Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại hà nội

2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR 522.5.6 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC 522.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng 2.5.8 Xác đị

L AM OA

Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn

Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội”

là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc

ác iả luận án

uyễn hị h nh hủy

L ẢM Ơ

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Đào tạo Sau Đại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú

y vùng I đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Nghiên cứu sinh tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Thú

y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi điều tra, lấy mẫu thực hiện đề tài

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học là TS Nguyễn Bá Hiên - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS Đỗ Ngọc Thúy - Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Cù Hữu Phú, ThS Lưu Thị Hải Yến và tập thể cán bộ Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Cơ quan Thú y vùng I, nơi tôi công tác đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này

Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bố mẹ, chồng

và hai con trai cùng các bạn đồng nghiệp, bạn bè đã đồng hành, đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

ác iả luận án

uyễn hị h nh hủy

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) 14

1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli và bệnh do chúng gây

1.4 Phương pháp phát hiện VTEC trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm 32

1.4.1 Phương pháp vi sinh vật 33

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phân loại vi sinh vật 40

2.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa

2.1.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi

2.1.3 Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng

2.4.1 Môi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 462.4.2 Các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm 47

2.5.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn trong canh khuẩn

2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 482.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 51

2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR 522.5.6 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC 522.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng

2.5.8 Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn

gốc khác nhau bằng phản ứng PFGE (Pulsed-field gel

3.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn

3.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ

gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 573.1.2 Kết quả điều tra điều kiện giết mổ và phương tiện vận chuyển

của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 603.1.3 Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa

3.1.4 Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ,

tiêu thụ sản phẩm thịt gia súc, gia cầm 693.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi

3.2.1 Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR 703.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu 733.2.3 Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn

3.2.4 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR

dùng để xác định VTEC trong môi trường nhân tạo 77

3.2.5 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

PCR dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch 833.2.6 Quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các

3.3 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm VTEC trên bò, lợn tại các điểm giết

3.3.2 Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng

3.3.4 Kết quả phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại

Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 109

DA MỤ Á Ữ V Ế Ắ

A/E Attaching and Effacing

BHI Brain Heart Infusion

EaggEC Enteroaggregative E coli

EHEC Enterohaemorrhagic E coli

EIEC Entero invasive E coli

EPEC Enteropathogenic E coli

ELISA Enzyme-linked immunosorbent asay ETEC Enterotoxigenic E coli

FDA Food and Drug Administration

OMP Outer membrane protein

PCR Polymerase chain reaction

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis

SLT Shiga - like toxin

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

DAN MỤ Á BẢ

1.2 Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE 43

2.1 Trình tự mồi dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae 49

3.1 Số lượng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 59

3.2 Kết quả điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận

chuyển của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 62

3.3 Thực trạng vệ sinh của các điểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc

3.4 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR đơn và Multiplex - PCR để

phát hiện một số gen độc lực của VTEC 72

3.5 Kết quả xác định môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn E coli

3.6a Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR để phát hiện các

chủng vi khuẩn E coli đối chứng dương 75

3.6b Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR với

3.7 Kết quả nuôi cấy hai chủng vi khuẩn đối chứng dương trên một

3.8 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi

xác định VTEC trên môi trường nuôi cấy 803.9 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi

3.10 Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập được tại một số

3.11 Tổng hợp số lượng mẫu thịt thu thập được tại một số chợ trên

3.12 Kết quả phân lập chủng E coli từ mẫu ban đầu 90

3.13 Kết quả kiểm tra các đặc tính của vi khuẩn E coli phân lập được 91

3.14 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu thịt 933.15 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân 96

3.16 Khả năng sản sinh độc tố của các chủng VTEC phân lập được 98

3.17 Kết quả xác định serotyp của các chủng VTEC phân lập được 101

1.5 Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với

enzym cắt hạn chế Sma I với vi khuẩn Haemophilus influenzae 42 2.1 Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn 53 3.1 Sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng

3.2 Kết quả nuôi cấy chủng FD636 ở các nồng độ pha loãng khác

3.3 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau

từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD636 82 3.4 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau

từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD523 82

3.7 Tính chất mọc của E coli trên môi trường MacConkey 92 3.8 Tính chất mọc của E coli trên môi trường thạch máu 92 3.9 Tính chất mọc của E coli trên môi trường EMB 92 3.10 Tính chất mọc của E coli trên môi trường CT-SMAC 92 3.11 Khả năng lên men sinh hơi một số loại đường của E coli 92

3.13 Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu thịt sau quá trình điện di 94 3.14 Sản phẩm của phản ứng PCR từ khuẩn lạc riêng biệt của một số

3.15 Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu phân và mẫu lau thân thịt

3.16 Sản phẩm của phản ứng PCR từ những khuẩn lạc riêng biệt của

3.17 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của vi khuẩn VTEC bằng

3.18 Hình ảnh điện di xung trường (PFGE) của một số chủng vi khuẩn

Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) VSATTP có vai trò rất quan trọng đối với cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia

Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực

phẩm ở người (Salmonella, E coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium

botulinum .), những năm gần đây, các vi khuẩn E coli thuộc nhóm

Verotoxigenic (VTEC) ngày càng được biết đến như là một trong những tác

nhân quan trọng Verotoxigenic E coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin

Các chủng VTEC là nguyên nhân gây ra các ca bệnh lẻ tẻ hoặc các ổ dịch lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) và hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm màng não (meningitis) (XU và cs 1999) [92]; (Lake và Cressey, 2002) [49]

Mặc dù E coli O157: H7 vẫn được biết đến như là một serotyp chính

phân lập được từ các vụ dịch ở hầu hết các quốc gia, các chủng VTEC thuộc các serotyp khác cũng đã được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với các vụ dịch tương tự như serotyp O111 ở Canada, Italia, Đức và Australia, O103 ở Pháp, Italia và O104 ở Mỹ

Ở rất nhiều quốc gia, VTEC là tác nhân gây bệnh tiêu chảy rất hay gặp (Wachsmuth, 1994) [95] Ví dụ, ở Đức, VTEC được phân lập từ trẻ em bị tiêu

chảy là nguyên nhân vi khuẩn thường gặp đứng thứ 2, sau Salmonella và ở

Áo, VTEC là nguyên nhân thường gặp thứ 3, sau Salmonella và

Campylobacter (Allerberger và cs 1996) [12]

Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E coli đã bùng phát

tại Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác WHO cho biết, trên phạm vi toàn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1 trường hợp ở Thụy Điển Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau

quả bị nhiễm E coli O104 Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới nền kinh tế

thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại đây thất thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD)

