Khía cạnh khoa học trong nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh của cây trồng

Khía cạnh khoa học trong nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh của cây trồng

Khía cạnh khoa học trong nghiên cứu kích thích

tính kháng bệnh của cây trồng Phạm Văn Kim

Bộ môn bảo vệ thực vật Trường Đại học Cần Thơ

Tóm tắt

Các nghiên cứu về sự kích thích tính kháng bệnh của cây trồng được dựa trên các hiểubiết về các cơ chế kháng bệnh của thực vật các cơ chế kháng bệnh của thực vật được xếp vào hainhóm: nhóm cơ chế về sinh hoá và nhóm cơ chế về cấu trúc mô học nhóm cơ chế về sinh hóahọc bao gồm sự tiết ra các protein có liên quan đến bệnh cây, trong đó có 12 chất được biết dướicác tên là pr-1, pr-2, ?β-1,3-glucanase), pr-3 ?chitinase), pr-4, pr-5, pr-8, pr-11, protein bất hoạtribosom ?ribosome inactivating protein), protein chuyển hoá chất béo nstps ?lipid transferprotein), amps ?hevein-type), thionis và plant defensins, các enzim có liên quan đến kháng bệnhcủa thực vật như pal ?phenylalanine ammonia lyase), peroxidase và catalase nhóm cơ chế về cấutrúc mô học bao gồm các phản ứng lignin hoá vách tế bào bị xâm nhiễm, sự hình thành cácpapillae bên dưới đĩa áp của nấm gây bệnh, các tế bào tích tụ polyphenol, h2o2

các nghiên cứu về kích thích tính kháng bệnh của thực vật được tiến hành theo 3 bước: tìm ra cáctác nhân kích thích tính kháng bệnh của cây, đánh giá hiệu quả kích thích tính kháng bệnh củacác tác nhân và tìm hiểu các cơ chế kháng bệnh và tác nhân đó đã gợi ra được trong giống câynhiễm bệnh khi bị mầm bệnh độc tấn công bước tìm ra tác nhân và đánh giá hiệu quả kích thíchtính kháng bệnh được thực hiện trong nhà lưới và đánh giá theo định lượng với thang điểm đượcnghiên cứu từ trước bước nghiên cứu các cơ chế kháng bệnh do tác nhân kích kháng gợi ra trong

mô của giống nhiễm bệnh được kích thích tính kháng tạo ra khi bị mầm bệnh tấn công, được thựchiện trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các cơ chếkháng bệnh về mặt cấu trúc mô học hoặc sử dụng máy đo quang phổ để phát hiện các cơ chếkháng bệnh về cấu trúc mô học hoặc sử dụng máy đo quang phổ để phát hiện sự gia tăng hoạttính các enzim β-1,3-glucanase, chitinase, pal, peroxidase và catalase

1 mở đầu

ở động vật cao cấp, sự miễn dịch trong cơ thể ở mức mô học cũng như ở mức tế bào đãđược hiểu biết khá tường tận và được ứng dụng một cách có hiệu quả trong phòng ngừa và trị cácbệnh quan trọng ở người và gia súc qua ứng dụng các hiểu biết này chúng ta đã ngăn chặn sựphát triển hoặc loại trừ một số các loại như dịch hạch, dịch bệnh đậu mùa…

trên thực vật, hệ miễn dịch thể hiện một cách khác hơn ở động vật và khó nhận ra hơn nênviệc ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp còn hạn chế ở các loại cây trồng, chúng ta thường quantâm đến việc sử dụng giống cây kháng bệnh để đối phó với các dịch bệnh của loại cây này chúng

ta thường nhắc đến các gen kháng bệnh như các công cụ quan trọng trong chọn lọc các giống đểđưa ra sản xuất, để đối phó với các dịch bệnh quan trọng tuy nhiên có những trường hợp cácgiống cây tuy bị nhiễm bệnh nhưng lại có các đặc tính khác rất ưu việt mà chúng ta không thểloại bỏ được vậy chúng ta có thể ứng dụng các kiến thức đã biết về hệ miễn dịch của thực vật đểtìm ra biện pháp cải thiện tính nhiễm bệnh của chúng để sử dụng các giống có những đặc tính ưuviệt này hay không? kiến thức của nhân loại cho thấy bên cạnh sự kháng bệnh tự nhiên của một

số giống cây, các giống nhiễm bệnh cũng có thể được kích thích để có được khả năng kháng với

bệnh sự kiện này được gọi dưới tên là sự kích thích tính kháng bệnh ?induced resistance) ở thựcvật.

2 sự kháng bệnh ở thực vật và sự kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng

đến nay kiến thức của nhân loại đã tiến khá sâu vào lĩnh vực miễn dịch của thực vật đốivới bệnh bên cạnh việc tiến rất sâu vào khía cạnh phân tử của các gen khánh bệnh, các nhà khoahọc còn đi sâu dần vào các cơ chế của sự kháng bệnh bài báo này sẽ đề cập đến một số cơ chếkháng bệnh của thực vật có liên quan đến chuyên đề kích thích tính kháng bệnh

các cơ chế của sự kháng bệnh ở thực vật có thể được phân ra hai nhóm: nhóm cơ chếthuộc về sinh hoá học và nhóm cơ chế thuộc cấu trúc mô học

