MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như: Tách chiết gen PCR Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai Lai p

GVHD: Trần Thị DungSVTH: Nguyễn Thị Hoàng Yến 61103239

Nguyễn Văn Cư 61103020Huỳnh Thị Mai Thy 61103315

MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN

PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Mục lục:

• 1.Nguyên lý.

• 2.Nguyên tắc.

• 1.Tạo mẫu dò nhờ Plasmid

I Giới thiệu về phương pháp

Southern blot

Phương pháp lai Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của

tế bào với mẫu dò DNA Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự

có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào

Southern blot - một kĩ thuật chủ yếu trong việc

phân tích cấu trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do Edwin Southern ở MRC một bộ phân của genome động vật hữu nhũ ở

Edinburgh (Southern, 1975)

Edwin Southern

Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số

kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như:

Tách chiết gen

PCR

Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai

Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu)

…

Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ yếu bao gồm:

Tăng độ nhạy

Giảm một số bước trong quá trình lai

Giảm thời gian thực hiện

Vẽ kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn rất nhiều.

II Nguyên lý và Nguyên tắc

Dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa

các cặp nucleotide: A-T, G-C ( các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung).

Màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận

DNA

Màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận

DNA

“Probe”, Probe được đánh

dấu.

Đòi hỏi một đọan DNA (RNA) đã biết trình tự để làm mồi

“Probe”, Probe được đánh

dấu.

Các vật liệu, trang thiết bị máy móc

chính xác:

màng lai, máy Blotting,

buồng lai, máy PCR

Các vật liệu, trang thiết bị máy móc

chính xác:

màng lai, máy Blotting,

buồng lai, máy PCR

III Tạo mẫu dò (probe)

Tạo mẫu dò nhờ Plasmid

 Cắt plasmid và DNA đã

tách chiết từ tế bào bởi cùng một loại enzyme

 Gắn DNA vào plasmid

trong điều kiện môi trường phù hợp

 Thực hiện biến nạp vào

trong tề bào vi khuẩn

 Nhân các tế bào vi kuẩn và

 Gắn DNA vào plasmid

trong điều kiện môi trường phù hợp

 Thực hiện biến nạp vào

trong tề bào vi khuẩn

 Nhân các tế bào vi kuẩn và

 Biến tính mẫu DNA thành các sợi đơn

 Gắn mồi vào các sợi đơn

 Tổng hợp các sợi DNA mới

 Biến tính để tách các chuỗi mới vừa tổng hợp thành các sợi đơn

 tiếp tục quay về gắn mồi vào các sợi đơn

Đánh dấu mẫu dò

Gồm có 4 phương pháp:

1 Phương pháp Nick-translation

2 Phương pháp random priming

3 Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide

4 Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)

1 Phương pháp Nick-translation

 DNAse I tạo các khía trên DNA ở nhiều vị trí ngẫu nhiên khác

nhau

 DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’, cắt mạch

DNA theo chiều 5’-3’ theo các khía đã tạo sẵn, đồng thời, tổng hợp bù đoạn thiếu với sự tham gia của nucleotide đánh dấu (thường là dATP)

 Kết quả là DNA được đánh dấu.

2 Phương pháp random priming

 DNA kép được biến tính bằng nhiệt thành 2 mạch đơn.

 Hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp được thêm vào, trở

thành mồi (primer) cho DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung

 Một trong 4 loại nucleotide bổ sung vào được đánh dấu, nên 2

mạch mới tổng hợp cũng được đánh dấu

3 Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide

Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi

được đánh dấu ở đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với sự hiện diện của một nucleotide đánh dấu Sau phản ứng các nuclotide tự do cũng được loại bỏ bằng sắc kí lọc gel, sắc kí lỏng cao áp (HPLC),…

4 Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)

 Trước hết, trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải

được đưa vào một vector có mang các promoter

 Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA

polymerase thích hợp được thêm vào phản ứng cùng với các nucleotide đánh dấu

 RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từ

promoter, tạo ra một lượng lớn RNA đánh dấu

 Sau phản ứng, vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I

phân hủy, các enzyme được loại bỏ qua tách chiết bằng

phenol và RNA được tinh sạch trên sắc kí lọc gel

IV Quy trình của phương pháp

Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose

DNA kép được xử lý với kiềm (NaOH 0.4M), biến tính thành DNA mạch đơn ngay trên gel.