Ở động vật, VTEC là nguyên nhân gây ra chứng viêm ruột xuất huyết

và tiêu chảy ở bò, gây phù đầu ở lợn Động vật nhai lại, đặc biệt bê và bò là nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng và việc tiêu thụ các loại thực phẩm (thịt

bê, bò, các sản phẩm sữa) chưa qua xử lý kỹ là nguyên nhân chính gây ra các trường hợp bị bệnh ở người do VTEC Các nghiên cứu tại một số quốc gia về

sự tạp nhiễm phân ở các trang trại chăn nuôi bò sữa, đã chỉ ra sự dao động rất lớn về tỷ lệ nhiễm của các chủng VTEC thuộc nhóm O157 (từ 0,2 đến 48,8%)

và không thuộc nhóm O157 (từ 0,4 đến 74,0%)

Trong những thập kỷ gần đây, ô nhiễm vi khuẩn E coli thuộc nhóm

VTEC sản sinh độc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm đã trở thành đề tài nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn

này gây ra ở người (Bergamini, 2007) [16] Việc xác định chính xác loại vi khuẩn thuộc nhóm này là rất cần thiết, do mối nguy hại của vi khuẩn này liên quan đến các nạn dịch tiêu chảy trầm trọng ở người và khả năng truyền lây bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật Hiểu biết về các đặc tính của vi khuẩn VTEC ở thịt các loài động vật nuôi (bò, lợn…) làm thực phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp Nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố ở hầu khắp các quốc gia trên thế giới Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý

Để có được những hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC trong thực trạng giết mổ và chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề

tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC)

phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ”

- Xác định đặc tính của vi khuẩn E coli nhóm VTEC phân lập được từ

bò, lợn tại điểm giết mổ

- Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi

- Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn

E coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn

- Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC

- Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực

phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp

- Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội

- Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam

- Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của

vi khuẩn E coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có

nguồn gốc khác nhau

một bệnh nhân nhi Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và

sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống

nhất là Escherichia coli, viết tắt là E coli Từ đó đến nay, E coli được xác

định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91]

E coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae

Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn Quan sát dưới kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi Phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ lông (flagella) hoặc không di động Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi Thông

thường, E coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính E coli là vi khuẩn thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E coli được

thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,

Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E coli là tác

nhân gây một số bệnh ở trẻ em Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và

Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà

sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC Từ đó, những nhóm

E coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy Các vi khuẩn

E coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh

nghiêm trọng Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela,

tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra Những độc tố

này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc Shiga-like toxin Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất

là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố này được gọi

là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC

Trong những năm gần đây, các chủng E coli gây tiêu chảy được chia thành ít nhất 5 nhóm Đó là E coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic

E coli) - sản sinh độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E coli xâm nhập ruột

(EIEC - Entero invasive E coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột,

E coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E coli) có khả năng bám

dính vào tế bào biểu mô và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching

and Effacing - A/E), E coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative

E coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô nhờ một cơ quan giống

lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột Nhóm cuối cùng là VTEC gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm tiểu cầu ở người Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ Nhưng khi phát hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC

E coli O157: H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây

ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993) [55], Canada (Waters và cs 1994) [96], Anh (Thomas và cs 1996) [88] và Nhật Bản (Bettelheim, 1997) [17] Vi khuẩn này được xác định là một trong các tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ độc thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (Phạm Thị Tâm và cs 2009, trích dẫn theo Griffin, 1995) [6]

Vụ dịch đầu tiên được báo cáo vào năm 1982, E coli O157: H7 được

xác định là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ Trong một thập kỷ sau đó, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm Vụ dịch lớn nhất được báo cáo xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7 - 8/1996, với 9.578 ca bệnh được ghi nhận và

11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS Vụ dịch lớn thứ hai xảy

ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP Mặc dù, serotyp O157: H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một

số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người Hơn nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau

Có hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O có khả năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP

Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường (Wachsmuth, 1994) [95] VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần như không có triệu chứng gì, có hoặc không có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP Đối tượng thường bị nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già Ở những người trưởng thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không xuất huyết Điều này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn Ở động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bò, chúng cũng

có thể gây bệnh phù đầu ở lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8]

Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157: H7, có liên quan tới sử dụng thịt bò chưa chín kỹ, và một số thực phẩm tương tự hoặc sữa tươi Truyền qua thực phẩm là phương thức lây truyền chủ yếu của VTEC Vật nuôi, đặc biệt là trâu bò, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin

và cs 1993) [18] Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng có thể truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia

súc khác qua tay người giết mổ và dụng cụ lò mổ Hiện nay, người ta vẫn chưa khẳng định được liệu tất cả các chủng VTEC phân lập được từ động vật có gây bệnh cho người hay không

Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm của Việt Nam quy định : vi khuẩn này không được phép có mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp, rau quả muối, nước uống, sữa và các sản phẩm từ sữa

Ở Việt Nam, có rất ít thông tin về VTEC ở những động vật mang trùng, thân thịt sau khi giết mổ và thực phẩm Hiện nay trên thị trường thế giới có rất

ít bộ kít phát hiện VTEC ngoài nhóm O157 (kit PCR DNA vòm, LAMP) Do đó, các phương pháp phát hiện nhanh VTEC ở Việt Nam cần phải được phát triển để xác định được vai trò của vi khuẩn này ở động vật mang trùng và các sản phẩm từ động vật

VTEC-1.1.1 Phân loại E coli

E coli có thể được chia thành các nhóm dựa trên bệnh lý mà chúng gây

ra, vị trí các kháng nguyên, định typ phage, thông tin về plasmid và khả năng sản sinh yếu tố dung huyết Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học thường

được sử dụng và hiệu quả khi phân loại E coli (Hanna Evelina

Sidjabat-Tambunan, 1997) [38]

Năm 1944, Kauffman là người đầu tiên đưa ra một phương pháp phân

loại vi khuẩn E coli dựa trên đặc điểm huyết thanh học, và cùng với một số

cải tiến, phương pháp này vẫn được áp dụng cho tới ngày nay Theo đó, vi

khuẩn E coli được phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm có

kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar) và kháng nguyên giáp mô K (Capsular) (Lior, 1996) [53]

Mặc dù, E coli được phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên này nhưng

kháng nguyên O và H thường được sử dụng nhiều hơn Do đó, thuật ngữ serotyp chỉ được sử dụng khi hai kháng nguyên này đã được xác định Khi chỉ

có kháng nguyên O được xác định, các vi khuẩn E coli được xếp thành nhóm kháng nguyên O (serogroup O) Hiện nay, nhóm E coli dựa trên kháng

nguyên O đã được xác định được đánh số từ O1 đến O173 (trừ 7 nhóm đã bị loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122)

