Sản xuất glycoprotein trị liệu trong tế bào động vật có vú

Tế bào CHO được sử dụng rộng rãi để sản xuất glycoprotein vì vô số lợi thế: Tế bào CHO sản xuất glycoprotein tái tổ hợp giống với glycans người Tế bào CHO sản xuất glycoprotein tái tổ hợ

Trang 1

Lê Xuân Nhật Vinh

Trang 2

NỘI DUNG:

5 Quan điểm “Omics”

2 Tế bào vật chủ

Trang 3

1 Giới thiệu:

Rất nhiều loại protein tái tổ hợp đã được sản xuất thông qua

hệ thống biểu hiện tế bào động vât có vú

Trang 4

Glycosyl hóa liên kết N và liên kết O trên protein liên kết

màng sinh chất.

Glycosyl hóa có thể ảnh hưởng

đến quá trình tổng hợp protein tái

tổ hợp

Tăng tính ổn định và thời

gian bán hủy của protein

trong tuần hoàn máu

Tăng tính ổn định và thời

gian bán hủy của protein

trong tuần hoàn máu

Giảm khả năng sinh miễn

dịch của protein

Giảm khả năng sinh miễn

dịch của protein

Trang 5

Các tế bào CHO lai xa là dòng

tế bào được sử dụng phổ biến nhất

• Đa số được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng (mAbs)

Trang 6

Hệ thống biểu hiện được sử dụng để sản xuất glycoprotein trong

ngành dược phẩm sinh học

Trang 7

2 Tế bào vật chủ:

2.1 Tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc:

Trang 8

Tế bào CHO được sử dụng rộng rãi để sản xuất glycoprotein vì vô

Phát triển được trong các môi trường nuôi cấy không có huyết thanh

Trang 9

Tế bào CHO được sử dụng rộng rãi để sản xuất glycoprotein vì vô

số lợi thế:

Tế bào CHO sản xuất glycoprotein tái tổ hợp giống

với glycans người

Tế bào CHO sản xuất glycoprotein tái tổ hợp giống

với glycans người

Có khả năng chống lại sự lây nhiễm của virus ở người, điều này giúp giảm thiểu rủi ro về an toàn

Trang 10

Một số glycoprotein trị liệu được Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) và Cơ quan Thuốc Châu Âu (EMA) phê duyệt:

Một số kháng thể đơn dòng

Siltuximab

(SYLVANT®)

Rituximab (RITUXAN®)Pertuzumab

(PERJETA®)

Trang 11

Một số glycoprotein trị liệu được Cơ quan Thực phẩm và Dược

phẩm Mỹ (FDA) và Cơ quan Thuốc Châu Âu (EMA) phê duyệt:

Chất hoạt hóa plasminogen mô

tPa, ACTILYSE®,

ACTIVASE®

Human DNAse (PULMOZYME®)

Trang 12

Một số glycoprotein trị liệu được Cơ quan Thực phẩm và Dược

phẩm Mỹ (FDA) và Cơ quan Thuốc Châu Âu (EMA) phê duyệt:

Kháng thể đơn dòng được sử dụng để điều trị đa u tủy, hen

suyễn và tăng cholesterol máu

Kháng thể đơn dòng được sử dụng để điều trị đa u tủy, hen

suyễn và tăng cholesterol máu

Daratumumab

(DARZALEX®)

Evolocumab / Alirocumab (REPATHA® /

PRALUENT®)

Mepolizumab (NUCALA®)

Trang 13

Hạn chế

Không thể tạo ra một số loại glycosyl hóa ở người (α-2,6-sialylation và α-1,3 / 4-fucosylation)

Tế bào CHO không sản xuất được axit N-glycolylneuraminic và galactose-α1,3-galactose ở người

Có khả năng hạn chế đối với các protein tái tổ hợp gamma-carboxylate như các yếu tố đông

máu

Có khả năng hạn chế đối với các protein tái tổ hợp gamma-carboxylate như các yếu tố đông

máu

Trang 14

2.2 Các dòng tế bào của người:

Các dòng tế bào người được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất glycoprotein trị liệu là tế bào HEK293 và HT-1080, có nguồn gốc từ thận và u xơ của phôi thai người

