Trong đó, nam men và vi khuẩn lactic 14 hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết định đến chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men.. Xuất phát từ bản chất c
Trang 1_|-
BQ GIAO DUC VA DAO TAO DAI HOC DA NANG
HOANG THI HONG ANH
NGHIEN CUU VAI TRO VI KHUAN LACTIC TRONG
QUA TRINH LEN MEN TAO HUONG CA PHE HAT TUOI
Chuyén nganh: CONG NGHE THUC PHAM VA ĐỎ UỐNG
Ma sé: 60.54.02
TOM TAT LUAN VAN THAC Si KY THUAT
_2-
MỞ ĐẦU
1 Lý do lựa chọn đề tài
Hiện nay, “cà phê chôn” là loại cà phê đắt giá và được ưa chuộng nhất trên thế giới về hương vị Tuy nhiên, loại cà phê này khá hiếm, người ta chỉ thu được khoảng 224kg trong một năm Vậy điều
gì đã khiến cho loại cà phê chỗn này có giá trị sử dụng cao như vậy? Chính hệ vi sinh vật yếm khí trong đường ruột của con chỗn đã tạo ra
hương vị đặc biệt của cà phê
Quả cà phê tươi sau khi thu hoạch có vị ngọt dịu và màu đỏ ở
phần vỏ ngoài, hoàn toàn không có hương thơm Hương và màu sắc của hạt cà phê chúng ta cảm nhận được chỉ hình thành sau khi “ú” Ủ
là quá trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao sôm: nam men, nắm mốc và vi khuẩn Trong đó, nam men và vi khuẩn
lactic 14 hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết định đến chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men Nhiều nghiên cứu khẳng định sự có mặt của nắm mốc, nắm men, vi khuẩn
(lactc, axetic, coliform) và một số vi khuẩn øram âm Trong đó, nhiều chủng vi khuẩn lactic trong khối hạt ủ được phân lập và định
tên
Xuất phát từ bản chất của quá trình lên men yếm khí quả cà phê tươi xảy ra trong hệ thống tiêu hóa của con chỗn, chúng tôi chọn
vi khuẩn lactic làm đối tượng nghiên cứu quá trình lên men trên quả
cà phê tươi sau thu hoạch, nhằm góp phần “công nghiệp hóa” giai đoạn lên men, cải thiện chất lượng về hương vị thay vì chỉ lên men cà phê thóc như hiện nay Vì mục đích đó, chúng tôi chọn để tài:
“Nghiên cứu vai trò của vì khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê hạt tưo†`
Trang 2_3-
2 Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic tham gia vào quá
trình tạo hương dựa trên khả năng chuyên hoá đường tạo thành các
axit hữu cơ Sản phẩm axit hữu cơ tham gia phản ứng este với rượu —
sản phẩm tạo hương chính cho cà phê nhân
- Lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng chuyển
hóa đường mạnh để ứng dụng cho quá trình lên men cà phê hạt tươi
- Từ kết quả ứng dụng, đề xuất quy trình lên men mới thay
thế quy trình lên men thóc như hiện nay và ứng dụng vào giai đoạn
lên men tại huyện EaH” leo — Daklak
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Quả cà phê Robusta thu hái tại huyện EaH’ leo, tinh Daklak
- Các vi khuẩn lactic được tuyển chọn trong quá trình lên men
tự nhiên cà phê
- Nắm men rượu vang từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ
sinh học Việt Nam
4 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp vi sinh vat
- Phương pháp hóa lý
- Phương pháp hóa học
- Phương pháp xử lý số liệu
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1 Ý nghĩa khoa học
- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic sinh
axit lactic cao
- Xác định vai trò tạo hương cho hạt cà phê của các vi khuẩn