1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E coli

1.1.2.1 Đặc tính hình thái

E coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 2 - 3 x 0,6 µm

Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, đôi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài Vi khuẩn không sinh nha bào và không bắt màu với các thuốc nhuộm axit Vi khuẩn có lông và có khả năng di động (Nguyễn Như Thanh và cs 2001) [7] Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, một số chủng vi khuẩn nhất định có mang cấu trúc fimbriae hay còn gọi là yếu tố bám dính (Nguyễn Thị Liên Hương, 2010) [4]

1.1.2.2 Đặc tính nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí tùy tiện Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 370C, pH thích hợp là 7,4; nhưng vi khuẩn cũng có thể phát triển được ở môi trường có pH từ 5,5 - 8,0 (Nguyễn Như Thanh và cs 2001) [7]

Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản

- Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 - 3mm Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M

- Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối

- Môi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng gây dung huyết

- Môi trường CT-SMAC: khuẩn lạc tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, màu hồng cánh sen (lên men đường Sorbitol) hoặc màu trắng đục (không lên men đường Sorbitol)

- Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục

- Môi trường Endo: khuẩn lạc màu đỏ

- Môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen

- Môi trường SS: khuẩn lạc có màu đỏ

1.1.2.3 Đặc tính sinh hóa

- Đặc tính lên men và sinh hơi các loại đường: vi khuẩn E coli có khả

năng lên men và sinh hơi một số loại đường như: Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose; lên men không chắc chắn với các loại đường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin

Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi nhanh đường Lactose, còn vi khuẩn

Salmonella spp không có đặc tính này Đây chính là đặc điểm quan trọng để

phân biệt với E coli và Salmonella

- Đặc tính khác:

+ Vi khuẩn làm đông vón sữa sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 370C

+ Vi khuẩn không làm tan chảy gelatin

+ Các phản ứng: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP, Urease, H2S âm tính Vi khuẩn E coli có khả năng khử nitrat thành nitrit, khử

cacboxyl trong môi trường lysine decacboxylase

1.1.2.4 Sức đề kháng

Vi khuẩn E coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 550

C trong 1

giờ hoặc 600C trong 30 phút, đun sôi ở 1000C thì chết ngay Các chất sát trùng như axit phenic 3%, HgCl2 0,5%, formol 1-2% có thể tiêu diệt vi khuẩn nhanh trong 5 phút

Trong phân, chất độn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời, vi khuẩn

có thể tồn tại trên 2 tháng Vi khuẩn E coli có khả năng đề kháng với sự sấy khô và hun khói Những chủng E coli trong phân có xu hướng đề kháng với

nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài Ở môi

trường bên ngoài, các chủng E coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng

(Gross W G 1994) [34]

1.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli được chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc

kháng nguyên O, K, H và F Cho đến nay, có ít nhất 173 kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H đã được xác định (Gyles, 2004) [35]; (Orskov và Orskov, 1992) [67]

1.1.2.5.1 Kháng nguyên O (Somatic antigen)

Kháng nguyên O còn gọi là kháng nguyên thân, bản chất là polysaccharide Polysaccharide là một thành phần của lipopolysaccharide, đây

là thành phần cơ bản cấu tạo nên màng ngoài của vi khuẩn gram âm Kháng nguyên O có khả năng chịu được nhiệt độ, các chất cồn và axit HCN 1N

Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide gồm 3 phần: gồm chuỗi lipit A, một vùng lõi và chuỗi polysaccharide (kháng nguyên O) Khi làm mất dần từng đơn vị đường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn Thành phần lipit trong

kháng nguyên có tác dụng quyết định độc tính của vi khuẩn E coli

Kháng nguyên O không phải là một kháng nguyên đơn (single antigen)

mà gồm một số thành phần và thường được gọi là nhóm kháng nguyên O Các nhóm kháng nguyên O khác nhau có thể có một vài thành phần kháng nguyên

chung, và do đó có thể gây phản ứng chéo giữa các nhóm Phản ứng chéo với

các vi khuẩn khác cũng đã được ghi nhận như Shigella, Salmonella và

Citrobacter (Winkle và cs 1972) [100]

ình 1.1 ấu trúc hán n uyên O (M i n và M rtin , 2006) [56]

KDO: ketodeoxyoctonate, Hep: hepto, Glu: gluco, Gal: galasto, GluNac:

Nacetylglucosamine, GlcN: glucosamine, P: phosphate

1.1.2.5.2 Kháng nguyên H (Flagella antigen)

Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất là protein Việc xác định kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả năng

di động của vi khuẩn được thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên môi trường bán cố thể Hầu hết các kháng nguyên H đều có tính đặc hiệu cao,

ít hoặc không có phản ứng chéo Các chủng không di động được ký hiệu là

NM (Non motile) hoặc H

- Kháng nguyên H kém bền vững hơn so với kháng nguyên O, kém chịu nhiệt, bị phá hủy trong cồn 50% và các enzyme tiêu hóa protein, không bị tác động khi xử lý bằng formol 0,5%

Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông Do vậy, vi khuẩn có

khả năng di động, khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không

di động

Kháng nguyên H không có vai trò về độc lực và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng tạo miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn (Gyles, 2004) [35]

1.1.2.5.3 Kháng nguyên K (Capsular antigen)

Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên vỏ bọc, chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là Polysaccharide Thông

thường, kháng nguyên K sử dụng để định typ E coli không gây ngưng kết

với kháng huyết thanh O tương ứng Việc xác định kháng nguyên K dựa trên đặc điểm hóa học của kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide Có 3 nhóm kháng nguyên K đã được sử dụng là L, A và B ; chúng khác nhau về đặc tính kháng nguyên và khả năng kết hợp với kháng thể khi ở nhiệt độ khác nhau Kháng nguyên K nhóm B và L vô hoạt sau khi đun ở 1000C trong 1 giờ, trong khi nhóm A sau 1 giờ nhưng ở 1210C Khả năng kết hợp với kháng thể của nhóm B không bị mất đi sau khi đun ở 1210

C trong 1 giờ, trong khi nhóm L thì bị mất sau khi ở 1000C trong 1 giờ Xác định kháng nguyên K có thể tiến hành bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính hoặc trong ống nghiệm Nhưng hiện nay, kháng nguyên K ít được sử dụng, mà thường sử dụng kháng nguyên O: H

Một số nhà nghiên cứu cho rằng kháng nguyên K không có ý nghĩa về độc lực (Pourbakhsh và cs 1997) [75]; (McPeake và cs 2005) [60] Bên cạnh

