Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên her2

Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quần thể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặc hiệu. Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bào ung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiện mạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú. ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc (toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phương pháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp. HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Cho đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể tạo dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu. Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư vú. Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư. Tính chất này làm cho HER2 trở thành một đích hữu hiệu để chẩn đoán sớm cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -2- Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới. Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted effect). Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị thấp. Những nghiên cứu gần đây về các marker sinh học trong ung thư vú đã mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược điểm của các liệu pháp truyền thống. Một trong số thuốc có bản chất kháng thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là HERCEPTIN. Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2’’

NGUYỄN PHƯƠNG HOA

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn phương Hoa

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

Ngành: Sinh họcChuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Quang Huấn

Hà Nội - 2010

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 3

1 Khái niêm, phân loại và ứng dụng của immunotoxin……….3

1.2 Tình hình ung thư vú (UTV) trên thế giới và ở Việt Nam 4

1.2.1.Trên thế giới 4

1.2.2.Ở Việt Nam 4

1.3 Giới thiệu ung thư vú………5

1.3.1 Khái niệm chung về bệnh UTV 5

1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thư vú 6

1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán 7

1.3.4 Các phương pháp điều trị 9

1.4 Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế nào ung thư vú 10

1.4.1 Khái quát về kháng nguyên HER2 10

1.4.2 Cấu trúc HER2 11

1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 11

1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2 11

1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thư của HER2….13 1.5 Khái quát chung về kháng thể - Kháng thể đơn dòng 16

1.5.1 Cấu tạo chung của kháng thể 16

1.5.2 Kháng thể đơn dòng 17

1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể……… 17

1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thư vú …19

1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………22

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined. 2.1.1 Sinh phẩm 23

2.1.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined. 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined. 2.2.1 Phương pháp PCR……….24

2.2.2 Cắt bằng enzym giới hạn 26

2.2.3 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện 26

2.2.4 Phương pháp biến nạp 29

2.2.5 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp 30

2.2.6 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 31

2.2.7 Phương pháp tính sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ 32

2.2.8 Phương pháp phân tích khối phổ 33

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch hermel 36

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tổ hợp……… 38

3.1.4 Xác định trình tự gen hermel ………Error! Bookmark not defined. 3.2 Biểu hiện và tối ưu hoá biểu hiện gen hermel ……….Error! Bookmark not defined. 3.2.1 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli BL21(DE3) Er ror! Bookmark not defined. 3.2.2 Biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 trong tế bào E coli BL 21(DE3)……… 45

3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2 trong E coli 46

3.3.1.Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch herme 47

3.3.2 Ảnh hưởng của oxi lên khả năng biểu hiện của gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………48

3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………50

3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ……… Error! Bookmark not defined. 3.3.5 Ảnh hưởng của IPTG……….52

3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu………54

3.3.7 Biểu hiện protein tái tổ hợp hermel ở các điều kiện thích hợp đã lựa chọn……….55

3.4 Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định bằng khối phổ và xác đinh hoạt tính……… 56

3.4.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp HER2……… 56

3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp……….57

3.4.3 Xác đinh hoạt tính của protein hermel……… 59 Kết luận và kiến nghị

……… Error! Bookmark not

defined.

Tài liệu tham khảo

………Error! Bookmark

not defined.

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Base pair (cÆp baz¬ nit¬)Dideoxynucleotide

DeoxynucleotideEthylen Diamine Tetra acetic AcidPseudomonas exotoxin

Ethidium BromideHorseradish peroxidaseIsopropyl--D-ThiogalactopyranosideInter-repeat region (miÒn lÆp néi m¹ch b¶o tån)Kanamycin

Kilo DaltonM«i tr-êng Lauria BetaniDiphtheria toxin

Leucine-rich repeat (®o¹n lÆp giµu leucine)

Tris - Acetate - EDTATris - EDTA

ung th- vóvßng/phót5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- - D-galactopyranoside

http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunotoxin - ITs) được xác định lànhững chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọn lọc quầnthể tế bào mà ở đó có biểu hiện những kháng nguyên hoặc thụ thể bề mặt đặchiệu

Phân tử độc tố miễn dịch ITs có tác dụng nhận biết và làm tan tế bàoung thư vú biểu hiện quá mức HER2 một yếu tố phát triển biểu mô biểu hiệnmạnh ở 25-30% bệnh nhân ung thư vú

ITs được tạo ra bằng việc kết hợp giữa 2 yếu tố : (1) chất gây độc

(toxins) có bản chất là protein và (2) tác nhân hướng đích theo các phươngpháp hoá học (7) hoặc bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô

(Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase,

đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào Chođến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể tạodimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồngthụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu Sự khuếch đạigen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên

bề mặt tế bào ung thư vú Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bàothành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u Theo nhiều

nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sựkhuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ungthư Tính chất này làm cho HER2 trở thành một đích hữu hiệu để chẩn đoánsớm cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch

Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ caonhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới Điều trị ung thư vú cũng như nhiềuloại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trịliệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rấtlớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targetedeffect) Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trườnghợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trịthấp Những nghiên cứu gần đây về các marker sinh học trong ung thư vú đã

mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điềutrị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhượcđiểm của các liệu pháp truyền thống Một trong số thuốc có bản chất khángthể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhânung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là HERCEPTIN

Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loạithuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch

immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2’’

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Khái niệm, phân loại và ứng dụng Immunotoxin

Như đã nói ở trên, cộng hợp độc tố miễn dịch (Immunôtxin-IT) đượcxác định là những chất gây độc cho tế bào, được tạo ra để giết một cách chọnlọc quần thể tế bào mà ở đó biểu hiện những kháng nguyên hoặc receptor bềmặt đặc hiệu Những độc tố dạng này đang được nghiên cứu và chế tạo khôngchỉ trong trị liệu ung thư (5), mà còn được thử nghiệm trên các bệnh khácnhư GvHD (6), các bệnh tự miễn dịch và AIDS (7) Immunotoxin được tạo rabằng việc kết hợp giữa hai yếu tố : chất gây độc (toxins) có bản chất là

protein và (2) tác nhân hướng dích theo các phương pháp hoá học (9) hoặccông nghệ ADN tái tổ hợp (11) Cho tới nay các toxin thường hay được dùngnhất để chế tạo ITs là các protein từ vi khuẩn [pseudomonas exotoxin (PE)hay diptheria toxin (DT)] , hoặc từ thực vật [nhóm các protein bất hoạt

