Tỷ lệ này phục thuộc vào chủng ngô và các giống ngô khác nhau

2.1.4 Tình hình và định hướng phát triển cây ngô ở Việt Nam

ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, có sự phát triển rộng khắp, liên tục và đạt đỉnh điểm vào năm 2005 Theo “tổng quan nông nghiệp năm 2005” của Nguyễn Sinh Cúc (NN và PTNT – 1/2006) thì sản xuất ngô năm 2005 có tiến bộ vượt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, năng suất

đạt 35,5 tạ/ha và sản lượng đạt 3,69 triệu tấn, đã làm thay đổi tỷ trọng cơ cấu sản lượng thực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1]

Những tiến bộ về sản xuất ngô Việt nam thể hiện rất rõ nét trong giai

đoạn 20 năm thực hiện đường lối đổi mới của Đảng Trong suất 20 năm qua (1985-2004) diện tích, năng suất và sản lượng ngô Việt Nam tăng liên tục với tốc độ rất cao Tỷ lệ tăng trưởng bình quân hàng năm trong suốt 20 năm về diện tích là 7,5%/năm, năng suất 6,7%/năm và sản lượng là 24,5%/năm, cao hơn nhiều 10 năm trước đó khi đất nước ta thống nhất 1975-1985 (các tỷ lệ tương ứng giai đoạn này là 4,2%; 3,9% và 10,0%) Nếu chúng ta lấy số liệu tuyệt đối của 2 năm (1985) và sau 20 năm đổi mới (2004) thấy rằng diện tích ngô tăng 2,5 lần, năng suất 2,3 lần và sản lượng 5,9 lần [1]

Tuy nhiên, năng suất ngô của Việt Nam năm 2004 (34,9 tạ/ha) vẫn còn thấp hơn năng suất bình trung bình thế giới (48,5 tạ/ha), vẫn thấp hơn nhiều so với Mỹ (100,0 tạ/ha) và Trung Quốc (51,1 tạ/ha) song đã vượt được năng suất bình quân khối các nước đang phát triển (31,3 tạ/ha) Mặc dầu vậy, khách quan

mà nói: Sản xuất ngô Việt Nam trong thời kỳ đổi mới đã có sự phát triển vượt bậc, toàn diện và đáng trân trọng

2.2 Cây trồng biến đổi gen

2.2.1 Khái niệm về cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen hoặc cây trồng công nghệ sinh học là các cây trồng đã được biến đổi về mặt di truyền nhằm làm cho cây trồng mang một số

đặc tính quý giá mà cây trồng tự nhiên không có Công nghệ này cho phép các gen riêng biệt đã chọn lọc được chuyển từ một cơ thể này sang một cơ thể khác cũng như giữa các loài không có liên quan với nhau Các tính trạng thường được chuyển vào cây trồng như tính kháng côn trùng, kháng nấm bệnh, kháng vi khuẩn, kháng thuốc trừ cỏ, kháng mặn, cho năng suất cao, chất lượng sản phẩm tốt Đây là một phương hướng quan trọng giải quyết vấn đề an toàn lương thực cho nhân loại góp phần giảm thiểu các loại nông dược và phân bón hoá học, bảo

vệ môi trường sinh thái bền vững

Sự biến đổi về mặt di truyền thường bao gồm sự chèn đoạn ADN, tái tổ hợp những mảnh ADN nhỏ hơn vào trong hệ gen của cây trồng bị biến đổi Cấu trúc của gen chèn điển hình trong GMC (Genetically Modified Crops) được tạo nên bởi 3 bộ phận:

1 Đoạn promoter (đoạn khởi động) có chức năng điều khiển hoạt động của gen cấu trúc, nó được ví như chiếc công tắc bật/mở để đọc gen chèn vào

2 Gen đã được chèn (gen đã bị biến đổi) đây thực chất là một gen cấu trúc mã hoá cho đặc điểm đã chọn lọc riêng biệt

3 Đoạn terminator (đoạn kết thúc) có chức năng như một tín hiệu dừng

để đọc gen đã chèn

Ngoài ra một vài yếu tố khác có thể có mặt trong cấu trúc của đoạn ADN chèn và chức năng của chúng thường là để điều chỉnh và ổn định chức năng của gen hoặc là để chứng minh sự có mặt của cấu trúc ADN chèn trong GMC hoặc

để có sự kết hợp dễ dàng của các thành phần khác nhau trong cấu trúc đoạn ADN chèn Cấu trúc của đoạn ADN chèn phải tương hợp với hệ gen của cơ thể nhận để nó có sự di truyền ổn định

2.2.2 Những vấn đề liên quan đến cây trồng biến đổi gen

2.2.2.1 Lợi ích của cây trồng biến đổi gen

Thực trạng phát triển nhanh chóng của cây trồng biến đổi gen trong những năm qua đã chứng tỏ chúng có những mặt mạnh nổi trội hơn hẳn những cây trồng không biến đổi gen Sau đây là những lợi ích mà chúng đem lại cho con người trong thời gian kể từ khi cây trồng biến đổi gen đầu tiên xuất hiện cho

đến nay:

– Lợi ích trong nghiên cứu cơ bản: Việc sử dụng GMC đã góp phần to lớn trong việc phát hiện các gen quan trọng, xác định được chức năng của một gen bất kỳ