đó, có công trình nghiên cứu chứng minh kháng nguyên K có ý nghĩa về độc lực vì chúng tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ và giúp gắn kết kháng nguyên bám dính vào tế bào biểu mô nhung mao ruột dễ dàng (Gyles, 2004) [35] Kháng nguyên K có tác dụng chống lại sự

thực bào, gồm cả kháng bổ thể trong huyết thanh

Nói chung, các nghiên cứu đều thống nhất về kháng nguyên K với hai chức năng sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết kháng nguyên O của vi khuẩn + Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào cũng như các yếu tố phòng vệ khác của vật chủ

1.1.2.5.4 Kháng nguyên F (Fimbriae antigen)

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh đều có khả năng sản sinh ra một

hoặc nhiều loại kháng nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính (Carter và cs 1995) [25] Kháng nguyên

bám dính giúp vi khuẩn E coli có thể bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề

mặt tế bào biểu mô ruột và lớp màng nhày, chống lại khả năng đào thải vi

khuẩn do nhu động ruột Kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli chính

là các cấu trúc pili (hay còn gọi là Fimbriae) có cấu trúc giống sợi lông, ngắn Fimbriae có bản chất là protein, bao phủ trên bề mặt ngoài của tế bào vi

khuẩn với số lượng từ 200 - 400/ tế bào vi khuẩn

Trước khi cấu trúc hóa học của chúng được biết đến, các kháng nguyên này được gọi là kháng nguyên K như K88 và K99 Tuy nhiên, ngày nay, chúng được gọi là kháng nguyên bám dính F4 và F5

Trong số E coli có khả năng gây tiêu chảy, VTEC được xem là một nhóm

quan trọng gây tiêu chảy có lẫn máu ở người (Levent Akkaya và cs 2006) [52]

1.2.1 Danh pháp

Mặc dù đã được xác định là các chủng E coli có khả năng sản sinh độc

tố VT hoặc Shiga-like toxin và được phân loại là nhóm VTEC, nhưng danh pháp quốc tế của nhóm vi khuẩn này vẫn chưa thống nhất SLTEC (Shiga-like

toxin-producing Escherichia coli) và STEC (Shiga toxin-producing

Escherichia coli) là những tên gọi khác của VTEC

1.2.2 Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn nhóm VTEC

Nhìn chung, ngoại độc tố VT được coi là yếu tố độc lực của VTEC Tuy nhiên, sự có mặt của riêng độc tố VT có thể không đủ gây ra bệnh, những yếu tố được cho là độc lực khác có thể đóng một vai trò nào đó Người ta cho rằng một số yếu tố có liên quan đến khả năng bám dính của VTEC với tế bào biểu mô ruột, gây nên bệnh tích A/E Trong những yếu tố này có plasmid 60-

Mda, mã hóa cho yếu tố bám dính - một loại protein màng ngoài (OMP -

Outer membrane protein), có trọng lượng phân tử 94 kDa, có yếu tố intimin

do gen eae quy định tổng hợp

Trong số các yếu tố này, mới chỉ có VT được xác định rõ vai trò trong quá trình gây bệnh của VTEC

1.2.2.1 Độc tố Verocytotoxin (VT)

Konowalchuk và cs (1977) [46] đã có một công trình nghiên cứu về độc

tố gây độc tế bào (cytotoxin) của E coli Các tác giả đặt tên độc tố này là VT (Verotoxin) Vero là tế bào thận khỉ xanh châu Phi (Cercopithecus aethiops),

thường được dùng trong phòng thí nghiệm, đặc biệt trong các nghiên cứu về virus học Theo Konowalchuk, có hai loại độc tố VT: VT1 và VT2 Độc tố VT1

rất giống độc tố của Shigella dysenteriae typ 1 về mọi phương diện, kể cả miễn dịch học Trong điều kiện in vitro, có thể dùng kháng độc tố Shiga để trung hòa

VT1 Vì thế, VT1 còn được gọi là độc tố giống độc tố Shiga (SLT) Độc tố VT2

không có liên quan gì về miễn dịch học với độc tố của Shigella dysenteriae typ

1, nhưng cũng có khả năng gây độc tế bào như VT1 Konowalchuk nhận thấy rằng một số chủng EPEC có khả năng tổng hợp độc tố VT1 và/hoặc VT2, vì những chủng này gây độc và làm biến dạng tế bào Vero đơn lớp Tuy nhiên, phát

hiện này chưa được chú ý đến khi một vụ dịch do E coli O157: H7 xảy ra ở Mỹ,

và vi khuẩn này có khả năng sản sinh VT

Trong một nghiên cứu độc lập khác, O’Brien và cs (1993) [66] phát

hiện một loại độc tố do E coli O26 sản sinh, gây độc cho tế bào Hela và bị

trung hòa bởi kháng huyết thanh kháng độc tố Shiga Độc tố này được O’Brien gọi là độc tố gần giống độc tố Shiga Nhóm tác giả nhận thấy độc tố này giống

độc tố E coli O157: H7 sản sinh Do đó, cả hai tên gọi SLT và VT đều chỉ một

loại độc tố

Tại hội nghị châu Á về bệnh tiêu chảy tại Bangkok năm 1985, các nhà

vi khuẩn học Sri Lanka (Peiris, Mohamed và Perera) [74] khi trình bày kết

quả nghiên cứu các EPEC có nhận định rằng: các chủng E coli có độc tố VT

thường thấy gây bệnh ở gia súc (trâu, bò), nhưng không có vai trò gì quan trọng trong bệnh tiêu chảy ở người, ít nhất là ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á

Trình tự nucleotit của gen chịu trách nhiệm sản sinh VT1 và trình tự axit amin đã được xác định và so sánh với gen sản sinh độc tố SLT Mặt khác, VT2 và các biến thể của nó có những đặc điểm khác biệt với VT1 Mức độ

tương đồng của trình tự nucleotit và axit amin của VT2 và VT1 khoảng 55 -

60% Các loại VT2 hiện nay đã xác định được gồm có VT2, VT2vha (VT2va), VT2vhb (VT2vb), VT2vp1 (VT2e) và VT2vp2

Schmidt và cs (1994) [82] đã mô tả gen tương tự mã hóa VT2 ở

Citrobacter freundii, được gọi là C freundii slt-IIcA và slt-IIcB Những gen

này cũng đã phân lập được từ Enterobacter cloacae - vi khuẩn có liên quan đến bệnh HUS ở người Nhóm tác giả này cũng báo cáo rằng VT2 từ C

freundii không ổn định do độc tố mất hoạt tính, đồng nghĩa với việc mất gen

mã hóa VT trong quá trình cấy chuyển Các gen giống VT1 cũng đã được

phân lập từ Aeromonas spp từ bệnh nhân bị tiêu chảy và từ môi trường, có

khả năng gây độc đối với tế bào Vero

Cấu trúc chung và cơ chế tác động của các độc tố VT giống với độc tố

Shiga Mỗi độc tố có cấu trúc gồm tiểu phần A - B, 1 tiểu phần A (khoảng 33

kDa) và 5 tiểu phần B (khoảng 7,5 kDa) Tiểu phần A có hoạt tính của một enzyme, tác động ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào, gồm có dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide Tiểu phần B có mang vị trí tiếp xúc của phân tử độc tố với một receptor glycolipid trên màng tế bào