riboxom (RIPs) như : Ricin, pokweet anti- viral protein (PAP) Saporin(SAP) ] Cả hai loại toxin này tác động lên tế bào theo cơ chế làm bất hoạtEP-2 (PE, DT) hay tác động lên điểm gắn của EP-2 (RIPs) trên tiểu phầnriboxom 28S, làm ức chế quá trình sinh tổng hợp protein (17) Mặc dù cáctoxin kể trên có hoạt tính cao và chỉ bằng không đến 10 phân tử có thể giếtchết một tế bào đích, việc kết hợp giữa chúng để tạo ra ITs còn mang lại giátrị sử dụng cao hơn nhiều.Các kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy ITs tạo rabởi các toxin kể trên có khả năng ức chế tế bào ung thư mạnh và hiệu quả hơn

từ hàng trăm tới hàng nghìn lần do có tính hướng đích và tính chọn lọc

Độc tố Melitin là gì ?

Melitin là một loại protein hay chuỗi axit amin, thu hút rất mạnh đốivới màng tế bào nên ngay khi tiếp xúc với bề mặt tế bào mục tiêu, nó nhanh

chóng thấm vào qua những lỗ nhỏ để phá vỡ và tiêu diệt chúng, kết quả là cáckhối u ngừng phát triển hoặc thu nhỏ.

1.2 TÌNH HÌNH UNG THƯ VÚ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.2.1 Trên thế giới

Theo Hiệp hội ung thư Mỹ, ung thư vú (UTV) là một trong số nhữngbệnh gây ra tử vong ở phụ nữ trên toàn thế giới Mỗi năm, có khoảng 1,3 triệungười bị chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú và 465.000 người chết vì bệnh này

Tỷ lệ mắc ung thư vú có sự chênh lệch lớn giữa các nước, cao nhất ở Hoa Kỳ

và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu, Tây Âu, Bắc Mỹ và thấp nhất ởchâu Á Theo nghiên cứu của hiệp hội ung thư, tỉ lệ UTV ở Mỹ đã tăng từ80/100.000 người trong năm 1975 lên 105/100.000 người trong năm 1985 và178/100.000 người trong năm 1998 Theo Nazario và cs, tỉ lệ UTV ở PuertoRico đã tăng từ 15,3/100.000 người trong giai đoạn 1960-1964 lên

43,3/100.000 người trong giai đoạn 1985-1989 Tại Vaud, Thụy Sĩ, tỉ lệ UTV

đã tăng từ 2,1/100.000 phụ nữ (1997-1979) lên 9,4/100.000 phụ nữ 1994) [16, 19]

(1992-Tỉ lệ UTV ở châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt ở Nhật Bản,Hồng Kông và Singapore, nơi có lối sống tây hóa Điều này cho thấy các yếu

tố môi trường, lối sống và đặc biệt là chế độ ăn uống đóng một vai trò quantrọng trong sự phát triển của bệnh UTV

1.2.2 Ở Việt Nam

Tại Việt Nam, ung thư vú là bệnh ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ.Thống kê trung bình mỗi năm có 150.000 bệnh nhân ung thư mới được pháthiện, khoảng 75.000 người chết vì bệnh này và có đến 80% trường hợp chỉphát hiện khi bệnh đã ở giai đoạn muộn Theo điều tra ở Hà Nội năm 1998, tỉ

lệ số người mắc UTV là 20,3/100.000 người, năm 2000 là 17,4/100.000

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

người, năm 2006 tỉ lệ tăng lên 40/100.000 người, còn ở thành phố Hồ ChíMinh là 20/100.000 người [3].

1.3 GIỚI THIỆU VỀ UNG THƢ VÚ

1.3.1 Khái niệm chung về ung thƣ vú

UTV là bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ, bệnh diễn biến chậm,

khoảng 30% số bệnh nhân UTV tiến triển nhanh và dẫn đến tử vong trongvòng vài tháng Theo ước tính, từ khi tế bào hình thành khối u đến khi pháthiện được khối u từ 1 cm thì mất khoảng từ 7 đến 8 năm Nhưng khối u cókích thước từ 1 cm đến 2 cm thì mất thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng.Đây là thời gian cần có sự chữa trị sớm

Thường khi về già từ độ tuổi 40 trở đi, các tế bào bất thường dị dạng(abnormal cells) hay còn gọi là tế bào ung thư phát sinh từ biểu mô ống tuyếnhay biểu mô của tiểu thùy Nếu không chữa trị sớm, các tế bào ung thư sẽphát triển nhanh chóng trong vú, tạo thành một khối u ác tính

Trong quá trình phát triển, từ khối u đó cho ra những tế bào ung thư đivào mạch bạch huyết, lan tới các hạch bạch huyết Có khi tế bào ung thư đitheo các mạch máu để xâm nhập các cơ quan nội tạng (gan, phổi, óc ) hay bộxương, dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm chết người

Người phụ nữ trẻ cũng có thể bị ung thư vú, nhưng xuất độ (tần xuất,

độ xảy đến) thấp hơn nhiều so với người lớn tuổi Tuổi càng cao càng dễ bịung thư đủ loại, trong đó có ung thư vú [4, 28, 29]

1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú

Cho đến nay, con người vẫn chưa biết rõ ràng các nguyên nhân gây ungthư vú, nhưng có những yếu tố nguy cơ đã được xác định làm tăng khả năng

bị ung thư vú

a Tiền sử gia đình

Nguy cơ bị ung thư vú tăng từ 1,5 - 3 lần nếu người phụ nữ có mẹhoặc chị em gái mắc bệnh này Đặc biệt khi mẹ hoặc chị em gái bị ung thư

vú cả hai bên ở tuổi tiền mãn kinh thì nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ cóquan hệ gia đình này đạt tới mức gần như tuyệt đối Nguy cơ ung thư vúđối với con gái sẽ tăng từ 1,7 lần nếu người mẹ bị ung thư vú một bên, lênđến 3,28 lần nếu người mẹ bị ung thư vú cả hai bên

