Giáo trình di truyện học vi sinh vật và ứng dụng

Giáo trình di truyền học vi sinh vật và ứng dụng

1970 là hai s ki n n i b t nh t k t sau khi Sinh h c phân t ra đ i S phát tri n cùng v i nh ng thành t u đ t đ c c a di truy n h c trong th i gian qua qu là vô cùng to l n!

góp ph n đ i m i n i dung giáo trình Di truy n h c Vi sinh v t và

ng d ng theo h ng c p nh t ki n th c c ng nh ph ng pháp d y và

h c b môn b c i h c, chúng tôi đã tham c u nhi u tài li u khác nhau

và n l c biên so n giáo trình trên tinh th n y Chúng tôi hy v ng r ng giáo trình này s đáp ng đ c ph n nào nhu c u gi ng d y và h c t p

c a gi ng viên và sinh viên, và c ng có th s d ng nh m t tài li u tham

kh o b ích cho giáo viên Sinh h c các tr ng THPT trong b i c nh đ i

m i giáo d c hi n nay

N i dung giáo trình g m Bài m đ u và 8 ch ng: Ch ng 1 gi i thi u các đ c đi m c a di truy n h c vi sinh v t Ch ng 2 - C s phân

t c a tính di truy n - trình bày khái quát v c u trúc và t ch c c a các

b gene vi sinh v t và các c ch truy n thông tin di truy n ch y u là sinh v t ti n nhân (prokaryote) Ch ng 3 đi sâu phân tích các khía c nh

c a các nguyên lý đi u hoà bi u hi n gene vi khu n Ch ng 4 - Bi n d

vi sinh v t - đ c p đ n các quá trình bi n đ i c a v t ch t di truy n các vi sinh v t ( đ t bi n gene, s a ch a DNA và các y u t di truy n v n

đ ng) Ch ng 5 t p trung vào l nh v c di truy n h c c a các virus

Ch ng 6 trình bày các nguyên lý c a di truy n h c vi khu n - ti p h p,

bi n n p và t i n p Ch ng 7 gi i thi u nh ng hi u bi t m i có tính ch t

đ i c ng v di truy n vi n m và vi t o Và ch ng 8 t p trung trình bày các khái ni m, ph ng pháp và thành t u c a l nh v c công ngh DNA tái

t h p - t o dòng gene vi sinh v t, c ng nh các ng d ng c a nguyên lý

k thu t di truy n liên quan vi sinh v t trong vi c t o ra các sinh v t bi n

đ i gene (genetically modified organisms = GMOs) và phóng thích chúng

vào môi tr ng

Cu i m i ch ng đ u có các ph n Câu h i và Bài t p và Tài li u tham

kh o đ b n đ c ti n ôn t p và tra c u Và, trong ch ng m c có th , các thu t ng khoa h c thông d ng đ c s d ng b ng ti ng Anh ho c chú thích trong ngo c đ n đ giúp ng i h c d dàng h n trong vi c ti p c n thông tin qua sách báo n c ngoài ho c internet

Giáo trình Di truy n Vi sinh v t và ng d ng do ThS Hoàng Tr ng Phán và TS Tr ng Th Bích Ph ng - các gi ng viên đang công tác t i Khoa Sinh h c các tr ng i h c S ph m và i h c Khoa h c, i

h c Hu - biên so n, v i s phân công nh sau:

ThS Hoàng Tr ng Phán ch biên v i Bài m đ u và các ch ng 1, 2,

3, 6, và 8; TS Tr ng Th Bích Ph ng biên so n các ch ng 4, 5 và 7 Chúng tôi xin trân tr ng c m n D án Giáo d c i h c Hu đã tài

tr cho vi c biên so n giáo trình trong khuôn kh c a D án Giáo d c

i h c m c B

Chúng tôi xin bày t lòng c m n đ c bi t đ n PGS TS Ph m Thành

H - Tr ng i h c Khoa h c T nhiên, i h c Qu c Gia Tp H Chí Minh đã dày công đ c b n th o và cho nhi u ý ki n quý báu

Do kh n ng còn h n ch , ch c ch n giáo trình còn nhi u thi u sót Chúng tôi r t mong nh n đ c s phê bình và ch b o c a các đ ng nghi p và b n đ c đ giáo trình đ c hoàn ch nh h n trong l n in sau