Trang 15

Drotrecogin alfa (Xigris®) là glycoprotein trị liệu đầu tiên được sản xuất nhờ tế bào người (HEK293)

Trang 16

Một số glycoprotein được sản xuất bằng công nghệ kích hoạt gen

trong tế bào HT-1080

Velaglucerase alfa (VPRIV®)

Trang 17

Ưu điểm của các sản phẩm được sản xuất bằng HT-1080

Các cấu hình glycan đa dạng, tính ổn định và

hiệu quả tương tự nhau

Các cấu hình glycan đa dạng, tính ổn định và

hiệu quả tương tự nhau

Các kháng thể kháng Imiglucerase trung hòa

được quan sát thấy ở 24% bệnh nhân

Các kháng thể kháng Imiglucerase trung hòa

được quan sát thấy ở 24% bệnh nhân

Trang 18

rFVIIIFc (ALPROLIX®) và rFIXFc (ELOCTATE®) là các protein được sử dụng để ngăn ngừa các đợt chảy máu ở những người mắc bệnh máu khó đông A và B.

Chúng bao gồm các miền của protein FVIII và FIX được hợp nhất với phần Fc của IgG1.

Các glycoprotein này được sản xuất trong HEK293 làm cho quá trình sulfat hóa tyrosine và axit glutamic γ-carboxyl hóa lớn hơn so với tế bào CHO

Cấu trúc của rFVIIIFc

Trang 19

Dulaglutide (TRULICITY®) là một protein dung hợp Fc

khác được sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường tuýp

2, được sản xuất trong các tế bào HEK293-EBNA1

Trang 20

Human-clrhFVIII (NUWIQ®), một yếu tố đông máu thay thế cho bệnh rối loạn ưa chảy máu A Nó được sản xuất trong dòng tế bào HEK293-F.

Trang 21

Ngoài ra còn một số dòng tế bào người hiện đang được sử dụng

trong các giai đoạn phát triển tiền lâm sàng và lâm sàng để sản xuất glycoprotein tái tổ hợp

Tế bào PER.C6: các nguyên bào võng mạc phôi người được biến đổi với trình tự mã hóa E1A và E1B của

CL184

Trang 22

2.3 Các dòng tế bào động vật có vú (không phải người) khác:

 Tế bào thận của Hamster Baby

(BHK) chủ yếu được sử dụng cho

sản xuất vaccine

• Hiện chỉ có hai glycoprotein tái

tổ hợp được bán trên thị trường

được sản xuất trong các tế bào

này, Yếu tố VIIa và Yếu tố VIII

Trang 23

 Tế bào u tủy Murine, có nguồn

gốc từ các tế bào khối u không

còn sản xuất các globulin miễn

dịch ban đầu của chúng

• Được sử dụng để sản xuất một

số kháng thể đơn dòng

thương mại như Cetuximab và

Palivizumab

• Ba đơn dòng trị liệu mới kháng

thể được tạo ra trong tế bào

chuột Dinutuximab,

Necitumumab và Elotu-zumab

• Murine tế bào có thể tạo ra

α-gal và Neu5Gc cao hơn tế bào

chuột lang, làm tăng nguy cơ

sinh miễn dịch

Tế bào Murine

Trang 24

2.4 Các dòng tế bào không phải động vật có vú và các hệ thống biểu hiện khác:

Vi khuẩn Tế bào nhanh tăng trưởng và năng suất cao

Nhưng protein thường tổng hợp lại và phải được chiết xuất từ các cơ quan bao

gồm, do sự vắng mặt của protein

chaperonCác enzym có sẵn không bị glycosyl hóa như asparaginase và collagenase

Trang 25

Nấm men Phân chia nhanh chóng và tạo ra sản lượng cao

Sản xuất glycoprotein với cấu trúc glycans mannose cao, có thể gây miễn dịch và ít hơn tiềm năng trong con