b Tiền sử sinh sản

Tuổi có kinh, tuổi mãn kinh và tiền sử mang thai là những yếu tố liênquan chặt chẽ với UTV Người ta đã chứng minh rằng ở những phụ nữ cókinh lần đầu sớm thì thường có hàm lượng estradiol cao hơn so với phụ nữbình thường, hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triểnUTV Một số nghiên cứu bệnh chứng khác cứ chậm kinh lần đầu một nămthì nguy cơ phát triển UTV sẽ giảm 20% Mãn kinh muộn sau tuổi 55 vàtổng thời gian có kinh nguyệt trong cuộc đời người phụ nữ cũng là nhữngyếu tố quan trọng trong nguy cơ gây UTV Phụ nữ chưa mang thai có nguy

cơ mắc bệnh UTV cao gấp 1,4 lần so với phụ nữ có mang thai Sinh con

sau 30 tuổi có nguy cơ bị UTV cao gấp 2 -5 lần so với nhóm sinh con trướctuổi 19 [12, 14]

c Thuốc tránh thai và điều trị các hormon thay thế

Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa dùng thuốc tránh thaitrong thời gian dài với UTV Nếu dùng thuốc tránh thai trên 8 năm, nguy

cơ mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên 10 năm thì nguy cơ tăng tới4,1 lần Dùng hormon thay thế ở phụ nữ mãn kinh là an toàn khi dùng trongthời gian ngắn Nếu dùng với liều trung bình trong thời gian từ 10 -20 nămnguy cơ mắc UTV tăng từ 1,5 - 2,0 lần [12, 21]

d Dinh dưỡng và rượu

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Thức ăn nhiều mỡ, cũng như rượu có thể làm gia tăng rủi ro mắc bệnhung thư vú National Cancer Institute (Viện Ung Thư Quốc Gia) khuyến

khích phụ nữ nên dùng thức ăn ít mỡ, tập thể dục đều đặn, và chỉ nên dùngrượu có chừng mực [8, 9, 17]

e Yếu tố môi trường

Các yếu tố môi trường như thực phẩm, thuốc reserpin, cafein, thuốc xịttóc, sự tiếp xúc với tia bức xạ ion hóa từ nguồn tự nhiên hay nhân tạo sẽ làmtăng nguy cơ phát triển UTV Gần đây, những nghiên cứu cũng chỉ ra mốiliên quan giữa khói thuốc lá và sự gia tăng nguy cơ mắc UTV Nhiều nghiêncứu gần đây cũng cho thấy các hợp chất hữu cơ chứa Clo như PCBs

(polychlorinated biphenyls) cũng làm tăng nguy cơ mắc UTV [6]

1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán

a Phương pháp vật lý: siêu âm, chụp cộng hưởng từ, chụp hình cắt lớp

phát xạ positron, chiếu xạ hình MIBI, chụp cắt lớp vi tính, nhiệt ký, chiếusáng qua mô và chụp thấu quang

b Phương pháp giải phẫu bệnh lý: Sinh thiết, xét nghiệm giải phẫu

bệnh lý, chẩn đoán lâm sàng (kích thước u, hạch và di căn)

c Phương pháp hóa sinh và hóa sinh miễn dịch: nguyên lý của

phương pháp dựa trên cơ sở khi cơ thể có khối u, bản thân tế bào ung thư sẽphát sinh ra những chất mới đặc hiệu, mà các chất này đóng vai trò như chấtnhận biết cho các tế bào ung thư này Các chất này thường được gọi tên

“tumor marker” và được phát hiện bằng các phương pháp miễn dịch

Tumor marker (TM): TM của cơ thể có thể là những phân tử protein,axit nucleic, enzym, hormon hay một số tế bào đặc biệt trong cơ thể khi xuấthiện những TBUT Việc phát hiện những chất này được thực hiện bằng các

phản ứng miễn dịch với kháng thể đặc hiệu, có độ nhạy cao Ví dụ, có thểdùng kháng thể đơn dòng để nhận biết CD33, CD20,…

d Phương pháp chẩn đoán thông qua một số gen đặc trưng: Sau đây

là một số gen đặc trưng được dùng để chẩn đoán bệnh UTV:

- Yếu tố phát triển mô HER2: Đây là phương pháp xác định sự khuếch

đại quá mức và biểu hiện quá mức của HER2 trong tế bào UTV HER2 là mộtthụ thể trên màng tế bào, có bản chất là một glycoprotein HER2 đóng vai tròquan trọng trong quá trình phát triển, biệt hóa, sự kết dính và sự chết của tếbào Cấu trúc, vai trò và chức năng của HER2 sẽ được trình bày chi tiết hơn ởphần sau

- Gen p53: đây là gen mã hóa cho phosphoprotein p53 của nhân, điều

hòa sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Thông thường p53 cóthời gian bán hủy rất ngắn nên không thể phát hiện được bằng phương pháphóa mô miễn dịch Trong tế bào ung thư, gen p53 đột biến làm kéo dài thờigian bán hủy của protein p53 nên có thể phát hiện bằng phương pháp hóa mômiễn dịch

- Gen telomerase: mã hóa cho ribonucleoprotein ADN polymerase, có

chức năng duy trì vùng telomersis của nhiểm sắc thể bị mất khi mỗi lần phânchia

- Gen CEA (carcinoembryonic antigen): mã hóa cho kháng nguyên bề

mặt của tế bào ung thư

- Gen cytokeratin 19 (CK19): dùng để chẩn đoán di căn ung thư vú, đạt

tới 67%

- Gen TMS-1 (target of methylation-induced silencing) có chức năng

trong điều hòa quá trình chết theo chương trình

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Gen BRCAI (breast cancer gene 1): Vào những năm đầu thập kỷ 90,

bằng việc nghiên cứu phân tích sự kết hợp một vị trí đặc hiệu ở nhóm nguy cơ

cao ung thư vú, người ta đã tìm thấy gen BRCAI BRCAI nằm trên một locus

nhỏ của nhiễm sắc thể 17 đôi 12 và 21 Phụ nữ bị đột biến trên BRCAI ướctính nguy cơ ung thư vú là 20% ở tuổi 40, 51% ở tuổi 50 và 81% ở tuổi 70

- Gen BRCAII (breast cancer gene 2): BRCA2 nằm trên nhiễm sắc thể

13, được phân lập vào năm 1995 Gen này nằm ngay cạnh gen nguyên bàovõng mạc (RBI) BRCAII chiếm khoảng 35% đến 40% ung thư vú mang tính

di truyền và đã tìm thấy trong những gia đình bị ung thư vú, gặp cả ở nam vànữ

- Gen BRCAIII (breast cancer gene 3): Trong số những gia đình có

nguy cơ cao bị ung thư vú, có khoảng 10.20% không thấy có mối liên quan

hoặc BRCAI hoặc BRCAII Giả thuyết có thể có một gen BRCAIII liên quan

đến ung thư vú Phân tích mối liên quan trong 8 gia đình đã cung cấp một số

dữ liệu bước đầu cho thấy có một gen thứ 3 liên quan đến ung thư vú

Ngoài ra, gần đây các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu đến độtbiến gen ti thể có liên quan tới chẩn đoán UTV

