ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC (DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP) VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR ) MERR )

CacĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --- ---CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ KHÁNG V

CacĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

-CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA

VÀ KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC

(DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP)

VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR.) MERR.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

-CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA

VÀ KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC

(DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP)

VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR.) MERR.)

Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Kim Trâm

ThS Trần Trúc Thanh

TPHCM, tháng 01 năm 2021

MỤC LỤC

I Mở đầu 2

1.1 Lý do chọn đề tài 2

1.2 Mục tiêu đề tài 3

1.3 Đối tượng và phạm vi đề tài 3

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 4

II Nội dung nghiên cứu 8

III Phương pháp nghiên cứu 9

3.1 Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm in vitro của cao chiết Huyết giác Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep và Bồ kết Gleditsia fera (Lour.) Merr 9

3.2 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa 9

3.3 Định lượng các hợp chất trong cao chiết 12

3.3.1 Tổng hàm lượng Polyphenol 12

3.3.2 Tổng hàm lượng Flavonoid 14

3.4 Đánh giá khả năng gây độc của tế bào: Phương pháp MTT 17

3.5 Đánh giá khả năng tiết NO 19

IV Dự kiến nội dung luận văn 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

I Mở đầu

I.1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, là nước có khí hậu nhiệt đới giómùa, nóng và ẩm Với đặc điểm khí hậu như vậy nên dẫn đến khả năng mắc các bệnhnhiễm trùng nặng do viêm là rất cao

Ngày nay, với sự phát triển của Y học, nhiều loại thuốc kháng viêm đã được nghiêncứu và ứng dụng rộng rãi, tuy nhiên đa số các loại thuốc kháng viêm thì có nguồn gốc

là tổng hợp hóa dược Các loại thuốc kháng viêm được sử dụng trong điều trị thuộc hainhóm có bản chất là steroid và không steroid Chúng mang lại hiểu quả cao trong điềutrị nhưng cũng có các tác dụng không mong muốn như làm suy giảm miễn dịch, teo cơ,xốp xương, loét dạ dày, tá tràng, … nếu sử dụng trong thời gian dài Vì vậy, việc tìmkiếm những loại thuốc kháng viêm có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên đóng vai tròquan trọng như một giải pháp sinh học an toàn thay thế cho các loại thuốc kháng viêmtổng hợp

Việt Nam được đánh giá là một quốc gia có tiềm năng lớn về dược liệu trong khu vựcĐông Nam Á và trên toàn thế giới Với nguồn dược liệu phong phú, đa dạng, theothống kê của Viện Dược liệu, Việt Nam ghi nhận có trên 5000 loài thực vật và nấm,

408 loài động vật và khoảng 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc Điều này chothấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam, có thể sử dụng trong nghiên cứusàng lọc tìm ra các chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có nhóm chất chốngviêm mới có hiệu quả không gây các phản ứng phụ

Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy các hợp chất kháng oxy hóa tự nhiên có thể ngănngừa một số bệnh như ung thư, tim mạch, suy giảm hệ thần kinh và lão hóa sớm –những căn bệnh có nguyên nhân do stress oxy hóa (sự mất cân bằng giữa các gốc tự do

và hoạt động của các chất chống oxy hóa trong cơ thể) gây ra Polyphenol là nhóm chấtđược quan tâm với các đặc tính sinh học như khả năng kháng oxy hóa, chống viêm,chống dị ứng và khả năng kháng khuẩn [1]

Do đó, chuyên đề luận văn “Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm in vitro

của cây Huyết giác (Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep) và Bồ kết (Gleditsia

fera (Lour.) Merr.)” nhằm góp phần đánh giá và tìm hiểu tiềm năng kháng oxy hóa,

định lượng một số hợp chất phổ biến trong cao chiết thu được và khả năng điều trịkháng viêm in vitro của cây Huyết giác và Bồ kết

Ý nghĩa khoa học của đề tài

 Kết quả là tiền đề cho các nghiên cứu về ứng dụng dược liệu trong các hợp chấtkháng oxy hóa và điều trị viêm trong tương lai

 Khẳng định tiềm năng từ nguồn dược liệu quý của Thế giới nói chung và ViệtNam nói riêng, vì vậy cần được tiến hành nghiên cứu thêm và khai thác nguồndược liệu quý này một cách hiệu quả

I.2 Mục tiêu đề tài

 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Huyết giác Dracaenae

cambodianae Pierre ex Gagnep và Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.)