lactc thực nghiệm trên chỉ tiêu xác định
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Ứng dụng vi khuẩn lactic lên men cà phê quả tươi tận dụng được nguồn dinh dưỡng có trong vỏ quả chuyển hóa thành các chất tạo hương nhằm chu dong nang cao chat lượng về hương của cà phê
- Ứng đụng kết quả nghiên cứu vào giai đoạn ủ cà phê tươi ở huyện EaH leo, Daklak,
6 Câu trúc luận văn
Luận văn gồm các phân:
Mở đầu
Chương l1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
Trang 3_5-
Chuong 1 TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Tổng quan về cây cà phê
1.1.1 Nguôn gốc
1.1.2 Các giống cà phê
1.1.2.1, Cà phê chè (coffea Arabica L)
1.1.2.2 Cà phé voi (Coffea Robusta)
1.1.2.3 Ca phé mit (Coffea Excelsa Chev)
1.1.3 Cầu tạo, thành phân hóa học của cà phê nhân
1.1.3.1 Cấu tạo hạt cà phê
1.1.3.2 Thành phần hóa học của hạt cà phê
1.2 Hệ vi sinh vật tham gia quá trình lên men hạt cà phê
1.2.1 Nẵm men
1.2.1.1 Sự tạo thành rượu etylc trong môi trường axI (pH =
4,5) và trong điều kiện yếm khí
1.2.1.2 Sự tạo thành glycerin trong môi trường kiêm
1.2.1.3 Sự tạo thành rưỢu cao †rong điều kiện thành phần dinh
dưỡng của môi trường lên men có chứa nhiêu axit amin khác nhau
1.2.2 Vi khudn lactic
1.2.2.1 Đặc điểm vì khuẩn lactic
1.2.2.2 Môi trường sống
1.2.2.3 Các quá trình trao đôi chất của vì khuẩn lactic
1.3 Môi trường dinh dưỡng và môi trường thực nghiệm
nuôi cây chủng giông
1.3.1 Môi trường dinh dưỡng cơ bản
1.3.2 Môi trường thực nghiệm nuôi cấy chúng giống
1.4 Nuôi cây thuần chủng và hỗn hợp giống
1.4.1 Nuôi cấy thuân chúng giống
-6-
1.4.2 Nuôi cấy hôn hợp chúng giống
1.5 Sinh tổng hợp hương cà phê
1.5.1 Khả năng tạo hương của vỉ khuẩn lactic
1.5.2 Một số hợp chất tạo hương trong cà phê
1.6 Quy trình lên men cà phê thóc
1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực của đê tài
1.7.1 Những nghiên cứu ngoài nước
1.7.2 Những nghiên cứu rong nước
Trang 4_7-
Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu và hệ vì sinh vật
Quả cà phê chín được thu hái tại các vườn cà phê thuộc
huyện EaH' leo, tỉnh Daklak, chủ yếu là giống Robusta
- Vi khuẩn lactic được phân lập và tuyển chọn từ khối cà phê
lên men tự nhiên
- Nắm men rượu được sử dụng từ bộ sưu tập viện Công nghệ
sinh học Quốc gia
2.1.2 Các môi trường phân lập, nhân giống vi khuẩn
2.1.3 Hóa chất thí nghiệm
2.1.4 Phương tiện thí nghiệm:
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuẩn bị môi trường
2.2.2 Phân lập và thuân chúng các chúng lactic
2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vỉ
khuẩn
2.2.4 Đặc tính sinh lý, sinh hóa
2.2.5 Phương pháp xúc định khả năng sinh trưởng, phát
triển của vi khuẩn lactic
2.2.6 Phương pháp xác định số lượng tẾ bào séng/Iml canh
trường
2.2.7 Phương pháp xác dinh chi sé este
2.2.8 Phương pháp phân tích phương sai
_8-
Chương 3 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả lựa chọn môi trường
Phương pháp thực hiện theo mục , tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn lactic như hình dáng khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng hay vàng ngà mọc trên đĩa petri có chứa môi trường MRS II, MRS
