Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS), sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để phát hiện virus

tiêu quang an nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lí của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản prrs, Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để Phát HIệN VIRUS Luận án tiến sỹ nông nghiệ

tiêu quang an

nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lí của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (prrs),

Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để Phát HIệN VIRUS

Luận án tiến sỹ nông nghiệp

hà nội - 2012

tiêu quang an

nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lí của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (prrs),

Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để Phát HIệN VIRUS

Chuyên ngành : Bệnh lí học và chữa bệnh vật nuôi Mã số : 62.62.50.01

Luận án tiến sỹ nông nghiệp

Ng-ời h-ớng dẫn khoa học

1 GS.TS đậu Ngọc Hào

2 Pgs ts nguyễn hữu nam

hà nội - 2012

Tôi xin cam đoan: Công trình khoa học này là của riêng tôi Các số liệu

và các kết quả trong luận án của tôi là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác Các thông tin sử dụng và trích dẫn trong luận án đều chính xác và có nguồn gốc rõ ràng

Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2012

Tác giả

Tiêu Quang An

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Viện Đào tạo Sau đại học, Khoa Thú Y – tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo cho tôi những điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành ch-ơng trình học tập và nghiên cứu của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo ở bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú Y – Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, những ng-ời đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện thành công từng thí nghiệm của đề tài nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Đậu Ngọc Hào là thầy h-ớng dẫn và luôn định h-ớng giúp tôi thực hiện đề tài một cách khoa học và chặt chẽ nhất

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Hữu Nam là thầy h-ớng dẫn trực tiếp, luôn tận tụy giúp tôi thực hiện từng b-ớc nhỏ nhất từ khi bắt đầu, đến lúc hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Lan – Bộ môn bệnh lý – khoa Thú Y đã cung cấp tài liệu và cho tôi những đóng góp quí báu trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng xin đ-ợc bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến những ng-ời thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp luôn giúp đỡ, động viên tôi để tôi hoàn thành luận án này

Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2012

Tỏc giả luận ỏn

Tiêu Quang An

bp : Base pair

CMI : Cell Mediated Immunity

CPE : Cytopathogenic Effect

cs : Cộng sự

DTL : Dịch tả lợn

EAV : Equine Ateritis Virus

ELISA : Enzyme - linked immunosorbent assay

FBS : Fetal Bovin Serum

GP5 : Glycoprotein 5

HE : Haematoxilin – Eosin

HMDTB : Hóa miễn dịch tế bào

IFA : Indirect fluorescent antibody test

IHC : Immuno Histochemistry

IL : Interleukin

IPMA : Immunoperoxidase monolayer assay

KT : Kháng thể

KTTH : Kháng Thể Trung Hòa

LDEV : Lactate Dehydrogenase elevating virus

MDS : Mystery dissease syndrome

MOI : Multiplisity Of Infection

NK : Natural Killer

NSP : Nonstructural Protein

PAM : Porcine Alveolar Macrophage

PBS : Photphat Buffer Salin

PCR : Polymerase Chain Reaction

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory and Syndrome

Virus RT-PCR : Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction sGOT : Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase

sGPT : Serum Glutamic Pyruvic Transaminase

SHF : Simian Hemorrhagic Fever Virus

SIRS : Swine Infertiliti and Respiratory Syndrome

SN : Serum Neutralize

SRRS : Swine Respiratory Reproductive Syndrome

TCID50 : 50% Tissue Culture Infective Dose

TNF- : Tumor Necrosis Factor - alpha

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) 5

1.1 M m bệnh 5

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 5

1.1.2 Hình thái cấu trúc của PRRSV 8

1.1.3 Sức đề kháng của PRRSV 11

1.1.4 Đặc tính nuôi cấy của PRRSV 12

1.2 Dịch tễ học 13

1.2.1 Loài mắc bệnh 13

1.2.2 Chất chứa m m bệnh và sự lây truyền 13

1.2.3 Điều kiện lây lan 14

1.3 Cơ chế gây bệnh 14

1.4 Đáp ứng miễn dịch lợn v i PRRSV 16

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 16

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào 17

1.4.3 Đáp ứng miễn dịch interferon 17

1 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam 18

1 .1 Một số đặc điểm dịch tễ của PRRS tại Việt Nam 19

1 .2 Khuyến cáo công tác phòng, chống dịch PRRS tại Việt Nam 20

1.6 Chẩn đoán PRRS 21

1.6.1 Phát hiện virus 21

1.6.2 Chẩn đoán huyết thanh học 22

1.7 Phòng bệnh 26

1.7.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh chăn nuôi tốt 26

1.7.2 Phòng bệnh bằng vaccine 26

2.1 Nghiên cứu PRRS trên thế gi i 30

2.2 Nghiên cứu về PRRS Việt Nam 32

2.3 Một số nghiên cứu đặc điểm bệnh l , ch huyết học trên lợn mắc tại PRRS tại Việt Nam 34

2.3.1 Các nghiên cứu về đặc điểm bệnh lí trên lợn mắc PRRS 34

2.3.2 Một số nghiên cứu về PRRS trên lợn gây bệnh thực nghiệm 35

2.4 Vi khuẩn kế phát trong các dịch PRRS 38

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 40

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 40

2.2.1 Nghiên cứu diễn biến dịch tại một số địa phương 40

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm bệnh lí chủ yếu của lợn mắc PRRS 40

2.2.3 Nghiên cứu một số ch tiêu huyết học khi lợn mắc PRRS 41

2.2.4 Áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) để chẩn đoán PRRSV 41

2.3 NGUYÊN LIỆU 41

2.3.1 Dụng cụ 41

2.3.2 Hóa chất thí nghiệm 41

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.4.1 Phương pháp quan sát 42

2.4.2 Phương pháp m khám toàn diện 42

2.4.3 Phương pháp điều tra hồi cứu 42

2.4.4 Phương pháp lấy mẫu 43

2.4 Phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào Marc-145 43

2.4.6 Phương pháp RT-PCR 44

2.4.9 Phương pháp xét nghiệm các ch tiêu huyết học 51 2.4.10 Phương pháp xét nghiệm một số vi khuẩn kế phát trong dịch PRRS 51 2.4.11 Phương pháp thống kê sinh học dùng để xử l số liệu c n thiết 51 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DIỄN BIẾN DỊCH PRRS TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG 53 3.1.1 Diễn biến tình hình dịch PRRS các t nh vùng tả ngạn sông

Hồng từ năm 2007-2010 53 3.1.2 Tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu đàn được khảo sát trong địa bàn

nghiên cứu 57 3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hư ng của qui mô chăn nuôi đến dịch

bệnh PRRS 64 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC PRRS 67 3.2.1 Kết quả xác định triệu chứng lâm sàng đặc trưng của lợn mắc PRRS 67 3.2.2 Nghiên cứu sự biến đ i về thân nhiệt khi lợn mắc PRRS 69 3.2.3 Ảnh hư ng của PRRSV đối v i lợn nái sinh sản 73 3.2.4 Hậu quả về rối loạn sinh sản trên đàn lợn nái sống sót sau dịch PRRS 74 3.2 Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS 77 3.2.6 Ảnh hư ng của vi khuẩn kế phát đến biến đ i bệnh lí của

lợn mắc PRRS 84 3.2.7 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể của lợn mắc PRRS 98 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA LỢN MẮC PRRS 106 3.3.1 Kết quả khảo sát một số ch tiêu hệ hồng c u của lợn bệnh 106 3.3.2 Kết quả nghiên cứu một số ch tiêu hệ bạch c u của lợn bệnh 109