Stein và cs (1992) [84] đã xác định cấu trúc tinh thể của tiểu phần B của VT1 và nhận thấy nó giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố LT

được sản sinh bởi hầu hết các chủng E coli VT là protein không chịu nhiệt,

nhưng khả năng chịu nhiệt của các loại VT khác nhau là khác nhau VT2e là kém chịu nhiệt nhất, nó mất hoạt tính hoàn toàn khi ở 650

C trong 30 phút VT2d có khả năng chịu nhiệt cao nhất, không mất hoạt tính khi ở 750

C trong

60 phút VT1 và VT2 là những độc tố có khả năng chịu nhiệt trung bình

Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), của VT2e là Globotetraosylceramide (Gb4) Gb3 là phức hợp trên màng tế bào nội mạc quản cầu thận Cấu trúc và số lượng những receptor đặc hiệu ở những loài và

mô khác nhau tạo nên sự khác nhau về độ mẫn cảm của tế bào, mô hoặc cơ quan đối với độc tố Tuy nhiên, nguyên nhân chính gây phá hủy thận trong bệnh tiêu chảy có liên quan đến HUS vẫn chưa được làm rõ

Vì ái lực của VT1 đối với Gb3 lớn hơn so với VT2, người ta cho rằng VT1 gắn với tế bào biểu mô ruột và gây phá hủy các tế bào này cũng như hệ thống mạch quản ở ruột, trong khi đó, VT2 có ái lực nhỏ hơn với Gb3 do đó khả năng vào được hệ thống tuần hoàn lớn hơn, theo máu đến các cơ quan, có thể gây HUS hoặc TTP

Khi độc tố được gắn với receptor, tiểu phần A sẽ xâm nhập vào trong tế bào theo cơ chế ẩm bào Sau đó, nó gây dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide, từ đó ức chế việc tổng hợp yếu tố kéo dài chuỗi gắn với ribosome của phân tử RNA vận chuyển Do đó, về cơ bản, sự kéo dài chuỗi peptit bị ngừng lại, ức chế sự tổng hợp protein, dẫn tới giết chết tế bào đích Hình 1.2 minh họa quá trình tác động của độc tố VT

Hình 1.2 ơ chế tác độn củ độc tố V

Các nghiên cứu dịch tễ học trong thời gian gần đây tại Mỹ và Anh đều chỉ ra rằng bị nhiễm VTEC có thể sản sinh cả hai loại độc tố VT1 và VT2 hoặc chỉ VT2 gây ra các tình trạng bệnh phức tạp hơn so với khi nhiễm các chủng chỉ sản sinh VT1 Các nhà nghiên cứu đã so sánh khả năng gây độc của những độc tố này trên chuột Họ phát hiện VT2 có liều LD50 thấp hơn gần 400 lần so với VT1 Hơn nữa, VT2 bền hơn với nhiệt độ và pH Độc tính của VT

đã được thí nghiệm trong điều kiện in vitro sử dụng phương pháp nhân nhanh

tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người Phương pháp sử dụng tế bào Vero để

đo lường khả năng gây độc bằng tính toán số lượng tế bào hủy hoại, rời ra khỏi lớp tế bào tầng đơn Một liều gây độc 50% tế bào đòi hỏi khoảng 1 pg độc tố Nó gần tương tự như giá trị CD50 của VT1 và VT2 đối với tế bào Hela Khả năng gây độc của từng loại VT cũng khác nhau Takeda (1995) [86] đã thống kê hoạt tính sinh học của các loại VT như sau:

Ghi chú : CD 50 (đơn vị tính) : Liều gây độc 50% tế bào Vero

LD 50 (đơn vị tính): Liều gây chết 50% chuột thí nghiệm

1.2.2.2 Gen eaeA (giúp bám dính và xâm nhập)

Gen eaeA đặc trưng của nhóm EPEC Gen này đóng vai trò cho việc

gắn tế bào vi khuẩn vào màng tế bào ruột, gây nên bệnh tích đặc trưng A/E Một số vi khuẩn thuộc nhóm EHEC cũng gây ra bệnh tích này do chúng có

thể có gen eae Vị trí gắn của các tế bào vi khuẩn dẫn tới sự phá hủy các lông

rung và hệ xương của tế bào chủ Beebakhee và cs (1992) [13] đã giải trình

tự gen eae của serotyp O157: H7 và thấy có sự tương đồng với gen này của nhóm EPEC Các tác giả cũng khẳng định sự tương đồng tới 50% với gen eae của Yersinia pseudotuberculosis Tương tự, Yu và Kaper (1992) [93] cho rằng gen eae có thể mã hóa cho một protein ngoài màng có trọng lượng phân tử 94 kDa (OMP) Tuy nhiên, Dytoc và cs (1994) [29] khẳng định gen eae khác so

với gen mã hóa cho OMP (sử dụng phương pháp giải trình tự peptit và miễn dịch học) Các tác giả quan tâm đến các yếu tố khác đã xác định được độc

tính hơn là gen eae và plasmid 60 - Mda, như CL8 - 57JB, Cl8 - 106JB, là

những protein bị bất hoạt nếu có sự đột biến của gen TnphoA Dytoc và cs (1994) [29] đã có báo cáo về sự khác nhau của khả năng bám dính giữa

serotyp O113: H21 (không có gen eae) và O157: H7 Allerberger và cs

(1996) [12] cũng đã phân lập thêm hai chủng VTEC không thuộc nhóm

O157: H7 và không mang gen eae từ những trẻ em bị tiêu chảy xuất huyết

Các tác giả cho rằng chúng có thể mang yếu tố bám dính khác mà chưa được xác định rõ

Một nghiên cứu về khả năng gây tiêu chảy của E coli O157: H7 sử

dụng lợn con làm động vật gây nhiễm đã được Donnenberg và cs tiến hành

năm 1993 [27] Các tác giả cho rằng một sự đột biến của gen eae ở chủng vi

khuẩn này có thể hạn chế khả năng bám dính của vi khuẩn Hơn nữa, khi gen

eae ở các vi khuẩn thuộc nhóm EPEC hoặc EHEC được bộc lộ, khả năng bám

dính sẽ được phục hồi McKee và O’Brien (1996) [60] đã xác định được yếu

tố intimin - sản phẩm của gen eae Intimin là một protein ngoài màng, trọng

lượng phân tử 97 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính của

E coli O157: H7 Kết luận này được khẳng định bằng phân tích cấu trúc -

chức năng của gen eae và bằng phương pháp chặn sự bám dính của vi khuẩn

vào tế bào HEp-2 sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu của intimin