II, MRS IV, MRS V được phân lập và thuần chủng Các chủng được
đem nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng có bố sung nước vắt và
tiến hành đo OD sau 48h Ký hiệu các khuẩn lac 14 C,, Co, C3, Cu, Cs,
Co, C7, Cg, Co, Cio, C11, Cra, C13 Két qua trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Ảnh hướng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng
và phát triên cua vì sinh vật
Sí( | Chúng | MRSI | MRSH MRSHI | MRS VI| MRS V
12 Cir 305 289 295 269 260
Trang 5_9-
13 Cha 320 295 308 289 251
Đánh giá kết quả phát triển của các chủng vi sinh vật trên 5
môi trường cho thấy: tại môi trường dinh dưỡng MRS I không bổ
sung thêm nước vắt cà phê tất cả 7 chủng phát triển mạnh nhất Tiếp
đó là môi trường MRS HI; MRS H; MRS VI; MRS V
Do đó, chúng tôi chọn môi trường III làm môi trường giữ giống
và nuôi vi khuẩn cho quá trình nghiên cứu
Các chủng nghi ngờ là vi khuẩn lactic trên tiếp tục được giữ
giống và nuôi cấy trên môi trường MRS III để tiến hành xác định
hình thái và định tính
3.2 Kết quả xác định hình thái của vi khuẩn
Cac chung C;, Cy, C3, Cy, Cs, Co, C7, Cg, Co, Cro, Cr, Cr, Cis
được thử catalase, nhuộm mau Gram va quan sat hình dạng tế bào
theo phương pháp ở mục 2.2.3 chương 2 Kết quả được trình bày ở
bảng sau:
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập
từ cà phê lên men
-10-
dong nhat
C Trăng sữa, tròn, mép Hình que
Tròn, bê mặt trơn, mép Hình que
Trắng trong, mép nhẫn, bê| _ x
mat 161 Trăng sữa, bê mặt xù xì, Ộ x
mép lượn sóng
C Trăng sữa, nhân hơi vàng, | _ Que ngăn,
câu trúc đông nhât mảnh
Cio | Trăng đục, đêu, không lôi | Hình que +
Cu Trang duc, déu, hoi 161 Hinh oval +
Ciro Vàng nhạt, tròn đêu, lôi z +
ngăn
ngăn
té bao
Mau trắng sữa, tròn, lôi, Ộ
C¡ , » Hinh oval + +
mép phăng
Màu trắng trong, tròn, đẹt, | s
nhỏ
C Trắng trong, mép phẳng, Hình que
Cụ Trắng sữa, đẹt, cấu trúc Hình cầu + -
Kết quả ở bảng (3.2) cho thấy có 7 chủng có thể là vi khuẩn lactic,
C3, Cy, Cs, Co, Co, Cr2, C13 (Catalase ( - ); gram (+))
Các chủng này được thử khả năng chuyển hóa đường thành axit lactic, từ đó lựa chọn các chủng có khả năng chuyển hóa đường cao
3.3 Khả năng chuyển hóa đường thành axit lactic và khảo sát động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
3.3.1 Kết quả định tính khả năng sinh axit lactic
Trang 6-11-
Kết qua cho thấy tất cả 7 chủng phân lap C3, Cu, Cs, Co, Co,
Cy2, Cy3 c6 kha nang tao axit lactic (am chuyén mau tim cua dung
dịch thuốc thử sang màu vàng chanh như mẫu đối chứng) Xin xem
kết quả ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Định tính khả năng sinh axit lacic của các chủng vì khuẩn
Chủng khảo sát Kết
Ca
Cy
Cs
+
Ghi chú +: Sinh axit lactic
3.3.2 Két qua dinh lwong axit lactic của các chúng vỉ khuẩn
Bảng3.4 : Lượng axit lactic tạo thành của các chủng vì khuẩn
St Tén Lượng axit tạo thành (mgi/l)
Chúng 24h 48h 72h 96h
1 C; 34,78 88,39 82,80 64,42
2 Cụ 89,47 120,63 115,80 114,87
3 Cs; 112,72 142,74 158,80 146,86
4 Ce 63,57 117,31 111,70 105,91
5 Co 101,62 155,72 148,10 151,04
6 Cr 117,99 162,88 165,10 144,17
7 Ca 55,09 120,90 120,30 118,88
-12-
Từ bảng kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy các chủng