người

Phương pháp trị liệu từ

hệ thống biểu hiện nấm men là ocriplasmin và catridecagog

Trang 26

Tế bào thực vật và côn trùng

Cả hai có thể tạo ra các protein tái tổ hợp với các glycans phức tạp, nhưng với cấu trúc hoàn

toàn khác với cấu trúc của con người

Cả hai có thể tạo ra các protein tái tổ hợp với các glycans phức tạp, nhưng với cấu trúc hoàn

toàn khác với cấu trúc của con người

Trang 27

Thực vật Tạo ra cốt lõi α1,3-fructose và β1,2-xylose

Cả tế bào thực vật và côn trùng đều thiếu dư lượng axit

sialic trên glycans của chúng

Cả tế bào thực vật và côn trùng đều thiếu dư lượng axit

sialic trên glycans của chúng

Trang 28

3 Kĩ thuật tế bào:

Sản xuất glycoprotein hiện được thực hiện nhờ sự biểu

hiện gen nhất thời hoặc ổn định trong tế bào

Trang 29

Khi nhu cầu tiếp cận nhanh chóng và tiết kiệm, biểu hiện nhất thời vẫn là lựa chọn tốt

nhất để sản xuất protein

Khi nhu cầu tiếp cận nhanh chóng và tiết kiệm, biểu hiện nhất thời vẫn là lựa chọn tốt

nhất để sản xuất protein

Bỏ qua quá trình chọn lọc kéo dài đối với các

tế bào đã tích hợp plasmid trong bộ gen của chúng (hiện tượng chuyển nhiễm nhất thời)

Bỏ qua quá trình chọn lọc kéo dài đối với các

tế bào đã tích hợp plasmid trong bộ gen của chúng (hiện tượng chuyển nhiễm nhất thời)

Trang 30

• Hiệu quả của giai đoạn chuyển nạp

• Độc tính tế bào của thuốc thử chuyển gen

• Tính rộng rãi của chiến lược cho ăn được áp dụng cho nuôi cấy sau khi chuyển gen

Tốc độ sản xuất

phụ thuộc vào

nhiều yếu tố

Trang 31

Trong quá trình chuyển nhiễm nhất thời, DNA plasmid chủ yếu được giữ ngoài nhiễm sắc thể, các tế bào nhanh chóng mất nó trong quá trình phân chia, do đó hạn chế số lượng protein biểu

hiện

Trong quá trình chuyển nhiễm nhất thời, DNA plasmid chủ yếu được giữ ngoài nhiễm sắc thể, các tế bào nhanh chóng mất nó trong quá trình phân chia, do đó hạn chế số lượng protein biểu

Trang 32

Khi nói đến sản xuất glycoprotein với số lượng lớn, hệ thống biểu hiện gen ổn định vẫn là con đường được ưu

tiên

Khi nói đến sản xuất glycoprotein với số lượng lớn, hệ thống biểu hiện gen ổn định vẫn là con đường được ưu

tiên

Trang 33

Sự gấp và tiết protein

Tích hợp gen điểm đươc nhắm mục tiêu (recombinase, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9

Tăng trưởng

và tăng sinh

tế bào

ACE (Biểu hiện nhiễm sắc thể nhân tao) PiggyBac TM

Các yếu tố điều tiết biểu sinh tác động cis (S/MAR, UCOE, STAR)

Phân tử nhỏ (VPA, NaB, chất ức chế deacetylase

Hạ thân nhiệt (30-32 0 C)

Kiểm soát tăng sinh tế bào(E2F-1, c- myc, mTOR, mir-17, p27, p21

Màng túi buôn

Chaperones (PDI, BiP, HSP)

Con đường UPR (phản ứng protein

mở ra)

Các chiến lược kỹ thuật tế bào được phát triển để cải thiện năng suất và quá trình glycosyl

hóa

Quy định về gen apoptosis (caspases, bak, Bax)