1.3.4 Các phương pháp điều trị

a) Hóa chất trị liệu: là phương pháp dùng hóa chất để tiêu diệt tế bào

ung thư vú như: adriamycin, cytoxan, taxol, taxotere, navelbine Mỗi loại lại

có cơ chế tác động riêng nhằm ngăn cản sự sinh sôi không kiểm soát của tếbào Ví dụ: adriamycin có tác dụng gắn vào chuỗi ADN làm cho tế bào khôngthể phân chia được trong khi taxol và taxotere thì gây độc tế bào ung thư bằngcách ức chế sự phân chia của tubulin

b) Hormon trị liệu: đây là phương pháp điều trị ung thư bằng cách

ngăn cản hay cho thêm kích thích tố vào cơ thể Rất nhiều trường hợp UTV

phát triển dưới sự kích thích của các kích thích tố Nếu chế ngự được sự kíchthích này, các tế bào ung thư có thể ngừng phát triển hay bị tiêu diệt Các biệtdược thông thường được dùng trong nhóm này gồm tamoxifen, toremifene,anastrozole, letrozole

c) Kháng thể đơn dòng: hiện nay trên thị trường đã có nhiều loại

kháng thể đơn dòng để phòng chống bệnh UTV như: muMAb, Herceptin,Lapatinib, immunoliposomes Các kháng thể đơn dòng sẽ được trình bày rõhơn trong phần tiếp theo

1.4 KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UNG THƢ VÚ 1.4.1 Khái quát về kháng nguyên HER2

EGF (Epidermal growth factor) là một trong những yếu tố tăng trưởngđược biết đến sớm nhất Stanley Cohen và cs tìm thấy yếu tố này lần đầu tiênvào năm 1962

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì – gọi là EGFR (epidermal

growth factor receptor) nằm trên bề mặt tế bào Đây là một glycoprotein

xuyên màng, phần nằm bên trong tế bào của thụ thể này gắn với một tyrosinekinaze Tyrosine kinaze này được hoạt hóa khi EGF đến gắn với thụ thể này.Thụ thể này do một gen nằm trong tế bào quy định Sự khuếch đại của gennày sẽ làm thay đổi thụ thể này và có thể gây gia tăng nguy cơ ung thư ở súcvật thí nghiệm và ở người Gen quy định EGF và thụ thể EGFR đã được tìmthấy ở mô tuyến vú bình thường và nhiều loại mô khác, nó điều hòa sự phânbào, sự sống và sự biệt hóa của nhiều loại tế bào

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì cũng là một nhóm, gồm 4 loạithụ thể: EGFR hay HER-1, HER-2, HER-3 và HER-4 (Human Epidermalgrowth factor Receptor) Trong đó được biết đến và được nghiên cứu nhiều

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhất là HER-2 Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của NST 17, mãhóa một thụ thể có chứa tyrosine kinse xuyên màng.

1.4.2 Cấu trúc của HER2

1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2

Gen HER2 được nghiên cứu phát hiện ra với tên HER-2 và eerG bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập vào năm 1985 (Coussens et al., 1985;

c-erbB-Semba et al., 1985) Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó cho thấy hai gen này

hoàn toàn giống nhau và thống nhất đặt tên gọi HER-2/neu (HER2) HER2

thuộc họ gen mã hóa các thụ thể sinh trưởng của các tế bào biểu bì HER

(Human Epidermal Growth Factor Receptor) Nó còn có các tên gọi khác như

v-erb-b2, Neu, TKR1, NGL, HER2, nằm ở nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm

động, ở vị trí q11.2 - q12.0 HER2 là một gen tiền ung thư (proto-oncogen) cóchiều dài 30528 bp chứa 27 exon, tổng chiều dài các exon là 4477 bp trong đóexon dài nhất có 969 bp, exon ngắn nhất có chiều dài 48 bp, gen này có 3 bảnsao tương đồng tương ứng với 3 allele B1( Ile-654/Ile655); allele B2 (Ile-654/Val-655); allele B3 (Val-654/Val-655)

Mặc dù kích thước gen HER2 trong hệ gen là rất lớn nhưng quá trình

hiệu chỉnh sau khi phiên mã tạo ra mARN trưởng thành với khoảng 1800 bp[1, 5, 18, 20, 22]

1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2

Protein HER2 có khối lượng phân tử 185 kDa, gồm 3 phần chính:

+ Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu N của thụ thể.Nằm ở vùng ngoại bào này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu

tố tăng trưởng biểu mô

+ Vùng xuyên màng lipit

+ Vùng nội bào có chứa đuôi C có mang các gốc tyrosine được

phosphoryl hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể

Hình 1.1 Cấu trúc của protein HER2 [74]

Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2); (3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)

Thụ thể HER2 bao gồm phần ngoại bào khoảng 632 amino acid, vùngxuyên màng dài 22 amino acid và vùng tyrosine kinase nội bào được cấu trúc

từ 580 amino acid Vùng ngoại bào của HER2 gồm 4 tiểu vùng: Tiểu vùng I

bao gồm các gốc amino acid từ vị trí số 1 đến vị trí 195 (SEQ1); tiểu vùng II

từ 196 319 (SEQ2); tiểu vùng III từ 320 488 (SEQ3); tiểu vùng IV từ 489

-630 (SEQ4) Thụ thể HER bình thường tồn tại ở trạng thái đơn phân bất hoạt

Sự hoạt hóa thụ thể xảy ra khi có ligand bám vào và làm hoạt hóa một dãy cácquá trình dẫn đến sự nhị hợp giữa các thụ thể, và cuối cùng làm trung gian

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cho các quá trình sinh học như sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào [7, 10, 11,27].

1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thƣ của HER2

Tất cả các tế bào biểu mô bình thường chứa đựng 2 bản sao của gen

HER2 và là mức thấp nhất của thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào Trong một vài trường hợp, số lượng các bản sao của gen HER2 tăng lên dẫn đến sự phiên

mã ra mARN tăng, số lượng các thụ thể HER2 cũng tăng lên trên bề mặt tế

bào gọi là sự biểu hiện quá mức của gen HER2.