Louie và cs (1994) [54] nghiên cứu gen eae ở VTEC phân lập từ trâu

bò bị tiêu chảy nặng và từ người bị HUS hoặc HC và đã kết luận rằng 82%

VTEC phân lập từ người và 59% phân lập từ trâu bò có mang gen eae Mainil

và cs (1993) [57] nhận thấy rằng 75% các chủng E coli phân lập từ trâu bò bị tiêu chảy có gen eae là VTEC Sandhu và cs (1996) [81] nghiên cứu về gen

eae ở các chủng VTEC phân lập được từ trâu bò khỏe mạnh, kết quả có

35,2% số chủng VTEC có gen này và hầu hết đều thuộc các nhóm kháng nguyên O chính Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở nghiên cứu của

Wieler và cs (1996) [97] Cấu trúc gen eae ở E coli O157 được nghiên cứu

bằng phương pháp lai mẫu dò DNA Kết quả cho thấy tất cả các chủng VTEC

O157 đều có phản ứng bắt cặp với mẫu dò gen eae Tuy nhiên, trong 129

E coli O157 không sản sinh VT, 10 chủng vẫn có phản ứng với mẫu dò gen eae Beutin và cs (1994) [19] đã nghiên cứu các yếu tố độc lực của các chủng

VTEC phân lập được từ người Trong 54 chủng, 94% có gen eae Tuy nhiên, Schmidt và cs (1994) [82] cho rằng không nên sử dụng mồi eae mà sử dụng

mồi VT để xác định VTEC Kết quả của nhóm tác giả này chỉ ra 2 trong 6

VTEC không phản ứng với mồi eae, 3 trong 7 chủng E coli có gen eae không

phản ứng với mồi VT Các chủng VTEC phân lập được từ phân người và thực

phẩm có nguồn gốc động vật ở Úc cũng có gen eae và kết quả này được công

bố trong nghiên cứu của Paton và cs (1996) [70] VTEC chủng O111: H

và O157: H- phân lập được từ bệnh nhân bị HUS và HC cũng dương tính với

eae Nhưng, chủng O91, O123 và O128 phân lập được từ bệnh nhân HC cho

kết quả âm tính với eae Kết quả trên cho thấy vai trò của gen eae trong cơ

chế gây bệnh của vi khuẩn vẫn chưa được khẳng định chắc chắn và cần thêm nhiều nghiên cứu nữa về yếu tố này

1.2.2.3 Plasmid 60 - Megadalton

Karch và cs (1987) [45] là nhóm tác giả đầu tiên quan sát và nghiên

cứu về plasmid 60 - Megadalton (MDa) ở E coli O157: H7 phân lập được từ

bệnh nhân bị HC và HUS Mặc dù được phát hiện từ 13 trong 14 chủng

E coli O157: H7 phân lập được nhưng vai trò của yếu tố này trong quá trình

gây bệnh chưa được làm rõ khi thí nghiệm với lợn con gây nhiễm Do đó, mặc dù có mặt ở các chủng O157: H7, vai trò gây độc của yếu tố này vẫn chưa được kết luận đầy đủ

1.2.2.4 Độc tố gây xuất huyết ruột (Enterohaemolysin)

Một vài chủng có khả năng gây dung huyết đã được xác định trong các

nhóm E coli khác nhau Gây xuất huyết ruột là một đặc điểm điển hình của

nhóm EHEC Schmidt và cs (1994, 1995) [82][83] cho biết hiện tượng xuất

huyết ruột là kết quả của sự có mặt của một loại protein - đó là protein gây xuất huyết ruột EHEC (EHEC Hly - EHEC haemolysin protein) EHEC - Hly

được mã hóa bởi một plasmid lớn, liên quan tới dung huyết kiểu alpha

Schmidt và cs (1995) [83] cũng đã xây dựng phương pháp PCR để xác

định EHEC - hlyA Khoảng 90% VTEC có khả năng sản sinh độc tố này Hầu

hết các chủng VTEC gây xuất huyết ruột (98,4%) phân lập từ động vật đều có trình tự DNA đặc hiệu cho plasmid mã hóa độc tố xuất huyết ruột Để xác định yếu tố này, sử dụng thạch máu cừu có bổ sung Canxi (WSBA-Ca : Wash sheep blood agar with Calcium) Sau 4 giờ nuôi cấy, nếu quan sát thấy hiện tượng dung huyết là dung huyết kiểu alpha ; còn nếu để qua đêm mới quan sát thấy hiện tượng dung huyết thì chỉ chứng tỏ sự có mặt của độc tố xuất huyết ruột Do có sự liên quan chặt chẽ giữa sự sản sinh VT và độc tố gây xuất huyết ruột nên sự biểu hiện của độc tố này là một đặc điểm tốt cho việc xác

định nhanh và đơn giản các chủng VTEC Sự tồn tại của EHEC - Hly ở

EHEC là một đặc điểm quan trọng vì nó có ở mọi chủng O157 phân lập được

từ bệnh nhân HUS và từ mọi chủng VTEC phân lập được từ trẻ em bị HC

1.2.3 Vai trò của VTEC không thuộc nhóm O157

Mặc dù các triệu chứng của các bệnh nghiêm trọng ở người như HC và HUS hầu hết đều liên quan đến các chủng O157 (Beutin và cs 1994) [19], vẫn còn một số trường hợp bệnh lẻ tẻ do các chủng không thuộc nhóm O157 gây ra

Có hơn 30 nhóm kháng nguyên O hoặc 100 serotyp O: H khác nhau được cho là có liên quan tới một số ca bệnh HUS và HC ở người (Paton và cs 1996) [70] Đó là các nhóm O1, O2, O4, O5, O6, O18, O22, O23, O25, O26, O38, O39, O45, O48, O50, O55, O73, O75, O82, O84, O91, O100, O103, O104, O111, O113, O114, O115, O117, O118, O119, O121, O125, O126, O128ab, O132, O145, O146, O153, O163, O165, O166 và một số chủng chưa được định typ khác Các VTEC khác không thuộc nhóm O157 nên được chú ý hơn ở một số quốc gia Ví dụ nguyên nhân thường gặp của HUS là các chủng không thuộc nhóm O157 như O104: H2 ở Pháp, O111: H-