– Lợi ích trong cải tạo giống cây trồng: Nhờ có công nghệ gen mà nhiều giống cây trồng mới được tạo ra với các đặc tính không có ở cây trồng tự nhiên như khả năng chống chịu các điều kiện ngoại cảnh, chống chịu sâu bệnh, chống chịu thuốc diệt cỏ nhằm nâng cao sản lượng và chất lượng cây trồng

– Lợi ích trong chăn nuôi gia súc: Công nghệ chuyển gen thực vật đã tạo ra các loại thức ăn gia súc chứa các kháng thể đặc hiệu hay văcxin tái tổ hợp, làm tăng sức đề kháng của vật nuôi đối với bệnh tật, tạo ra các loại thức ăn có chất lượng dinh dưỡng cao

– Lợi ích trong công nghệ thực phẩm: Rất nhiều loại thực phẩm mới có chất lượng dinh dưỡng cao, mẫu mã đẹp, thời gian bảo quản lâu, hay làm thay đổi hàm lượng acid béo trong dầu thực vật nhằm làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch đã được tạo ra nhờ công nghệ chuyển gen thực vật

– Lợi ích trong công nghệ dược phẩm: Nhờ kỹ thuật ADN tái tổ hợp, người

ta có thể sản xuất ra các sản phẩm như các kháng nguyên, các protein người, hemoglobin, một số kháng thể từ cây trồng biến đổi gen

– Lợi ích về môi trường: Năng suất của cây trồng biến đổi gen cao hơn rất nhiều so với các cây trồng tự nhiên do đó sự phát triển của GMC sẽ làm giảm nhu cầu chuyển đổi đất rừng và đất ở thành đất nông nghiệp Làm giảm nhu cầu

sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc trừ cỏ, bón đạm như vậy sẽ làm giảm ô nhiễm nguồn nước và nguy cơ gây hại cho sức khoẻ con người

– Lợi ích về kinh tế: GMC đã và đang mang lại cho người nông dân nhiều lợi ích về kinh tế, nó làm giảm chi phí sản xuất, giảm sức lao động và tăng giá trị sản phẩm Năm 2007, doanh thu từ GMC đạt 6,9 tỷ USD và dự định năm

2008 là 7,5 tỷ USD [42]

– Lợi ích người tiêu dùng: Nhờ có công nghệ chuyển gen thực vật mà người tiêu dùng có thể có được các sản phẩm thực phẩm có lợi hơn đối với con người như các sản phẩm có chất lượng dinh dưỡng cao, có hương vị, có thời gian bảo quản lâu, hay được bổ sung một số chất như vitamin A, vitamin E [12, 20]

– Ngoài những lợi ích to lớn kể trên, khi đưa GMC ra ngoài môi trường người ta đặc biệt quan tâm đến những ảnh hưởng của nó đối với môi trường và

sự cân bằng hệ sinh thái Thực tế đã cho thấy cây trồng biến đổi gen có ích lợi tiềm tàng đối với môi trường Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi tự nhiên, sinh cảnh và các nguồn lợi bản địa, chúng góp phần giảm xói mòn đất, cải thiện chất lượng nước, cải thiện rừng và nơi cư ngụ của động vật hoang dại

2.2.2.2 Những rủi ro có thể có của cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính đã được cải biến nhằm mang lại những lợi ích tối đa cho con người nhưng khi đưa chúng ra môi trường tự nhiên và thương mại hoá chúng thì không thể không đánh giá những rủi ro có thể xảy ra Những rủi ro này thường được xem xét ở một số khía cạnh chính sau:

– Hiểm hoạ cỏ dại: Khả năng xảy ra là các gen mới trong GMC có thể chuyển sang cây họ hàng sống hoang dã ngoài tự nhiên theo phương thức lan truyền hạt phấn, cũng như khả năng tao ra những loại cỏ mới, kháng thuốc trừ

cỏ hay kháng côn trùng [5]

– Khả năng kháng sâu: Cây trồng kháng sâu có khả năng tiêu diệt các loài sinh vật không phải là sinh vật cần diệt làm ảnh hưởng đến chuỗi thức ăn tự nhiên, ảnh hưởng đến sự đa dạng sinh học

– Nguy cơ phát sinh các mầm bệnh: Một nguy cơ tiềm tàng khác là khả năng tái tổ hợp của một gen virus sẵn có trong GMC với các gen từ một virus khác nhiễm vào cây đó và tạo ra một virus mới [5]

– Sự kháng kháng sinh: Do các GMC thường được chuyển các gen quy định tính trạng kháng kháng sinh, vì thế gây ra mối lo lắng rằng liệu các gen này có thể được phát tán từ GMC sang các vi sinh vật cư trú trong ruột người và làm chúng tăng khả năng đề kháng đối với kháng sinh Tuy nhiên người ta thấy rằng mối nguy cơ này xảy ra với xác suất vô cùng nhỏ và nếu có xảy ra thì tác động này cũng không đáng kể vì gen chỉ thị được sử dụng trong GMC được ứng dụng rất ít trong thú y và y học [12]