•Kiềm giúp cho cực âm của gốc thymine trong DNA gắn kết với cực dương của gốc amino có trong màng, biến tính DNA mạch kép thành DNA mạch đơn, đồng thời, loại tất cả các RNA còn sót lại

•Chỉ có DNA đơn mới có thể được chuyển lên màng lai.

Giai đoạn 2

Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai (màng nylon hoặc nitrocellulose)

Nguyên tắc của quá trình:

Là sự mao dẫn của dung môi (thường là NaOH/NaCl)qua lớp gel từ nơi có thế nước cao sang nơi có thế nước thấp, mang theo DNA đính lên màng lai được sắp xếp ngay trên lớp gel.Quá trình này diễn ra trong vài giờ hoặc có thể dùng thiết bị thấm hút chân không

Tương tác ion giữa màng lai (tích điện dương) và DNA (tích điện âm) tạo lực hút, gắn kết các DNA lên màng lai

Trong quá trình chuyển, vị trí các DNA không thay đổi

Màng lai sau quá trình trên, được xử lý nhiệt (80 0 trong 2 giờ) hoặc chiếu tia UV (vài phút) để cố định DNA trên màng .

Cách tiến hành:

 Đặt gel lên giá chuyển máy Bloting để chuyển nguyên vẹn các sợi DNA biến tính

 Dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0.4M

 Màng lai sẽ giữ cố dịnh các đoạn DNA được chuyển lên

từ gel điện li

Giai đoạn 3

Lai các DNA cố định trên màng lai với các mẫu

dò (probe) có đánh dấu phóng xạ ( 32 P), biotin hoặc mẫu dò phát quang sinh học Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung của các

probe với DNA cố định

Lai các DNA cố định trên màng lai với các mẫu

dò (probe) có đánh dấu phóng xạ ( 32 P), biotin hoặc mẫu dò phát quang sinh học Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung của các

probe với DNA cố định

Sau quá trình lai, màng lai được rửa để loại các probe không bắt cặp chuyên biệt với

DNA trên màng

Sau quá trình lai, màng lai được rửa để loại các probe không bắt cặp chuyên biệt với

DNA trên màng

Cuối cùng, nhờ kĩ thuật phóng xạ

tự ghi (đối với probe đánh dấu

phóng xạ), phương pháp so màu

(với probe đánh dấu bằng biotin)

hay dựa vào sự phát quang (với

các probe phát quang sinh học) để

định vị DNA-probe

Cuối cùng, nhờ kĩ thuật phóng xạ

tự ghi (đối với probe đánh dấu

phóng xạ), phương pháp so màu

(với probe đánh dấu bằng biotin)

hay dựa vào sự phát quang (với

các probe phát quang sinh học) để

định vị DNA-probe

IV Ứng dụng

Southern blot được sử dụng để đánh giá bản copy của gen

trong genome, xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm hoặc mất đoạn…

Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể

phân biệt được các loài, các loài đồng hình

Southern blot – RFLP : giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các

đoạn cắt bởi RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các RE dẫ đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA tạo ra từ RE đó Đòng thời RFLP còn sử dụng để xác định huyết thống, lập bản đồ giới hạn gene

Truy tìm tội phạm dựa vào dấu vết hiện trường.

Chuẩn đoán bệnh thai nhi.

Tài liệu tham khảo:

• Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương

• www.Wikipedia.org

THE END THANKS FOR WATCHING !