 Định lượng một số hợp chất trong cao chiết Huyết giác Dracaenae

cambodianae Pierre ex Gagnep và Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.):

I.3 Đối tượng và phạm vi đề tài

Cao chiết từ cây Huyết giác giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep và Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.) được cung cấp từ Khoa Dược – Đại học Y dược thành

phố Hồ Chí Minh Được tách chiết với dung môi dichloromethane và methanol Đượcbảo quản trong điều kiện -20℃C

Tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 (Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM –Phòng Công nghệ Sinh học Y Dược cung cấp) được nuôi cấy môi trường DMEM + 5%FBS + 1% kháng sinh Penicillin + Steptomycin (PS) Được bảo quản trong nitơ lỏng

I.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Huyết giác là loại dược liệu có từ lâu đời và được lưu truyền qua các bài thuốc dângian dùng để chữa các bệnh như: chống đông máu, chống tiêu chảy, kháng khuẩn,kháng viêm, tái tạo cơ,… Mặc dù được biết đến lâu đời nhưng vẫn chưa có nhiềunghiên cứu về tác dụng dược lý của Huyết giác cũng như thành phần có trong câyHuyết giác [2]

Một trong các hợp chất chủ yếu có trong Huyết giác được quan tâm là phenolic vàflavonoid Theo J Sung và các công sự thì thành phần flavonoid có trong cây Huyếtgiác có hiệu quả tiềm năng đối với các bệnh như tim mạch, giảm đau, kháng viêm, …[3]

Năm 2003, Zheng và các cộng sự của mình đã tìm ra 2 hợp chất glycoside pregnane

mới và đặt tên là dracaeenoside C và D được tách chiết từ thân của cây D.

cochinchinensis với cấu trúc lần lượt là 3β, 14α – dihydroxypregna – 5, 16 (17) – diene

– 20 – one 3 – O – α – L – rhamnopyranosyl (1->2)[α – L - rhamnopyranosyl (3->4)] –

β – D – glucopyranoside và 3β, 14α – dihydroxypregna – 5, 16 (17) – diene – 20 – one

3 – O – α – L – rhamnopyranosyl (1->2)[β – D - rhamnopyranosyl (3->4)] – β – D –glucopyranoside [4]

Năm 2005, Gurgel và các cộng sự của mình đã thực hiện nghiên cứu “Hoạt tính kháng

nấm in vitro của cây Huyết giác từ Croton urucurana đối với các loại nấm trên da”.

Kết quả của nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ vỏ cây Huyết giác được thu nhận từCroton urucurana Bali có hoạt tính kháng nấm tương đối với các loại khuẩn gây bệnh

da liễu như Tricophyton amidan, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum,

Microsporum canis và Epidermophyton floccossum [5].

Năm 2008, Nguyễn Hải Đăng và các công sự của mình đã tách chiết được hợp chấtmới đặt tên là dracagenin A (1), 25S – namogenin B (2) và spriroconazole A (3) từ

thân cây D cambodianae Các hợp chất trên được đánh giá về khả năng kháng nấm cho kết quả lần lượt là hợp chất (1) và (3) ức chế hoạt động đối với Aspergilus niger với giá trị MIC là 50 µg/ml, nhưng không có tác dụng ức chế đối với F oxysporum, S.

cerevisiae và C albicans Đặc biệt hợp chất (3) có khả năng gây độc đối với các dòng

tế bào ung thư Hep – 2, Lu và RD với giá trị IC50 lần lượt là 2.002, 4.727 và 4.029µg/ml [6]

Năm 2010, Y Luo và các công sự đã đánh giá khả năng kháng oxy hóa các phân đoạn

Hexan, ethyl acetate n – BuOH, nước cũng như 9 hợp chất phân tách được từ cây D.

cambodianae Pierre ex Gagnpep bằng các phương pháp thử nghiệm gốc tự do DPPH,

ABTS+ và anion Superxide Kết quả cho thấy những hợp chất này có khả năng chốngoxy hóa và có thể được sử dụng làm chất chống oxy hóa tự nhiên [7][8]