2.1 cơ chế kháng bệnh thuộc về sinh hoá học

sau khi bị vi sinh vật tấn công để gây bệnh, nơi bị xâm nhiễm tiết ra một loạt các hợp chấtchống vi sinh vật ?antimicrobial compounds), cac protein liên quan đến bệnh ?pathogenesisrelated protein), các enzim để làm giảm hoạt động của mầm bệnh và nhiều chất khác

về hợp chất chống vi sinh vật có thể chia ra hai nhóm, nhóm phytoanticipins và nhómphytoaleuxins phytoaleuxins do ký chủ tiếu ra để chống lại với mầm bệnh, trong khi đóphytoanticipins không phải do ký chủ trực tiếp tiết ra mà do sự tương tác giữa các chất của kýsinh và ký chủ tạo ra ?mansfied, 2001) hai nhóm chất này có thể tìm thấy trong các giống có tínhkháng bệnh cao

bên cạnh đó các tác giả lần lượt phát hiện ra một loạt các protein có liên quan đến bệnhcây cũng được tế bào tiết ra cac protein này có vai trò làm giảm sự phát triển của mầm bệnhbằng các tác động lên vách tế bào, màng nguyên sinh chất hoặc lên ribosom của sinh vật cácprotein này được xếp vào 18 họ protein trong đó 12 họ được biết đến với tên là pr-1, pr-2, pr-3,pr-4, pr-5, pr-8, pr-11, protein bất hoạt ribosom ?ribosome inactivating protein), protein chuyểnhoá chất béo nsltps ?lipis transfer proteins), amps ?hevein – type), thionins, plant defensins… vaitrò của các protein này được tóm lược như sau: pr-2 ?β-1,3-glucanase) có vai trò trong phân huỷthành phần β-1,3-glucan và β-1,6-glucan của vách tế bào vi sinh vật ?van loon, 2001) hai nhómezim β-1,3-glucanase và chitinase có tác động hỗ trợ nhau làm tăng hiệu quả trong sự phân huỷvách tế bào của mầm bệnh ?broekaert và ctv., 2001; schlumbaum và ctv., 1986 và mauch và ctv.,1998) hình 1 cho thấy cách tác động của 12 họ protein chống vi sinh vật kể trên

hình 1 sơ đồ tác động của các protein chống vi sinh vật lên nấm gây bệnh cây ?broekaert và ctv., 2001)

bên cạnh đó một loạt các enzim khác cũng được hình thành trong tế bào bị mầm bệnhxâm nhiễm với vai trò chuyển hoá các chất độc do mầm bệnh tiết ra hoặc trung hoà độc tính củacác chất do tế bào cây tiết ra khi phản ứng lại mầm bệnh, các chất này khi ở nồng độ cao có thểgây hại cho tế bào cây trong phạm vi bài này, có thể kế hai enzim có liên quan đến bệnh cây nhưpal ?phenylalanine ammonia lyase), peroxidase, catalase…pal có vai trò thúc đẩy sự sinh tổnghợp các hợp chất polyphenol, là chất quan trọng trong sự chống bệnh của cây trồng ?lawton vàctv., 1980) còn peroxidase có nhiều vai trò trong đó có vai trò khử h2o2 và vai trò phối hợp vớipal trong việc giúp lignin hoá vách tế bào bị tấn công qua đó ngăn cản cơ học sự lan ra xa hơncủa nấm gây bệnh ?legrand và ctv., 1976) h2o2 được tích tụ trong tế bào với nhiệm vụ oxyd hoácác chất độc do nấm tiết ra, oxyd hoá các polyphenol làm cho polyphenol không còn độc đối với

tế bào, nhưng h2o2 với nồng độ độc cao lại gây hại cho tế bào do đó peroxidaz làm giảm bớt tínhđộc của h2o2 đối với tế bào ký chủ

bên cạnh phát hiện ra sự gia tăng hoạt tính của các enzim, các tác giả còn nghiên cứu sựxuất hiện các tín hiệu do sự kích kháng gợi lên các tín hiệu bao gồm: salicylic acid, jasmonicacid và etylen.

2.2 cơ chế kháng bệnh về cấu trúc mô học

moerschbacher và mendgen ?2001) tổng kết cho thấy có 4 cơ chế kháng bệnh về mặt môhọc, tuỳ thuộc vào 4 cách xâm nhập của nấm gây bệnh ?hình 2)

hình 2 sơ đồ mô tả 4 cách chống lại sự xâm nhiễm của nấm gây bệnh của thực vật ?vẽ theomoerschbacher và mendgen, 2001)

1) sự tạo ra lớp vách tế bào mới chung quanh vết thương để bao vây và ngăn cản sự xâmnhập tiếp theo của các nấm yếu, chỉ xâm nhập qua vết thương

2) sự rắn chắc hoá vách tế bào bằng cách lignin hoá vách tế bào bị nấm xâm niễm

3) sự hình thành papillae ?vách dầy) bên dưới đĩa áp ?appressorium) để ngăn cản sự xâmnhập của nâm gây bệnh

4) tích tụ hợp chất phenol đưa đến phản ứng tự chết của tế bào để cô lập nấm gây bệnh làphản ứng kháng bệnh ở mức cao của thực vật

bốn phản ứng tự vệ này có thể quan sát được qua kính hiển vi quang học ?moerschbacher

và mendgen, 2001)

phản ứng lignin hoá vách tế bào do tác động của pal và peroxidase, có thể được nhận thấyqua kính hiển vi huỳnh quang dưới dạng các vách tế bào phát huỳnh quang sự hình thành cácpapillae cũng có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ?trần thị thu thuỷ và ctv., 2004)

sự tích tụ h2o2 và polyphenol trong tế bào ký chủ cúng có thể quan sát được qua kính hiển

vi quang học với các phương pháp nhuộm thích hợp ?trần thị thu thuỷ và ctv., 2004)

phản ứng của cây đối với sự tấn công của mầm bệnh còn phức tạp hơn vì các phản ứngnày còn có mối tương tác hỗ trợ lẫn nhau để tạo ra hiệu quả chống bệnh cao hơn

ở giống cây kháng bệnh, khi bị mầm bệnh tấn công, tế bào phản ứng tức thì với một hoặcnhiều cơ chế, tuy nhiên khi bị mấm bệnh tấn công, các cơ chế này được hoạt hoá rất chem nênkhông đủ sức chống lại sự tấn công của mầm bệnh nên bị nhiễm bệnh có thể do những sự ức chế

