NUÔI CẤY NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG CÁC CÂY LAN HOÀNG THẢO ý, BÁCH HỢP, CẨM CHƯỚNG, HOA TRÀ VÀNG

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ tạo thành cây hoàn chỉnh nhờ vào sự điều chỉnh môi trường nuôi cấy in vitro Ngày xưa chúng ta

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA SINH HỌC

NGUYỄN HOÀNG CÁT NGUYÊN

MÃ SINH VIÊN 17T3041054

NUÔI CẤY NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ MỘT

SỐ ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG CÁC CÂY LAN HOÀNG THẢO Ý, BÁCH HỢP, CẨM

CHƯỚNG, HOA TRÀ VÀNG

NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT– 2020-2021.2.CNS4762.002 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS LÊ VĂN TƯỜNG HUÂN

HUẾ, THÁNG 6 NĂM 2021

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 2

I CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO 2

1 Nuôi cấy đoạn thân mang chồi nách 2

2 Nuôi cấy đỉnh chồi 2

3 Tái sinh chồi bất định 3

4 Nhân giống thông qua callus 4

5 Phát sinh phôi soma 4

II ỨNG DỤNG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO TRONG NHÂN GIỐNG CÁC CÂY HOA 6

1 Lan hoàng thảo ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum reichenb.f.) 6

2 Cây Bách hợp (lilium brownii f.e brown) 7

3 Hoa cẩm chướng 9

4 Hoa trà vàng (Camellia sp.) 10

KẾT LUẬN 1

TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các

phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm trên môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường bao gồm các nhân tố thiết yếu đa lượng và vi lượng, chất kích thích sinh trưởng, đường, vitamin và một số hợp chất hữu

cơ cần thiết khác

Tế bào thực vật có tính toàn thế, tế bào đơn hoặc protoplast thực vật đều có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là điều kiện quan trọng để ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ tạo thành cây hoàn chỉnh nhờ vào sự điều chỉnh môi trường nuôi cấy

in vitro

Ngày xưa chúng ta đã biết nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô tính truyền thống giâm, chiết, ghép, Nhưng các biện pháp đó ngày càng bộc lộ nhiều hạn chế : giống được nhân nhiều lần bị thoái hóa giống, mắc nhiều bệnh hơn, năng suất giảm, phân ly Bằng biện pháp nhân giống in vitro, với công nghệ vô trùng cao đã khắc phục được những hạn chế trên, nâng cao năng suất chất lượng của giống cây trồng cả về giá trị nông học và giá trị thương phẩm Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển nhân giống in vitro ngày nay là rất quan trọng cần được chú trọng đầu tư

Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đang được sử dụng rộng rãi để sản xuất giống cây trồng tạo nguồn giống đồng nhất về di truyền, sạch bệnh, đồng đều về sinh lý và phát triển bình thường Những ứng dụng của vi nhân giống trong nghề vườn nói riêng

và nông nghiệp nói chung đã rộng khắp thế giới nhưng việc thương mại hóa vẫn còn giới hạn do chi phí sản xuất lớn, giá thành sản phẩm cao

NỘI DUNG

1 Nuôi cấy đoạn thân mang chồi nách

- Một đoạn thân mang chồi nách được phân lập và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng sẽ phát triển chồi đây là phương pháp tự nhiên nhất trong nuôi cây nhân giống

vô tính in vitro, các chồi có thể được cấy chuyển để tạo nên chồi mới Khi đã thu được chồi thì các chồi sẽ được tạo rễ và cuối cùng được chuyển ra đất Nuôi cấy đoạn thân mang chồi nách về nguyên tắc không cần thêm cytokinin Phương pháp nuôi cấy thân mang chồi nách đã thành công với nhiều cây khác nhau [4]

2 Nuôi cấy đỉnh chồi

- Với phương pháp nuôi cấy đỉnh chồ thì một đỉnh chồi được phân lập từ đó các nụ chồi nách phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin nồng độ khá cao Các chồi có thể được tiếp tục cấy chuyển sang môi trường mới và các chồi mới sẽ hình thành Khi số chồi đã đủ, các chồi có thể được tạo rễ và sau đó các cây con sẽ được chuyển ra trồng ngoài đất