Biểu hiện quá mức của các gen chống apoptosis (Bcl-

Trang 34

plasmid vào bộ gen của chúng

Gen chỉ thị thường tích hợp trong plasmid biểu hiện cùng cDNA mã hóa gen quan tâm

 lợi thế chọn lọc cho các tb tích hợp

plasmid vào bộ gen của chúng

Số bản sao của plasmid tích hợp cũng như

vị trí tích hợp trong bộ gen vật chủ  yếu

tố quan trọng của biểu hiện gen ổn định

Số bản sao của plasmid tích hợp cũng như

vị trí tích hợp trong bộ gen vật chủ  yếu

tố quan trọng của biểu hiện gen ổn định

Trang 35

Hai hệ thống lựa chọn thường được sử dụng trong dược phẩm sinh học

Glutamine synthetase (GS) Dihydrofolate

reductase (DHFR)

Trang 36

Glutamine synthetase (GS)

● GS là một loại enzym xúc tác quá trình tổng hợp glutamine từ

glutamate và amoniac bằng cách sử dụng thủy phân ATP thành ADP và phosphate để thúc đẩy phản ứng Nó là enzym duy nhất

có thể tổng hợp glutamine de novo

Trang 37

Glutamine synthetase (GS)

 Hệ thống ban đầu được thiết kế để sử dụng trong các dòng

tế bào không sản xuất đủ GS để hỗ trợ tăng trưởng

 Các dòng tế bào NS0 và Sp2/0 biểu hiện không đủ hàm

lượng GS mặc dù có gen GS

 Tuy nhiên, đối với tế bào CHO, cần bổ sung methionine

sulfoximine (MSX) kết hợp với loại bỏ glutamine trong môi trường, giúp ức chế hoạt động của glutamine synthetase nội sinh và có đủ áp lực chọn lọc

Trang 38

DHFR là một enzyme xúc tác quá trình khử dihydrofolate thành tetrahydrofolate, một chất dẫn proton cần thiết cho quá trình tổng hợp de novo của purin

Dihydrofolate reductase (DHFR)

Trang 39

Dihydrofolate reductase (DHFR)

được lựa chọn để thiếu hụt DHFR

chịu áp lực chọn lọc và khuếch đại gen với nồng độ methotrexate ngày càng tăng để ức chế hoạt động của enzym DHFR, kết hợp với sự vắng mặt của tiền chất nucleotide trong môi trường

Trang 40

3.2 Biểu hiện gen:

● Một vấn đề vẫn tồn tại với phương

pháp này là chúng dựa trên sự tích hợp ngẫu nhiên của plasmid và băng biểu hiện của nó trong bộ gen vật chủ.

● Sự tích hợp ngẫu nhiên này tạo ra quần

Trang 41

a) RMCE (Trao đổi băng cassette qua trung gian tái tổ hợp):

Trang 42

b) Sử dụng các endonuclease:

Trang 44

Nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú (MAC) cung cấp một phương tiện để đưa một lượng lớn thông tin di truyền vào tế bào ở dạng sao chép tự động, không tích hợp

Biểu hiện nhiễm sắc thể nhân tạo dựa trên DNA của động vật có vú

(ACE) có thể được tạo ra một cách tái tạo de novo trong các dòng tế

bào của các loài khác nhau và dễ dàng được tinh chế từ nhiễm sắc thể của tế bào chủ.

Biểu hiện nhiễm sắc thể nhân tạo dựa trên DNA của động vật có vú

(ACE) có thể được tạo ra một cách tái tạo de novo trong các dòng tế

bào của các loài khác nhau và dễ dàng được tinh chế từ nhiễm sắc thể của tế bào chủ.

Các ACE của động vật có vú đã được tinh sạch có thể được đưa lại vào nhiều dòng tế bào nhận khác nhau, nơi chúng đã được duy trì ổn định trong thời gian dài mà không có áp lực chọn lọc

c) ACE (Artificial Chromosome Expression):

Trang 45

Sơ đồ tải gen

chuyển theo vị trí cụ thể lên nền tảng

ACE

Trang 46

MAR (matrix attachment region)

• Là các trình tự trong DNA của nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn nơi chất nền hạt nhân gắn vào

• MARs làm trung gian cho tổ chức cấu trúc của chất nhiễm sắc trong nhân

• Các yếu tố này tạo thành các điểm neo của DNA cho giàn nhiễm sắc và phục vụ để tổ chức chất nhiễm sắc thành các miền cấu trúc