2.2.2.3 Vấn đề an toàn và những quy định về quản lý cây trồng biến đổi gen

Mặc dù GMC đang được thương mại hoá có nhiều đặc tính ưu việt hơn so với các cây trồng cùng loại nhưng do mới xuất hiện nên người ta chưa đánh giá hết được những ảnh hưởng bất lợi của chúng Vì vậy yêu cầu đặt ra khi thương mại hóa GMC và sản phẩm của chúng là chúng ta phải đặt vấn đề xem xét về mức độ an toàn của các sản phẩm này lên hàng đầu Vì thế bất kỳ một sản phẩm chuyển gen nào trước khi được đưa ra thị trường phải được thử nghiệm toàn diện, được các nhà khoa học và giám định viên đánh giá độc lập xem có an toàn hay không về mặt dinh dưỡng, độc tính, khả năng gây dị ứng và các khía cạnh khoa học thực phẩm khác Những đánh giá về an toàn thực phẩm này dựa trên

những quy định của từng quốc gia Chúng bao gồm: một hướng dẫn sử dụng sản phẩm, một thông tin chi tiết về mục đích sử dụng sản phẩm, các thông tin về phân tử, hoá sinh, độc tính, dinh dưỡng, khả năng gây dị ứng

Do những rủi ro và những lo ngại bất thường xung quanh quá trình biến

đổi di truyền mà việc bắt buộc dán nhãn các sản phẩm GMC đã trở thành một yêu cầu và là quy định của nhiều quốc gia Việc dán nhãn GMC cho phép người tiêu dùng lựa chọn sản phẩm theo phong tục, tôn giáo, chế độ ăn hàng ngày của

họ vì nhiều tôn giáo không thích sử dụng các sản phẩm được tạo ra nhờ sự biến

đổi di truyền

2.2.3 Tình hình sản xuất, sử dụng cây trồng biến đổi gen trên thế giới

Sau khi những kết quả nghiên cứu đầu tiên về cây trồng biến đổi gen được công bố những năm 80 thế kỷ XX, sự phát triển của cây trông biến đổi gen có những bước đột phá quan trọng về những kết quả nghiên cứu và ứng dụng chúng vào sản xuất:

Năm 1994, lần đầu tiên FDA (Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ) chấp nhận thực phẩm được tạo ra bằng CNSH là cà chua Năm 1996, cây trồng biến đổi gen thực sự bùng nổ với sự ứng dụng rộng rãi trong sản xuất Năm 1997, cây trồng biến đổi gen lần đầu tiên được thương mại hóa, diện tích cây trồng biến đổi gen thương mại hoá đạt gần 11 triệu hecta (chủ yếu là Mỹ, Achentina, Auxtralia, Canada, Trung Quốc và Mehico) Năm 2000, diện tích cây trồng biến đổi gen đạt 44,2 triệu ha trên 13 nước Năm 2001, chèn thành công gen đơn từ Arabidopsis vào cây cà chua để tạo ra cây trồng đầu tiên có thể trồng trên đất và nước mặn Năm 2002, tổng giá trị thị trường toàn cầu của cây trồng biến đổi gen ước tính đạt khoảng 4,5 tỷ USD Năm 2004, diện tích cây trồng biến đổi gen đạt con số 81 triệu hecta Năm 2005 diện tích cây biến đổi gen đã đạt 90 triệu hecta, diện tích cây trồng biến đổi gen đã tăng hơn 50 lần trong thập kỷ đầu tiên cây biến đổi gen được trồng đại trà, số nước trồng cây biến đổi gen tăng lên tới 21 nước Năm 2007 diện tích cây CNSH tiếp tục tăng 2

con số, đạt 12% tương đương với 12,3 triệu hecta (30 triệu mẫu) Diện tích đất canh tác cây CNSH lên tới 114, 3 triệu hecta [42]

Tổng diện tích đất trồng cây CNSH từ năm 1996 đến năm 2007 đạt 690 triệu hecta (1,7 tỷ mẫu), tăng 67 lần so với năm 1996, đưa CNSH trở thành thành tựu được ứng dụng nhanh nhất trong nông nghiệp Năm 2007 cũng là năm đầu tiên tổng luỹ kế số nông dân quyết định canh tác cây trồng CNSH vượt con số 50 triệu người [42]

Hình 1: Diện tích cây trồng CNSH trên toàn cầu 1996-2007 (triệu ha)

Từ năm 1996 đến năm 2007, tỉ trọng diện tích trồng cây CNSH của các nước đang phát triển so với diện tích trồng trên toàn thế giới tăng đều mỗi năm Năm 2007, 43% diện tích cây trồng CNSH trên toàn cầu là ở các nước đang phát triển (tăng 3% so với tỷ trọng 40% năm 2006), tương đương với 49,4 triệu hecta Trong khoảng thời gian từ 2006 đến 2007, diện tích trồng cây CNSH ở các nước

đang phát triển (8,5 triệu ha hay 21%) tăng cao hơn so với các nước công nghiệp (3,8 triệu ha hay 6%) Đáng chú ý là có 5 nước lớn và đang phát triển đưa cây trồng CNSH vào canh tác, nằm ở 3 châu lục: Trung Quốc và ấn Độ ở Châu á, Achentina và Braxin ở châu Mỹ Latinh, Nam Phi ở châu Phi; tổng dân số ở cả 5

quốc gia này là 2,6 tỉ người, chiếm 40% dân số thế giới, trong đó có 1,3 tỉ người sống hoàn toàn dựa vào nông nghiệp

Bảng 1: Diện tích trồng cây CNSH năm 2007 phân theo nước (đ/v: triệu ha)