ở mức phân tử nên các cơ chế này không phát huy kịp thời nếu chúng ta kích thích để giải thoát

sự cức chế này trước khi cây bị nhiễm bệnh, các cơ chế này sẽ được kích hoạt kịp thời và giúpcây chống được với mầm bệnh và cây trở nên kháng với bệnh, ở mức độ nhất định, tuỳ thuộc vào

cơ chế kháng mà giống đó có đây là sự kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng

tuỳ thuộc vào giống cây có sẵn những cơ chế kháng bệnh nào, hiệu quả của sự kích thíchtính kháng bệnh sẽ ở mức cao hoặc ở mức vừa nếu cây có cơ chế hình thành papillae thì sự kíchthích tính kháng bệnh sẽ giúp cây giảm số vết bệnh ?do papillae ngăn cản bớt sự xâm nhập củanấm bệnh) nếu cây không có phản ứng hình thành papillae, thì kết quả là số vết bệnh ở cây đượckích kháng sẽ tương đương như ở cây không được kích kháng tuy nhiên diện tích vết bệnh sẽnhỏ hơn vết bệnh ở cây không được kích kháng do phản ứng tự vệ bên trong tế bào bị xâm nhiễmđược hình thành, như sự lignin hoá vách tế bào giúp vách tế bào rắn chắc hơn làm cho mầm bệnhlan ra chung quanh khó khăn hơn, hoặc sự gia tăng hoạt tính các enzim như β-1,3-glucanase,chitinase, pal, peroxidase hoặc sự tích tụ polyphenol… làm ngăn trở sự phát triển của mầm bệnh,thậm chí giết chết dần mòn mầm bệnh trường hợp này cây có phản ứng kháng vừa

phần sau đây xin gọi tắt cụm từ “kích thích tính kháng bệnh” là “kích kháng”

để tìm ra giải pháp kích kháng cho một giống cây nhiễm với bệnh, quá trình nghiên cứucần qua các bước sau:

- tìm ra các tác nhân gây kích kháng thích hợp

- đánh giá khả năng kích kháng của tác nhân này.

nghiên cứu xác nhận sự kích kháng của tác nhân này thông qua các cơ chế kháng bệnh thểhiện sau khi được kích kháng và bị mầm bệnh tấn công quá trình nghiên cứu cơ chế của sự kíchkháng được thực hiện theo hai cách: quan sát cơ chế kháng bệnh qua kính hiển vi ?cơ chế khángtrong cấu trúc mô học) và phân tích sự gia tăng hoạt tính của các enzim có liên quan đến sựkháng bệnh ?cơ chế kháng về sinh hoá học)

3 tìm và đánh giá khả năng kích kháng của tác nhân gây kích kháng

trong thiên nhiên có rất nhiều tác nhân có thể gây kích kháng cho một giống nhiễm bệnhcủa một loại cây trồng thông thường, mầm bệnh thuộc chủng yếu đối với giống ấy, thường tạođược phản ứng kích kháng ?fink và ctv., 1990) và được rất nhiều tác giả sử dụng trong nghiêncứu sự kích kháng tuy nhiên tác nhân này chỉ dùng để nghiên cứu, không thể áp dụng được, vìchủng mầm bệnh này có thể trở nên độc đối với giống khác có ngoài sản xuất do đó trong thực

tế, việc tìm tác nhân kích khángthường đặt mục tiêu trên các vi sinh vật không gây hại cho cáclaọi cây trồng và không độc hại cho môi trường thí dụ, trong nghiên cứu tìm tác nhân kích kháng

chống bệnh đạo ôn ?pyricularia grisea) trên lúa, trần vũ phến và ctv ?2003) đã tìm được chủng nấm colletotrichum sp ?đến nay chủng nấm này được xác định là sporothrix sp.) gây kích kháng

tốt đây là chủng nấm gây bệnh cho cỏ lồng vực trên trong ruộng lúa, không ký sinh trên lúa và

các loại cây trồng khác lăng cảnh phú và phạm văn kim ?2002) tìm ra chủng vi khuẩn flavimonas

oryzihabitans, là tác nhân gây kích kháng giúp cây lúa kháng vừa với bệnh đạo ôn bên cạnh các

vi sinh vật, các chất trích từ một số loài thực vật cũng có thể gây kích kháng cho cây trồng phạmvăn kim và ctv ?2003) báo cáo chất trích từ năm loại thực vậtcó khả năng kích kháng đối vớibệnh đạo ôn trên lúa các hoá chất không phải là thuốc bảo vệ thực vật cũng là nguồn cung cấptác nhân kích kháng quan trọng cho các nhà nghiên cứu phạm văn kim và ctv ?2004) đã pháthiện ra 10 hoá chất có khả năng kích kháng giúp giống lúa nhiễm bệnh kháng với bệnh đạo ôn ởcác mức độ khác nhau

về mặt thể hiện hiệu quả kích kháng trên cây có thể phân ra kích kháng tại chỗ ?localizedinduced resistance) và kích kháng lưu dẫn ?systemic acquired resistance) kích kháng tại chỗ làkhi sự kích kháng chỉ gợi được tính kháng bệnh tại nơi được kích thích, còn các phần khác củacây không có được hiệu quả này kích kháng lưư dẫn là sự kích thích được tác động lên một láhoặc một bộ phận của cây nhưng các bộ phận khác của cây cũng nhận được hiệu quả kháng bệnh.trên thực tế, kích kháng lưu dẫn hữu ích hơn kích kháng tại chỗ và được quan tâm nghiên cứunhiều hơn