IV Các ph ng pháp nghiên c u đ c thù c a di truy n h c VSV

Ch ng 2: C s phân t c a tính di truy n

Hoàng Tr ng Phán 50

I S l c v thành ph n hoá h c và c u trúc c a các nucleic acid 50

II T ch c phân t c a các nhi m s c th vi khu n và sinh v t

nhân chu n 54

IV Phiên mã (transcription) và các lo i RNA prokaryote 64

Ch ng 3: i u hoà bi u hi n gene vi khu n

Hoàng Tr ng Phán 76

III i u hoà âm tính c a các operon c m ng: lac operon 79

2 C ch đi u hoà âm tính c a trp operon 85

V S c ch d hoá (catabolite repression): i u hoà d ng tính

VI S k t thúc phiên mã s m (attenuation) trp operon 89

2 Tái t h p di truy n trong m t chu k sinh tan (lytic cycle) 120

3 S s p x p c a các gene trong nhi m s c th phage 120

4 L p b n đò c u trúc tinh vi vùng rII c a phage T4 122

5 Tính ti m tan (lysogeny) và phage 125

II Bi n n p (transformation) vi khu n 143

2 C ch phân t c a bi n n p 143

III Ti p h p (conjugation) vi khu n 145

2 Các plasmid và s truy n DNA vi khu n 150

3 T i n p chuyên bi t (specialized transduction) 158

Ch ng 7: Di truy n h c vi n m và vi t o

Tr ng Th Bích Ph ng 162

I i c ng v nghiên c u di truy n m t s vi t o thông d ng 162

II Phân tích di truy n vi n m 163

1 Tính không dung h p vi n m 163

2 Phân tích b b n và l p b n đ vi n m 164

3 Phân tích di truy n trong chu trình c n h u tính (tái t h p

III N m men nh là E coli c a các t bào eukaryote 168

III T o dòng gene vi khu n 183

1 Phân l p và tách chi t các đo n DNA ngo i lai 184

2 Ki n t o phân t DNA tái t h p in vitro 184

3 Ch n l c v t ch thích h p và chuy n các gene vào t bào ch 185

5 Phát hi n và sàng l c nucleic acid ngo i lai và protein 188

IV Phóng thích ra môi tr ng các sinh v t đ c bi n đ i gene 193

V S d ng các vi sinh v t đ chuy n gene vào các th c v t 196

VI S d ng các vi sinh v t đ chuy n gene vào t bào đ ng v t 208

VII T o các gi ng vi sinh v t m i b ng k thu t di truy n 211

VIII M t s ng d ng khác c a k thu t di truy n vi sinh v t 211

1 S ra đ i và phát tri n c a di truy n Mendel

T đ u Hà Lan (Pisum sativum), v i ý t ng và

ph ng pháp nghiên c u đ c đáo, n m 1865

Gregor Mendel (Hình 1) đã phát hi n ra các quy

lu t di truy n c s đ u tiên và qua đó suy ra s t n

t i t t y u c a các đ n v đi truy n đ c thù - nhân t

di truy n (genetic factor) - quy đ nh các tính tr ng

đ c truy n t th h này sang th h khác mà sau

này g i là gene Tuy nhiên, gi i khoa h c đ ng

th i không hi u và do đó không th đánh giá t m

vóc v đ i c a phát minh này

Hình 1 G Mendel

Mãi đ n n m 1900, ba nhà th c v t h c là Carl Correns (Germany), Hugo de Vries (Netherlands) và Erich von Tschermak (Austria) đ c l p nhau khám phá l i các quy lu t di truy n c a Mendel Và di truy n h c chính th c ra đ i t đây mà ng i sáng l p là Mendel

2 S ra đ i và phát tri n c a thuy t di truy n nhi m s c th

T 1910, Thomas Hunt Morgan (Hình 2) cùng

v i ba c ng s là Alfred H.Sturtevant, Calvin

Bridges và Herman J Muller đã xây d ng thành

công thuy t di truy n nhi m s c th (chromosome

theory of inheritance) d a trên đ i t ng nghiên

c u là ru i gi m Drosophila melanogaster H c

thuy t này xác nh n r ng gene là đ n v c s c a

tính di truy n n m trên nhi m s c th ( trong

nhân); trên đó các gene s p x p theo đ ng th ng

t o thành nhóm liên k t Nh ng đóng góp đáng k c a các môn đ xu t

s c c a Morgan đó là: xây d ng b n đ di truy n (Sturtevant 1913), ch ra

c ch xác đ nh các ki u hình gi i tính ru i gi m (Bridges 1916) và phát

Hình 2T.H.Morgan

tri n ph ng pháp gây đ t bi n b ng tia X (Muller 1927) V i đóng góp to

l n đó Morgan đã đ c trao gi i Nobel n m 1933 và Muller n m 1946

N m 1931, Barbara McClintock (Hình 3) và

Harriet Creighton thu đ c b ng ch ng v t lý tr c

ti p v tái t h p ngô Sau đó, hi n t ng này

c ng đ c C Stern quan sát Drosophila Nh

3 S ra đ i và phát tri n c a di truy n h c phân t

S ra đ i c a di truy n h c phân t (molecular genetics) g n li n v i

các khám phá v DNA (deoxyribonucleic acid) t gi a th k XX trên đ i

t ng nghiên c u ch y u là các vi sinh v t Tuy nhiên, tr c đó Friedrich Miescher (1869) đã khám phá ra m t h n h p trong nhân t bào g i là nuclein mà thành ph n chính c a nó sau này đ c bi t là DNA

V m i quan h gi a gene và protein, t 1902 Archibald Garrod qua nghiên c u b nh alcaptonuria ng i đã g i ý r ng đây là m t tính tr ng

l n Mendel, có th liên quan t i s sai h ng m t enzyme B ng các thí nghi m gây đ t bi n các gene liên quan đ n các con đ ng sinh hóa trên

n m m c Neurospora, n m 1941 George Beadle và E.L.Tatum (Hình 4)

xác nh n m i gene ki m soát s t ng h p m t enzyme đ c thù Chính gi thuy t m t gene-m t enzyme (one gene-one enzyme hypothesis) n i ti ng

này đã m đ ng cho s ra đ i c a di truy n hóa-sinh, và hai ông đã đ c trao gi i Nobel cùng v i Joshua Lederberg n m 1958 V sau, gi thuy t này đ c chính xác hóa là m t gene xác đ nh ch m t chu i polypeptid -

c u trúc s c p c a các protein, trong đó có các enzyme

Hình 4 Beadle, Tatum, Jacob và Monod (t trái sang)

V y b n ch t c a gene là gì? N m 1944, Oswald Avery (Hình 5) và

các c ng s là MacLeod và McCarty b ng thí nghi m bi n n p in vitro đã

ch ng minh r ng DNA là v t ch t mang thông tin di truy n N m 1949, Erwin Chargaff công b các k t qu đ u tiên v thành ph n hóa h c c a DNA m t s loài

Hình 5 O.T Avery, MacLeod và McCarty (t trái sang)

Vi c nghiên c u c u trúc phân t DNA đ c b t đ u t 1951 v i các

d n li u nhi u x tia X c a Rosalind Franklin và Maurice Wilkins (Hình 6) Các s li u hóa h c và v t lý này là c s mà t đó James Watson và Francis Crick (Hình 7) đã xây d ng thành công mô hình c u trúc phân t