ở Úc Trước đây, đã

có một sự nhầm lẫn khi cho rằng chỉ những chủng E coli O157 không lên men

sorbitol mới thuộc nhóm EHEC, do đó đã có rất nhiều chủng EHEC quan trọng

bị bỏ qua Có rất nhiều chủng EHEC phân lập được từ các trẻ em bị HUS như O6: H31, O26: H11, O91: H10, O98: H-, O111: H-, O111: H12, O146: H8, O157: H-,… (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan, 1997) [38]

Cũng đã có một số báo cáo về các vụ dịch do VTEC không thuộc nhóm O157 gây ra Năm 1992, ở Italia, O111: H- đã gây ra nhiều ca bệnh HUS Ở

Úc, báo cáo ca bệnh HUS đầu tiên do VTEC gây ra là vào năm 1987 Kiểm tra

mẫu phân, các bác sỹ đã phân lập được chủng E coli O111: H2 Pryor và cs

(1990) [76] phân lập được O111 từ các bệnh nhân bị HC, mà trong đó không

sử dụng phương pháp phân lập các chủng O157 không lên men sorbitol Ở Úc, Paton và cs (1996) [70] kết luận chủng O111: H- là nguyên nhân gây ra một vụ dịch HUS ở Adelaide, Nam Úc, liên quan tới việc sử dụng nước sốt lên men Các chủng vi khuẩn này đã gây chết một người, 23 trẻ em phải nhập viện và 18 trẻ em bị HUS Chủng vi khuẩn này đã được phân lập từ mẫu phân của 18 trong số 23 bệnh nhân và từ 4 trong 5 mẫu nước sốt Do đó, chủng O111 trở thành nguyên nhân gây HC và HUS chủ yếu ở Úc Ở Đức, chủng O111: H-

là chủng không thuộc nhóm O157 thường gặp nhất liên quan tới HUS ở trẻ em

Có một số chủng E coli không thuộc nhóm O157, không lên men đường

sorbitol, là nguyên nhân gây HUS, như O104: H21 ở Montana (Mỹ) Ở Đức, từ

1988 - 1989, từ 91% bệnh nhân HUS đã phân lập được E coli O157 Tuy

nhiên, năm 1994, một số chủng khác phân lập được thường xuyên hơn chủng O157 Điều này đưa ra một gợi ý về sự dịch chuyển dịch tễ học hướng về các chủng khác hơn là về O157 và có thể xảy ra ở các quốc gia khác nhau Ở Úc, tỷ

lệ phân lập O157 và các chủng khác ở trẻ em là tương đương nhau Các chủng O157: H- lên men sorbitol cũng đã được phân lập từ 21 bệnh nhân HUS ở Đức năm 1988 Ngoài ra, kiểu gen và kiểu hình của chúng giống với các chủng O157: H7 lên men sorbitol Ở Canada, VTEC O26: H11 là chủng phổ biến thứ

hai sau O157: H7 Serotyp này thường gặp ở trâu bò, bê bị tiêu chảy và đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới, nhưng không nhiều ở Nhật Bản, Anh, Argentina Ở người, VTEC O26: H11 gây một vài trường hợp bệnh riêng lẻ và một số ca bệnh tiêu chảy, HC và HUS (Lai king và cs 2005) [48]

Nhiều chủng không thuộc nhóm O157 có nhiều yếu tố độc lực như sản

sinh độc tố VT, gen eae, plasmid EHEC và độc tố gây xuất huyết ruột, do

vậy, chúng được xếp vào nhóm EHEC Tuy nhiên, nhiều vi khuẩn thuộc nhóm EHEC thiếu một hoặc nhiều yếu tố độc lực nhưng vẫn gây HUS và HC Liều gây nhiễm của các chủng không thuộc nhóm O157 cũng tương đương với chủng thuộc nhóm O157 Có thể chỉ với một số lượng rất nhỏ, dưới 10 vi khuẩn cũng có thể gây ra những bệnh trầm trọng ở người mẫn cảm Do đó, các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 gây bệnh HUS và HC ở người cũng cần được chú ý như VTEC O157 (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan, 1997) [38]

1.2.4 VTEC ở động vật

Carlton (2004) [24] cho rằng tỷ lệ VTEC ở động vật dao động khoảng 6% - 100% Các nghiên cứu đều cho thấy hầu hết các đàn gia súc đều có O157 cũng như các VTEC khác nhưng hiện có ít thông tin về các yếu tố ảnh hưởng tới sự thải VTEC ra ngoài môi trường của động vật

1.2.4.1 VTEC O157 ở động vật

Thông thường, E coli O157 có thể được tìm thấy trong đường tiêu hóa

của một số loài như trâu bò, cừu, gia cầm, trong đó trâu bò đóng vai trò là nguồn tàng trữ chính (Levent Akkaya và cs 2006) [52]

Trên thế giới, đặc biệt ở Mỹ, đã có nhiều nghiên cứu về E coli O157:

H7 ở vật nuôi, thường trên trâu bò Hancock và cs (1994) [37] thấy rằng chỉ có

10 trong 3.570 (0,28%) mẫu phân bò sữa và 10 trong 1.412 (0,71%) mẫu phân

bò thịt có chứa E coli O157: H7 Zhao và cs (1995) [94] đã tiến hành xác định

sự tồn tại của E coli O157: H7 trên bê ở các đàn bò sữa Nhóm nghiên cứu đã

sử dụng các đàn bò đã phân lập được E coli O157: H7 trước đó làm đàn thí

nghiệm, ở các đàn này tỷ lệ dương tính với vi khuẩn cao hơn so với đàn đối chứng (50% và 22%) Tương tự, tỷ lệ phân lập phụ thuộc vào lứa tuổi của động vật Tuy nhiên, không có sự khác nhau về lứa tuổi giữa đàn đối chứng và đàn

thí nghiệm Bê sau cai sữa 4 tháng thường thải E coli O157: H7 theo phân, với

tỷ lệ phân lập từ các mẫu phân ở đàn thí nghiệm là 5,3% và 4,9% ở đàn đối

chứng E coli O157: H7 phân lập được từ những bê trong độ tuổi từ 24 giờ sau

khi sinh đến cai sữa là 1,5% ở đàn đối chứng và 2,9% ở đàn thí nghiệm Một nghiên cứu bệnh chứng của Garber và cs (1995) [33] cũng cho kết quả tương

tự Họ nhận thấy E coli O157: H7 phân lập được ở các bê nuôi lấy sữa thường

là những bê sau cai sữa (4,8%) hơn là trước cai sữa (1,4%)