Hình 1.2 Sự biểu hiện quá mức của HER2 trên bề mặt tế bào

Thụ thể HER2 không cần có các chất liên kết để hoạt hóa mà cấu trúccủa nó luôn luôn trong trạng thái “mở”, bắt chước trạng thái liên kết với

ligand, làm cho nó có khả năng bắt cặp hình thành trạng thái nhị hợp (dimer)với bản thân nó hoặc với các thành viên khác trong họ như HER1, HER3,HER4

Sự biểu hiện quá mức của HER2 là tác nhân làm tăng dimer hóa giữaHER2 với chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3) Đó cũng là những tín

hiệu khởi đầu cho các con đường sinh ung thư khác nhau Dưới đây là một đềxuất của Moaser về con đường sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của

HER2-HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào Tăng sự biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu Một vài yếu tố phiên mã được cảm ứng trong những tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết quả của những sự thay đổi biểu hiện gen

ở mức dư thừa

Feldman và cs (2007) đã đưa ra mô hình về con đường truyền tín hiệu

của những thụ thể hoạt động này Ở trạng thái hoạt động nó kích thích con

đường truyền tín hiệu phosphatidyl inositol 3′-kinase (PI3K) thông qua việc

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

gắn tiểu phần p85 vào Akt, dẫn tới hoạt hóa Akt Akt làm bất hoạt các phân tửtiền apoptosis bao gồm Bad, caspase-9 và p53 Thêm vào đó, dưới tác độngcủa Akt, các hoạt động chuyển hóa glucose, các kênh vận chuyển glucose(GLUT) (nhờ sự phosphoryl GSK3) và sự tổng hợp protein, chu trình pháttriển của tế bào (thông qua sự phosphoryl hóa của protein p90RSK, p70S6K,mTOR) đều tăng lên là những nhân tố ngăn chặn quá trình apoptosis Hơn thếnữa, sự hoạt hóa các yếu tố phiên mãB (nuclear factorB) còn kích ứng sựbiểu hiện của các gen anti-apoptosis thông qua các protein c-IAP1-2, TRAP1-2, và A1/Bfl-1 Kết quả của sự tăng sinh này cũng là một trong những

nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành ung thư [13, 15]

Hình 1.4 Cơ chế gây ung thư của HER2

1.5 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN

DÒNG

1.5.1 Cấu tạo chung của kháng thể (Immunoglobulin)

Kháng thể (antibody) là các globulin có trong huyết thanh của động vật

và có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó

Kháng thể theo định nghĩa trên đây được gọi là kháng thể miễn dịch

(Immunoglobulin, Kí hiệu là Ig).

Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm một hay nhiều đơn

vị hợp thành Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi polypeptide, 2chuỗi nặng (kí hiệu là H) và 2 chuỗi nhẹ (kí hiệu là L) Chuỗi nặng và chuỗinhẹ được nối với nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi nặng được nối với nhaubởi 2 cầu disulfide

Chuỗi nhẹ: Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi

nhẹ, chuỗi nhẹ kapa (κ) và lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai) và lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai

chuỗi nhẹ lambda hoặc hai chuỗi nhẹ kapa mà không bao giờ chứa cả hai loại.Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin, một vùng có trật tự axit amin

có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi có ki hiệu VL(variable) Vùng này nằm ởphía đầu amin (-NH2) của phân tử Vùng còn lại có trật tự axit amin khôngthay đổi gội là vùng hằng định kí hiệu CL(constant) Vùng này nằm ở phía đầucacboxyl (-COOH)

Chuỗi nặng: có 5 loại chuỗi nặng là μ, γ, δ, α và ε ứng với 5 lớp kháng

thể là IgM, IgG, IgD, IgA và IgE Chuỗi nặng chứa 4 vùng axit amin, mộtvùng biến đổi và 3 vùng cố định Cũng tương tự như ở chuỗi nhẹ, vùng biếnđổi của chuỗi nặng nằm ở phần đầu amin Vùng này có kí hiệu là VH Vùng

cố định nằm ở đầu cacboxyl Ba vùng cố định của chuỗi nặng được kí hiệu là

CH 1, CH 2, CH 3 Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhautạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy đảm bảo tính đadạng của kháng thể [2]

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo của kháng thể

1.5.2 Kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là kháng thể được tạo ra từ một dòng tương bàobiệt hóa từ lympho B ban đầu sau khi được kích thích bởi một quyết địnhkháng nguyên Kháng thể đơn dòng do quyết định kháng nguyên nào kíchthích thì chỉ kết hợp đặc hiệu với quyết định kháng nguyên ấy mà thôi

1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể

Trong cấu tạo của bất kỳ một kháng thể tự nhiên nào đều có 4 vùng biến

đổi (V - Variable) Sự kết hợp giữa 1 vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và

1 vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên(paratope) Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên.Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với

2 kháng nguyên giống nhau Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là

phần nhận biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding) Vùng kháng

nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope

Các kháng thể tự nhiên thường có kích thước lớn, khi có một tác nhângây bệnh xâm nhập vào trong cơ thể, nó được tổng hợp chậm và do có kíchthước lớn nên đôi khi nó được chuyển đến đích tác dụng chậm với tác nhângây bệnh Với công nghệ ADN tái tổ hợp hiện nay, đã có nhiều nhà khoa họcnghiên cứu tạo ra các kháng thể tái tổ hợp, tối ưu hóa các kháng thể đó màvẫn đảm bảo được tính đặc hiệu với kháng nguyên Cho đến nay đã có nhiềuthế hệ kháng thể tái tổ hợp được sản xuất ra.