TT Nước trồng Diện tích trồng Loại cây biến đổi gen

1* Hoa Kỳ 57.7 Đậu tương, ngô, bông, cải, đu đủ, cỏ alfalfa 2* Achentina* 19.1 Đậu tương, ngô, bông

* 13 nước được coi là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 héc-ta trở lên

Trong số các cây trồng CNSH được đưa vào thương mại hoá từ năm 1996

đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội Năm 2007, tính trạng chịu được thuốc trừ cỏ được triển khai trên cây đậu tương, ngô, cải canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích

đất trồng cây CNSH toàn cầu) Năm 2007, Hoa Kỳ, Achentina, Braxin, Canada,

ấn Độ và Trung Quốc tiếp tục là các nước đưa cây trồng CNSH vào canh tác

nhiều nhất Hoa Kỳ vẫn dẫn đầu thế giới với 57,7 triệu hecta (chiếm 50% diện tích đất trồng cây CNSH trên thế giới), do nhu cầu ngày càng tăng của thị trường ngô dùng trong sản xuất cồn ethanol, diện tích trồng ngô CNSH tăng tới 40% - mức tăng này đã phần nào bù lại mức giảm đôi chút đối với diện tích trồng đậu tương và bông CNSH Đáng chú ý là 63% ngô CNSH, 78% bông CNSH và 37% các loại cây CNSH khác ở Hoa Kỳ là các sản phẩm mang gien độn (các sản phẩm tập hợp nhiều đặc tính) có chứa hai hay ba đặc tính và đem lại nhiều lợi ích trên một cây trồng Xu thế của tương lai là sử dụng những loại cây trồng CNSH mang gien độn kiểu này nhằm đáp ứng nhu cầu của nông dân và người tiêu dùng

Như vậy, trên thế giới tình hình phát triển của cây trồng biến đổi gen rất mạnh mẽ, nó đã đem lại rất nhiều lợi ích cho con người, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp: cây trồng biến đổi gen cho phép tạo ra nhưng cây trồng cho năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn

2.2.4 Tình hình sản xuất và sử dụng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam

Hiện nay ở nước ta lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, đặc biệt

là cây trồng biến đổi gen đang được tiếp cận, đầu tư và triển khai nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng đặc biệt Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng như năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu đã được phân lập và nghiên cứu nhằm chuyển vào cây trồng để tạo nên những giống lý tưởng CNSH Việt Nam nói chung và lĩnh vực cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bước phát triển đáng chú ý:

Đã thành công trong việc phân lập đoạn promoter đặc trưng hạt của gen Gluteline lúa và thiết kế các gen Cry Xa21 vào Plasmid pCAMBIA nhằm làm chủ nguồn gen có giá trị để tạo ra chủng vi khuẩn Agrobacterium cho việc chuyển gen vào thực vật Hoàn thiện quy trình chuyển gen CryIA(b), CryIA(c) kháng côn trùng, gen Chitinase kháng bệnh nấm, gen Xa21 kháng bệnh bạc lá

vi khuẩn và gen Bar kháng thuốc diệt cỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào cây lúa giống C71, giống DT10 và DT13, cây cải dầu và bắp cải

Đối với cây lúa, đã tạo được lúa biến đổi gen giống Nàng Hương Chợ Đào

và 2 dòng cây biến đổi gen GUS A và hph

Kết quả đã thu được những cây trồng biến đổi gen và lưu giữ chúng trong

điều kiện invitro và trong điều kiện nhà kính

2.3 Cây ngô biến đổi gen

2.3.2 Tình hình sản xuất cây ngô biến đổi gen trên thế giới

Trên thế giới thì diện tích cây ngô biến đổi gen là lớn thứ 2 sau đậu tương với diện tích 25,2 triệu ha chiếm 25% diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới Cây ngô biến đổi gen được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Achentina, Brazin, Canada, China, Nam Phi, Uruguay, Philippin…Cây ngô chủ yếu được nghiên cứu, sản xuất và sử dụng giống có tính trạng chống chịu thuốc trừ cỏ, kháng sâu, chịu hạn

Năm 2006, thêm một số nước thuộc liên minh Châu Âu (EU) lần đầu tiên

đưa ngô Bt vào trồng đại trà Tổng diện tích trồng ngô Bt ở 5 nước (Pháp, Cộng Hoà Séc, Bồ Đào Nha, Đức và Slovakia) đã tăng trên 5 lần từ xấp xỉ 1.500 ha năm 2005 lên gần 8.500 ha năm 2006, diện tích này còn tăng lên rất nhiều trong năm 2007

Ngô là cây trồng được các quốc gia trên thề giới cấp phép sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhiều nhất với tổng số 35 giống khác nhau, vượt hẳn cây trồng đứng thứ 2 là bông (với 19 giống khác nhau) Giống ngô được cấp phép nhiều nhất là ngô kháng sâu bệnh (MON 810) và ngô kháng thuốc trừ cỏ (NK603), cả hai giống ngô được 18 nước cấp phép

Năm 2006, theo ước tính của hãng phân tích thị trường Cropnosis, thị trường cây trồng biến đổi gen toàn cầu trị giá khoảng 6,15 tỷ đô la, chiếm 16% thị trường cây trồng được bảo hộ trên toàn cầu và chiếm 21% thị trường hạt

giống toàn cầu Trong đó giá trị của ngô biến đổi gen chiếm 39% tương đương khoảng 2,39 tỷ đô la