DNA n m 1953, còn g i là chu i xo n kép (double helix) Phát minh v

đ i này m ra k nguyên m i cho s phát tri n c a di truy n h c và sinh

h c nói chung V i phát minh đó, Watson và Crick cùng v i Wilkins đ c trao gi i Nobel n m 1962 K t sau đó là s ra đ i c a hàng lo t các công trình nghiên c u trong l nh v c sinh h c phân t , đáng k là vi c gi i

mã di truy n đ c hoàn t t vào tháng 6 n m 1966 b i hai nhóm nghiên

c u c a M Nirenberg và H Khorana (gi i Nobel n m 1968)

Hình 6 R.Franklin (trái), M.Wilkins Hình 7 J.D.Watson (trái) và F.H.C.Crick

4 S ra đ i và phát tri n c a công ngh DNA tái t h p

Có th nói, n n t ng c a công ngh DNA tái t h p (recombinant

DNA technology) đ c thành l p t 1972 khi Paul Berg (Hình 8) t o ra phân t DNA tái t h p đ u tiên trong ng nghi m (recombinant DNA in

vitro) M t n m sau Herbert Boyer và Stanley Cohen (Hình 8) l n đ u tiên

s d ng plasmid đ t o dòng DNA L nh v c ng d ng m i này c a sinh

h c phân t đã t o ra m t cu c cách m ng m i trong sinh h c óng góp

đáng k trong l nh v c này là khám phá v các enzyme gi i h n

(restriction enzyme) t 1961-1969 c a Werner Arber, Daniel Nathans và Hamilton Smith (gi i Nobel 1978; Hình 8); đ xu t các ph ng pháp xác

đ nh trình t base trong các nucleic acid n m 1977 b i P.Berg, W.Gilbert

và Frederick Sanger (gi i Nobel hóa h c 1980; Hình 8); s khám phá ra

các gene phân đo n (split gene) n m 1977 b i Phillip Sharp và Richard

Robert (gi i Nobel 1993; Hình 8); s phát minh ra ph ng pháp PCR

(polymerase chain reaction) c a Kary B.Mullis n m 1985 (Hình 8) và

ph ng pháp gây đ t bi n đ nh h ng (site-directed mutagenesis) c a

Michael Smith t 1978-1982 (gi i Nobel hóa h c 1993)

Hình 8A Các nhà khoa h c đo t gi i Nobel y h c liên quan k thu t gene T trái sang: D.Nathans, H.Smith, W.Arber, P.Sharp và R.Robert

xã h i, nh vi c s n xu t các ch ph m y-sinh h c b ng công ngh DNA

tái t h p, s d ng li u pháp gene (gene therapy) trong đi u tr b nh di truy n, t o các gi ng sinh v t m i b ng con đ ng bi n đ i gene

(genetically modified organisms = GMOs), d án b gene ng i (Human

Genome Project = HGP) gây ra không ít hoài nghi, tranh cãi xung quanh các v n đ v đ o lý sinh h c (bioethics) và an toàn sinh h c (biosafety)

II Di truy n h c vi sinh v t v i cách m ng công ngh sinh h c

Cho đ n đ u th p niên 1940 các vi sinh v t, bao g m các vi khu n và virus c a chúng và các vi sinh v t nhân chu n đ n bào nh n m men, n m

m c th c s tr thành các đ i t ng nghiên c u chính y u c a di truy n

h c T đây hình thành các l nh v c di truy n h c sinh-hoá và di truy n

h c vi sinh v t, hai n n t ng chính cho s ra đ i c a di truy n h c phân t (1953) và công ngh ADN tái t h p sau này (1978)

đây vi khu n E coli đ c xem là m t sinh v t mô hình nh t quán

tuy t v i c a di truy n h c hi n đ i Nó đ c s d ng m t cách r ng rãi trong các thí nghi m ch ng minh các ph ng th c tái b n bán c a DNA (Meselson và Stahl 1958; John Cairns 1961; Okazaki 1969), phân tích tái

t h p và l p b n đ di truy n, nghiên c u c u trúc tinh vi và ch c n ng sinh hoá c a gene (Benzer 1961; Yanofsky 1961); c ch đi u hoà sinh

t ng h p protein (Jacob và Monod 1961) v.v N m men bia S.s cerevisiae

c ng s m đ c s d ng làm mô hình cho các nghiên c u di truy n h c eukaryote và ng d ng r ng rãi trong công ngh DNA tái t h p sau này

V i s phát tri n vô cùng nhanh chóng c a di truy n h c trong vài

th p niên qua, đ c bi t là s ti n b c a công ngh sinh h c

(biotechnology) nói chung đã có nh ng tác đ ng m nh m lên nhi u ngành khoa h c và trên m i m t c a đ i s ng, kinh t , chính tr và xã h i

ph m vi toàn c u Di truy n h c nói chung và di truy n h c vi sinh v t nói riêng đ c hình dung v trí trung tâm và giao thoa v i sinh h c, hóa sinh h c, k ngh , y-d c, nông nghi p, sinh thái h c, kinh t h c, lu t, xã

h i h c và tri t h c (Hình 9)

Hình 9: Tác đ ng c a di truy n h c (vi sinh v t) lên các l nh v c khác nhau

Giáo s danh d môn hóa h c i h c Havard, F.H.Westheimer, bình lu n v sinh h c phân t nh sau:"Cu c cách m ng trí tu v đ i nh t

c a 40 n m qua đã x y ra trong sinh h c Li u có th tìm ra m t ng i nào đó có h c ngày nay mà không hi u bi t chút gì v sinh h c phân t ?" (Weaver và Hedrick 1997, tr.15)