- Trong thực tế, phương pháp nuôi cấy đỉnh chồi đã trở thành phương pháp nuôi cấy in vitro quan trọng nhất Phương pháp này nói chung đơn giản hơn các phương pháp khác tốc độ nhân giống cao và các cây con sinh trưởng tốt

- Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành chồi trong đó nhu cầu về cytokinin đối với hình thành chồi là khác nhau Nồng độ và loại cytokinin phụ thuộc vào từng loài nhân giống Ngoài ra, nồng độ của cytokinin cũng còn phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của vật liệu

- Sự hình thành callus phải được tránh bởi vì các chồi bất định được tái sinh từ callus

có thể mang đột biến Sự hình thành chồi có thể được đẩy mạnh bằng cách sử dụng môi trường lỏng thay cho môi trường đặc Phương pháp nuôi cấy đỉnh chồi được sử dụng đầu tiên cho cây hoa cẩm chướng (1967) và sau đó được áp dụng nhiều loài cây khác nhau Đáng lưu ý sử dụng trong nhân giống cây ăn quả

- Riêng ở trường hợp cây hoa lan Morel (1960) đã thực hiện nuôi cấy đỉnh phân sinh của cây lan Cymbidium (địa lan) với mục đích để thu nhận cây sạch vi rút Morel đã

nhận thấy từ các đỉnh chồi nuôi cấy in vitro các protocorm được tạo thành Từ các protocorm này có thể thu nhận các protocorm mới, mỗi protocorm có thể phát triển được chồi với các lá và rễ Bằng cách này Morel có thể tạo ra hàng ngàn cây trong một năm từ đỉnh chồi Tạo dòng các hoa lan bằng nuôi cấy đỉnh phân sinh đã trở thành ứng dụng thương mại đầu tiên của nhân giống in vitro Phương pháp này được sử dụng đầu tiên ở Cymbidium về sau đã được sử dụng cho nhiều loại lan khác nhau và hiện nay đã được sử dụng ở quy mô toàn thế giới và kết quả là cây hoa lan không còn là một loại hoa quá đắt đỏ [4]

3 Tái sinh chồi bất định

- Hệ thống thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy đỉnh chồi, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới Đỉnh chồi bất định, mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật, hoặc gián tiếp từ mô callus mà

mô callus hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật

- Một số loại mẫu vật có thể dùng cho tái sinh chồi bất định Ví dụ như đoạn thân ( ở cây thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải) Mẫu vật có thể là mảnh lá (thuốc lá, cà chua, hoa cải, cà phê, ca cao) Cuống lá ( cây hoa thủy tiên), các bộ phận của hoa (cải hoa, lúa mì, thuốc lá), nhánh củ ( họ lay ơn, thủy tiên), đoạn mầm (cây măng tây)

- Sự phát triển chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm trong biểu

bì hoặc ngang phía dưới bề mặt của thân Một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh Các thể phân sinh này có nguồn gốc từ các tế bào đích Chiều hướng phát triển của thực vật phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng bổ sung Ví dụ nghiên cứu tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sâm Douglas cho thấy cytokinin BAP nồng độ 5µM/L là cần thiết cho phát sinh chồi bất định nhưng có 3 kiểu phản ứng khác nhau các kết quả tùy thuộc vào nồng độ auxin NAA Nếu nồng độ NAA nhỏ hơn 5µM/L thì chỉ có chồi phát triển, nếu nồng độ NAA cao hơn 5 µM/L thì

lá mầm tạo ra các callus và nhiều chồi Nếu cung cấp auxin NAA với nồng độ 5µM/L thì chỉ có callus được tạo thành

- Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp là thông qua giai đoạn callus, sau đó các chồi phát triển từ loại vi mô callus mà không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn thuộc mẫu vật [4]