Do đặc tính sinh lý của cây ngô nên tỷ lệ đạt kết quả nghiên cứu chuyển gen trong cây ngô trên thế giới là rất cao và đạt độ an toàn cao nhất so với các loại cây trồng biến đổi gen trên thế giới Như vậy, với việc đưa cây ngô biến đổi gen vào sản xuất đã góp phần ổn định lương thực trên thế giới trong hiện tại và trong tương lai

2.3.3 Tình hình sản xuất và sử dụng cây ngô biến đổi gen tại Việt Nam

Việt Nam là một quốc gia với nền kinh tế nông nghiệp chủ yếu Ngô là một trong những cây lương thực đóng vai trò quan trọng Vì vậy, việc nghiên cứu cây ngô biến đổi gen đang được đầu tư mạnh mẽ

Vào ngày 5/09/2005 thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành trồng thử nghiệm hai loại bắp chuyển gen trên diện tích 1.000 mP

2

đất ở Q.12 Hai loại ngô chuyển gen nói trên là hai loại ngô đã được chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu [41]

Kết quả từ việc trồng thử nghiệm bắp chuyển gen sẽ được so sánh với các giống bắp thông thường hiện đang được trồng tại thành phố Hồ Chí Minh Trên cơ sở đó, các nhà khoa học sẽ đề xuất nên hay không nên ứng dụng trồng ngô chuyển gen ở Việt Nam

Đặc biệt mới đây, đề tài/dự án tạo ngô biến đổi gen kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ được nghiên cứu tại viện Di Truyền Nông Nghiệp do TS Nguyễn Văn Đồng chủ nhiệm đề tài, mục tiêu là tạo dòng ngô kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ có năng suất cao và thích nghi tốt với các vùng sinh thái khác nhau Đây

là đề tài/dự án thuộc chương trình trọng điểm “Phát triển ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp” thực hiện từ tháng 10 năm 2006

2.4 Những vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ và một số dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ

2.4.1 Một số vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ

Khi được hỏi, bất cứ người nông dân nào cũng trả lời rằng cỏ dại luôn là một vấn đề gây lo lắng cho họ Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy nước, chất dinh dưỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để mọc mà còn là nơi cư trú cho côn trùng và các loại sâu bọ gây bệnh, gây tắc nghẽn hệ thống tưới tiêu, làm giảm sút chất lượng mùa màng, và còn đem theo cả hạt giống cỏ vào cây trồng được thu hoạch

Thông thường, nông dân sẽ cày bừa trước khi trồng trọt nhằm làm giảm

số lượng cỏ dại trên cánh đồng Sau đó họ phun thuốc diệt cỏ theo diện rộng để làm cho cỏ dại không thể mọc được ngay trước khi geo hạt Biện pháp diệt cỏ này rất tốn kém và việc cày xới đất sẽ khiến gió và nước làm xói mòn lớp đất phía trên bề mặt gây hậu quả nghiêm trọng kéo dài cho môi trường Ngoài ra, một số thuốc diệt cỏ lại tồn tại dai dẳng trong môi trường Sự tạo thành các cây trồng kháng thuốc diệt cỏ là một cách để khắc phục các yếu điểm đó

Một số cải biến sinh học khác nhau có thể làm cho cây trồng trở nên kháng thuốc diệt cỏ có thể nêu ra là:

– Tạo ra một loại protein mới giải độc thuốc diệt cỏ

– Thay đổi protein mục tiêu của thuốc diệt cỏ do vậy mà protein này sẽ không bị tác động bởi thuốc diệt cỏ

– Sản xuất quá mức protein mục tiêu nhạy cảm thuốc diệt cỏ sao cho vẫn có dư để duy trì các chức năng tế bào bất chấp sự có mặt của thuốc diệt cỏ

– Cho cây khả năng bất hoạt về mặt chuyển hoá thuốc diệt cỏ

Ba cách đầu tiên là những cách phổ biến nhất mà các nhà khoa học dùng

để phát triển loại cây trồng chịu được thuốc diệt cỏ (bảng 2)

Trong số các cây trồng CNSH được đưa vào thương mại hóa từ năm 1996

đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội Năm 2007, tính trạng chịu được thuốc trừ cỏ được triển khai trên cây đậu tương, ngô, cải canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích đất trồng cây CNSH toàn cầu) Các giống phổ biến nhất là chịu được thuốc

glyphosate và glufosinate [42] Bảng dưới đây cho thấy các nước đã chuẩn y các loại cây trồng chịu được thuốc diệt cỏ chính dùng làm thực phẩm

Bảng 2: Một số ví dụ về sự kháng thuốc diệt cỏ

Thuốc diệt cỏ Cơ chế phát triển tính kháng thuốc diệt cỏ

Tính kháng thuốc là do sự thay đổi gen psbA mã hoá

cho đích của thuốc diệt cỏ, protein lục nạp D-1

Các gen mã hoá các dạng kháng của enzym axetolactat synthetaza đã được đưa vào lúa, cây dương, cây lanh, cây cải dầu

Các giống có các dạng enzym axetolactat synthetaza kháng đã được chọn lọc trong nuôi cấy mô