Các phân tử kháng thể chứa các domain protein riêng biệt mà có thểphân tách bằng protease hoặc được tạo ra nhờ kỹ thuật tái tổ hợp Hai mảnhkháng thể được thiết kế gắn với kháng nguyên - Fab và Fv đã được tách

dòng và bộc lộ trên phage Mảnh kháng thể lớn hơn - Fab gồm các phần VH

- CH và VL - CL liên kết với nhau bằng cầu disulfide, còn mảnh kháng thểnhỏ hơn Fv chỉ bao gồm vùng V H và VL

Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi

Dạng tái tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi (scFv) Hai vùngbiến đổi trong mảnh kháng thể tái tổ hợp đơn chuỗi (scFv) được nối với nhaubằng một đoạn peptide, thường gồm 15 axit amin có trình tự (Gly4Ser)3 vàđược biểu hiện như một chuỗi polypeptide đơn (Hình 6) Đoạn nối cho phépvùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Mảnh kháng

kDa

1 Vùng VH và VL nối với nhau bằng

một linker dài 15 axit amin

Fv 25 kDa 1 Giữa VH và VL không có đoạn nối

(linker)

Minibody 80 kDa 2 Một protein dung hợp ở trạng thái

nhị phân gồm 2 mảnh scFv-CH3

Fab 50 kDa 1 Gồm hai chuỗi: VH-CH1 và VL-CL

IgG 150 kDa 2 Phân tử kháng thể mẹ gồm: 2

chuỗi nặng (VH-CH1-CH2-CH3) và

2 chuỗi nhẹ (VL-CL)

(VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạttính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích Đặc điểm của cácmảnh kháng thể khác nhau được tóm tắt trong bảng số 1 [23, 24, 25]

Bảng 1 Một số mảnh kháng thể đơn chuỗi

1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thƣ vú

Hiện nay, sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp các nhà khoa học đã

nghiên cứu để tạo ra các kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hiệu với HER2giúp cho sự chẩn đoán và điều trị mang lại hiệu quả cao hơn trong UTV

Ở Việt Nam, các thuốc chữa ung thư có bản chất kháng thể đơn dòngcũng đã xuất hiện nhưng với giá thành rất cao, phạm vi áp dụng hẹp, không thểđáp ứng được nhu cầu chữa trị của bệnh nhân Do đó việc nghiên cứu và đưavào sản xuất các thuốc chữa trị ung thư bằng công nghệ ADN tái tổ hợp đang

rất được quan tâm Đối với bệnh UTV dương tính với HER2 thì bước đầu tiêncủa quá trình là tách được toàn bộ gen HER2, sau đó có thể phát triển theo cáchướng quan tâm như chế tạo thuốc hay tạo các kít chẩn đoán sớm Sau đây làmột số loại kháng thể đang được sử dụng trong điều trị UTV dương tính vớiHER2:

- Kháng thể đơn dòng kháng HER2 từ bò (muMAb ): muMAb là kháng

thể đơn dòng tương tác với kháng nguyên HER2 nằm trên bề mặt của tế bào.muMAb 4D5 đem lại hiệu quả mong muốn trong việc chống lại sự phân chia

của các dòng tế bào ung thư vú ở người in vitro có sự biểu hiện quá mức thụ

thể HER2 mà không ảnh hưởng đến các dòng tế bào không biểu hiện quá mứcgen này Các thử nghiệm cận lâm sàng với muMAb 4D5 trên mẫu ghép UTV

và ung thư buồng trứng đã khẳng định tác dụng trị liệu của muMAb 4D5

- Trastuzumab (Tên thương mại: Herceptin) : được phát triển từ

muMAb 4D5, nhưng trastuzumab có khả năng gắn với domain trên bề mặtngoài tế bào của HER2 với ái lực lớn gấp 3 lần so ái lực của muMAb 4D5.Trastuzumab giống muMAb 4D5 ở khả năng ngăn chặn sự lớn lên của khối u

in vitro, tuy nhiên không giống muMAb 4D5, nó còn có thể cảm ứng sự gây

độc tế bào phụ thuộc kháng thể đối với các dòng tế bào ung thư vú

Herceptin tác dụng theo 3 con đường khác nhau:

1 Ức chế sự phát triển của khối u

Herceptin liên kết với thụ thể protein HER2 trên bề mặt tế bào khối u.HER2 với Herceptin gắn vào, được kéo lùi vào trong tế bào Khi HER2 khôngcòn ở trên bề mặt tế bào thì chúng sẽ không thể tạo nên tín hiệu làm tăng trưởng

và phân chia tế bào

2 Làm tín hiệu cho hệ miễn dịch

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Herceptin gắn vào thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào khối u Sau đó có

một số tế bào trong hệ miễn dịch, có thể là các tế bào diệt tự nhiên (NK –

Natural Killer), gắn với Herceptin Các tế bào NK có khả năng nhận ra các tế

bào khối u đó là bất thường và giết chết các tế bào khối u

3 Tác động kết hợp với hoá trị liệu

Herceptin và hoá trị liệu tác động ở các con đường khác nhau, nhưng

khi kết hợp cùng nhau, cả hai loại thuốc đó có thể hình thành nên một sự cộng

tác Ví dụ, khi Herceptin được sử dụng với hoá trị liệu mà tấn công và phá

huỷ ADN trong nhân của các tế bào khối u, Herceptin ngăn chặn không

cho tế bào sửa chữa chúng Do đó sự sửa chữa không được thực hiện và

dẫn đến tế bào sẽ bị chết Điều này làm chậm lại quá trình sinh trưởng của

khối u Herceptin cũng tác động kết hợp với các loại thuốc hoá trị liệu khác

và hoạt động theo các con đường khác nhau, tuy nhiên các nhà nghiên cứu

vẫn chưa biết chính xác được quá trình đó xảy ra như thế nào [26]

Hình 1.7 Cơ chế tác động của Herceptin đối với tế bào UTV

Herceptin (Tratuzumab) gắn kết với vùng ngoại bào của thụ thể HER2 trên bề mặt

tế bào ung thư vú, ức chế sự phân cắt vùng này để tương tác với các thụ thể khác trong

họ HER, làm cảm ứng sự chết theo chương trình của tế bào ung thư, giảm sự biệt hóa tế bào, làm giảm sự biểu hiện của HER2…

Herceptin đã được FDA chấp thuận (1998) sử dụng lần đầu tiên kết hợp

với paclitaxel trong việc điều trị UTV di căn dương tính với sự biểu hiện quá

mức thụ thể HER2

1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin

Một trong những liệu pháp mới đang được quan tâm là sự kết hợp giữa

phân tử kháng thể hướng đích điều trị với phân tử gây độc tế bào Độc tố

miễn dịch (Its) kết quả của sự kết hợp này đang được hi vọng là sẽ mang lại

hiệu quả cao hơn Với hướng phát triển đó, chúng tôi đã lựa chọn Melitin để

tạo phân tử đọc Its sử dụng trong điều trị ung thư vú Melitin là một peptide

gồm 26amino axid, chiếm 50% trọng lượng khô của lọc độc ong, có khả năng

phá huỷ tế bào do phá vỡ cấu trúc màng tế bào (8) Gen mã hoá độc tố miễn

dich được tạo ra bằng công nghệ gen bao gồm phần mã hoá kháng thể đơn

chuỗi đặc hiệu HER2 và phần mã hoá melitin (Lê Quang Huấn, 2004) (1)