để phát hiện một tác nhân có khả năng gây kích kháng, các nghiên cứu cần chọn giốngcây và chủng của mầm bệnh thích hợp ?giống cây nhiễm với chủng của mầm bệnh sử dụng trongthí nghiệm) và bố trí trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ hoàn toàn thích hợp với sự phát triển củamầm bệnh, cây thí nghiệm được bón phân đạm với mức thích hợp nhất cho sự lây bệnh nhân tạo.cây trồng được kích kháng trên một vài lá đã phát triển đầy đủ sau đó vài ngày, cây được tiêmchủng nhân tạo vơí mầm bệnh tương ứng trên tất cả các lá của cây và được đưa vào điều kiện tốihảo để ủ bệnh bệnh được đánh giá trên các lá không được kích kháng một cách cẩn thận theothang đánh giá đã được nghiên cứu trước để có số liệu chính xác thí nghiệm cần có ít nhất 3nghiệm thức là: giống kháng không kích kháng, giống nhiễm không kích kháng và giống nhiễm

có kích kháng số liệu sau khi phân tích và thống kê sẽ cho biết hiệu quả của sự kích kháng vàcủa tác nhân kích kháng tương ứng

4 nghiên cứu tìm hiểu cơ chế kích kháng

có hai hướng nghiên cứu tìm hiểu các cơ chế của sự kích kháng:

- quan sát sự thay đổi của mô ở nơi bị mầm bệnh xâm nhiễm.

- tìm hiểu sự tăng hoạt tính của các enzim có liên quan đến sự kháng bệnh trong mô cây được kích kháng

4.1 quan sát sự thay đổi của mô để đánh giá hiệu quả của kích kháng

thí nghiệm được bố trí như trên với ít nhất 4 lần lặp lại và 3 nghiệm thức: đối chứngkháng ?giống kháng bệnh không kích kháng), đối chứng nhiễm ?giống nhiễm bệnh không kíchkháng) và giống nhiễm bệnh có kích kháng sau khi kích kháng và lây bệnh nhan tạo lấy mẫu lá

để quan sát vào rất nhiều thời điểm tuỳ laọi cây và loại bệnh mẫu lá được định hình và tẩy diệplục tố, sau đó có hoặc không nhuộm màu theo nhu cầu và được quan sát trực tiếp qua kính hiển viquang học thích hợp cho từng mục đích

để khảo sát sự tăng cường lignin hoá vách tế bào, nơi bị mầm bệnh xâm nhiễm, số tế bào

có vách phát sáng được đém dưới kính hiển vi huỳnh quang sự so sánh số liệu giữa 3 nghiệmthức giống nhiễm có kích kháng, giống nhiễm không kích kháng và giống kháng không kíchkháng giúp chúng ta thấy được cơ chế tăng cường lignin hoá do kích kháng gợi ra

qua kính hiển vi huỳnh quang, các papillae được hình thành nơi bị đĩa áp của nấm xâmnhiễm cúng phát sáng và được phát hiện

để khảo sat sự tích tụ polyphenol trong tế bào bị xâm nhiễm, mẫu lá được nhuộm màu vớitoluidine blue o và quan sát dưới kính hiển vi quang học các tế bào có tích tụ polyphenol có màuxanh lá, từ nhạt đến sậm

để khảo sát sự tích tụ h2o2, mẫu lá được nhuộm với dab ?3,3’ – diaminobenzidine) trướckhi tẩy diệp lục tố và quan sát dưới kính hiển vi quang học các tế bào có tích tụ h2o2 ngả màu nâu

đỏ, từ nhật đến sậm

sự gia tăng các tế bào có các cơ chế trên so với đối chứng nhiễm không kích kháng chứng

tỏ tác nhân nghiên cứu có tạo ra các cơ chế kháng bệnh trong cây được kích kháng

4.2 nghiên cứu sự gia tăng hoạt tính của các enzym có liên quan đến sự kích kháng

một loạt các enzym, do tế bào đã được kích kháng tiết ra trong tế bào đã bị mầm bệnhxâm nhiễm, có thể phân tích và phát hiện thí nghiệm cũng được bố trí như trên với các nghiệmthức đối chứng kháng ?giống kháng không kích kháng), đối chứng nhiễm ?giống nhiễm khôngkích kháng) và giống nhiễm có kích kháng sau khi tấn công cây bệnh bằng cách lây bệnh nhântạo, lá cây thí nghiệm được thu thập mỗi giờ 1 lần từ 0 giờ cho đến 72 giờ sau lây bệnh nhân tạo.thời gian thu mẫu có thể dàu hơn tuỳ thuộc vào loại mầm bệnh, loại cây thí nghiệm và loại enzymcần phân tích dịch trích của mẫu lá thí nghiệm được đo độ quang truyền trong dịch trích so sánhvới enzym tinh dòng chuẩn, với máy đo quang phổ ?spectrophotometer)

các loại enzym thường được quan tâm là pal ?phenylalanine ammonia lyase), glucanase, chitinase, peroxidase và catalase đây là loại enzym có vai trò quan trọng trong sựkháng bệnh của cây trồng

β-1,3-hiệu số độ quang truyền so với enzym chuẩn, của nghiệm thức có kích kháng ở từng thờiđiểm, được so sánh với hệ số quang truyền ở thời điểm tương ưng của các đối chứng kháng vàđối chứng nhiễm sự gia tăng hoạt tính của enzym, cao hơn đối chứng nhiễm ?không kích kháng)

sẽ được phát hiện vào một hoặc vài thời điểm giúp xác nhận hiệu quả của sự kích kháng

một tác nhận có tạo ra sự hiệu quả gia tăng hoạt tính của một hoặc nhiều laọi enzym kểtrên so với đối chứng nhiễm không kích kháng được xem là có hiệu quả kích thích cây trồngtương ứng kháng với bệnh đang nghiên cứu kết quả cũng chứng minh được là tác nhân đượcnghiên cứu có tạo ra các cơ chế kháng bệnh trong giống cây nhiễm bệnh, tức đích thực là tácnhân gây kích kháng