Các thuốc diệt cỏ này kìm hãm enzym axetyl coenzym

A carboxylaza Sự kháng được chọn lọc trong nuôi cấy mô, có được là do enzym thay đổi không nhạy cảm thuốc diệt cỏ hoặc phân huỷ thuốc diệt cỏ

Tính kháng do sản xuất quá mức EPSPS, đích của thuốc diệt cỏ này Tính kháng thuốc được cải biến bằng biến nạp đặc trưng với gen EPSPS kháng glyphosat và thuốc lá với gen glyphosat oxidoreductaza mã hoá enzym phân huỷ glyphosat

Cây bông và thuốc lá có tính kháng được tạo thành bằng

biến nạp với gen tfdA từ Alcaligenes mã hoá

dioxygenaza phân huỷ chất diệt cỏ này

Hơn 20 loại cây khác nhau đã được biến nạp với gen bar

từ Streptomyces hygroscopicus hoặc gen pat từ S

Viridochromogenes Phosphinothrixin axetyltransferaza

mà các gen này mã hoá khử độc thuốc diệt cỏ này

Cây trồng Nước

Canola Ôxtralia, Canađa, Nhật bản, Hoa kỳ, Achentina

Bông Achentina, Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ

Ngô Achentina, Ôxtralia, Canađa, Liên minh Châu âu, Nhật

Bản, Thuỵ sỹ, Anh, Hoa kỳ

Đậu tương Achentina, Ôxtralia, Braxin, Canađa, Nhật Bản, Hàn

Quốc, Mêxicô, Hà Lan, Nga, Nam Phi, Thuỵ sỹ, Hoa

kỳ, Uruguay

Củ cải đường Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ

2.4.2 Một số gen kháng thuốc trừ cỏ Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT), Bar

™ Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT)

Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) là một trong những gen kháng thuốc trừ cỏ đã được chuyển vào một số cây trồng như ngô và đậu tương Gen này chống chịu được với thuốc trừ cỏ glufosinate, được phân lập từ một loại xạ khuẩn đất Streptomycesviridochromogenes Gen PAT cho phép sản sinh ra enzyme phosphinothricine N-acetyltransferase (PAT), enzym này có khả năng chống chịu được glufosinate

™ Gen Bar

Gen Bar là một trong các gen kháng thuốc trừ cỏ ammonium-glufosinate (hay phosphinothricin) Ammonium-glufosinate là thành phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, Finale, Buster, Harvest và Liberty, đây là loại thuốc trừ cỏ

có hệ thống phân loại rõ nét mà nó đã được sử dụng rộng rãi để kiểm soát không chọn lọc đối với các loài cỏ dại 1 năm và lâu năm, là chất diệt cỏ có phổ rộng và

được sử dụng để kiểm soát vùng cỏ dại rộng lớn trong quá trình canh tác Glufosinate là hợp chất tự nhiên được phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức

chế hoạt tính của enzym tổng hợp glutamin, enzym cần thiết cho sự tạo thành glutamin và độc tính ammonia Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật Điều này làm cho quá trình quang hợp ngừng và cây chết sau vài ngày

Gen Bar mã hoá cho enzym phosphinothricin- N- acetyltransferase (PAT)

được phân lập từ chủng Streptomyces hygroscopicus HP632 Ngoài việc cung cấp tính trạng kháng thuốc trừ cỏ, gen mã hoá enzym PAT còn được sử dụng như marker chọn lọc để xác định các cây đã chuyển gen trong suốt quá trình tái sinh nuôi cấy mô làm cho thành phần hoạt tính trong thuốc trừ cỏ glufosinate là phosphinothricin không hoạt động, cho phép các cây trồng sống sót trong khi

mà ứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết

2.4.3 Một số dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ

™ Event Bt16

Phương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen

Dòng Bt16 được cải biến di truyền để kháng thuốc trừ cỏ glufosinate (hay phosphinothricin), thμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, Finale, Buster, Harvest vμ Liberty Ammonium-glufosinate lμ một chất diệt cỏ có phổ rộng, không chọn lọc Nó được sử dụng để kiểm soát cỏ dại sau khi cây mọc hoặc kiểm soát thảm thực vật mọc trên đất mμ chúng không sử dụng cho mục đích gieo trồng Nó có thể bị vi khuẩn phân huỷ ở mức độ cao, không có hoạt tính dư thừa, vμ mức độ độc tính đối với con người vμ động vật

ammonium-rất thấp Khả năng chống chịu glufosinate trong dòng nμy lμ do gen bar, gen

nμy mã hoá cho enzym phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) mμ cho phép các cây trồng nμy sống sót trong khi mμ ứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết

Hình 2: Cấu trúc pDPG165 sử dụng trong biến nạp event Bt16

™ Event GA21

Phương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen

Dòng GA21 lμ ngô Roundup Ready, chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate Glyphosate lμ 1 loại thuốc trừ cỏ được biết sau nμy, đây lμ loại thuốc trừ cỏ có

hệ thống phân loại rõ nét mμ nó đã được sử dụng rộng rãi để kiểm soát không chọn lọc đối với các loμi cỏ dại 1 năm vμ lâu năm Dòng GA21 có khả năng kháng thuốc trừ cỏ nhờ chuyển gen EPSPS nội sinh của ngô vμo genome của cây, enzym mã hoá của gen nμy không nhạy với sự khử hoạt tính bởi glyphosate