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vector biểu hiện pET21-a(+)

Các enzyme giới hạn EcoRI, và NotI,

Anti-HER2F: 5’- 3’

TGGCGCCTCATGGACTGCCCTTACGGACCAAG-Anti-HER2R: 5’- ACCCGGGATCGGTÂCCAAGTACCTTGACC-3’

2.1.2 Hóa chất và môi trường

 Hóa chất

Các hoá chất tinh khiết được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học

phân tử của BioLabs, Invitrogen, Novagen, Sigma, Fermentas và

Bioscience, gồm:

- Các hóa chất dùng trong điện di polyacrylamid: Acrylamid,

Bis-acrylamid Tris-HCl, Glycerol, SDS, APS, temed, ……

- Chất cảm ứng IPTG

- Các hóa chất dùng để tinh sạch protein: Guanidinium lysis buffer,

Denaturing binding buffer, Denaturing wash buffer, Native wash

buffer, Native elution buffer

 Môi trường

- LB lỏng: trypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%.

- LB đặc: trypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, agar 1,5%

Môi trường được khử trùng ở 121oC, 0,8 atm trong 30 phút

2.1.3 Thiết bị

Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc)

Máy li tâm (Eppendorf, Đức)

Máy đo pH (Metter, Thuỵ Sĩ)

Máy soi gel (Pharmacia, Mỹ)

Máy PCR (Mỹ)

Máy lắc ổn nhiệt 37oC, 30oC, 28oC

Cân phân tích 10-4 g (Mettler Toledo)

Cân điện 10-1 g (Ohaus)

Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật)

Bộ điện di protein (Bio-Rad)

Máy Vortex (Rotolab OSI)Máy đọc trình tự (Mỹ)

Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật)

Bể ổn nhiệt (Teche, OSI)

Pipetman các loại (Gilson)

Bộ điện di ADN

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 PCR

Kỹ thuật PCR được Karl Mullis và các cộng sự phát minh năm 1985

(giải Nobel hoá học năm 1993) Đây là kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu in vitro

đoạn ADN nằm giữa hai đoạn trình tự ADN đã biết (đoạn mồi) PCR là mộtphản ứng sinh hóa phụ thuộc vào nhiệt độ, có sự tham gia của một loại

enzyme ADN polymerase chịu nhiệt và sử dụng nguyên lý như quá trình sao

chép ADN trong tự nhiên

Nguyên tắc: Dựa trên sự lai đặc hiệu giữa ADN mồi với ADN khuôn

theo nguyên tắc bổ sung và phản ứng kéo dài chuỗi của ADN polymerase trong ống nghiệm (in vitro) Do đó từ một đoạn gen đã biết trước ta có thể

tổng hợp nên số lượng lớn gen đó trong ống nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3 phút

45 giây

45 giây

1 phút 20giây

Taq ADN polymerase

H20Tổng

2,52,52,541120,39,225

Thành phần phản ứng, các điều kiện về nhiệt độ và thời gian của toàn

bộ quy trình như sau:

Chương trình thực hiện phản ứng PCR

Thành phần Thể tích (l)

ADN/PlasmidDung dịch đệm 4BSA

NotI

H20

325535

PlasmidDung dịch đệm 2

EcoRI

H20

155322

2.2.2 C¾t b»ng enzyme giíi h¹n.

Thµnh phÇn hçn hîp ph¶n øng c¾t ADN plasmid b»ng enzyme giíi h¹n

EcoRI:

Toàn bộ hỗn hợp trên được giữ ở 370C, 4h

Thµnh phÇn hçn hîp ph¶n øng c¾t ADN plasmid b»ng enzyme giíi h¹n

NotI:

Ủ hỗn hợp 370C, thời gian 4h

2.2.3 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện

Thiết kế vector mang gen hermel: Vector pET-21a(+) được cắt bằng

hai enzyme giới hạn tại hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

NotI, gen mã hoá độc tố miễn dịch hermel trong vector tách dòng TOPO PCR

2.1 cũng được cắt bằng hai enzyme trên Sản phẩm cắt được tinh sạch và điện

di trên gel agarose 0.8%, sau đó được gắn vào vector biểu hiện pET-21a(+)bằng T4 ligase (BioLabs)

Sau khi gắn sản phẩm được biến nạp vào E.coli chủng TOP10 Cáckhuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên đĩa môi trường LB đặc có

bổ sung Apicilli (100 μμg/ml) và được nuôi trong môi trường LB lỏng (có chứaampicillin), Plasmid ADN sau đó được tách ra để kiểm tra sự có mặt của genmong muốn bằng PCR với cặp mồi Anti-Her2F và Anti-Her2R

Sản phẩm thôi gel được gắn vào vector pET21a(+) cũng đã được cắt

với 2 enzyme giới hạn EcoRI và NotI Các dòng tế bào có chứa vector tái tổ

hợp mang gen mã hoá độc tố miễn dịch được chọn lọc bằng cách so sánh kíchthước tương đối của ADN plasmid cũng như kết quả cắt kiểm tra bằng các

enzyme giới hạn EcoRI và NotI.

Kết quả này còn được khẳng định bởi việc xác định trình tự nucleotide

của gen hermel sau khi được gắn vào vector biểu hiện pET21a(+) tại các vị trí

nhận biết của enzyme giới hạn EcolRI và NotI Gen hermel chứa các vùng

chức năng cũng như mã mở đầu, mã kết thúc theo đúng thiết kế (xem phần

phân tích trình tự dưới đây) Trình tự gen hermel đã được đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế với mã số: AM402973 Plasmid chứa gen hermel sau khi

được xác định trình tự được tinh sạch và biến nạp vào E.coli chủng Rosetta đểbiểu hiện gen tái tổ hợp ở nhiệt độ 37oC sau 4h cảm ứng với nồng độ 0.6 mMIPTG

Plasmid tái tổ hợp

pET-21a(+)/HER2

Chủng E coli BL21

(DE3)Biến nạp

Chủng E coli BL 21 (DE3) mang

plasmid tái tổ hợppET-21a(+)/HER2

Biểu hiện

Protein tái tổ hợp (độc tốmiễn dịch đặc hiệu khángnguyên Her2)