3.4 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH ĐỂ CHẨN

ĐOÁN PRRS 115 3.4.1 Chẩn đoán PRRS bằng phản ứng RT-PCR 116 3.4.2 Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp nuôi cấy phân lập virus trên môi

trường tế bào Marc-145 117 3.4.3 Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) 120 3.4.4 Mối tương quan giữa bệnh tích đại thể, vi thể của lợn mắc PRRS v i kết

quả nhuộm hóa mô miễn dịch 124 3.4 So sánh kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch v i các phương pháp chẩn

đoán RT-PCR và Phân lập virus trên môi trường tế bào Marc-145 125 Chương 4: KẾT LUẬN TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hệ gen của các chủng PRRSV trên thế gi i 7

Bảng 1.2 T ng hợp tình hình dịch PRRS trong 4 năm (2007-2010) 19

Bảng 2.1 Thành ph n phản ứng RT - PCR 45

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT - PCR 46

Bảng 3.1 Diễn biến tình hình dịch PRRS các t nh vùng tả ngạn sông Hồng từ năm 2007-2010 54

Bảng 3.2 T ng hợp số lợn mắc bệnh trong vùng dịch PRRS từ năm 2007 – 2010 địa bàn nghiên cứu 55

Bảng 3.3 Tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu đàn được khảo sát trong địa bàn nghiên cứu 57

Bảng 3.4 T ng hợp tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS trong địa bàn nghiên cứu 59

Bảng 3 Tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS theo cơ cấu đàn được khảo sát trong địa bàn nghiên cứu 61

Bảng 3.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hư ng của qui mô chăn nuôi đến dịch bệnh PRRS 65

Bảng 3.7 Triệu chứng của lợn ốm trong vùng dịch PRRS 67

Bảng 3.8 Kết quả đo thân nhiệt lợn mắc PRRS 70

Bảng 3.9 Tỷ lệ nhiễm PRRSV trên đàn nái sinh sản 73

Bảng 3.10 Ảnh hư ng của PRRS sau khi khỏi bệnh đến sự sinh sản của đàn lợn nái 74

Bảng 3.11 Bệnh tích đại thể ph i và hạch ph i lợn mắc PRRS 77

Bảng 3.12 Bệnh tích đại thể một số cơ quan của lợn mắc PRRS 79

Bảng 3.13 Kết quả phân lập vi khuẩn kế phát trên lợn trong vùng dịch PRRS 85

Bảng 3.14 Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn APP phân lập 86 Bảng 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

P multocida phân lập 87

Bảng 3.17 Kết quả định typ vi khuẩn Actinobacillus Pleuropneumoniae (APP) 89

Bảng 3.18 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn P multocida trên chuột

thí nghiệm 90Bảng 3.19 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn St suis trên chuột thí nghiệm 91Bảng 3.20 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn APP trên chuột thí nghiệm 92Bảng 3.21 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm v i kháng sinh của vi

khuẩn phân lập 93Bảng 3.22 So sánh bệnh tích ph i lợn mắc PRRS v i một số bệnh ph i

thường gặp 95Bảng 3.23 Bệnh tích vi thể ph i, hạch ph i và hạch Amidan của lợn

mắc PRRS 98Bảng 3.24 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể gan, lách và thận của

lợn mắc PRRS 102Bảng 3.2 Bệnh tích vi thể tim, hạch ruột và ruột của lợn mắc PRRS 103Bảng 3.26 Kết quả khảo sát một số ch tiêu hệ hồng c u của lợn bệnh 106Bảng 3.27 Kết quả khảo sát ch tiêu bạch c u của lợn bệnh 109Bảng 3.28 Kết quả nghiên cứu biến động bạch c u của lợn mắc PRRS 111Bảng 3.29 Kết quả nghiên cứu về ch tiêu GOT & GPT 113Bảng 3.30 Kết quả khảo sát hàm lượng protein huyết của lợn bệnh 114Bảng 3.31 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc-145 118Bảng 3.32 Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch một số cơ quan của lợn

mắc PRRS 121Bảng 3.33 Mối tương quan giữa bệnh tích đại thể, vi thể và kết quả

nhuộm hóa mô miễn dịch 124Bảng 3.34 So sánh kết quả của các phương pháp dùng trong chẩn

đoán PRRS 126

Hình 1.1 Quan hệ về nguồn gốc di truyền của virus PRRS v i các virus

khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae theo Gorbalenya

và cs, (2006) 6

Hình 1.2 Virus PRRS 9

Hình 1.3 Cấu trúc virus PRRS 9

Hình 1.4 Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS 10

Hình 1.5 Đại thực bào bình thường 15

Hình 1.6 Đại thực bào bệnh lí 15

Hình 3.1 Biểu đồ t ng hợp số lợn mắc bệnh trong vùng dịch PRRS từ năm 2007 – 2010 địa bàn nghiên cứu 56

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn tình hình lợn mắc PRRS theo cơ cấu đàn trong địa bàn nghiên cứu 58

Hình 3.3 Biểu đồ t ng hợp tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu đàn trong địa bàn nghiên cứu 59

Hình 3.4 Biểu đồ t ng hợp tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS 60

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS theo cơ cấu đàn được khảo sát trong địa bàn nghiên cứu 62

Hình 3.6 Biểu đồ t ng hợp tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS theo cơ cấu đàn, khảo sát trong địa bàn nghiên cứu 63

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn kết quả nghiên cứu ảnh hư ng của qui mô chăn nuôi đến dịch bệnh PRRS 66

Hình 3.8 Lợn ốm ngày thứ 1 72

Hình 3.9 Lợn chết do PRRS 72

Hình 3.10 Lợn tím tai, xanh tai 72

Hình 3.11 Lợn sốt cao, thân đỏ, nôn mửa 72

Hình 3.12 Lợn ủ rũ mệt mỏi 72

Hình 3.15 Thai chết lưu 76

Hình 3.16 Sẩy thai kỳ chửa đ u 76

Hình 3.17 Lợn nái đẻ non 76

Hình 3.18 Thai chết lưu và thai gỗ 76

Hình 3.19 Lợn đực giống mắc PRRS 76

Hình 3.20 Màng bao tim viêm tơ huyết 80

Hình 3.21 Xoang ngực tích nư c 80

Hình 3.22 Bệnh tích gan lợn mắc PRRS 80

Hình 3.23 Bệnh tích ruột lợn mắc PRRS 81

Hình 3.24 Bệnh tích hạch màng treo ruột lợn mắc PRRS 81

Hình 3.2 Bệnh tích lách lợn mắc PRRS 82

Hình 3.26 Bệnh tích thận lợn mắc PRRS 83

Hình 3.27 Sung huyết tử cung lợn hậu bị mắc PRRS 84

Hình 3.28 Bệnh tích tử cung và sẩy thai lợn mắc PRRS 84

Hình 3.29 Viêm phế quản ph i, viêm kẽ ph i PRRS (tiêu bản tham khảo) 97 Hình 3.30 Viêm ph i dính sườn do APP 97