Hình 3: Đoạn ADN của cấu trúc pDPG434 sử dụng trong biến nạp để tạo

ra event GA21

™ Event T14, T25

Phương pháp chuyển nạp: Chuyển ADN trực tiếp vμo genome của cây

T14 vμ T25 đã được cải biến di truyền để chống chịu ammonium glufosinate (phosphinothricin), thμnh phần hoạt tính của các loại thuốc trừ cỏ của các hãng Basta, Finale, Buster, Harvest vμ Liberty Tính kháng thuốc trừ cỏ ammonium glufosinate có được lμ do gen PAT

Hình 4: Plasmid p35S/Ac đã được sử dụng để tạo ra event T14, T25

™ Event TC1507

Phương pháp biến nạp: Chuyển nạp nhờ súng bắn gen

TC1507 được cải tiến di truyền để kháng côn trùng vμ thuốc trừ cỏ glufosinate Dòng nμy chứa gen cry1F - lμ protein cry1F của côn trùng có nguồn

gốc từ B thuringiensis var aizawai Protein nμy có hiệu quả trong việc kiểm

soát ấu trùng của nhiều loμi sâu bọ phổ biến ở ngô chẳng hạn như sâu đục thân ngô Châu Âu, sâu đục thân ngô Tây Bắc, sâu ngμi đen, sâu cắn gié Dòng TC1507 có khả năng chống chịu ammonium glufosinate lμ do chuyển gen PAT vμo genome của dòng nμy

Hình 5: Plasmid PHI8999A đã được sử dụng để tạo ra event TC1507 2.5 Các phương pháp phát hiện cây trồng biến đổi gen

Việc nhận biết GMC có rất nhiều ứng dụng như để đánh giá mức độ sạch của Cây giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia

Có rất nhiều kỹ thuật đã và đang được phát triển để đáp ứng nhu cầu này Nhận biết GMC và dẫn xuất của nó có thể được thực hiện nhờ sự nhận biết phân tử mà những phân tử này có nguồn gốc từ gen được chèn [13, 14] Có 3 phương pháp

để xác định GMC đó là:

1 Phương pháp khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotit:

Bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleic (NASBA), các kỹ thuật RFLP, AFLP, RAPD

- Dựa trên cơ sở ARN: Nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và

phân tử ADN hoặc ARN tổng hợp (gọi là primer) Thường thì sự liên kết giữa ARN và primer sẽ dẫn đến sự chuyển hoá phân tử ARN thành ADN thông qua quá trình sao chép ngược Cuối cùng ADN có thể được nhân lên nhờ kỹ thuật PCR Hoặc ARN được phiên mã thành hàng trăm bản coppy như là một mẫu chuẩn trong kỹ thuật NASBA [13]

- Dựa trên cơ sở ADN: Chủ yếu là nhờ vào sự nhận đôi của ADN đặc

hiệu với kỹ thuật PCR Đây là kỹ thuật được sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệm bởi đó là một phương pháp nhạy và có tính đặc hiệu cao, có thể phát hiện được ADN ngay ở hàm lượng rất thấp Kỹ thuật PCR không những được sử dụng để xác định GMC mà còn được sử dụng vào mục đích định lượng

2 Phương pháp dựa trên cơ sở protein:

Bao gồm điện di SDS một chiều, điện di SDS hai chiều, phân tích Western-blot, kỹ thuật ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assays) Là phương pháp nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa protein và kháng thể Kháng thể chính là tác nhân bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và virus, khi kháng thể nhận ra phân tử lạ thì nó sẽ liên kết với phân tử này và trong các phân tích nhận biết GMC thì sự phức tạp của mối liên kết lần lượt được nhận biết nhờ phản ứng hình thành sắc tố Đây chính là kỹ thuật ELISA Tuy nhiên kháng thể

có thể không được sinh ra nếu không nhận được protein sạch Protein này phải

được làm sạch ngay từ bản thân GMC hoặc có thể được tổng hợp trong thư viện nếu như biết thành phần của acid amin của protein Phương pháp này thích hợp với việc phân tích đối với nguyên liệu thô [13, 19]

3 Phương pháp dựa trên sự phát hiện hoạt tính của enzym:

Phương pháp này không thích hợp với các thực phẩm đã qua chế biến bởi vì lúc này protein đã bị biến tính [17]

Cho đến nay các phương pháp chính để phát hiện GMC và các dẫn suất của nó chủ yếu dựa trên sự phát hiện ADN, trong khi chỉ có một vài phương pháp được phát triển để phát hiện ARN hoặc protein

2.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng PCR để xác định cây trồng biến đổi gen

Rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để xác định GMC đã được tiến hành Kỹ thuật PCR cũng đã được ứng dụng rất nhiều để phát hiện ngô GM

và đậu tương GM Để nhận biết đậu tương Roundup Ready GM và ngô Bt 176, các nhà khoa học Đài Loan đã sử dụng các cặp mồi 35S, NOS, EPSPS và LE để phát hiện đoạn promoter 35S, đoạn terminator NOS, vùng gen cấu trúc EPSPS (enolpyruvyl Shikinate-3-phosphate Synthase) của đậu tương Roundup Ready và gen lectin Sử dụng các cặp mồi Cry IA(b), CDPK-cry, IVR để nhận biết gen Delta-Endotoxin (đoạn 184 bp và 211bp) và gen Invertase trong ngô Bt 176