Các thành t u đ t đ c nh ng d ng di truy n h c trong nông nghi p

là vô cùng to l n, góp ph n t o nên cu c cách m ng m i v i s ra đ i c a hàng lo t các gi ng v t nuôi-cây tr ng có u th v t tr i, các sinh v t

bi n đ i gene (GMO) mang nh ng đ c tính hoàn toàn m i l

Trong y h c, đó là s ra đ i c a hàng lo t các d c ph m đ c s n

xu t b ng k thu t di truy n dùng cho đi u tr b nh và c i bi n trí thông minh c a con ng i; đó là các ph ng pháp ch n đoán và đi u tr b nh

m c phân t v.v Nh ng v n đ này s đ c đ c p ch ng 8

Có th nói, s thành công c a d án b gene ng i (HGP) vào tháng 4

n m 2003 cho phép chúng ta l n đ u tiên đ c đ c toàn b trình t kho ng 3,2 t c p nucleotide trong b gene con ng i (Homo sapiens)

HGP là m t trong nh ng k công thám hi m v đ i nh t trong l ch s nhân

lo i (NHGRI 2005) Theo c tính m i nh t đ c công b ngày

21/10/2004 trên t p chí Nature, b gene chúng ta ch a s l ng gene mã hóa protein th p m t cách đáng kinh ng c, kho ng 20.000 đ n 25.000 ch không ph i là 50.000 đ n 140.000 gene nh d đoán ban đ u ho c 35.000 theo d đoán trong vài ba n m l i đây (NHGRI 2005)

Tuy nhiên, nh ng thách th c cho t ng lai c a nghiên c u khoa h c

v các b gene (genomics) đ i v i sinh h c, v n đ s c kh e và xã h i

c ng đ c đ t ra (Collins và cs 2003) S hoàn t t c a HGP t nó không

có ngh a là đã xong mà đúng h n là đi m kh i đ u cho công cu c nghiên

c u th m chí còn h ng thú h n Các nhà nghiên c u hi n gi đang c

g ng làm sáng t m t s quá trình ph c t p nh t c a sinh h c, đó là: m t

đ a bé phát tri n t m t t bào đ n l b ng cách nào, các gene ph i h p

ch c n ng c a các mô và c quan nh th nào, s ti n đ nh b nh t t x y ra

nh th nào và b não ng i làm vi c ra sao (NHGRI 2005)

III i c ng v Genomics và m i liên quan gi a nó v i các

l nh v c nghiên c u khác

S ti n b nhanh chóng g n đây c a sinh h c phân t và công ngh sinh h c (biotechnology), nh đã nói trên, là nh s phát tri n m nh m

c a các ph ng pháp và k thu t m i trong sinh h c phân t nh : (i) Kính

hi n vi đi n t ; (ii) Tách chi t và phân tích đ nh tính và đ nh l ng thô nucleic acid; (iii) Xác đ nh trình t nucleic acid c a gene (b ng ph ng

pháp hoá h c c a Maxam và Gilbert và b ng ph ng pháp didesoxy c a Sanger); (iv) Lai phân t nucleic acid; (v) ánh d u đ ng v phóng x và

s d ng các m u dò; (vi) PCR; (vii) T o dòng DNA tái t h p; (viii) Gây

đ t bi n đ nh h ng; v.v

Tuy nhiên, chính s k t h p tin h c và máy tính trong nghiên c u sinh

h c phân t đã d n t i s ra đ i c a hàng lo t các l nh v c nghiên c u

m i, đó là: Tin-sinh h c (bioinformatics) cho phép thu th p, t ch c và

phân tích s l ng l n các s li u sinh h c nh s d ng m ng máy tính và

các ngu n d li u (databases); Khoa h c v b gene hay B gen h c (Genomics) - phân tích toàn b genome c a m t sinh v t đ c ch n; DNA microchip technology - xác đ nh các đ t bi n trong các gene; DNA microarray technology - nghiên c u cách th c m t s l ng l n các gene

t ng tác l n nhau và c ch m ng l i đi u hòa c a t bào ki m soát

đ ng th i s l ng c c k l n các gene; v.v

D i đây là m t s khái ni m c b n v Genomics và các l nh v c liên quan đ n k nguyên sau b gene (Post-genomic Era) ây chính là cánh c a m i v -OME và -OMICS hi n đ c ph bi n trên các trang web (-OME and -OMICS Gateway):

http://www.nature.com/omics/index.html

http://www.genomicglossaries.com/content/gloss_cat.asp

Bên c nh s phát tri n c a l nh v c genomics là s ra đ i c a khoa

h c v b protein (Proteomics) và nhi u l nh v c -omics khác, nh :

Transcriptomics; Cellomics; Metabolomics; Ionomics v.v D i đây chúng ta ch tìm hi u v genomics và m t s v n đ liên quan đ làm sang

t t c đ phát tri n chóng m t c a các ngành khoa h c m i m này

1 Genomics

Vi c gi i thành công trình t DNA c a b gene (genome) ng i và

c a hàng lo t các sinh v t mô hình đã đ c ti n hành trong su t th p niên

1990 và ti p di n cho đ n nay [Các k t qu này đã đ c công b r ng rãi trên nhi u trang web n i ti ng, ví d : http://www.genome.gov/ ] Chính

đi u này d n đ n s ra đ i c a m t l nh v c khá m i m g i là khoa h c

v b gene (genomics)

Các tri th c b t ngu n t khoa h c v b gene (genomics) cho phép

chúng ta không nh ng hi u sâu và chi ti t v các c ch phân t c a s

s ng mà còn t o nên cu c cách m ng th t s trong nông nghi p, y-d c

h c và nhi u l nh v c k thu t và công ngh khác Nó c ng cung c p cho chúng ta nhi u cách ti p c n m i nh m phát hi n, b o t n và s d ng tính

đa d ng sinh h c Bên c nh đó nó còn thúc đ y phát tri n các th h máy

tính và ph n m m m i d a trên s mô ph ng cách th c truy n tín hi u chính xác và tinh vi c a các t bào