5 kết luận

việc tìm ra một tác nhân kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn trên cây trồng đối phó với một loại bệnh là quá trình nghiên cứu lâu dài, nghiêm túc và có cơ sở khoa học trên thế giới việc nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh của cây trồng được tiến hành từ rất lâu, nhưng việt nam chúng ta mới bắt đầu gần đây nên còn thiếu kinh nghiệm và cần tiếp tục học hỏi thêm dù vậy chúng ta cũng đang rất nghiêm túc trong việc nghiên cứu để các kết quả đạt được có giá trị khoa học và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

kích thích tính kháng bệnh đạo ôn hại lúa trên khía cạnh mô học

trần thị thu thuỷ

huỳnh minh châu, phạm văn kim,

h j lyngs jorgensen and e de neergaard

1 đặt vấn đề

bệnh đạo ôn do nấm pyricularia grisea ?cooke) sacc gây ra ?giai đoạn hữu tính

magnaporth grisea), là một trong những bệnh quan trọng trên lúa ở đồng bằng sông củu long

?đbscl) hai trong những biện pháp để đối phó với bệnh là sử dụng giống kháng và thuốc hoá học.biện pháp hoá học cho kết quả nhanh nhưng ảnh hưởng đến môi trường, còn sử dụng giống kháng

an toàn nhưng đôi khi không thành công vì sự thay đổi nhanh của nòi nấm gây bệnh ?noda và ctv,1998) do đó, để hạn chế việc sử dụng thuốc cần phải kết hợp với kỹ thuật “kích thích tính khánglưu dẫn trong cây” đây là kỹ thuật sử dụng một loại vi sinh vật nào đó không gây hại cho môitrường hoặc là một loại hoá chất nào đó không có tác dụng diệt vi sinh vật gây bệnh cũng nhưkhông gây ô nhiễm môi trường nhưng có tác dụng kích thích cây trồng tạo ra tính kháng bệnh kỹthuật đã được ngiên cứu và ứng dụng thành công trên thế giới và trên một số loại cây trồng nhưdưa leo, cà chua, lúa mạch và lúa ?hammerschmidt at al., 1995; ozeretskovskaya, 1995; jorgensen

et al., 1998; manandhar et al., 1998) kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng ?gọi tắt là kíchkháng) đã được bộ môn bảo vệ thực vật, trường đại học cần thơ hợp tác với bộ môn sinh học thựcvật, trường đại học nông nghiệp và thú y hoàng gia, đan mạch nghiên cứu từ năm 1998 đến 2006

để quản lý bệnh đạo ôn hại lúa ở đbscl ?phạm văn kim và ctv., 2003) kết quả nghên cứu đã tìmđược 2 loài vi sinh vật có khả năng kích thích tính kháng bệnh đạo ôn hại lúa như vi khuẩnflavimonas oryzihabitans ?lăng cảnh phú, 2000), nấm colletotrichum sp ?trần vũ phến và ctv.,2003) và nhiều loại hoá chất không độc hại môi trường như salicylic acid, benzoic acid, cloruađồng,… ?diệp đông tùng, 2000; trịnh ngọc thuý, 2000, phạm văn dư và ctv., 2003, phạm văn kim

và ctv., 2003) để có thể hiểu sâu hơn về cơ chế kích kháng của một số hoá chất, nhiều thống số

đã được các tác giả sử dụng để đánh giá hiệu quả của các chất kích kháng trên khía cạnh mô họcbao gồm sự phát sáng tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, sự tổng hợp các chấtpolyphenol và h2o2 trong tế bào phương pháp quan sát và phát hiện phản ứng rtế bào khi có sựxâm nhiễm của mầm bệnh là sự phát sáng tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang có nhiều dangphát sáng như một cấu trúc phát sáng được thành lập ngay dưới đĩa áp ?appressorium) được gọi làfluorescent papillae ?fp), vị trí và thời điểm xuất hiện của fp được dùng để xác định vị trí xâmnhiễm ?penetration site) và thời điểm xâm nhiễm của nấm fp là một trong các hợp chất bao gồmlignin, callose hoặc phenol được tạo ra để chống lại sự xâm nhiễm của nấm bệnh cờu trúc fp đã

được tìm thấy trên lúa khi bị xâm nhiễm bởi nấm piricularia grisea nhưng với tần suất rất thấp

?<7%) ?peng & shishiyama, 1998; heath et al., 1990) và bipolaris oryzae ?1,5 – 2%) ?thuy, 2002).ngoài ra sự phát sáng đơn tế bào ?single fluorescent epidermal cell) có thể do phản ứng siêu nhạycảm hoặc do các hợp chất được tạo ra như phenol sự phát sáng vách tế bào ?fluorescent cell wall

= fcw) có thể do các hợp chất được tạo ra như lignin, callose,…phản ứng của tế bào nhằm tiêudiệt mầm bệnh hoặc làm hàng rào ngăn cản việc xâm nhiễm hoặc lấy chất dinh dưỡng của mầmbệnh một trong những phương pháp để chứng minh được tế bào phát sáng có liên quan đến phảnứng siêu nhạy cảm phải chứng minh được ở tế bào đó có sự tổng hợp h2o2 báo cáo sau đây nhằmtổng kết các công trình nghiên cứu về khả năng kích kháng của các hoá chất trên khía cạnh môhọc đã được quan sát từ năm 2000 – 2005