Hình 3.31 Viêm phế quản ph i, viêm kẽ ph i lợn mắc PRRS 97

Hình 2.32 Viêm ph i bệnh suyễn lợn (tiêu bản tham khảo) 97

Hình 3.33 Viêm phế quản ph i, viêm kẽ ph i lợn mắc PRRS 97

Hình 3.34 Viêm ph i bệnh tụ huyết trùng lợn (tiêu bản tham khảo) 97

Hình 3.35 Phế nang viêm (HEx10) 104

Hình 3.36 Viêm kẽ ph i, dịch phù lòng phế nang (HEx40) 104

Hình 3.37 Ph i sung huyết (HE x 10) 104

Hình 3.38 Thâm nhiễm tế bào viêm kẽ ph i (HE x 40) 104

Hình 3.39 Gan sung huyết (HE x10) 104

Hình 3.40 Thâm nhiễm tế bào viêm gan (HEx40) 104

Hình 3.43 Lách nhồi huyết, hoại tử (HEx10) 105

Hình 3.44 Lách nhồi huyết (HEx40) 105

Hình 3.45 Thâm nhiễm viêm ruột (HEx10) 105

Hình 3.46 Hoại tử biểu mô ruột (HEx40) 105

Hình 3.47 Biểu đồ biến động về số lượng bạch c u của lợn mắc PRRS 112

Hình 3.48 Kết quả phản ứng RT-PCR 116

Hình 3.49 Đối chứng (-) 119

Hình 3.50 Đối chứng (+) 119

Hình 3.51 Sau 36 giờ gây nhiễm 119

Hình 3.52 Sau 48 giờ gây nhiễm 119

Hình 3.53 Sau 60 giờ gây nhiễm 119

Hình 3.54 Sau 72 giờ 119

Hình 3.55 Virus tập trung ph i (IHCx10) 123

Hình 3.56 Virus tập trung ph i (IHCx40) 123

Hình 3.57 Virus tập trung gan (IHCx10) 123

Hình 3.58 Virus tập trung gan (IHCx40) 123

Hình 3.59 Virus phân bố thận (IHCx10) 123

Hình 3.60 Virus phân bố thận (IHCx40) 123

MỞ ĐẦU

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản lợn (Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome – PRRS), là một trong những dịch bệnh nguy hiểm nhất

trong mấy năm g n đây Hàng năm PRRS gây thiệt hại rất l n cho ngành chăn nuôi lợn Việt Nam và nhiều nư c trên thế gi i

Từ năm 1983 Mỹ và Châu Âu, đã có những nghi ngờ đ u tiên về PRRS, khi ấy do chưa có nhiều thông tin cho nên người ta tạm gọi là bệnh

“bí hiểm” lợn (Mystery swine disease) hoặc Mystery disease syndrome (MDS) Một số nư c khác thì gọi bệnh là Swine Respiratory Reproductive

Syndrome (SRRS), hay là Swine Infertiliti and Respiratory Syndrome (SIRS), v.v Về triệu chứng, bệnh tích, bệnh nguyên của hội chứng này;

đ u tiên gi i chuyên môn còn nh m lẫn v i Parvovirus, virus giả dại, virus

cúm lợn, thậm chí là v i virus gây viêm cơ tim Bệnh được phát hiện l n

đ u tiên Mỹ vào năm 1987, hàng năm nư c này phải chi phí đến trên 0 triệu USD cho công tác phòng chống PRRS (Neumann và cs, 200 ) Bệnh

có mặt Đức (1990) Hà Lan (1991), bệnh lây lan sang các nư c Châu

Âu sau đó bệnh có mặt h u hết các châu lục trên thế gi i (Albina và cs, 1994) Cho đến tháng 6 năm 1991, Wensvoort và cs viện Thú y Trung ương Hà Lan đã phân lập được virus 16 trong số 20 lợn con và 41 trong

số 63 lợn nái bị ốm Ngoài ra virus còn được tìm thấy trong bào thai của

lợn nái chửa Lelystad được dùng làm tên gọi cho virus để kỷ niệm thành

phố nơi mà người ta tìm ra nó

Tên PRRS – Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, do t chức Thú Y thế gi i (OIE) chính thức dùng từ hội nghị quốc tế t chức tại Minesota (Mỹ) năm 1992 (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007)

Từ năm 200 đến nay 2 nư c và vùng lãnh th có dịch bệnh PRRS (Báo cáo của Cục Thú y, 2007) Kể cả các nư c có ngành chăn nuôi phát triển rất mạnh như Pháp, Đan Mạch, hàng năm cũng phải chịu thiệt hại hàng trăm triệu USD để giải quyết những vấn đề xung quanh PRRS

Năm 2006 Trung Quốc 10 t nh có dịch PRRS v i 2 triệu con lợn mắc bệnh và hơn 400 ngàn lợn chết (Han và cs, 2006), năm 2007 dịch lại xảy ra 26/33 t nh của nư c này

PRRS được ghi nhận l n đ u tiên Việt Nam vào năm 1997, trên đàn lợn nhập về từ Mỹ vào các t nh phía nam Khi kiểm tra cho thấy 10/ 1 lợn giống có huyết thanh dương tính v i PRRS

V i đặc tính lây lan mạnh, hơn nữa trong môi trường chăn nuôi phân tán và

sự vận chuyển lợn bừa bãi, ch sau 10 năm xuất hiện PRRS đã tr thành dịch l n Việt Nam M đ u bằng vụ dịch xảy ra ngày 12/3/2007 tại Hải Dương, sau đó dịch lây lan ra khắp cả nư c Từ năm 2007 đến nay, PRRS luôn là vấn đề thời sự

b i tính nguy hiểm của nó

Mỗi khi dịch n ra, ngoài việc gây thiệt hại rất l n về kinh tế, PRRS còn là thách thức v i gi i chuyên môn trong công tác nghiên cứu, để đưa ra giải pháp phòng và trị bệnh Thực tế cho thấy PRRS gây bệnh cho nhiều đối tượng lợn khác nhau; lợn nái, lợn đực giống, lợn nuôi thịt và lợn con Mỗi đối tượng lợn khi mắc PRRS thường cho những biểu hiện bệnh lí rất phức tạp Hơn nữa việc ghép các bệnh thứ phát khi lợn mắc PRRS lại rất ph biến, càng làm cho công tác chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Đã có những nghiên cứu về PRRS; tập trung vào các vấn đề dịch tễ học, virus gây bệnh, đặc biệt là vai trò của các vi khuẩn thứ phát trong dịch PRRS Tuy nhiên những nghiên cứu về bệnh lí lâm sàng, giải phẫu bệnh học, các ch tiêu huyết học của lợn mắc PRRS và những nghiên cứu về các phương pháp chẩn đoán, xác định virus để phân biệt

v i các bệnh truyền nhiễm khác g n như còn thiếu, không ch trong nư c mà

cả trên phạm vi thế gi i

Trư c thực tế đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lí của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS), sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để phát hiện virus”

* MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

+ Nghiên cứu có hệ thống đặc điểm bệnh lí của lợn mắc PRRS, v i

trọng tâm là về triệu chứng lâm sàng, biến đ i bệnh lí đại thể, vi thể, sự thay

đ i ch tiêu huyết học khi lợn mắc PRRS nhằm phân biệt v i các bệnh ph i khác lợn

+ Nghiên cứu sự bội nhiễm của một số vi khuẩn kế phát, gây bệnh tích cho lợn trong các dịch PRRS; giúp cho công tác phòng chống dịch chính xác và hiệu quả

+ Áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry

-IHC) để chẩn đoán và xác định sự khu trú của PRRSV trong mô bào lợn bệnh

* Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI:

+ Đây là nghiên cứu khá đ y đủ về một số đặc điểm bệnh lí của hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản lợn (PRRS) Những biến đ i đại thể, vi thể các cơ của quan lợn bệnh, những thay đ i về ch tiêu huyết học, tình

trạng suy đa tạng của lợn mắc PRRS…

+ Áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) chẩn đoán và xác định được vị trí khu trú của virus trong nhiều mô bào lợn bệnh, điều đó có nghĩa rất l n trong nghiên cứu phân lập PRRSV và nghiên cứu cơ chế

sinh bệnh của virus

+ Kết quả nghiên cứu của luận án là tài liệu tham chiếu cho các nghiên

cứu chuyên sâu khác

+ Kết quả nghiên cứu là cơ s khoa học để các nhà chuyên môn hoạch

định phương pháp phòng trị bệnh hiệu quả

+ Luận án là tài liệu tham khảo có nghĩa phục vụ cho giảng dạy và

nghiên cứu khoa học

* NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI:

+ Đây là nghiên cứu bư c đ u có hệ thống về triệu chứng lâm sàng,

về những biến đ i đại thể, vi thể các cơ quan của lợn mắc PRRS, từ đó có

thể phân biệt v i các bệnh ph i khác lợn

+ Đây là nghiên cứu bư c đ u và đã công bố những kết quả về sự thay

đ i một số ch tiêu huyết học, tình trạng suy đa tạng của lợn mắc PRRS

+ Sử dụng thành công kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) để chẩn đoán PRRS và xác định được sự khu trú của virus trong mô bào lợn bệnh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS)

1.1 M m bệnh

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản lợn là do virus

thuộc họ Arteriviridae, tên gọi của họ này được coi là bắt nguồn từ một loài virus trong họ Equine Ateritis virus (virus gây viêm động mạch ngựa) Mặc

dù bộ gen của họ Ateriviridae ch bằng 1/2 bộ gen của họ Coronaviridae,

nhưng chúng có nét tương đồng về mặt di truyền và đều mang bản sao mã đặc

trưng của l p Nidovirales Họ Ateriviridae ch có một giống Aterivirus bao gồm 2 thành viên là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sẩy thai và viêm ph i ngựa non; Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome

Virus (PRRSV) gây rối loạn hô hấp và sinh sản lợn

Ngày nay các nhà khoa học cho rằng giống Aterivirus còn có hai thành viên nữa là: Lactate Dehydrogenase elevating virus (LDEV) gây bệnh trên chuột và Simian Hemorrhagic Fever Virus (SHFV) gây bệnh sốt xuất huyết

kh và một số loài linh trư ng (Cavanagh, 1997)

Hình 1.1 Quan hệ về nguồn gốc di truyền của virus PRRS với các virus khác

trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae theo Gorbalenya và cs, (2006)

Khi phân tích cấu trúc và nguồn gốc hệ gen các nhà khoa học đã chia virus làm 2 nhóm

Nhóm 1: Bao gồm những virus thuộc chủng Châu Âu (thường gọi là

Qua nghiên cứu người ta thấy các chủng PRRSV gây bệnh Việt Nam mấy năm g n đây có quan hệ mật thiết về mặt di truyền v i các chủng PRRSV gây bệnh Trung Quốc, thể hiện qua sơ đồ phả hệ di truyền

Phả hệ di truyền của một số chủng PRRSV gây bệnh ở Việt Nam năm 2007 và 2008, dựa trên kết quả giải trình tự gen NSP2

(Nguồn Ken Inui, 2007)

08548-LC 08143-ND 08254-TH 08409-TB 08340-NB 08659-VL Vinh 7B 08663-PT 07196-BG 07768-KH 07619-QNg 07643-QT Tphuong p75 07142-BN 07172-SL

Viet nam

HUN4

07544-HP 07207-QNh Viet nam

Viet nam 07264-TB

JXA1 HEB1 JXwn06

Viet nam 07430-HTy

08626-HNm 07213-HNo Viet nam

HUB1 HUB2 JX0612

MN184A

MN 184C VR2332

2008

2007

NSP2 Phylogeny

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hệ gen của các chủng PRRSV trên thế giới

Hệ gen

5’

UTR

Ph n

mã hoá

ORF 1a

ORF 1b

cs, 2003) Hệ gen của virus PRRSV chủng GD (Quảng Đông) (số đăng k : EU109 03) đại diện cho một nhóm PRRS m i phân lập g n đây có độc lực rất cao Trung Quốc, cũng thuộc genotype II, dòng Bắc Mỹ, có độ dài là

15353 bp, trong đó ph n mã hoá sử dụng cho 7 khung đọc m là 14981 bp (Tian và cs, 2007)

Độ dài các gen và trình tự xắp xếp các ribonucleotid trên gen khác nhau giữa các chủng PRRSV, đã tạo ra khoảng cách về di truyền và sự sai khác về mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PRRSV Đây cũng chính là tính phức tạp về mặt bệnh nguyên của PRRS

1.1.2 Hình thái cấu trúc của PRRSV

Virus có hình c u, có vỏ bọc và có các gai nhô ra Kích thư c của virus vào khoảng 4 -80nm, nhân nucleocapsid có kích thư c 25-3 nm, bề ngoài của virus được bao bọc b i l p vỏ Sự phát triển của virus bị dừng lại khi dùng chlofoform hay ether chứng tỏ rằng vỏ của virus có chứa lipid

Hình 1.3 Cấu trúc virus PRRS

(Nguồn http://www

Pigprogress.net/news/modified-prrs-virus-cause-of-outbreak-in-China-1408,html)

Một phân tử protein vỏ nhân virus (N) Hoạt động trung hòa xảy ra mạnh

v i các protein có khối lượng phân tử 2 , 31 và 4 KD

Hình 1.4 Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS

(Nguồn: http://www porcilis- prrs.com/mycrobiology-prrsv-structure.asp)