Có th nói, s hi u bi t chi ti t v c u trúc và ch c n ng c a b gene

ng i và b gene các sinh v t khác là đ nh cao c a công ngh gene

Genomics đã phát sinh ra m t khoa h c m i nghiên c u toàn b b gene b ng cách xâm nh p vào các môn di truy n h c truy n th ng nh là

di truy n h c qu n th , s l ng và phân t v i nh ng công ngh m i trong sinh h c phân t , phân tích DNA, tin sinh h c và các h th ng robot

t đ ng hoá (Hình 1.10)

Hình 1.10 Genomics m t môn h c r ng l n xâm nh p vao các khu v c truy n

th ng c a di truy n h c (ph ng theo các Hình 1.1 và 1.2 trong Liu 1998)

Ngu n: http://www.fao.org/DOCREP/003/X6884E/x6884e03.htm

M t s l ng l n các phân môn c a genomics có th t h p l i đ cung c p m t cách ti p c n m nh m cho nghiên c u s bi n đ i di truy n

thích h p nh : Genomics c u trúc (Structural genomics); Genomics ch c

n ng (Functional genomics)- Genomics so sánh (Comparative genomics); Genomics k t h p (Associative genomics); Genomics th ng kê (Statistical

genomics) v.v

1.1 Genomics c u trúc (Structural genomics)

Genomics c u trúc c g ng h ng t i xác đ nh toàn b các gene trong

m t b gene, đôi khi g i là khám phá gene, và xác đ nh v trí c a chúng trên các nhi m s c th M c tiêu này đ t đ c b ng cách phân tích trình t các gene riêng l , các đo n gene ho c toàn b b gene Các gene riêng l

đ c xác đ nh t trình t DNA thông qua các ch ng trình x lý b ng máy tính (sophisticated computer algorithms) Các ch c n ng sinh hoá c a

m t gene đ c suy di n thông qua s so sánh trình t DNA đó v itình t

c a các gene có ch c n ng đã bi t trong ngân hàng d li u M t trong các

Genomics ch c n ng đi sâu tìm hi u ch c n ng c a các gene và cách

th c chúng xác đ nh các ki u hình M t trong nh ng l i th chính c a

genomics ch c n ng là s d ng các vi m ng DNA (DNA microarray; c ng

g i là các chíp DNA = “DNA chips”) đ đo s bi u hi n đ c thù c a hàng ngàn gene m t cách đ ng th i DNA microarray ch a hàng ngàn m u DNA ho c các trình t oligonucleotide đ c in ho c t ng h p trên màng

l c nylon (nylon membrane filter) ho c slide kính hi n vi trong m t ki u chính xác đã đ c bi t và đ i di n cho hàng ngàn gene trong b gene M i

ch m DNA đ i di n cho m t gene duy nh t mà đ c dùng đ đo l ng

đ nh l ng s bi u hi n c a mRNA (messenger RNA) b ng cáh đem lai

v i mNA có đánh d u hu nh quang (fluorescent labelled mRNA) (Hình 1.11)

Hình 1.11 S d ng các DNA microarray trong phân tích s bi u hi n bi t hoá

c a các gene (T Albelda và Sheppard 2000) Thí nghi m lai so sánh liên quan

t i vi c cách ly mRNA t hai m u riêng bi t (A) mRNA t m i m u đ c x lý

v i reverse transcriptase (B) và đ c đánh d u v i m t đích hu nh quang riêng

(C) Hai công c RNA đanh d u đ c tr n l n, lai v i nhau đ cho DNA

microarray có ch a m t b đ y đ g m hàng ngàn ho c hàng ch c ngàn trình t DNA d a trên b gene ho c ho c các trình t DNA b sung (cDNA), và r a s ch

(D) Microarray array này đ c quét nh s d ng m t máy ghi hình hu nh

quang chuyên d ng (specialised fluorimage), và màu s c c a m i ch m s đ c xác đ nh (E) Trong ví d này, các gene ch đ c bi u hi n M u A s có màu

đ , các gene ch bi u hiên M u B s có màu xanh và các gene y đ c bi u

hi n ngang b ng nhau trong c hai m u ãe cho màu vàng i u này cho phép nhà nghiên c u xác đ nh các gene đ c bi u hi n m t cách đ c bi t tong vi c đáp ng v i vi c x lý ho c b nh,ho c các gene đ c thù cho mô đ c bi u hiên

m t mô, ch không ph i các mô khác

Hình 1.12

2.1.3 Genomics so sánh (Comparative genomics)

Genomics so sánh s d ng thông tin t các loài khác nhau và tr giúp

cho vi c hi u bi t t ch c và s bi u hi n c a gene c ng nh s sai khác

v m t ti n hoá Nó có l i th v s b o t n cao đ c a gene v c u trúc

và ch c n ng (ngh a là có sai khác nh ngang qua các đ n v phân lo i đa

d ng) và áp d ng nguyên lý này theo cách th c gi a các loài (interspecific) trong s tìm ki m các gene ch c n ng và s t ch c b gene c a chúng Genomic so sánh còn t ng c ng nghiên c u b ng cách

ki m tra s đa d ng c a các sinh v t mô hình (model organisms) mà trong

đó các tính tr ng sinh lý, phát tri n ho c sinh hoá đã đ c s n sàng đ nghiên c u

c bi t là các nghiên c u genomics các th c v t có hoa nh nh

cây c i Brassica, Arabidopsis thaliana, v n đ c s d ng r ng rãi nh là các loài mô hình, mà s li u trình t c a b gene đã đ c gi i xong r i

