BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62. 62. 05. 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH 2: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ học vị nào. Các tài liệu trích dẫn được chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp đỡ đã được cám ơn. Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012 Tác giả luận án Trịnh Minh Hợp ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến GS. TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Phan Hữu Tôn, những người thầy đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học và Viện Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ về mọi mặt để tôi thực hiện đề tài này. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật đã trợ giúp tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã cho tôi động lực, chia sẻ với tôi mỗi khi gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012 Tác giả luận án Trịnh Minh Hợp iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Ký hiệu và chữ viết tắt trong luận án ix Danh mục bảng trong luận án xi Danh mục hình trong luận án xiv MỞ ĐẦU ………………………………………………………………. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ………………………………………… 1 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ……………………… 2 2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ………………………………… 2 2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ………………………………… 3 3. Mục đích và yêu cầu của đề tài ………………………………… 3 3.1. Mục đích của đề tài ……………………………………… 3 3.2. Yêu cầu của đề tài ………………………………………… 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài …………………… 4 4.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài ………………………… 4 4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài …………………………… 4 5. Đóng góp mới của luận án ……………………………… 4 iv Trang Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ……………… 5 1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam 5 1.1.1. Sơ lược về cây bông …………………………………… 5 1.1.2. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ………………… 5 1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam ……… 6 1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra ………………………………… 9 1.2.1. Sâu hại bông ……………………………………………… 9 1.2.2. Tổn thất do sâu hại bông và chi phí phòng trừ ………… 11 1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu 12 1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu ………………………… 14 1.4.1. Tăng năng suất ……………………………………………. 14 1.4.2. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu ………………………………. 14 1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt ………………………………. 16 1.6. Tái sinh cây bông 17 1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ……………… 17 1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi …………………. 22 1.7. Chuyển gen cây bông ………………………………………… 23 1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ………… 24 1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn 28 1.7.2.1. Cơ chế của chuyển gen PTP ………………………… 28 v Trang 1.7.2.2. Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông …………… 30 1.7.2.3. Thuận lợi và khó khăn của chuyển gen PTP ……… 30 1.7.2.4. Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen PTP … 32 1.7.2.5. Nguyên tắc cơ bản trong thao tác vi tiêm ……… 33 1.8. Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen ………………………… 33 1.8.1. Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc ………………………………………………… 34 1.8.1.1. Gen chỉ thị chọn lọc …………………………………. 34 1.8.1.2. Gen chỉ thị chọn lọc thông dụng …………………… 35 1.8.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chuyển gen ……………………………………………… 37 1.8.2.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào bằng PCR …………………………………………… 37 1.8.2.2. Xác định sự gắn kết và số bản sao gen chuyển bằng Southern blot ………………………………………… 39 1.8.3. Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen …………………………………………… 41 1.8.3.1. Đánh giá hoạt động phiên mã của gen chuyển bằng Northern blot ………………………………………… 41 1.8.3.2. Đánh giá hoạt động dịch mã của gen chuyển bằng Western blot …………………………………………. 42 1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt …… 43 vi Trang Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1. Vật liệu nghiên cứu …………………………………………… 46 2.1.1. Giống bông ……………………………………………… 46 2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn ………………. 46 2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu …………………………………………. 48 2.1.4. Hoá chất ………………………………………………… 48 2.1.5. Máy móc, thiết bị …………………………………………. 49 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu …………………………. 49 2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens …… 49 2.2.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ………… 49 2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi 51 2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens 53 2.2.2. Chuyển gen vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn ………………………………………… 55 2.2.2.1. Xác định thông số vi tiêm …………………………… 55 2.2.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T 0 ……………… 55 2.2.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen …………………. 56 2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh ……. 56 2.2.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ………… 57 2.2.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen …. 57 vii Trang Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………… 60 3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens ……… 60 3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma … 60 3.