2 phương pháp nghiên cứu

các hoá chất đã được khảo sát khả năng kích thích tính kháng bệnh đạo ôn trên khía cạnh

mô học bao gồm acibenzolar-s-methyl, benzoic acid, chitosan và clorua đồng ?cucl2) thí nghiệmđược thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm bệnh cây và nhà lưới của bộ môn bảo vệ thựcvật khoa nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường đại học cần thơ, bao gồm nội dung nghiêncứu như sau:

2.1 xác định thời gian thu mẫu để khảo sát mô học

thí nghiệm được thực hiện nhằm tìm hiểu thời gian thích hợp nhất khi thu mẫu để khảo sátphản ứng của tế bào thí nghiệm được thực hiện trên giống lúa mtl119 ?nhiễm bệnh) và chất kíchkháng k2hpo4 ?30mm) được xử lý bằng cách ngâm hạt trong 24 giờ phun nấm gây bệnh bằngchủng nấm thu thập trên ruộng sản xuất tại cần thơ trong vụ đông xuân 2000 – 2001 các lá lúacùng tuổi và nở hoàn toàn ?15 ngày sau khi gieo) được cố định trên bảng nhựa trong banừg 2 sợidây bông vải mẫu được thu vào các thời điểm 6, 8, 12, 18, 22, 24 và 48 giờ sau khi phun nấmgây bệnh ?gps) bằng cách cắt từng đoạn dài 4 – 5 cm, sau đó tẩy diệp lục tố bằng dung dịchethanol – acid acetic ?3:1) và tồn trữ trong lactoglyceron ?lactic acid:1; glyceron:1, nước cất:1).mộu được quan sát bằng dung dịch evans blue 0,01% và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

2.2 khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang

thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng kích kháng của từng loại hoá chất thông qua phảnứng của tế bào lúa được xử lý kích kháng bằng cách ngâm hạt trong hoá chất kích kháng 24 giờtrước khi ủ và gieo khi cây lúa được 17 ngày tuổi, cố định lá lúa trên bảng nhựa trong bằng 2 sợi

dây cotton và phun nấm pyricularia grisea gây bệnh với mật số 50.000 bào tử/ml mẫu lá lúa

được thu thập ở thời điểm 24 và 48 gps bằng cách cắt từng đoạn dài 4 – 5 cm, sau đó tẩy diệp lục

tố và tồn trữ tương tự như mô tả ở trên mộu được quan sát ở 24 – 48 giờ sau khi phun nấm tấncông dưới kính hiển vi huỳnh quang ?bước sóng 400 – 440 nm) bằng dung dịch evans blue0,01% dưới kính hiển vi huỳnh quang, những tế bào có phản ứng phát sáng sẽ có màu vàng sáng.các chỉ tiêu được quan sát bao gồm phần trăm đĩa áp tạo phát sáng đơn và đa tế bào, diện tích và

số vách tế bào phát sáng trung bình trên mỗi đĩa áp và các mức độ phát sáng của tế bào ?+, ++, +++)

2.3 khảo sát sự tổng hợp hợp chất phenol

thí nghiệm nhằm khảo sát phản ứng của tế bào thông qua sự tổng hợp polyphenol thínghiệm được bố trí tương tự như khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào được mô tả ở phần trên.mộu lá được quan sát ở các thời điểm 24, 48, 72 và 96 gps hợp chất phenol được chỉ thị bằngmàu xanh lá cây sau khi được nhuộm với toluidine blue o ?0,05% ph 6,8) ở nhịêt độ 400c trong 4giờ quan sát dưới kính hiển vi thường chỉ tiêu ghi nhận gồm số lượng đĩa áp có tạo sự tích tụpolyphenol, mức độ tích tụ polyphenol +, ++ và +++ và diện tích vùng tế bào có sự tích tụpolyphenol tư đó suy ra phần trăm đĩa áp tạo sự tích tụ polyphenol ở tế bào và phần trăm đĩa áptạo sự tích tụ polyphenol ở mức +, ++ và +++ diện tích vùng tế bào có sự tích tụ polyphenolđược đo và tính theo cong thức diện tích hình chữ nhật

2.4 khảo sát sự tổng hợp h 2 o 2

thí nghiệm nhằm tìm hiểu phản ứng của tế bào thông qua sự tổng hợp h2o2 thí nghiệmđược bố trí tương tự như các thí nghiệm ở trên mộu được thu thập ở các thời điểm 4 giờ trướckhi phun nấm và các thưòi điểm 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36 và 48 gps, sau đó nhuộm với dung dịch0,05% dab ?3,3’ – diaminobenzidine, d – 8001, sigma) theo phương pháp của thordal –christensen et al ?1997) ghi nhận phần trăm đĩa áp tích tụ h2o2, diện tích vùng tế bào có sự tích tụh2o2 trên đĩa áp và mức độ tích tụ h2o2

3 kết quả nghiên cứu

3.1 xác định thời gian thu mẫu để khảo sát mô học

huỳnh minh châu và ctv ?2002) ghi nhận tỷ lệ bào tử nẩy mầm và hình thành đĩa áp của

nấm p grisea trên giống mtl 119 không khác biệt giữa có và không xử lý kích kháng điều này

cho thấy xử lý kích kháng không có hiệu quả ức chế sự hình thành đĩa áp của nấm gây bệnh trêngiống lúa nhiễm trong khi đó, giống lúa kháng bệnh có khả năng ức chế sự hình thành đĩa áp sựkhác biệt này có thể do cơ chế kích kháng trên giống nhiễm thể hiện muộn hơn so với cơ chếkháng của giống kháng vì vậy, việc nghiên cứu tìm hiểucơ chế kích kháng thể bên trong tế bào làrất cần thiết như sự phát sáng tế bào, sự tổng hợp của chất phenol và sự tổng hợp h2o2

khảo sát về phản ứng phát sáng của tế bào khi xử lý với k2hpo4 qua các thời điểm khácnhau, huỳnh minh châu và ctv ?2002) ghi nhận thời điểm bắt đầu có phản ứng tế bào là 24 giờ,tuy nhiên vào thời điểm này tỷ lệ tế bào phát sáng rất thấp so với thời điểm 48 giờ ngoài ra khi

xử lý hạt bằng benzoic acid ?0,5 mm), clorua đồng ?cucl2, 0,05 mm) trên giống lúa mtl 119, cáctác giả cũng ghi nhận thời gian bắt đầu có tế bào phát sáng vẫn là 24 gps và nhiều nhất là ở 48giờ như vậy thời điểm thích hợp nhất để khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào bắt đầu từ 24 –