M t trình t b gene đ y đ c a cây d ng (populus) ch ng bao lâu n a

c ng s có s n cho phân tích genomics so sánh

2 Xác đ nh trình t DNA c a toàn b các b gene

Vi c gi i hoàn t t trình t các b gene c a nhi u loài quan tr ng và mô hình là m t thành t u đáng k c a genomics, v n cung c p c s cho phân tích so sánh v c u trúc và ch c n ng Các câu tr l i cho các câu h i

ch ng h n nh : (1) s l ng, s đ nh khu và phân b c a các gene trong genome; (2) t ch c c a gene và ch c n ng c a chúng; (3) các gene nào là

gi ng nhau ho c đ c b o t n cao b ng qua các loài khác nhau; và (4) các gene nào ch u trách nhi m cho các loài thích nghi và ti n hoá mà có th thu nh n đ c bây gi Các trình t b gene đ y đ đã đ c xác đ nh cho

n m men bia Saccharomyces cerevisiae (5/1997), giun tròn Caenorhabditis elegans (12/1998), ru i gi m Drosophila melanogaster (3/2000), th c v t có hoa hàng n m Arabidopsis thaliana (12/2000), con

ng i (2/2001), và còn nhi u loài khác sos li u gi i trình t c ng s p hoàn thành nh chu t, lúa, ngô, v.v Hi n gi có th xác đ nh b ng thí nghi m trình t b gene đ y đ c a các cây r ng nh là cây d ng Populus (500 tri u c p base) hay Eucalyptus (340-580 tri u c p base)

S l ng các gene trong m t b gene là có gi i h n và không quá cao

nh t trong s các ch c n ng c a t bào - chuy n hoá c s , s phiên mã

c a DNA thành RNA, s d ch mã c a RNA thành protein, s tái b n DNA - ch ti n hoá m t lúc và h u nh gi nguyên không đ i k t s ti n hoá c a n m men đ n bào và vi khu n

B ng 1.1 Kích th c b gene c a nhi u loài đem so sánh

Ph m vi phân

lo i Tên Latin Tên chung n

S bp (x 106)

TV h t kín L.esculentum khoai tây 12 900 ?

TV h t kín Eucalyptus 3 b ch đàn 11 340-580 ? Cây r ng/TV h t

tr n

Thông 3 thông 12

20.000-30.000

?

Hình 1.13 So sánh s l ng và m t đ gene ba loài E coli, n m men bia n y

ch i S cerevisiae và giun tròn C elegans

Genomics so sánh khám phá đ c tính b o t n c a gene nh th , đã giúp cho vi c hi u bi t và suy ra ch c n ng c a m t gene c th t các s

li u thu đ c đ i v i các gene t ng đ ng gi ng nhau (similar homologous genes) đã đ c nghiên c u các sinh v t khác Khá nhi u

ch c n ng c a các gene cây r ng có th h c đ c t các s i u thu đ c

các sinh v t khác, ch ng h n nh Arabidopsis Trong s các thách th c

khác nhau là tính ph c t p và kích th c l n c a các b gene cây c i (B ng 1.1) Kích th c c a b gene cây thông (20,000-30,000 tri u c p base), ch ng h n, là l n g p 6 đssen 8 l n so v i b gene ng i (3,400 tri u c p base), và 150 đ n 200 l n l n h n b gen c a Arabidopsis (125

tri u c p base) Ngay c kích th c v t lý t ng đ i nh c a b gene cây

d ng Populus (500 tri u c p base), v n 40 l n bé h n loài thông Pinus taeda (đã đ c nghiên c u rât k ) s gi ng nh b gene cây r ng đ u tiên

đã đ c gi i toàn b trình t , s b ng kho ng 4 l n b gen Arabidopsis

(m c dù gi ng v i lúa và 6 l n bé h n ngô, c hai h u nh đ u đã đ c

gi i trình t đ y đ )

Cùng v i s phát tri n nhanh chóng và vô cùng h p d n nh v y c a

l nh v c genomics, hàng lo t các công ty c ph n doanh nghi p nhà n c (doanh nghi p công) và t nhân đua nhau ra đ i, đ c bi t là các qu c gia

đi đ u trong l nh v c này nh : M , c, Pháp, Anh, Canada, B , Nh t,

Úc, Thu i n, v.v

Hình 1.14 và 15 d i đây cho th y s phát tri n t ng ti n v s l ng

c a các công ty c ph n doanh nghi p công M t n m 1994 đ n 2000,

L y t bào làm đ n v nghiên c u; (2) Thông tin di truy n ch a trong b gene t bào chi ph i m i bi u hi n s ng c a nó mà các gene là đ n v di truy n c s ; (3) S ho t đ ng c a các gene trong quá trình phát tri n cá

th là đ c tr ng cho t ng gene t ng giai đo n c th ; (4) Các quá trình trong các h th ng s ng ph i đ c đi u hòa và ki m soát đ đ m b o cho

s t n t i c a nó là liên t c, trong đó ph bi n là s t đi u ch nh b ng các

c ch ph n h i thông tin (feed-back mechanism); (5) S th ng nh t gi a

c u trúc và ch c n ng bi u hi n t t c các m c đ t ch c khác nhau c a

s s ng; (6) T t c các t ch c và quá trình s ng đ u tuân theo các quy

lu t v t lý và hóa h c; (7) S s ng trên trái đ t tr i qua quá trình ti n hóa kho ng 3,5 t n m qua, vì v y khi so sánh, nh ng nét t ng đ ng gi a chúng cho th y tính th ng nh t v m t ngu n g c và nh ng nét d bi t cho

th y tính phát tri n, s phân hóa đa d ng t t y u c a chúng

2 Ph ng pháp h c t p b môn

C ng nh b t k môn h c nào khác, vi c h c t p di truy n h c vi sinh

v t đòi h i ph i n m v ng l ch s môn h c, đ i t ng, nhi m v , ph ng pháp nghiên c u và h th ng ki n th c c n b n c a nó Bên c nh các nguyên t c nói trên v n r t c n cho t duy trong h c t p, đây xin nêu vài nét chính liên quan đ n ph ng pháp h c t p đ c thù c a b môn