• MAR đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen

Sử dụng các yếu tố điều hòa biểu sinh

Trang 47

UCOE (Ubiquitously acting chromatin opening elements)

Được xác định bởi khả năng tạo ra một cách nhất quán vị trí biểu hiện gen chuyển độc lập, ổn định, tỷ lệ với số lượng bản sao, bao gồm từ bên trong các vùng của dị nhiễm sắc như tâm động

Các UCOE có cấu trúc bao gồm các đảo CpG tự do methyl hóa

UCOE cũng được phát hiện là hữu ích để tăng năng suất của các dòng tế bào protein tái tổ hợp

Trang 48

Có thể giúp tăng mức độ biểu hiện của liệu pháp sinh học mà còn có thể tăng số lượng dòng vô tính

đã tích hợp gen chuyển với số lượng bản sao xác định hơn của gen chuyển trên mỗi tế bào, do đó đẩy nhanh quá trình chọn lọc

Có thể giúp tăng mức độ biểu hiện của liệu pháp sinh học mà còn có thể tăng số lượng dòng vô tính

đã tích hợp gen chuyển với số lượng bản sao xác định hơn của gen chuyển trên mỗi tế bào, do đó đẩy nhanh quá trình chọn lọc

MAR và UCOE đã giúp giảm sự biến đổi biểu hiện giữa các dòng vô tính khác nhau và góp phần duy trì trạng thái phiên mã hoạt động để biểu hiện

gen chuyển tốt hơn

MAR và UCOE đã giúp giảm sự biến đổi biểu hiện giữa các dòng vô tính khác nhau và góp phần duy trì trạng thái phiên mã hoạt động để biểu hiện

gen chuyển tốt hơn

UCOE cũng có thể ngăn chặn sự methyl hóa DNA của vùng khởi động CMV, do đó ngăn chặn sự im lặng biểu hiện gen

Trang 49

3.3 Sự tăng trưởng, sinh sôi và tồn tại của tế bào:

 Sản xuất nhiều protein với ít tài nguyên hơn và trong thời gian ngắn hơn vẫn là một thách thức đáng kể khi làm việc với các hệ thống biểu hiện tế bào của động vật có vú

Theo quan điểm này, các công cụ và phương pháp khác nhau tập trung vào sự phát triển, tăng sinh và tồn tại của tế bào đã được ngành công nghiệp sinh học và giới học thuật giải quyết

Các khía cạnh chính để tối ưu hóa sự phát triển và năng suất tế bào chắc chắn là các thông số của quá trình (pH, nhiệt độ, cách trộn, v.v.)

Trang 50

Natri butyrat (NaB)

Acid valproic (VPA)

Trang 51

• Các chiến lược hạ thân nhiệt và chống apoptosis này đã được sử dụng để kéo dài thời gian tồn tại của tế bào CHO và do đó tối đa hóa năng suất Chỉ cần sử dụng nhiệt

độ giảm trong giai đoạn sản xuất protein trong tế bào CHO đã cải thiện đáng kể năng suất của nhiều loại protein mô hình như

• Các chiến lược hạ thân nhiệt và chống apoptosis này đã được sử dụng để kéo dài thời gian tồn tại của tế bào CHO và do đó tối đa hóa năng suất Chỉ cần sử dụng nhiệt

độ giảm trong giai đoạn sản xuất protein trong tế bào CHO đã cải thiện đáng kể năng suất của nhiều loại protein mô hình như

Tiêu đề	Sản Xuất Glycoprotein Trị Liệu Trong Tế Bào Động Vật Có Vú
Tác giả	Hoàng Lan Phương, Nguyễn Hoàng Cát Nguyên, Nguyễn Kiều Giang, Nguyễn Thị Khả Hân, Huỳnh Kim Vũ, Lê Xuân Nhật Vinh
Người hướng dẫn	Lê Thị Hà Thanh
Trường học	unknown
Chuyên ngành	unknown
Thể loại	unknown
Năm xuất bản	unknown
Thành phố	unknown

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	4,28 MB