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi …………………. 71 3.1.3. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens 78 3.1.3.1. Xác định thông số chuyển gen ………………………. 78 3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen ………………………………. 84 3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn …………………………………… 90 3.2.1. Xác định thông số vi tiêm ………………………………… 91 3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T 0 …………………… 94 3.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen ………………………. 97 3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh …………. 97 3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin … 97 3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin ……. 100 3.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ……………… 107 3.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen 110 3.3.3.1. Đánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuyển gen thế hệ T 2 giống Coker312 và SSR60F ……… 110 3.3.3.2. Đánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuyển gen thế hệ T 2 giống LRA5166, MCU9 và TM1 … 111 viii Trang 3.3.3.3. Đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen thế hệ T 2 …………………………………………… 115 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……………………………………………. 120 1. Kết luận ………………………………………………………… 120 2. Đề nghị …………………………………………………………… 121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ……………………………………………. 122 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………. 123 PHỤ LỤC ……………………………………………………………… 141 [...]... nhất l sâu hồng (Pectinophora gossypiella), tiếp đến l sâu xanh (Helicoverpa armigera) , sâu loang (Earias spp .), sâu xám (Agrotis spp .), sâu xanh bắp (Helicoverpa zea), sâu khoang (Spodoptera literoralis), sâu xanh thuốc l (Heliothis virescens) và sâu xanh Úc (Helicoverpa punctigera) (James, 200 2) [73] Sâu xanh (Helicoverpa armigera) l sâu hại phổ biến nhất, tìm thấy ở 30/33 nước trồng bông l n,... (i) nhóm sâu miệng nhai, gồm các loại gây hại chính như sâu xanh (Helicoverpa armigera) , sâu xanh da l ng (Spodoptera exigua), sâu loang (Earias vittella), sâu hồng (Pectinophora gossypiella), sâu khoang (Spodoptera litura) ; và (ii) nhóm sâu chích hút, gồm các loại gây hại chính như bọ trĩ (Scrirtothrips dorsalis Hood và Thrips palmi Karny), rệp bông (Aphis gossypii), rầy xanh (Amrasca devastans)... thành công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn - Tạo được 87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh Đặc biệt, tạo được 50 dòng kháng sâu xanh cao l m vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Sơ l ợc về cây bông, tình hình sản xuất bông thế... Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc l c cho công tác chọn tạo giống bông truyền thống và l m cơ sở áp dụng để chọn tạo các loại giống cây trồng kháng sâu khác 2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh để l m vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu, nhằm cung cấp cho sản xuất bông hàng hóa... cầu bông xơ ngày càng tăng của ngành dệt may Việt Nam 3 Mục đích và yêu cầu của đề tài 3.1 Mục đích của đề tài - Ứng dụng được phương pháp chuyển gen để chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông, đặc biệt l giống bông Việt Nam - Tạo ra một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao (tỷ l giết sâu ≥ 80 %) l m vật liệu quý cho chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước 3.2 Yêu cầu của đề tài - Chuyển. .. hirsutum L. ) kháng sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner) được tiến hành 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng l c, đánh giá và chọn l c cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển l nh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu. .. tỷ l chuyển gen khá cao, khắc phục được những hạn chế của tái sinh và có thể chuyển gen vào bất kỳ giống bông nào Mặc dù, cũng có nhược điểm như quy mô chuyển gen l n, tốn nhiều công lao động, phụ thuộc vào ngoại cảnh, nhưng phương pháp chuyển gen này đang ngày càng được quan tâm sử dụng Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum. .. trồng bông l n trên thế giới đã sử dụng phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu Việt Nam cũng đang nghiên cứu theo hướng này 1.3 Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu Cây bông chuyển gen được trồng đầu tiên trên thế giới vào năm 1996, chủ yếu ở Mỹ, với diện tích chỉ khoảng 0,8 triệu ha (James, 199 7) [72] Từ đó đến nay, diện tích trồng bông chuyển gen liên tục... Sơ l ợc về cây bông Cây bông (Gossypium sp .) thuộc chi Bông (Gossipyum), họ Cẩm Quỳ (Malvaceae) Chi Bông có 45-50 loài, trong đó, 40-45 loài nhị bội (2n = 2x = 2 6) và 5 loài tứ bội (2n = 4x = 5 2) Có 4 loài bông trồng trọt: 2 loài nhị bội l loài bông Cỏ châu Á (G arboreum L. ) và bông Cỏ châu Phi (G herbaceum L. ), có trung tâm khởi nguyên ở Ấn Độ, Tây Nam Châu Á (Cỏ châu ) và Đông Phi (Cỏ châu Phi);... E.coli chủng DH5 và A tumefaciens chủng C58 - Sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner) 4.2 Phạm vi nghiên cứu của đề tài - Phạm vi nội dung nghiên cứu l chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn; và sàng l c, đánh giá, chọn l c cây chuyển gen bằng kháng sinh, PCR và bio-test (nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng) . trong đó ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu l rất cần thiết. Để tạo cây bông Bt, chủ yếu sử dụng phương pháp chuyển gen thông. - Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh để l m vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu, nhằm