Hệ gen mang mã di truyền có cấu trúc điển hình gồm 3 vùng chính: vùng điều khiển hay vùng ’ có một số trình tự đặc hiệu (promoter, operator…) có chức năng điều khiển hoạt động của gen Promoter là trình tự nhận biết và vị trí tiếp cận v i gen của RNA polymerase và các nhân tố phiên mã, promoter có chức năng kiểm soát hoạt động của gen Vùng 3’ gọi là vùng kết thúc gồm các trình tự mang tín hiệu kết thúc và một số trình tự chưa rõ chức năng Ở giữa là vùng mang mã di truyền (coding sequence) hay khung đọc m ORF (open reading fream), từ đây các RNA dịch mã tạo ra các protein c n thiết cho virus Virus hoạt động, nhân lên và gây bệnh được trong cơ thể vật chủ chính

là nhờ các cấu trúc đọc mật mã (các ORFs) Dựa trên cơ chế sao mã và giải

mã vật chất di truyền Trong đó ORF 1a và 1b là mã kh i nguồn để tạo ra ARN polymerase Trong tế bào của vật chủ, virus PRRS sinh ra 6 loại ARN thông tin (mARN) mà đều có cấu trúc kh i đ u là đ u ´ và kết thúc bằng đ u 3´

Hệ gen của virus PRRS có đặc điểm là các khung đọc m (ORFs) lồng

vào nhau, cấu trúc tương tự các ORFs của Coronavirus (Cavanagh, 1997)

Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các khung đọc m (ORFs) lồng vào nhau từ 1-2 3 cặp base (base pair-bp) Ví dụ: khung đọc m 4 (ORF4) và (ORF ) lồng vào nhau b i 1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau

b i 2 3 bp Như vậy, virus sử dụng một ph n gen chung để mã hóa cho các protein khác nhau

1.1.4 Đặc tính nuôi cấy của PRRSV

Virus PRRS có thể phát triển các loại môi trường tế bào sau

- Đại thực bào phế nang lợn Porcine Alveolar Macrophage (PAM)

Quá trình phát triển của virus PRRS trong môi trường PAM đã được Pol, J.M và cs (1991), mô tả khá chi tiết Đ u tiên, vỏ bọc nhân của virus bắt đ u nhô ra khỏi lư i nội nguyên sinh khoảng 6 giờ sau khi cấy Sự nhân lên của virus thường được gi i hạn trong bào tương, những hạt virus lọt ra khỏi tế bào bệnh qua màng tế bào khoảng 9 - 12 giờ sau khi cấy Hậu quả là PAM bị thoái hóa, thể hiện các dạng bệnh lí tế bào là mất hạt và thay đ i lỗ h ng màng Đối v i các dòng tế bào CL2621 hoặc MA104 khi nuôi cấy virus PRRS, sau 2- 6 ngày cấy truyền cũng có các dấu hiệu bệnh lí tế bào đặc trưng, đ u tiên tế bào tập trung thành cụm, dày lên, nhân co lại rồi bong ra (Bautista và

cs, 1993) Có thể phát hiện virus trong bào tương của tế bào bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang

Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm trên thế gi i đang dùng loại tế bào MARC- 145 để phân lập virus PRRS, sau 24, 36, 72, 84, 96 giờ nuôi cấy, quan sát các CPE (Cytopathogenic Effect) để đánh giá sự nhân lên của virus, (Li và cs, 2007), đã có công bố về những nghiên cứu tác động của PRRSV lên

tế bào Marc-14 Một số loại tế bào: Ph i lợn, biểu mô khí quản, tim, thận, tủy xương, tuyến giáp, tế bào xương xoăn mũi lợn, tế bào gan, phôi gà, được kết luận là không có tác dụng trong nuôi cấy PRRSV

1.2 Dịch tễ học

1.2.1 Loài mắc bệnh

Mọi lứa tu i lợn đều có thể cảm nhiễm v i virus, m m bệnh thường tồn tại lâu trong đàn nái Lợn nái thường truyền m m bệnh cho bào thai Lợn rừng mọi lứa tu i đều cảm nhiễm virus, có thể phát bệnh, nhưng cũng có thể không phát bệnh, đây có thể coi là nguồn tàng trữ bệnh tự nhiên rất nguy hiểm Người và các động vật khác không mắc bệnh, trong thiên nhiên có loài vịt trời (Mallard duck) có thể mẫn cảm v i virus (Zimmerman và cs, 1997), đây là nguồn reo rắc m m bệnh trên diện rộng rất khó kiểm soát

1.2.2 Chất chứa mầm bệnh và sự lây truyền

Dịch mũi, nư c bọt, phân, nư c tiểu, tinh dịch của lợn ốm, lợn mang trùng đều được xác định là nguồn phát tán m m bệnh Ở lợn nái mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ giai đoạn chửa kỳ giữa Lợn nái nuôi con, virus có thể được bài thải qua sữa Lợn trư ng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày Lợn con và lợn choai có thể bài thải virus t i 1-2 tháng

Virus có thể phân tán thông qua các hình thức nhờ gió, bụi, bọt nư c, dụng cụ chăn nuôi, dụng cụ bảo hộ lao động

Lợn mẫn cảm v i virus PRRS theo các đường miệng, mũi, nội cơ, niêm mạc, âm đạo

Virus có thể bài thải qua nư c tiểu đến 42 ngày, tinh dịch 43 ngày, nư c mắt, nư c mũi 14 ngày

Ký chủ mẫn cảm chủ yếu là lợn, đặc biệt vịt trời thải virus qua phân và lợn cũng mẫn cảm v i virus PRRS có nguồn gốc từ vịt trời này

Sự lây bệnh PRRS từ đàn này sang đàn khác rất đa dạng, có thể theo tinh dịch khi phối giống, khi tiêm, nguồn nư c, không khí (gió có thể mang m m bệnh đi xa 3 km)

Các nghiên cứu Pháp cho thấy 6% số đàn mắc bệnh là do tiếp xúc, 20%

do tinh dịch, 21% do dụng cụ chăn nuôi và 3% từ nguồn chưa xác định (Lê văn Lãnh, 2007)

Qua nhiều nghiên cứu thực tế bệnh gây ra do vận chuyển có thời gian ủ bệnh từ 3-24 ngày, trung bình 19 ngày (theo dõi 9 đàn), 14-37 ngày (8 đàn), 10-18 ngày (6 đàn) Sự khác nhau về thời gian ủ bệnh nói lên sự khác nhau về độc lực giữa các chủng virus Sự khác nhau về thể trạng và mật độ của từng đàn lợn, cũng có thể biểu hiện ra triệu chứng lâm sàng khác nhau

1.2.3 Điều kiện lây lan

Thông thường trong đàn lợn đang nuôi vùng mà trư c đó đã từng có dịch PRRS đi qua thì tồn tại những cá thể lợn mang trùng là điều đương nhiên Song, không phải lúc nào m m bệnh đó cũng phát tán và lây lan thành dịch Thực tế cho thấy các nư c, các vùng khác nhau, PRRS xảy ra theo chu

kỳ khác nhau, mùa vụ khác nhau và mức độ khác nhau B i vì virus muốn lây lan được c n phải có những điều kiện nhất định như: Môi trường chăn nuôi bị

ô nhiễm, khí hậu không thuận lợi, vận chuyển lợn ốm bừa bãi, kiểm dịch thiếu chặt chẽ Khi nghiên cứu 1 0 đàn lợn bị bệnh Đức thấy có 9 % hoặc là đã mua giống dư i 4 tu n sau dịch, hoặc là cách đàn bị bệnh trong vòng km (Lê Văn Lãnh, 2007) Qua nhiều nghiên cứu, người ta kết luận rằng còn có những tác nhân sau đây được coi là có nghĩa trong việc lây lan virus PRRS:

Sau khi xâm nhập cơ thể, đích tấn công của virus PRRS là các đại thực

bào Đây là loại tế bào duy nhất có các thụ thể (receptor) phù hợp v i cấu trúc

hạt của virus Nói cách khác, virus có ái lực cao v i đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang Virus nhân lên ngay trong đại thực bào, sau đó phá hủy và giết chết đại thực bào, các virion ồ ạt được giải phóng và xâm nhập sang các tế bào khác Có t i 40% đại thực bào bị phá hủy làm cho sức đề kháng của lợn bị

suy giảm nghiêm trọng và dễ dàng mắc các bệnh truyền nhiễm kế phát (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007) Thường thấy các vi khuẩn gây

bệnh kế phát như Streptococcus suis; Salmonella; E coli; Actinobacillus

Pneuropneumonia bên cạnh đó nhiều loại virus cũng nhân cơ hội trỗi dậy

như dịch tả lợn; giả dại, Swine Influenza Virus, Porcine Circo virus

v i tỷ lệ khá cao, khi m khám thấy h u hết các bào thai đã hoại tử rất nặng, đây chính là nguyên nhân gây chết cho lợn mẹ

1.4 Đáp ứng miễn dịch lợn với PRRSV

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Kháng thể dịch thể, đặc biệt là kháng thể trung hoà (KTTH) có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại PRRSV Các kháng thể lưu hành chống lại PRRSV được phát hiện vào các ngày -7 lợn sau nhiễm và

có sự biến đ i trong huyết thanh vào ngày 14 sau nhiễm, sau đó giảm xuống vào ngày 42 sau nhiễm Nồng độ IgG đạt giá trị tối đa vào khoảng các ngày 21-49 sau nhiễm v i các kháng thể trung hoà

Những kháng thể xuất hiện s m nhất là kháng thể trực tiếp kháng lại protein nhân (N), tiếp theo là protein (M), sau đến glycoprotein (GP ) (Ostrowski và cs, 2002) Một protein phi cấu trúc (NSP2) chứa một cụm epitope B không trung hoà và chúng là những protein miễn dịch quan trọng nhất của PRRSV H u hết các test chẩn đoán chủ yếu phát hiện kháng thể kháng protein N Những kháng thể này xuất hiện trong tu n đ u tiên sau nhiễm trùng và tồn tại trong vài tháng, nhưng không có khả năng bảo vệ cơ thể bị nhiễm virus

Kháng thể trung hoà được phát hiện n định vào ngày thứ 28 sau nhiễm hoặc muộn hơn, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch v i PRRSV

và có sự khác nhau trong nhiễm trùng tự nhiên so v i tiêm phòng vaccine (Yoon và cs, 1994)

Sự xuất hiện s m của các kháng thể không trung hoà có thể tác động đáng

kể đến sự tiến triển bệnh của PRRSV Ngoài ra kháng thể không trung hoà làm tăng sự lây nhiễm của virus trong các túi thực bào của các đại thực bào

Đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng thể không trung hoà có thể tác động mạnh mẽ t i PRRSV thông qua việc thoát vỏ của virus và làm tăng

sự bắt giữ các tiểu ph n virus trong các tế bào đại thực bào

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào

Đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào CMI (Cell Mediated Immunity) cũng vô cùng quan trọng trong miễn dịch chống lại PRRSV Virus PRRS ngăn cản sự trình diện kháng nguyên và hoạt hoá tế bào lympho T PRRSV làm giảm đáp ứng miễn dịch tự nhiên bằng cách thay đ i hình dạng của tế bào thực bào và giảm sự xuất hiện cấu tử trình diện kháng nguyên đi kèm trên bề mặt tế bào đại thực bào trong việc trình diện kháng nguyên (Yonggang Liu

và cs, 2010) đã nghiên cứu bằng cách gây nhiễm thực nghiệm chủng có độc lực cao PRRSV HuN4 cho lợn mức 105

-109 virus/ml máu và 1010-1011 virus/g mô ph i, đã theo dõi được sự biến đ i của Interleukin 1 (IL- 1), (IL-6)

và các TNF- alpha

Những cá thể lợn đang bình phục có sự đáp ứng tăng sinh mạnh mẽ các

tế bào lympho, hiện tượng này không được phát hiện trong 4 tu n sau nhiễm trùng và cùng v i đáp ứng kháng thể trung hoà Các đáp ứng có vai trò cytokine, chủ yếu là interferon (IFN-c) và IL-2 nhưng vai trò interferon kéo dài ít hơn so v i interleukin, (Bautista E.M và Molitor T.W, 1997) (Yonggang Liu và cs, 2010)

1.4.3 Đáp ứng miễn dịch interferon

Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất b i các tế bào của hệ thống miễn dịch h u hết các loài động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và cả tế bào ung thư Interferon thuộc một l p l n của glycoprotein được biết đến v i tên gọi là cytokine như là một tác nhân hoạt hóa tế bào Interferon có vai trò quan trọng trong những đáp ứng miễn dịch đ u tiên của cơ thể Interferon là một ph n của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immune system), nó hoạt động giai đoạn đ u của quá trình cảm nhiễm, trư c khi hệ miễn dịch đặc hiệu (specific immune system) có thời gian để đáp ứng, người ta còn gọi Interferon là loại miễn dịch cản nhiễm

Có 3 l p Interferon chính là anpha, beta và gamma, chúng đều có tác dụng kháng virus, kháng khối u, hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho NK (Natural Killer)

PRRSV tăng nhạy cảm v i tác động của IFN type I, chúng có thể đã kháng lại v i những phản ứng của IFN-, (Lee và cs, 2002) Các chủng PRRSV khác nhau có khả năng tác động khác nhau không ch v i IFN- mà còn cả v i TNF-; IL-10 và IL-2, (Suradhat và cs, 2003) Tuy nhiên nhiều tác giả lại cho rằng miễn dịch interferon có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ đàn lợn vùng dịch bằng cơ chế miễn dịch cản nhiễm

1.5 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

h t ng h p t th y:

Từ tháng 3/2007, dịch PRRS xuất hiện và gây thành dịch tại nhiều địa phương, làm t n thất l n về kinh tế cho người chăn nuôi, cụ thể là:

Năm 2007, dịch PRRS đã xuất hiện tại 324 xã, thuộc 6 huyện của 18

t nh, thành phố T ng số lợn mắc bệnh là 70 77 con, số lợn chết và phải tiêu

huỷ là 20.366 con

Năm 2008, dịch PRRS đã xuất hiện tại 9 6 xã, phường, thuộc 103 huyện của 26 t nh, thành phố T ng số lợn mắc bệnh là 309 86 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con

Năm 2009, dịch xảy ra 69 xã thuộc 26 huyện của 13 t nh, thành phố:

Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng T u và Đắk Lắk v i 7.030 lợn mắc bệnh và 847 lợn buộc phải tiêu huỷ

Năm 2010, dịch PRRS đã xuất hiện tại 1.978 xã, phường, thị trấn thuộc

286 quận, huyện của 49 t nh, thành phố T ng số lợn mắc bệnh là 812.947 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con (Cục Thú Y, 2/2009)