48 giờ

3.2 phản ứng phát sáng của tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang

kết quả nghiên cứu của huỳnh minh châu và ctv ?2002) ghi nhân benzoic acid và cloruađồng có khả năng kích kháng trên giống lúa nhiễm mtl 119 thể hiện qua sự gia tăng số vách đa tếbào phát sáng được ghi nhận ở các thời điểm 24, 48 và 54 gps ?bảng 1)

ngoài ra, huỳnh minh châu và ctv ?2004) còn nghiên cứu khả năng kích kháng của cloruađồng và acibenzolar-s-methyl băàng phuơng pháp xử lý hạt trên giống lúa omcs 2000 ?nhiễm) và

nòi nấm pyricularia grisea có mã số 2,5 ?theo bộ giống định dòng của nhật) kết quả ghi nhận

thời điểm 24 gps trên cây lúa không xử lý kích kháng chưa có phản ứng phát sáng của tế bào,trong khi đó trên cây lúa được kích kháng bởi clorua đồng đã xuất hiện phản ứng phát sáng của tếbào, phần trăm đĩa áp tạo phát sáng tế bào ở nghiệm thức được kích kháng bởi clorua đồng là3,0% và tương đương với giống kháng ?5,1%) phần trăm đĩa áp tạo phát sáng vách đa tế bàokhông khác nhau giữa 2 nghiệm thức kích kháng và so với không kích kháng ?đối chứng nhiễm).tuy nhiên số lượng vách tế bào phát sáng trung bình của mỗi đĩa áp ở mỗi nghiệm thức xử lýclorua đồng cao hơn ?4,7 tế bào) và khác biệt so với không kích kháng ?0,0 tế bào) ngoài ra, ởthời điểm này, sự phát sáng ở nghiệm thức được kích kháng bởi clorua đồng và acibenzolar-s-methyl chỉ thể hiện ở mức +, trong khi đó trên giống kháng sự phát sáng thể hiện ở mức ++ vàkhông có phản ứng phát sáng trên giống nhiễm phần trăm đĩa áp tạo tế bào phát sáng ở mức +trên nghiệm thức clorua đồng cao hơn so với không kích kháng và tương đương đối chứng kháng

?bảng 2) tuy nhiên, đến thời điểm 48 gps phản ứng phát sáng tế bào hiện diện trên cả 2 loại tếbào ?biểu bì và thịt lá), phần trăm đĩa áp tạo hiện tượng phát sáng trên nghiệm thức clorua đồngcao nhất là 21,3%, khác biệt so với không kích kháng là 7,5% mức độ phát sáng tế bào tăng lên

?+++) nhưng không khác biệt trên tất cả các nghiệm thức ?bảng 3) như vậy qua kết quả khảo sát

về sự khảo sát của tế bào khi được kích kháng bởi clorua đồng và acibenzolar-s-methyl cho thấyclorua đồng có khả năng kích thích tính kháng trong cây lúa, làm cho tế bào lá lúa phản ứng sớmhơn

nguyễn hồng tín ?2005) khảo sát khả năng kích thích tính kháng bệnh của acid benzoic

?0,5mm) clorua đồng ?0,05m) và chitosan ?200 ppm) bằng cách xử lý hạt trên giống lúa omcs

2000 và phun nấm gây bệnh pyricularia grisea có mã số nòi 103,4 kết quả ghi nhận ở thời điểm

24 gps, phản ứng phát sáng xuất hiện trên tất cả các nghiệm thức trên nghiệm thức kích khángbằng clorua đồng có phần trăm đĩa áp tạo phát sáng cao hơn không kích kháng điều này chứng tỏ

clorua đồng có biểu hiện khả năng kích thích tính kháng trong cây lúa đến thời điểm 48 gps,phần trăm đĩa áp tạo phát sáng xuất hiện cao hơn với thời điểm 24 giờ và mức độ phát sáng cũngtăng lên đến mức +++ tren các nghiệm thức xử lý kích kháng đều có phần trăm đĩa áp tạo phảnứng phát sáng tế bào, số vách tế bào phát sáng trung bình trên mỗi đĩa áp cao hơn so với khôngkích kháng và tương đươngvới trên giống kháng như vậy, qua két quả khảo sát khả năng kíchkháng của 3 hoá chất clorua đồng, acid benzoic và chitosan cho thấy cả 3 hoá chất đều có khảnăng kích thích tính kháng thể hiện qua phản ứng phát sáng của tế bào riêng clorua đồng có khảnăng kích thích tạo phản ứng phát sáng sớm hơn acid benzoic và chitosan.