Tinh sạch

scFv đặc hiệu HER2

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình biểu hiện độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng

nguyên Her2 trong E coli

Chú thích: Biến nạp:

Biểu hiện:

- Làm tế bào khả biến (chủng E coli BL 21 (DE 3 ))

- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến

- Cảm ứng bằng IPTG -

-Xử lý mẫu Điện di gel polyacrylamid

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.4 Phương pháp biến nạp

Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp từ tế bào cho sang tế bàonhận Cơ chế của biến nạp là vi khuẩn nhận nhận trực tiếp ADN từ thể cho.Những tế bào có khả năng nhận ADN được gọi là tế bào khả biến

 Nguyên tắc của phương pháp

Màng tế bào có bản chất phospho lipid kép, tích điện âm, do đó sẽ cảntrở sự di chuyển của các plasmid ngoại lai cũng là những phân tử tích điện âm

ở bề mặt Khi xử lí các tế bào này với CaCl2, dưới tác dụng của Ca2+ sẽ chechắn các gốc tích điện âm ở trên lỗ màng và đồng thời làm cho màng tế bàoxốp hơn Sau đó khi sốc nhiệt, màng tế bào giãn nở đột ngột, lỗ màng mởrộng tạo điều kiện cho plasmid xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng

 Phương pháp thực hiện

Chuẩn bị tế bào khả biến:

- Lấy chủng tế bào E coli BL21 được cất giữ ở -200C

- Nuôi cấy 1% chủng tế bào trong 2 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở

37oC, 200 v/ph qua đêm

- Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua đêm sang 2 ml môi trường LBlỏng Nuôi lắc ở 37oC, 200 v/ph trong 3 h đến OD600 đạt 0,5 - 0,6

- Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút

- Ly tâm thu sinh khối (4000 v/ph, 4oC trong 5 phút), loại dịch nổi

- Rửa cặn tế bào bằng 300l CaCl2

- Ly tâm 4000 v/ph trong 5 phút, loại dịch nổi

- Hoà lại tế bào trong 60l CaCl2, búng nhẹ cho tan hết tế bào

- Để ống tế bào trong đá ít nhất 1 h trước khi sử dụng cho biến nạp

Biến nạp vào E coli BL21:

- Lấy tế bào khả biến đã chuẩn bị để trên đá.

- Lấy 2l plasmid tái tổ hợp pET-21a(+)/HER2 cho vào tế bào khảbiến để trên đá khoảng 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giây, sau đó đặt ngay ống tế bào vào đá và để 2phút

- Bổ sung 250l môi trường LB, nuôi lắc 200 v/ph ở 37oC trong 1 giờ

- Cấy trải 150l dịch tế bào nuôi cấy trên đĩa petri có môi trường thạch

LB chứa 1% Amp (100g/ml)

- Nuôi ở tủ ấm ở 37oC qua đêm

2.2.5 Phương pháp biểu hiện

 Cảm ứng mẫu

Nguyên tắc:

Nuôi cấy các thể biến nạp trong môi trường có chất cảm ứng promoter đểprotein tái tổ hợp có thể được tổng hợp Sau đó, kiểm tra protein tái tổ hợpbằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide để phát hiện băng proteintái tổ hợp

 Nuôi lắc 200 v/p, 37oC đến khi đạt OD600 thích hợp

 Thu mẫu trước cảm ứng, sau đó bổ sung vào dịch nuôi chất cảm ứngIPTG với nồng độ thích hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nuôi với chế độ và thời gian thích hợp cho sự biểu hiện Thu mẫu saucảm ứng.

2.2.6 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid

Nguyên tắc:

Phức hợp protein-SDS thu được sau khi biến tính protein bằng SDS cóđiện tích âm chỉ phụ thuộc vào kích thước của protein mà không phụ thuộcvào trình tự của protein đó Nhờ đó, hỗn hợp protein sau khi biến tính có thểchuyển động trong điện trường theo chiều từ cực âm đến cực dương và tách rathành các băng theo kích thước trên gel polyacrylamid

Protein trong gel polyacrylamide được phát hiện bằng cách nhuộm vớiCoomasie Brilliant Blue (CBB) và quan sát bằng mắt thường

Cách tiến hành:

Chuẩn bị gel polyacrylamid:

 Gel phân tách:

H2OTris-HCl (pH = 8; 3M)Acrylamide

GlycerolAPS.10%

SDS.10%

Temed

 Gel cô mẫu:

H2OTris-HCl (pH = 6,8 M ; 0,5 M)Acrylamide

3,125 ml0,625 ml2,1 ml

1 ml25l25l4l

1,385 ml0,625 ml0,425 ml

SDS.10%

Temed

25l12,5l3l

 Xử lý mẫu: Hút 1 ml dịch sau phản ứng ly tâm 12.000 v/p, thu cặn

tế bào Hòa lại trong 40l H2O + 10l SDS Sample, biến tính ở

100oC trong 5 phút

 Tra mẫu: Lấy 15l dịch protein đã biến tính tra vào mỗi giếng

 Chạy điện di: Điện di theo chiều thẳng đứng với cường độ dòngđiện 40 mA, trong thời gian khoảng 40 phút

Nhuộm bản gel: Bằng dung dịch CBB được pha trong dung dịch tẩygel Sau đó tẩy bản gel và xác định kết quả

2.2.7 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni 2+

Cột sắc ký ái lực Ni2+ được thiết kế để tinh sạch protein tái tổ hợp cóchứa 6 gốc histidine Đây là đuôi Histag được mã hóa bởi các bộ 3 mã hóanằm trên vector do nhà sản xuất thiết kế có ái lực mạnh đối với Ni2+ Có thểdùng cột sắc ký ái lực Nikel resin để tinh sạch những protein tái tổ hợp đượcbiểu hiện trong nhiều loại vật chủ khác nhau

Qui trình:

 Ly tâm thu cặn tế bào từ 50 ml môi trường

 Bổ sung 8 ml Guanidin Lysis Buffer (6 M Guanidin hydrochloride,Sodium phosphate 20 nM, pH 7.8, NaCl 500 mM), vortex nhẹ

 Dùng siêu âm để phá tế bào trong 5 phút

 Ly tâm 5.000 v/p, thu dịch nổi để chuyển lên cột Ni Đảo đều trong 30phút ở nhiệt độ phòng Cố định cột theo chiều thẳng đứng cho dịch chảy ra từtừ