Cũng với 2 đối tượng nghiên cứu trên và sử dụng các cặp mồi 35S1/2, SPA/B, LE1/2, Cry1/2, IVR1/2, một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Anh

về khả năng nhận biết ngô GM và đậu tương GM trong thực phẩm nhờ PCR cũng đã được chấp nhận [15] Một ứng dụng khác của PCR là định lượng GMC cũng đã được các nhà khoa học Argentina nghiên cứu thử nghiệm trên đối tượng

là ngô Bt 176 ở nghiên cứu này, các mẫu ngô GM được trộn lẫn với ngô không biến đổi gen ở các tỷ lệ khác nhau (0,5%, 1%, 2%, 5%, 20%) và nghiên cứu này cho thấy ở hàm lượng GMC lớn hơn 5% cho phản ứng dương tính [14]

2.7 Đa dạng di truyền

Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen (genom) khác nhau Sự

đa dạng về bộ gen có được là do các cá thể có các gen khác nhau, dù chỉ là rất

ít Những alen khác nhau của một gen có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và đặc

điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau Những cây trồng được lai

ghép hay những động vật được lai tạo phát huy những gen của mình để hình thành những giống cây con cho năng suất cao, có khả năng chống chịu sâu bệnh, cỏ dại tốt

Trong quá trình sinh sản hữu tích, kiểu gen của các cá thể trong quần thể

sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp hoặc do đột biến

Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sựu tồn tại các kểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể này thích nghi hơn so với những thay đổi của môi trường

2.7.1 ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và rất quan trọng đối với con người Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả các sinh vật để duy trì khả năng sinh sản, khả năng đề kháng với các loại dịch bệnh và khả năng thích nghi với những thay đổi của môi trường sống Sự đa dạng di truyền ở cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc bệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con người

2.7.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

2.7.2.1 Phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái

Các chỉ tiêu hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm Tuy nhiên, những đặc tính hình thái được sử dụng như là một chỉ thị di truyền là những tính trạng do một locus gen quy định và sự thể hiện của chúng không bị

ảnh hưởng của nhân tố môi trường Trong trường hợp này dấu chỉ tiêu hình thái

– Các chỉ tiêu hình thái thể hiện những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Paterson., 1996)

2.7.2.2 Phương pháp sử dụng các chỉ thị phân tử

™ Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):

Phương pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt giới hạn) do Botstein và cs, phát minh năm 1980 Nguyên lý của phương pháp này là: ADN của bộ gen sau khi được xử lý bằng enzym giới hạn sẽ bị cắt thành những đoạn

có kích thước khác nhau Sau khi điện di, các đoạn này phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này sẽ trở thành sợi đơn và được chuyển lên màng celulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi Trong quá trình lai ADN tiếp theo trên mẫu dò (thực chất là một đoạn ADN) sẽ bắt cặp với những đoạn có trình tự nucleotic tương đồng với nó trên màng lai – kỹ thuật lai Southern Khi phân tích đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thể được thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng lai

™ Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction):

Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN

Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu,

ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP vμ ion MgP

2+

hoạt động như một chất xúc tác

Phản ứng PCR gồm các giai đoạn sau:

– Giai đoạn biến tính (Denaturation): Hỗn hợp phản ứng được làm nóng

– Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ của giai đoạn này phải thích hợp cho quá trình bắt cặp bổ sung của mồi với chuỗi ADN khuôn, nó nhỏ hơn

Tm của 2 đoạn mồi khoảng 2-3P

o

C Tại đây, các đoạn mồi sẽ gắn bổ sung với trình tự bổ trợ trên các phân tử ADN khuôn Thời gian của giai đoạn này thường kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

– Giai đoạn tổng hợp (Extention): Nhiệt độ ở giai đoạn này được tăng lên

đến nhiệt độ thích hợp cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp nên sợi mới từ phức hợp mồi-khuôn Đối với Taq ADN polymerse thì nhiệt độ hoạt động tối ưu

o

C trong khoảng 5-10 phút để tất cả các sợi ADN được tổng hợp xong và các sợi

đơn ADN xoắn lại tạo sản phẩm PCR Cuối cùng, nhiệt độ được hạ xuống 4P

hệ thống chỉ thị đặc trưng gồm chỉ thị RAPD, SSR, AFLP…

Hình 6: Các giai đoạn của một chu kỳ PCR

™ Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphism ADN)

RAPD (Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) được định nghĩa là sự

đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên PCR_RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các mồi đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch

đối diện của mạch khuôn ADN trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn ADN có kích thước khác nhau sau khi khuếch

đại Sản phẩm thu được là tập hợp đa dạng các dòng đoạn ADN đặc trưng cho mỗi loài thậm trí cho mỗi cá thể William và cộng sự (1990)

Theo lý thuyết 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotid thì xác suất bắt gặp bằng 1/4P

10

= 1/1.048.576, nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp nucleotic có một trình tự bắt cặp với mồi Như vậy, với một đoạn mồi ngẫu nhiên có thể có 524 vị trí bắt cặp mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN được nhân bội Trong thực tế số lượng các đoạn được nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ thuộc vào độ dài đoạn được nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADN của bộ gen

Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp

để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là

2+

và chất lượng ADN bản mẫu), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu 2 cá thể có

bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR_RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho băng ADN giống nhau Nếu chúng ít nhiều có sự khác nhau