(1) N m v ng các ki n th c liên môn (nh t bào h c, hóa sinh h c,

mà trên h t là di truy n h c và vi sinh v t h c) và liên ngành (nh toán

th ng kê-xác su t, v t lý và hóa h u c )

(2) N m v ng h th ng khái ni m c b n c ng nh các thu t ng m i không ng ng n y sinh Ch ng h n, gene là khái ni m c n b n có n i hàm không ng ng đ c phát tri n sâu r ng c bi t, trong th i đ i ngày nay,

v i s m ra m t k nguyên m i - K nguyên sau b gene (Post-genomic

Era), hàng lo t thu t ng và l nh v c nghiên c u m i liên quan v i nh ng

cánh c a -ome và -omics đ ng lo t ra đ i và g n li n v i s phát tri n c a

Tin-sinh h c (Bioinformatics) nh : genome v i genomics, proteome v i

proteomics, transcriptome v i transcriptomics,

(3) Hi u rõ b n ch t c a các nguyên lý di truy n trong t ng ch đ

c ng nh m i liên quan gi a chúng đ có th gi i thích và v n d ng trong

gi i quy t các bài toán ho c tình hu ng c a đ i s ng và th c ti n s n xu t (4) n m ki n th c và phát tri n các k n ng t duy m t cách v ng

ch c đòi h i ph i bi t v n d ng ki n th c vào gi i bài t p c ng nh các k

n ng th c hành thí nghi m

(5) Di truy n h c vi sinh v t là m t khoa h c th c nghi m, nên thông tin thu đ c là nh các quan sát t th gi i vi sinh v t, và ph ng pháp

khoa h c chính là công c đ hi u bi t các quan sát đó Nói đ n ph ng pháp nghiên c u khoa h c là nói đ n các b c ti n hành theo m t trình t

t ch c công vi c ch t ch sau đây: Quan sát Gi thuy t D đoán

Th c nghi m (đ ki m tra gi thuy t đ t ra) xu t gi thuy t m i (6) Trong khi h c giáo trình, b n nên làm ít nh t m t ti u lu n v m t

v n đ c p nh t mà mình yêu thích Công vi c này đòi h i s say mê tìm tòi các thông tin m i, đ c bi t là thông qua m ng internet, đ vi t bài t ng

lu n khoa h c và trình bày trong m t seminar i u quan tr ng là ph i t o cho mình m t hoài bão h c t p, m t kh n ng và ph ng pháp t h c (7) B i di truy n h c vi sinh v t và các ng d ng c a nó là m t l nh

v c khoa h c non tr nh ng phát tri n v i t c đ h t s c nhanh chóng, cho nên kh i l ng ki n th c m i tích l y đ c là vô cùng phong phú và đa

d ng có th c p nh t thông tin v môn h c đòi h i ph i t ng c ng

kh n ng s d ng ti ng Anh và internet áng k là các trang web đ c

gi i thi u sau m i ch ng, ho c có th s d ng ngay các t khóa (key words) đ c cho t ng ch đ đ tìm ki m v i công c m nh nh t hi n

nay là Google (http://www.google.com/), ho c b ng các công c khác

nh : MSN (http://www.msn.com/), Yahoo (http://www.yahoo.com/) ho c Wikipedia (http://www.wikipedia.com/)

Madigan, MT and JM Martinko 2006 Brock Biololy of Microorganisms

11th ed Pearson Prentice Hall, Inc Upper Saddle River, New Jersey

Maloy, S 2006 Microbial Genetics

http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/genetics/ Nature -OMICS Gateway:

Chương 1

Các ñ c ñ i m c a Di truy n h c

Vi sinh v t

I Sơ lư c l ch s vi sinh v t h c

Vi sinh v t (microorganisms, microbials) là tên g i chung dùng ñ ch

t t c các sinh v t có hình th bé nh mà ch có th nhìn th y dư i kính

hi n vi quang h c ho c kính hi n vi ñi n t Lĩnh v c nghiên c u này g i

là Vi sinh h c (microbiology), ra ñ i cách ñây hơn 300 năm b i Antoni

van Leeuwenhoek (1676; hình 1.1) v i khám phá ñ u tiên các vi sinh v t

b ng kính hi n vi ñơn gi n

V l ch s phát tri n c a vi sinh h c, các tác gi khác nhau phân chia

không gi ng nhau (b n ñ c có th tham kh o các tài li u ñư c gi i thi u

dư i ñây) Ch ng h n:

Theo Nguy n Thành ð t (2005), có th chia làm 4 giai ño n: giai ño n

sơ khai (v i ñ i di n là A van Leeuwenhoek), giai ño n Pasteur, giai

ño n sau Pasteur và giai ño n hi n t i

Madigan và Martinko (2006, tr.9-20) xét qua 4 th i kỳ: (i) Nh!ng g c

r l ch s c a vi sinh h c - Robert Hook, van Leeuwenhoek và Cohn; (ii)

Pasteur, Koch và các k" thu t nuôi c y thanh trùng; (iii) Tính ña d ng vi

sinh v t và s ra ñ i c a vi sinh v t h c ñ i cương; và (iv) K# nguyên hi n

ñ i c a vi sinh v t h c

$ ñây, t m xét theo quan ni m c a McKane và Kandel (1996) Có th

nói r ng t% n a sau th& k# XIX, s phát tri n c a vi sinh h c g'n li n v i

b n hư ng nghiên c u chính ñư c tóm lư c như sau:

Tranh lu n v thuy t t sinh (spontaneous generation controversy):

Hàng lo t các b ng ch ng và lý l( vư t th'ng thuy&t t sinh, tiêu bi u là

các công trình c a Spallanzani (1765), Schroeder và von Dusch (1854),

Pasteur (1861) và Tyndall (1877)