4 Nhân giống thông qua callus

- Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống in vitro, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành callus, tế bào callus khi cấy truyền nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng đó, phải sử dụng loại callus mới phát sinh tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hi vọng thu được cây tái sinh đồng nhất [4]

5 Phát sinh phôi soma

- Khi phôi tái sinh từ tế bào hay phôi soma thì đây gọi là phôi soma Năm 1958 Reinert

và Steward đã thông báo về sự phát sinh phôi soma lần đầu tiên với nuôi cấy callus và huyền phù tế bào ở cà rốt Người ta đã nhận thấy sự phát triển in vitro của phôi soma có những điểm rất giống với phát sinh phôi hữu tính xảy ra trong nội nhũ Ngoài cà rốt, các loại khác thuộc họ Umbelliferae cũng đã được nghiên cứu phát sinh phôi soma, phát sinh phôi soma cũng có thể được tạo trên một môi trường tổng hợp Mặc dù có nhiều sự

giống nhau giữa phát sinh phôi hữu tính và phôi soma vẫn có những khác biệt rõ ràng

-Các vật liệu khởi đầu tốt cho phát sinh phôi soma có thể là các bộ phận của hoa phôi

hữu tính và mô nội nhũ

-Phát sinh phôi soma đã thực hiện ở nhiều loại thực vật và có nhiều thành công ở các

họ Umbelliferae, Ranuneulaceae, Rutaceae, Solanaceae, Gramineae

-Có hai kiểu phát sinh phôi soma

+ Thứ 1 là trực tiếp: trong trường hợp này các phôi phát sinh trực tiếp từ một tế bào hay mô mà không có sự hình thành callus trước đó Các vật liệu khởi đầu cho kiểu phát sinh phôi này có thể là mô phôi tâm ở các loài Citrus hoặc các tế bào biểu bì của trụ dưới lá mầm của cà rốt hay bắp cải

+ Thứ 2 là gián tiếp: trong kiểu phát sinh phôi này, một callus được tạo thành , sau đó các phôi hình thành từ callus, các vật liệu cho kiểu phát sinh phôi này có thể là mảnh

lá như ở cà phê, măng tây

- Có một số quy định chung cho tạo phôi soma

+ Nồng độ auxin cao thường được đòi hỏi cho sự tạo phôi

+ Ánh sáng nói chung kích thích sự tạo phôi mặc dù phát sinh phôi có thể tạo ra trong tối

+ Nhiệt độ cao thường thích hợp cho tạo phôi

+ Nồng độ saccharose thích hợp 2-3%

- Tạo phôi soma đã dược thực hiện với mức độ thành công cao ở một số loại cây, ví dụ như cây cọ dầu Cây cọ dầu đã được tạo dòng ở quy mô lớn bằng tạo callus phôi và chồi Các cây cọ dầu thu được cho thấy không có biến động di truyền đáng kể Theo cách thức này, các đồn điền có thể khởi đầu với các cây đã chọn lọc, cho sản lượng cao

- Tuy nhiên trong thực tế, phát sinh phôi soma chưa được dùng rộng rãi như một

phương tiện nhân giống bởi vì tạo phôi soma thường không dễ dàng và thậm chí không thích hợp cho một số loài Mặt khác, khi cấy chuyển nhiều lần khả năng tái sinh có thể giảm và có khả năng xảy ra đột biến [4]

❖ Hạt tổng hợp (hạt nhân tạo) [4]

- Để cho việc sản xuất các phôi soma có thể ứng dụng thực tế, các phôi có thể được bọc lại và được biết đến như là hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo Một gel có thể chứa các chất dinh dưỡng được bao ngoài phôi soma và đóng vai trò như nội nhũ Gel này có thể là agar, agarose hoặc alginate, trong đó phổ biến nhất là alginate Người ta đã phát triển một máy bọc gói có thể sản xuất, phân loại 6000 “hạt” phôi/1 giờ

- Sản xuất hạt nhân tạo bằng cách bọc các phôi soma và thu nhận cây từ chúng là không dễ dàng, bởi vì:

+ Việc sản xuất hạt nhân tạo ổn định trong vài tháng đòi hỏi các quá trình hóa học và vật lý để làm cho phôi không hạt hoạt động

+ Hạt nhân tạo cần được bảo vệ để khỏi bị khô ở các phôi cần được bảo vệ trong suốt quá trình vận chuyển, cất giữ và gieo

+ Ở việc tạo cây từ các hạt nhân tạo từ thấp có thể do sự hình thành phôi không hoàn toàn, hoặc do những khó khăn trong việc tạo được nội nhũ nhân tạo phù hợp

+ Phôi phải được bảo vệ đối với vi sinh vật bằng các chất kháng sinh hay chất diệt nấm Như vậy sự sản xuất và ứng dụng hạt tổng hợp càng bị hạn chế do giới hạn giá thành còn cao hơn so với hạt bình thường

II ỨNG DỤNG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO TRONG NHÂN

GIỐNG CÁC CÂY HOA

1 Lan hoàng thảo ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum reichenb.f.)

a) Đối tượng nhân giống: hạt từ quả của cây lan hoàng thảo ý thảo ba

màu(Dendrobium gratiosissimum Reichenb.f.) thu nhập tại Lâm Đồng, được

trồng tại Viện Công nghệ sinh học- Trường đại học lâm nghiệp

b) Phương pháp nghiên cứu

- Khử trùng mẫu: : Mẫu quả lan được rửa sạch, ngâm mẫu trong dd xà phòng loãng khoảng 5-10 phút và rửa sạch lại với nước Sát khuẩn bề mặt bằng ethanol 70% trong 2 phút, khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian khác nhau Sau mỗi lần dùng hóa chất đều phải rửa mẫu bằng nước cất vô trùng [2,2]

- Các giai đoạn nuôi cấy ở môi trường thích hợp

+ Nuôi cấy khởi động ở môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l, agar 5 g/l

+ Nhân nhanh chồi ở môi trường MS bổ sung BAP 0,5 mg/l, NAA 0,3 mg/l, Kinetin 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, nước dừa 100 ml/l, sucrose 30 g/l và agar 5 g/l + Chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh môi trường MS bổ sung IBA 0,2 mg/l, NAA 0,3 mg/l, dịch chiết khoai tây 100 ml/l, sucrose 20 g/l, agar 5 g/l

c) Điều kiện nuôi cấy

- Nuôi cấy trên môi trường MS

- pH ở mức 5,8 trước khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút

- mẫu sau khi cấy được nuôi dưới ánh sáng giàn đèn neon, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 3000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C

d) Kết quả

Kỹ thuật nhân giống in vitro cây Lan Hoàng thảo Ý thảo ba màu đã được nghiên

cứu thành công ở kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ mẫu sạch 96,67%, tỷ lệ mẫu tạo protocorm đạt 90% Nhân nhanh chồi đạt tỷ lệ 96,67%, hệ số nhân chồi đạt 9,53 Chồi ra rễ 93,33% và chiều dài rễ trung bình 3,22cm sau 5 tuần [2]

Hình 1 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống lan Hoàng thảo Ý thảo 3 màu

a) Tạo protocorm; b) Cụm chồi nuôi cấy trên môi trường MS;

c) Nhân nhanh chồi trên môi trường N9; d) Tạo rễ ở công thức môi trường R8

2 Cây Bách hợp (lilium brownii f.e brown)

a) Đối tượng nhân giống: vẩy thân hành và đốt thân cây bách hợp (Lilium brownii F.E.Brown) có nguồn gốc từ Hà Giang

b) Phương pháp nghiên cứu

- Khử trùng mẫu: rửa sạch, sau đó chúng được ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút, rồi rửa sạch lại Tiếp đó, ngâm mẫu trong thuốc diệt nấm 20 phút rồi tráng lại bằng nước cất Các mẫu được tráng bằng cồn 700 trong 30 giây, liền đó mẫu được xử

lý với HgCl20,1% với các khoảng thời gian khác nhau (8 phút, 10 phút, 12 phút và 15 phút), sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng [5]