Số lợn chết, tiêu hủy

1.5.1 Một số đặc điểm dịch tễ của PRRS tại Việt Nam

- Dịch PRRS l n đ u tiên xảy ra Việt Nam từ tháng 3/2007 đến nay và dịch thường xuất hiện vào dịp sau Tết âm lịch, khoảng tháng 3-4 hàng năm đối v i các t nh phía Bắc và sau tháng 8 đối v i các t nh phía Nam và có tính chất chu kỳ 2-3 năm một l n phát lại các t nh có dịch cũ, dịch đã xảy ra

h u hết các t nh trong cả nư c, năm 2008 và năm 2010 dịch xảy ra nặng nhất

và gây thiệt hại nghiêm trọng đối v i đàn lợn, gây thiệt hại kinh tế, an sinh xã hội, ảnh hư ng đến công tác phát triển chăn nuôi lợn của nư c ta

- Dịch xảy ra mọi lứa tu i của lợn v i đặc trưng là làm cho lợn ốm sốt cao; lợn con theo mẹ và lợn nái chửa giai đoạn cuối chết nhanh, nhiều hơn so

v i lợn thịt và lợn đực giống

- Dịch xảy ra chủ yếu các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán, những địa phương tiêm vaccine phòng một số bệnh truyền nhiễm khác như bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng, phó thương hàn, đóng dấu (4 bệnh đỏ) đạt tỷ lệ thấp

- Các đợt dịch cho thấy, lợn không ch PRRS mà thường bị bội nhiễm những bệnh kế phát khác như: dịch tả lợn, viêm ph i dính sườn, phó thương hàn, tụ huyết trùng, liên c u khuẩn lợn, suyễn lợn v.v,… Đây là nguyên nhân

kế phát gây chết nhiều lợn

- Dịch lây lan nhanh chủ yếu là do phát hiện chậm hoặc dấu dịch, người chăn nuôi bán lợn mắc bệnh, do không kiểm soát được vận chuyển lợn ốm từ vùng có dịch sang vùng không có dịch

- Virus gây bệnh: kết quả phân tích type virus gây bệnh tại Hàn Quốc cho thấy các virus gây dịch PRRS Việt Nam thuộc cùng một loại, tuy nhiên virus gây bệnh năm 2010 có sự biến đ i hình thành một nhóm khác Kết quả phân tích cũng ch ra rằng virus năm 2010 có sự tương đồng v i 1 virus phân lập Trung Quốc năm 2009, virus này cũng đồng thời được phát hiện tại Lào

và Căm-pu-chia thời gian qua Việc này cho thấy virus gây ra đợt dịch năm

2010 có khả năng m i xâm nhập vào Việt Nam

- Nguyên nhân chính là do chăn nuôi lợn nư c ta chủ yếu là nhỏ lẻ nên khó kiểm soát dịch bệnh, nhận thức của người chăn nuôi, buôn bán, giết m lợn về phòng, chống dịch còn nhiều hạn chế Nhiều chủ gia súc chăn nuôi không tiêm phòng hoặc tiêm phòng các bệnh đỏ (dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và phó thương hàn lợn) đạt tỷ lệ thấp, h u hết các hộ chăn nuôi không áp dụng các biện pháp an toàn sinh học Việc chấp hành Pháp lệnh Thú

y chưa triệt để, nhiều người chăn nuôi, buôn bán gia súc vẫn cố tình vận chuyển, buôn bán gia súc bị bệnh

1.5.2 Khuyến cáo công tác phòng, chống dịch PRRS tại Việt Nam

PRRS đã tr thành bệnh m i n i Việt Nam, bệnh đã gây thiệt hại cho đàn lợn giống và ảnh hư ng đến phát triển chăn nuôi và giá cả thị trường, nên công tác phòng, chống dịch:

- C n phải có sự quan tâm, ch đạo trực tiếp, kịp thời của các cấp, ngành, đoàn thể của Trung ương và địa phương, sự hư ng ứng của người dân;

- Tăng cường công tác thông tin, tuyên truyền kịp thời, sâu rộng t i mọi

t ng l p nhân dân và cấp chính quyền cơ s tạo ra sự đồng tình ủng hộ của nhân dân, của người chăn nuôi và chính quyền các cấp

- Chính quyền cơ s và nhân viên thú y tại địa phương đóng vai trò quan trọng trong việc giám sát, phát hiện nhanh dịch, xử l kịp thời dịch khi còn diện hẹp Địa phương nào có mạng lư i thú y xã phường, đồng thời chính quyền quan tâm t i các hoạt động của thú y thì công tác phòng chống dịch nơi đó đạt hiệu quả cao, hạn chế thiệt hại do dịch;

- Hàng năm chủ động triển khai tiêm phòng các bệnh đỏ cho lợn là các bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng lợn, đóng dấu lợn, phó thương hàn, yêu c u kết qủa tiêm phòng phải đạt trên 80% so v i t ng đàn

- Khi có dịch xảy ra phải thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng chống dịch

1.6 Chẩn đoán PRRS

1.6.1 Phát hiện virus

Để phát hiện virus, lấy bệnh phẩm là huyết thanh, huyết tương, ph i, hạch

ph i, t chức lympho, dịch của thai chết lưu hoặc lợn chết ngay sau khi sinh

Nhiều tác giả cho rằng bệnh phẩm lợn con thích hợp hơn bệnh phẩm lợn trư ng thành vì virus gây hội chứng PRRS tồn tại trong một thời gian dài lợn con

Có thể phân lập được virus huyết thanh trong vòng 4 - 6 tu n sau khi

bị nhiễm lợn đang bú, lợn cai sữa và lợn choai; và trong vòng 1- 2 tu n sau khi nhiễm lợn đực trư ng thành và lợn nái C n phải bảo quản lạnh ngay lập tức bệnh phẩm dùng để phát hiện virus (Lê Văn Lãnh, 2007)

Có thể áp d ng một số kỹ thuật sau đây để phát hiện virus:

- Phân lập virus trên một số loại tế bào: Tế bào phế nang của lợn, tế bào MA-104, tế bào MARC-145, CL2621 và CL-11171

- Phương pháp bệnh lí miễn dịch

- Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên

- Phương pháp nhân gen (PCR)

- Phương pháp lai phân tử tại chỗ (insitu hybridization)

Trong thực tế, vấn đề phân lập virus còn gặp nhiều khó khăn, b i vì tế bào dùng để phân lập virus là tế bào đại thực bào của lợn và đòi hỏi phải lấy lợn vô trùng (SPF) lứa tu i 6-8 tu n Lợn vô trùng là lợn được nuôi từ sơ sinh trong điều kiện vô trùng, không được sử dụng bất cứ một loại vaccine nào và cũng hoàn toàn không có bệnh Không phải tất cả các phòng thí nghiệm chẩn đoán đều chuẩn bị được môi trường tế bào đại thực bào đạt tiêu chuẩn như vậy

Các tế bào khác tỏ ra không mẫn cảm v i virus PRRS và không thể thay thế được môi trường tế bào đại thực bào

Sau khi phân lập được virus, có thể giám định bằng phương pháp nhuộm hóa miễn dịch tế bào (HMDTB)