tóm lại, trong các hoá chất được khảo sát về khả năng kích kháng qua phản ứng phát sángcủa tế bào là clorua đồng, acid benzoic, acibenzolar-s-methyl không tạo phản ứng phát sáng tếbào các hoá chất còn lại đều có phần trăm đĩa áp cho phản ứng phát sáng tế bào cao đặc biệt,clorua đồng khi được thử nghiệm trên cùng một giống lúa nhưng với 2 nòi nấm khác nhau dềucho phản ứng phát sáng thể hiện sớm và phần trăm đĩa áp tạo phát sáng cao hơn so với khôngkcíh kháng bên cạnh đó, hiệu quả kích kháng của clorua đồng và benzoic acid trên giống lúa vànòi nấm khác nhau vẫn có phản ứng phát sáng tế bào cao điều này cho thấy khả năng kích khángcủa hoá chất biểu hiện qua phản ứng phát sáng tế bào se không thay đổi theo giống lúa và dòngnấm riêng acibenzolar-s-methyl không biểu hiện kích kháng qua phát sáng tế bào có thể biểuhiện qua cơ chế khác các tác giả không tìm thấy có sự hình thành cấu trúc giống papillae

?papillae like structure)

bảng 1 sự phát sáng tế bào khi xử lý benzoic acid và cucl 2

?huỳnh minh châu và ctv., 2002)nghiệm thức tỷ lệ đĩa áp cho phản ứng phát sáng vách tế bào ?%)

24 giờ sau khi phun 48 giờ sau khi phun 54 giờ sau khi phun

trong cùng một cột các trung bình có cùng mẫu tự theo sau khac biệt không ý nghĩa qua phép thử dulcan ở mức ý nghĩa 5%

bảng 2 sự phát sáng tế bào khi xử lý clorua đồng và acibenzolar-s-methyl ở

24 giờ sau khi phun nấm gây bệnh ?huỳnh minh châu và ctv, 2004)nghiệm thức phàn trăm đĩa áp tạo sự phát sáng số lượng tế bào phát

sáng/đĩa áp

nghiệm thức phần trăm đĩa áp tạo sự phát sáng số lượng tế phần trăm đĩa

bào phát sáng/

đĩa áp

áp tạo sự phát sáng tế bào mức

dộ +++

tế bào vách đa tế bào

diện tích tế bào thịt lá phát sáng/đĩa áp

?bảng 5) ngoài ra, ở thời điểm này cũng ghi nhận trên nghiệm thức xử lý clorua đồng có một sốvùng tế bào quanh đĩa áp có màu xanh dương,c ó thể đay là những hợp chất cacbohydrate hoặctinh bột đã được tổng hợp ?de neergaard, 1997) điều này chứng tỏ khi được kích kháng bởiclorua đồng đã giúp giống nhiễm tạo ra polyphenol và cac hợp chất khác

kết quả còn ghi nhận diện tích vùng tế bào quanh đĩa áp có sự tích tụ polyphenol trênnghiệm thức clorua đồng rộng hơn so với không kích kháng ở 96 gsp ?bảng 6) điều này chứng tỏkhi xử lý kích kháng bằng clorua đồng đã giúp cây lúa tổng hợp polyphenol nhiều hơn so vớikhông xử lý kích kháng bên cạnh đó, phần trăm đĩa áp tạo sự tích tụ polyphenol ở mức +++ trênnghiệm thức có xử lý clorua đồng và acibenzolar-s-methyl cao hơn không kích kháng và tươngđươngvới giống kháng ở 72 gps ?bảng 7) điều này cho thấy clorua đồng và acibenzolar-s-methyl

đều có khả năng kích kháng qua sự gia tưng mức độ tích tụ polyphenol tuy nhiên, đến thời điểm96gsp mức độ tích tụ polyphenol không khác nhau giữa nghiệm thức cso kích kháng và khôngkích kháng trên giống nhiễm omcs 2000 khi được xử lý bởi clorua đồng và acibenzolar-s-methyl

có khả năng giúp cây lúa tổng hợp sớm hơn so với không xử lý ?bảng 7)

bảng 5 phần trăm đĩa áp tạo sự tích tụ polyphenol trong tế bào khi được xử lý kích kháng qua

các thời điểmnghiệm thức phần trăm đĩa áp tạo sự tích tụ polyphenol trong tế bào ở các thưòi điểm

48 giờ sau khi phun nấm

72 giờ sau khi phun nấm

96 giờ sau khi phun nấm

bảng 6 diện tích phenol tích tụ ở vùng tế bào bên dưới đĩa áp

khi được xử lý kích kháng qua 2 thời điểmnghiệm thức diện tích vùng tế bào tích tụ polyphenol/đĩa áp ?mm2)

72 giờ sau khi phun nấm 96 giờ sau khi phun nấm

72 giờ sau khi phun nấm 96 giờ sau khi phun nấm

tóm lại clorua đồng có khả năng kích kháng thể hiện qua phần trăm đĩa áp có sự tích tụpolyphenol xuất hiện sớm và nhiều trong khi đó acibenzolar-s-methyl chỉ thể hiện kích khángqua mức tích tụ polyphenol.

xử lý kích kháng qua các thời điểm quan sát

tuy nhiên, nguyễn hồng tín ?2005) cũng thực hiện trên giống lúa omcs 2000 nhưng với nòinấm mã số 103,4,lúa được kích kháng bởi clorua đồng ?0,05mm), benzoic acid ?0,5 mm) hoặcchitosan ?200 ppm) kết quả cho thấy có sự gia tăng h2o2 ở thời điểm 20 và 36 gsp ?bảng 8) sựkhác biệt vè kết quẩ thí nghiệm của các tác giả trên có thể do sự tương tác khác nhau giữa giốnglúa và nòi nấm gây bệnh

bảng 8 tỷ lệ đĩa áp tạo sự tích tụ h 2 o 2 trong tế bào lá lú khi được kích kháng bởi các hoá chất ở

thời điểm 20 & 36 giờ sau khi phun nấmnghiệm

thức

tỷ lệ đĩa áp có sự tích tụ hợp chất h2o2 ?%) diện tích

tb tích tụ h2o2/app

h2o2 tế

bào

tb thịt lá

đơn tb đa tế

bào

mức độ +

mức độ ++

mức độ +++

thời điểm 20 giờ sau khi phun nấm

acid

clorua