- Các giai đoạn nuôi cấy ở môi trường thích hợp

+ Giai đoạn tái sinh chồi ở môi trường MS có bổ sung 30 g/lđường và 0,5 mg/l NAA đối với vảy thân và là MSbổ sung 30 g/l đường và 0,5 mg/l BAP đối với đốt thân

+ Giai đoạn tạo củ sơ cấp ở môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA

+ Giai đoạn nhân nhanh chồi từ củ nhỏ sơ cấp ở môi trường MS bổ sung 60g/l đường, 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l BAP

+Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ở môi trường 1/2 MS có bổ sung tổ hợp1,0 mg/l NAA

và 0,2 mg/l BAP

c) Điều kiện nuôi cấy

- Nuôi cấy trên môi trường MS

- pH ở mức 5,8 trước khi khử trùng và được hấp khử trùng ở 121ºC

- Áp suất 1 atm trong 20 phút

- Nhiệt độ 250C ± 2, cường độ ánh sáng là 2000 lux, thời gian chiếu sáng 14h sáng/10 giờ tối

d) Kết quả

Cây bách hợp đã được nhân giống in vitro thành công sử dụng vật liệu ban đầu là mẫu

đốt thân và vẩy củ Số củ mới tạo thành trên một mẫu đạt cao nhất 4,5 củ Tỷ lệ tạo rễ bách hợp đạt cao nhất(86,67%) trên môi trường 1/2 MS có bổ sung tổ hợp1,0 mg/l NAA và 0,2 mg/l BAP được đưa ra trồng ở giá thể TN1 là giáthể tốt nhất cho cây bách hợp giai đoạn vườn ươm [5]

Hình 2 Củ hình thành trên môi trường MS bổ sung 60g/ml đường và 0,5mg/l NAA

Hình 3 Cây bách hợp trên các giá thể khác nhau ở vườn ươm a: TN1; b: Đất: bột

xơ dừa; c:Xơ dừa; d: Đất:phân vi sinh: trấu hun (6:1:2)

3 Hoa cẩm chướng

a) Đối tượng nhân giống: Chồi đỉnh và chồi nách của cây hoa Cẩm chướng.[3,1]

b) Phương pháp nghiên cứu

- Khử trùng mẫu: chồi đỉnh và chồi nách được khử trùng sơ bộ bằng ethanol 70% trong 1 phút, sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% một hoặc hai lần, trong các khoảng thời gian khác nhau [3]

- Các giai đoạn nuôi cấy ở môi trường thích hợp

+ Nuôi cấy khởi động ở môi trường MS bổ sung Kinetin 0,3mg/l, NAA 0,1 mg/l, sucrose 20g/l

+ Nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi ở môi trường MS bổ sung 0,05mg/l BAP, 0,1mg/l Kinetin, 0,1mg/l NAA, 30g/l sucrose

+ Kích thích chồi ra rễ môi trường MS bổ sung 0,1mg/l IBA, 20g/l sucrose

c) Điều kiện nuôi cấy:

- Nuôi cấy trên môi trường MS

- pH ở mức 5,6- 5,8 khử trùng ở 121ºC, áp suất 1atm trong 15 phút

- Nhiệt độ 25 ± 20ºC, cường độ ánh sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày d) Kết quả

Cây hoa cẩm chướng nhân giống in vitro với tỷ lệ tái sinh đạt 44,44% sau 2 - 4 tuần Chồi non vô trùng tái sinh từ mẫu cấy có 3 - 6 đốt lá được cắt thành những đoạn thân chồi, kích thước 1,0 – 2,0cm, mang chồi nách cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi đạt 100%, hệ

số nhân nhanh chồi đạt 3,4 lần, chiều cao trung bình của chồi là 4,13cm sau 4 tuần nuôi

Tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình/chồi đạt 4,5 rễ, chất lượng rễ tốt [3]

(a) (b) (c)