1.6.2 Ch n đoán huyết thanh học

Có thể phát hiện kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh, dịch của cơ thể hoặc từ thai chết lưu bằng một số phương pháp huyết thanh học bao gồm phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp, phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào một l p, ELISA và phản ứng trung hòa huyết thanh

Trong các phương pháp kể trên, ELISA là phương pháp tiện lợi hơn cả Thuận lợi của phương pháp này là có thể chẩn đoán một số lượng l n huyết thanh và các kết quả thu được của các phòng thí nghiệm (khi chẩn đoán cùng các huyết thanh) là tương đối đồng nhất

Một ưu điểm nữa của phương pháp này này là có thể phát hiện được cả chủng virus gây hội chứng PRRS có nguồn gốc châu Mỹ và các chủng có nguồn gốc châu Âu, trong khi đó phương pháp huỳnh quang kháng thể hoặc phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào ch phát hiện được các chủng virus về mặt kháng nguyên g n v i chủng dùng trong phản ứng

Rõ ràng là trong khi đánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh, phải cân nhắc đến trạng thái miễn dịch của đàn sau khi được tiêm phòng, b i

vì hiện nay chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể

do lợn mắc bệnh tự nhiên hay kháng thể do vaccine kích thích tạo nên

Động thái kháng thể kháng virus gây hội chứng PRRS khi đánh giá bằng các phản ứng huyết thanh học kể trên là tương tự như nhau Có thể phát hiện kháng thể từ 7- 14 ngày sau khi lợn bị nhiễm virus Hàm lượng kháng thể đạt mức tối đa vào 21-49 ngày sau khi nhiễm sau đó giảm d n và không phát hiện được nữa khoảng 4-6 tháng sau khi bị nhiễm

Phản ứng trung hòa huyết thanh có lẽ kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh học khác vì kháng thể trung hòa xuất hiện chậm hơn Tuy nhiên phản ứng trung hòa lại là ch thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hòa có thể tồn tại tương đối lâu trong cơ thể lợn

+ Phản ứng trung hòa huyết thanh – Serum Neutralize (SN)

+ Enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA)

- IPMA là phản ứng sử dụng đ u tiên để phát hiện kháng thể PRRS và

nó vẫn còn được dùng ph biến nhất Châu Âu IPMA có thể thực hiện v i PAM, CL 2621 hoặc MAC 104 Dùng phát hiện kháng thể s m 6 ngày sau khi nhiễm thực nghiệm Phản ứng này hình như rất đặc hiệu dựa trên kết quả của huyết thanh dương tính đã biết, nhưng độ nhạy trên từng cá thể là nghi ngờ Trong nghiên cứu thực tế, Wensvoort, (1991) và cộng sự đã phát hiện kháng

thể PRRS 123 trong số 16 con lợn nái đã thử nghiệm từ những trường hợp thể hiện lâm sàng Đ u tiên IPMA được dùng chủ yếu môi trường nuôi cấy PAM Nuôi cấy ban đ u không dễ gì thu được kết quả và phải được thử nghiệm đối v i các tác nhân ngoại lai Có thể khắc phục bằng sử dụng tế bào liên lạc CL2621 Tuy nhiên, vì phản ứng ch tin cậy trên từng đối tượng và không thể tự động được nên nó không phải là phản ứng để làm thường ngày trên quy mô l n

- Phản ứng IFA, l n đ u tiên được báo cáo b i Yoon và cộng sự, giống như IPMA và được dùng nhiều Mỹ, IFA so sánh tượng tự v i IPMA về độ đặc hiệu và độ nhạy Trong nghiên cứu của Yoon, (1994), quan sát các mẫu huyết thanh đã thử nghiệm âm tính trong đàn mắc lâm sàng, có t i 75% mẫu huyết thanh dương tính b i IFA Phản ứng IFA được hình thành có nguồn gốc

từ PAM nhưng đã được thích nghi một cách thoả mãn đối v i tế bào CL 2621 Những vấn đề tương tự ảnh hư ng t i phản ứng IFA, người ta phải xác định kết quả bằng mắt thường và phản ứng không được làm tự động vì vậy khó mà thực hiện v i quy mô l n

- Phản ứng trung hòa (SN) để phát hiện kháng thể chống virus trong huyết thanh cũng được phát triển Hiện nay phản ứng trung hoà không thể thực hiện trong PAM vì virus không được trung hòa Phản ứng trung hòa tiến hành v i CL 2621 trong phương pháp chuẩn, kháng thể SN phát triển chậm hơn so v i kháng thể IFA và phản ứng trung hoà được coi như là kém nhậy hơn sau khi nhiễm cấp tính Sử dụng SN trong đàn đã trải qua nhiễm nguyên phát 6 tháng trư c đó có thể có lợi nhưng vì SN ít nhậy hơn trong nhiễm cấp tính, trải qua nhiều bư c nên đến nay nó ch được gi i hạn sử dụng trong phòng thí nghiệm nghiên cứu

- Albina, (1994) và cộng sự đã phát triển phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể chống virus PRRS Kháng nguyên chế b i môi trường nuôi cấy

PAM gây nhiễm virus và kháng nguyên âm tính được chế bằng cách tương tự Một mẫu coi như dương tính khi tỷ lệ mật độ quang học giữa kháng nguyên dương tính trên kháng nguyên âm tính thay đ i rõ, tỷ lệ đó l n hơn 1,5

Albina và cộng sự đã báo cáo ELISA có độ đặc hiệu như IPMA và nhậy hơn đặc biệt là các xét nghiệm đ u dịch

Tuy nhiên Ed ards và cộng sự lại cho rằng ELISA ít nhậy hơn so v i IPMA và nhận thấy rằng ELISA cho kết quả thực tế không thể chấp nhận được một vài lợn nái âm tính

Nếu ELISA có thể tin cậy, nó sẽ được dùng rộng rãi vì nó có thể làm tự động và thực hiện trên quy mô l n một cách kinh tế

Phát hiện kháng nguyên

Virus được phân lập hằng ngày 2 hệ thống nuôi cấy tế bào Đ u tiên

là đại thực bào phế nang lợn (PAM) và tế bào liên kết Mặc dù một vài mẫu mọc riêng biệt hệ thống tế bào này hoặc kia PAM có tác dụng giúp phát triển của một số l n mẫu, đặc biệt khi phân lập từ huyết thanh Bautista và cộng sự đã phân lập được 1 mẫu virus từ 98 mẫu thí nghiệm Trong đó:

- 4 phân lập cả 2 môi trường nuôi cấy

- 4 phân lập được ch tế bào CL – 2621

- 7 phân lập riêng PAM

Hơn nữa Bautista cũng đã thử phân lập virus 73 mẫu huyết thanh kết quả là:

- 2 mẫu phân lập được hai hệ thống nuôi cấy

- 16 mẫu ch phân lập được PAM

G n đây tế bào nuôi cấy có chất lượng cao phát triển từ tế bào thận kh đơn dòng cho khả năng m i để phân lập virus Virus PRRS được phân lập từ huyết thanh, huyết tương, bạch c u ngoại vi, tuỷ xương, lách, phân lập điển hình lợn đang phát triển trong 4 tu n Điều quan trọng là duy trì mẫu huyết