Hình 1.1 A van Leeuwenhoek, L Pasteur và W Flemming (t trái sang)

Nghiên c u s lên men (fermentation): Năm 1837 Schwann xác

ñ nh n m men Saccharomyces cerevisiae ch u trách nhi m cho s lên men

c)n; ñ&n năm 1864 Pasteur (hình 1.1) c u vãng n n k" ngh s n xu t rư u vang Pháp nh phát tri n k" thu t ki m soát s lên men, và ñây là cơ s cho phương pháp kh trùng Pasteur hi n ñ i; năm 1897 Buchner khám phá ra s lên men c)n vô bào

Nghiên c u di truy n h c phân t (molecular genetics) kh i ñ u t%

công trình c a Beadle và Tatum năm 1941 v i gi thuy&t m*t gene-m*t enzyme và kéo dài cho ñ&n nay

Nghiên c u b nh lây nhi m (infectous disease): Năm 1798 Jenner

gi i thi u vaccine ñ u tiên, khi s d+ng m m b nh ñ u bò ñ gây mi n

d ch ch ng l i b nh ñ u mùa Năm 1876 Koch ch ng minh b nh nguyên

h c c a b nh than; ch ra b n bư c cho vi c xác ñ nh nguyên nhân c a các

b nh nhi m trùng Năm 1881, Pasteur ñi u ch& vaccine ch ng l i b nh than và ñ&n năm 1886 chính ông l i ñi u ch& vaccine ch ng b nh d i Năm 1883 Metchnicoff ch ng minh vai trò c a các t& bào b ch c u Năm

1929 Flemming (hình 1.1) khám phá ra penicillin

C n lưu ý r ng, chính t% nghiên c u ñ u tiên c a Jenner v vaccine ñã

hình thành m*t nhánh mi n d ch h c (immunology) mà s phát tri n c a

nó g'n li n v i tên tu,i c a Pasteur như ñã ñ c p ð&n năm 1954 Salk và

1955 Sabin s n xu t thành công các vaccine ch ng virus polio gây b nh

b i li t Năm 1980 T, ch c Y t& Th& gi i (WHO) tuyên b ñã gi i quy&t xong b nh ñ u mùa, và b nh AIDS cũng b't ñ u xu t hi n Năm 1984 Milstein, Koeller và Jeme s n xu t các kháng th ñơn dòng; năm 1990 Murry và Johnson s d+ng các tác nhân c ch& mi n d ch ñ th c hi n thành công các ca ghép mô ð&n 1993 ca li u pháp gene ñ u tiên duy trì

kh năng c a b nh nhân suy gi m mi n d ch ch ng ñư c b nh lây nhi m

II Các lo i t bào vi sinh v t prokaryote và eukaryote

Các vi sinh v t không ph i là m*t nhóm riêng bi t ho c m*t ñơn v phân lo i, mà thư ng bao g)m nhi u nhóm gi i khác nhau r t ña d ng, t% các virus (xem chương 5), vi khu.n cho ñ&n các vi sinh v t eukaryote

D a vào phân lo i h c phân t , năm 1977 Carl Woese chia sinh v t nhân sơ thành 2 nhóm d a trên trình t 16S rRNA, g i là nhóm hay v c

(domain) vi khu n th c (Eubacteria) và vi khu n c (Archaebacteria) Ông

lý lu n r ng hai nhóm này, cùng v i sinh v t nhân chu.n, ti&n hóa ñ*c l p

v i nhau và vào năm 1990 nh n m nh thêm quan ñi m này b ng cách ñưa

ra h th ng phân lo i 3 v c, bao g)m vi khu n (Bacteria), vi khu n c

(Archaea) và sinh v t nhân chu n (Eukarya) Quan ñi m này nói chung

ñư c ch p nh n r*ng rãi gi!a các nhà sinh h c phân t

Trư c tiên, ta hãy hình dung m i quan h v m t phát sinh ch ng lo i

c a các prokaryote (g)m bacteria và archaea) và các eukaryote Hình 1.2

C n lưu ý r ng, v m t ti&n hóa, vi khu.n ñư c coi là các vi sinh v t khá c,, xu t hi n cách ñây ch%ng 3,7 tri u năm Hai bào quan ty th (mitochondrion) và l+c l p (chloroplast) có m t trong các t& bào eukaryote

ñư c xem là b't ngu)n t% vi khu.n b ng con ñư ng n*i c*ng sinh (endosymbiotic)

Hình 1.2 Cây phát sinh ch ng lo i c a s s ng d a trên so sánh trình t RNA ribosome s i ñơ n (ssrRNA) T g c cây s s ng cho th y các prokaryote phân thành nhóm (Domains) là Archaea và Bacteria m c ñ phân lo i, các sinh v t

ph n ñ nh c a các nhánh Archaea ñ i di n cho các B (Order); ph n ñ nh c a các nhánh Bacteria là các ngành (Phyla) Các nhóm vi khu n ñ a d ng và quan

tr ng nh t, ñư c nghiên c u k nh t là Cyanobacteria, Proteobacteria và các vi khu n Gram d ương (Ngu n: Kenneth Todar, 2004)

1 T bào và các ñ c tính cơ b n c a nó

T bào (t% ti&ng Latin cella, nghĩa là khoang nh ; thu t ng! này do

Robert Hooke ñưa ra) là ñơn v c u trúc và ch c năng c a ña s sinh v t (tr% nh!ng d ng s ng ti n t& bào ch ng h n như virus) Nh!ng sinh v t ñơn bào như vi khu.n, cơ th ch g)m m*t t& bào Các sinh v t ña bào c u

t o t% nhi u t& bào

H c thuy&t t& bào ñư c xây d ng t% th& k# 19 và theo quan ni m hi n nay có th tóm t't n*i dung c a nó như sau:

1 M i sinh v t ñư c c u t o t% m*t ho c nhi u t& bào