Trong một nghiên cứu khác, Faith và cs (1996) [31] đưa ra kết luận tỷ

lệ E coli O157: H7 ở đàn bò sữa là 7% và ở các động vật khác là 1,8% Hơn

nữa, các tác giả này cũng kết luận rằng: bò cái tơ và trâu là nguồn tàng trữ

E coli O157: H7 quan trọng giống như bê Ở Anh, Mechie và cs (1997) [61]

nghiên cứu tỷ lệ E coli O157: H7 ở một đàn bò sữa đã dương tính với vi

khuẩn này trước đó trong một thời gian khoảng 15 tháng Kết quả là tỷ lệ vi khuẩn này trong khoảng từ 0% vào mùa đông và đạt cao nhất là 14% ở bò đang tiết sữa, 40% ở bò cạn sữa, 56% ở bê và 68% ở bò cái tơ vào đầu mùa hè Kết quả tương tự cũng thu được khi nghiên cứu trên cừu và trên bò thịt Kudva

và cs (1997) [47] thấy tỷ lệ E coli O157: H7 ở cừu trong khoảng từ 0% (vào mùa đông) đến 30% (vào mùa hè) Các kết quả trên cho thấy tỷ lệ E coli O157:

H7 ở bò và cừu có ý nghĩa quan trọng và phụ thuộc vào mùa trong năm

E coli O157: H7 không gây bệnh cho bê từ 3 tuần tuổi trở lên Tính

gây bệnh của vi khuẩn có liên quan đến tuổi, bê ở giai đoạn dưới 36 giờ sau

khi sinh bị gây nhiễm E coli O157: H7 ở giai đoạn 18 giờ sau khi sinh thấy

có biểu hiện tiêu chảy, viêm ruột, có bệnh tích A/E ở cả ruột non và ruột

già Không có bằng chứng cho thấy E coli O157: H7 không gây bệnh ở bê

đã cai sữa

Một số thí nghiệm khác cho thấy E coli O157: H7 không gây bệnh cho

bê Vi khuẩn không phát triển ở niêm mạc đường tiêu hóa, nhưng có thể tồn tại trong chất chứa dạ cỏ và kết tràng, có thể phát hiện theo từng đợt trong phân một thời gian dài Rasmussen và cs (1993) [77] nhận thấy chất chứa dạ

cỏ đặc biệt ở những trâu bò lớn nhanh là một nguồn chứa E coli O157: H7

Hơn nữa, vi khuẩn này có khả năng tồn tại một thời gian ngoài đường tiêu hóa

có thể là một nguyên nhân gây ra các vụ dịch liên quan đến sử dụng rau được bón phân trâu bò Tương tự, các hoạt động sống của động vật và việc sử dụng chung nước uống, thức ăn trong chuồng có thể có tác động làm lây lan vi khuẩn trong đàn Hơn nữa, nước uống bị nhiễm vi khuẩn còn là một nguồn

tàng trữ và lan truyền E coli O157: H7

Khi nghiên cứu về E coli O157: H7 trên thịt gà ở Thổ Nhĩ Kỳ, Levent

Akkaya và cs (2006) [52] cho rằng vi khuẩn này có trong đường ruột của gà

và được thải ra ngoài theo phân trong vài tháng Sau đó, từ những gà này,

E coli O157: H7 có thể nhiễm chéo sang các gà hoặc thịt gà trong quá trình

vận chuyển và/hoặc quá trình giết mổ; bằng chứng là tỷ lệ dương tính 1,05% trong số 190 mẫu thịt gà được kiểm tra trong nghiên cứu Việc phân lập được

E coli O157: H7 trên thịt gà cho thấy gà nói riêng và gia cầm nói chung có

thể là một nguồn tàng trữ khác, dễ dàng lây nhiễm sang người nếu không có các biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt

1.2.4.2 VTEC không thuộc nhóm O157 ở động vật

Có nhiều nghiên cứu về VTEC ở động vật đã được tiến hành Cray và

cs (1996) [26] đưa ra tỷ lệ 5,9% của 1.305 chủng E coli phân lập được từ

phân của bò cái tơ là VTEC Ở Đức, Beutin và cs (1993) [18] đã nghiên cứu

về VTEC ở 7 loài khác nhau VTEC thường phân lập được từ cừu (66,6%)

hơn là từ dê (56,1%) và trâu bò (21,1%) và thấp hơn nữa là ở lợn (7,5%), mèo (13,8%) và chó (4,8%) Không phân lập được chủng nào từ gà Ở Tây Ban Nha, phân lập được VTEC từ 35% bò khỏe mạnh và 37% bê khỏe mạnh Ở Canada, VTEC thường phân lập được ở bê nuôi lấy sữa (24,7%) hơn là từ bò sữa trưởng thành (9,5%) Ở Italia, VTEC phân lập được từ 18,3% bê nuôi lấy sữa và 7,8% lợn

Một nghiên cứu về tỷ lệ VTEC từ các chủng E coli phân lập được từ vật nuôi bị bệnh ở Mỹ chỉ ra rằng 2,8% các chủng E coli phân lập từ bò,

6,1% từ cừu, 4% từ lợn là VTEC Ở Tây Ban Nha, VTEC thường phân lập được từ bê bị tiêu chảy (20,5%) Nghiên cứu này cũng cho biết các chủng khác không thuộc nhóm O157 có tỷ lệ phân lập trội hơn ở cả trâu bò bị tiêu chảy và khỏe mạnh Hơn nữa, trong 126 chủng VTEC phân lập được có 27 nhóm kháng nguyên O khác nhau đã được xác định; trong khi đó con số này ở Đức là 16 nhóm (trong 28 chủng) Tuy nhiên, ở Mỹ, Cray và cs (1996) [26] chỉ thấy 18 nhóm kháng nguyên O khác nhau trong 77 chủng VTEC phân lập

từ phân bò cái tơ

60% các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 phân lập từ trâu bò có khả năng gây bệnh cho người, đặc biệt các bệnh nặng như HC và HUS Montenegro và cs (1990) [65] cho rằng tỷ lệ này chỉ khoảng 40% trong khi Blanco và cs (2006) [20] cho rằng tỷ lệ này thay đổi từ 45% vào năm 1994 đến 60% năm 1997 Beutin và cs (1993) [18] thấy rằng 60% VTEC phân lập

từ 7 loài vật nuôi khỏe mạnh có khả năng gây bệnh cho người Hiện nay, VTEC O26 thường phân lập được từ trâu bò và có các đặc tính giống với các chủng phân lập được ở người (Wieler và cs 1996) [97] Mặc dù, cho tới nay vẫn chưa có bằng chứng cụ thể rằng các chủng O26 có nguồn gốc từ trâu bò gây bệnh cho người (Jenkins và cs 2003) [43] Nhóm vi khuẩn này đã được cảnh báo là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở người và được cho có liên quan tới một vụ dịch lớn ở Ireland (McMaster và cs 2001) [59]