Năm 2011 Y Luo và các cộng sự tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của cây D.cambodiana đã phát hiện ra 3 dẫn xuất flavonoid mới (1 – 3) và 6 hợp chất đã biết (4 –9) Tất các hợp chất này đều được đánh giá khả năng gây độc trên các dòng tế bào K –

562, SMMC – 7721 và SGC – 7901, cũng như đánh giá hoạt động kháng khuẩn như:

Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) Kết quả

thu được các hợp chất 1, 2, 5, 7 và 9 cho thấy gây độc với các dòng tế bào K – 562,SMMC – 7721 và SGC – 7901 Tất cả các hợp chất điều cho thấy khả năng kháng

khuẩn với S aureus, riêng các hợp chất từ 1 – 4, 6, 8, và 9 cho thấy khả năng kháng

khuẩn với MRSA [9]

Hình 1.1 Thành phần hóa học của cây D cambodia [9]

Năm 2013, W Mei và các cộng sự đã tìm ra 2 dẫn xuất flanovoid mới đặt tên lần lượt

là cambodianin G và cambodianin H Cả hai hợp chất được đánh giá khả năng khángkhuẩn và gây độc trên tế bào K – 562 và SGC – 7901 Kết quả thu được cho thấy cả 2

hợp chất điều cho khả năng kháng khuẩn với S aureus và khả năng gây độc trên 2

dòng tế bào K – 562 và SGC – 7901 [10]

Ngày nay các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên trên thế giới và Việt Nam ngày càngphát triển, góp phần làm đa dạng về bản chất, công dụng và tính năng của nguồn dượcliệu thiên nhiên, làm tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu, tiềm năng ứng dụng vàchế tạo các loại thuốc điều trị mới

Từ lâu cây Bồ kết đã được sử dụng phổ biến trong đời sống với nhiều mục đích khácnhau Các công trình nghiên cứu về những loài trong chi Gleditsia trên thế giới đã được

quan tâm từ rất sớm Tuy nhiên, đối với nghiên cứu về cây Bồ kết Gleditsia fera

(Lour.) Merr trên thế giới cũng như ở Việt Nam vẫn còn hạn chế, bởi vì loài này chỉ

phân bố ở một số khu vực Dưới đây là một vài nghiên cứu tiêu biểu trong những năm

gần đây liên quan đến chi Gleditsia trên thế giới và Việt Nam.

Năm 2007, Li WH và các cộng sự đã phân lập được 1 triterpenoid và 4 steroids từ G.

sinensis LAM trong đó triterpenoid C – friedous – 7 – en – 3 – on đã được tìm thấy

trong nguồn gốc tự nhiên [8]

Nhóm chất flavonoid lớn nhất được tìm thấy trong chi Gleditsia là flavone glycoside Năm 2007, 3 hợp chất flavones đã đợc phân lập từ G sinensis bởi Zhou và cộng sự.

Trong một nghiên cứu khác được thực hiện bởi Mohammed và cộng sự đã phân lậpđược 8 hợp chất flavone glycoside và 2 flavone aglycone từ chiết xuất ethanol của lá

G triacathos Ngoài ra trong nghiên cứu này còn phát hiện các hợp chất phenolics như

ethyl gallate, caffeic acid, dihydrokaempferol, eridictyol, quercetin, 3,3’,5’,5,7 –pentahydroflavonone và (-) – epicatechin Cũng trong năm đó, 2 ellagic acid glycoside

từ gai của G sinesis LAM cũng được tìm thấy là 3 – O – methylellagic acid – 4’ acetyl) – alpha – L – arabinofuranoside và 3 – O – methylellagic acid – 4’ – O – alpha– L – rhamnopyranoside Cả 2 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này [11]

–(5’’-Vũ Mạnh Hùng và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu tác dụng kháng

khuẩn in vitro và in vivo của BK01 chiết từ Bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.)” vào

năm 2014, cho thấy ở in vitro BK01 có tác dụng kháng khuẩn mạnh ở các nồng độ tương đối thấp với các chủng vi khuẩn đã thử là trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas

aeruginosa), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), Escherichia coli và Bacillus subtilis In vivo được thử nghiệm trên vết bỏng thực nghiệm ở da thỏ, BK01 có tác

dụng kháng khuẩn tương đối tối, có tác dụng ở ngày thứ 14 sau khi bị bỏng cho thấy tốthơn thuốc đối chứng là sulfadiazin 1% là thuốc chữa bỏng tại chổ thường dùng tronglâm sàng [12]

Năm 2016, J Zhang và các cộng sự đã tìm thấy hơn 60 hợp chất bao gồm triterpenes,

sterol, flavonoid, alkaloid, phenolic được phân lập từ G japonica Miq., G sinensis Lam., G caspica Desf và G triacanthos L Các chiết xuất từ chi này cho thấy có các

hoạt tính sinh học đa dạng như kháng viêm, giảm đau, có khả năng kháng oxy hóa, có

tác dụng gây độc đối với tế bào ung thư, ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư, … Trong

đó saponin triterpenoid là thành phần chính của chi Gleditsia có nhiều triển vọng trong

tương lai, cần được quan tâm và nghiên cứu thêm về đặc tính dược lý nhiều hơn như làtác dụng giảm đau, chống ung thư của hợp chất saponin [13]

II Nội dung nghiên cứu

Pierre ex Gagnep và Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.).

Gagnep và Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.).

III Phương pháp nghiên cứu

III.1 Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm in vitro của

cao chiết Huyết giác Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep và Bồ kết Gleditsia fera (Lour.) Merr.

Hình 1.2 Quy trình chung đánh giá khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm in vitro

của cao chiết

III.2 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa

Phương pháp thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH

Phương pháp khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do DPPH [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α,

α diphenyl-β-picrylhydrazyl)] lần đâu tiên được đưa ra bởi Blois (1958) và sau đó được

Đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT

Đánh giá khả năng tiết NO

Nuôi cấy tế bào RAW 264.7Dịch chiết dược liệu

Đánh giá

hoạt tính

kháng oxy hóa

Định lượng các hợp chất sinh học

nghiên cứu phát triển hơn bởi nhiều nhà khoa học khác Đây là một trong các phươngpháp thường được sử dụng để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của thực vật.

Nguyên tắc:

Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen,làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạtdần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Hình 1.3 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH

Hình 1.4 Quy trình thực hiện phương pháp bắt gốc tự do DPPH

Pha mẫu ở các nồng độ 400,

200, 100, 50 và 25 µg/ml

Ủ trong tối Nhiệt độ phòng

Mẫu cao/ Vitamin C (𝜇l) EtOH (𝜇l) DPPH (𝜇l)

Bảng 1.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm DPPH

Hút 100 𝜇l dịch chiết, sau đó thêm 100 𝜇l dung dịch DPPH 0.3 mM, ủ trong điều kiệntối 30 phút trên máy lắc Sau đó tiến hành do độ hấp thu quang học ở bước sóng 517nm

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:

DPPH(%) = 100x(ACT – ASP)/ACT

Trong đó:

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của từng mẫu cao chiết được đánh giá dựa vào giátrị IC50 Giá trị IC50 là nồng độ cao chiết tại đó ức chế được 50% gốc tự do DPPH Giátrị này càng nhỏ, thể hiện khả năng kháng oxy hóa càng mạnh

III.3 Định lượng các hợp chất trong cao chiết

III.3.1 Tổng hàm lượng Polyphenol

Polyphenolic là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và toàn tại trong thực vật đã đượcchứng minh có khả năng kháng oxy hóa vô cùng hiệu quả Polyphenolic có thể bảo vệ

cơ thể, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau do gốc tự do gây ra Đặc điểmchung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzen) chứa một hay nhiềunhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng thơm Tùy thuộc vào số lượng và vị trítương hỗ của các nhóm OH với bộ khung hóa học mà các tính chất lý hóa học hoặchoạt tính sinh học thay đổi

Tổng hàm lượng Polyphenol được phân tích bằng phương pháp Folin - Ciocalteu vớimột số sửa đổi

Nguyên tắc:

Trong thành phần của thuốc thử Folin Ciocalteu có phức phospho – wolfram phosphomalypdat Phức này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenol tạo thành sản phẩmphản ứng có màu xanh thẫm, do các nhóm –OH trong phenolic sẽ được chuyển thànhnhóm quinol tạo thành phức hợp có màu Cường độ màu của hỗ hợp phản ứng tỉ lệthuận với nồng độ phenolic Căn cứ vào cường độ màu được đo ở bước sóng 760 nm

-và phương trình đường chuẩn của acid Gallic với thuốc thử có thể xác định được hàmlượng polyphenol tổng số trong mẫu [14]