C;, C¡; có khả năng sinh axit lactic cao nhất, vì vậy, chúng tôi chọn 2
chủng đó để tiếp tục khảo sát động thái sinh trưởng
3.3.3 Khảo sát động thái sinh trưởng của 2 ching vi khuẩn lựa chọn
400
350 4
300 |
250 4
200 |
150 4
OD3s86nm
100 |
50 -
0 ¬
0h 12h 24h 36h 46h 60h 72h
—®—= C5 II 172 276 310 320 332 337
—®c12 8 165 293 325 336 343 345
Hình 3.3 Động thái sinh truong cua 2 chung Cs va C7 Trong khoang thoi gian tt 0 — 36h mat do té bao tăng lên rõ rệt
bởi đây là giai đoạn các chủng vi khuẩn lactic trong giai đoạn thích
ứng và sinh trưởng, phát triển về sinh khối, nên giá trỊ ODsaonm do
được cũng là giá trị sinh khối tích lũy được trong thời gian 36h nuôi
cây Khoảng thời gian từ 48 — 72h, giá trị sinh khối của hai chủng Cs,
C¡a có tăng nhưng không đáng kể, điều đó thể hiện các chủng vi khuẩn lactic bước qua giai đoạn phát triển cân bằng và chuyên dân qua g1a1 đoạn suy vong
Trang 7-13-
Dựa vào kết quả đo được, chúng tôi khang định 36h là mốc
thời gian hai chủng C; và C¡; phát triển mạnh nhất và tại thời điểm
đó, chúng tôi xác định lượng tế bào sống/ml canh trường theo
phương pháp 2.4, phụ lục 2 Kết quả trình bày ở bảng 3.5
Bang 3.5 : Số tế bào sống/ml canh trường (CFU/m]) tương ứng
với độ pha loãng thập phân
Ching vi khuẩn C; Ci
Số lượng khuẩn
II |18 | 3 7 | 31 | 42 | 16 | 23
lac trén dia
Số vi khuẩn/Iml
(CFU/ml)
Vậy, sau 36h nuôi cấy trên môi trường MRS IIL sinh khối vi
sinh vật đạt giá trị cao nhất và tại thời điểm đó, chủng Cs tương ứng
số tế bào là 18x10 và C¡ là 51x10” Chúng tôi chọn thời điểm này
bổ sung vào khối lên men cà phê hạt
3.4 Nghiên cứu khả năng tạo este của các chủng giống
3.4.1 Nuôi cấy thuần chúng
3.4.1.1 Bồ trí thí nghiệm
- Mẫu M¡, M; là các mẫu cà phê có bổ sung vi khuẩn tương
ứng là Cs, C¡; Mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn
3.4.1.2 Kết quả
-14-
230-
222.08b 225+
2201
212.38c
Mẫu lên men
Hình 3.5 Khả năng lên men tạo este của các chủng vì khuẩn
So sánh chỉ số este hai mẫu có bổ sung vi khuẩn với mẫu đối chứng (ĐC) cho thấy, chỉ số este trong hai mẫu cao hơn so với mẫu đối chứng
Qua bảng biểu cũng cho thấy mẫu bổ sung chủng Cs có chỉ số este cao hon hai mau còn lại Nhằm thử khả năng lên men chuyển
hóa đường của hai chủng €s và C¡; khi nuôi cây hỗn hợp như thế
nào, chúng tôi đã tiến hành lên men hỗn hợp hai chủng này và so sánh với mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn
3.4.2 Nuôi cấy hôn hop ching vi khuẩn C;, Cp
3.4.2.1 BO tri thí nghiệm
M;: mau bé sung hỗn hop vi khuẩn C; : C¡; (1:1)
M;: Mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn
3.4.2.2 Kết quả
Trang 8
M3 MDC
Hình 3.7 Kha nding tao este ctia hon hop ching vi khudn C; va Cp
Dựa vào bảng kết quả chúng ta thấy, khi bổ sung hỗn hợp hai
chủng giống Cs và C;; vào khối lên men, chỉ số este (239,86) cao hơn
so với mẫu đối chứng (208,15) và mẫu chỉ bổ sung giống thuần
chung(229,75)
Nhu đã biết, vi khuẩn lactic lên men dị hình sản phẩm chủ yếu
tạo ra là axit lactic Theo lý thuyết, phản ứng este chỉ xảy ra khi có
mặt của axit và rượu Do đó, để có được lượng rượu cao phân tử cao
trong quá trình lên men có định hướng, chúng tôi sử dụng phương án
sử dụng hỗn hợp hai chủng vi khuẩn Cs; va Cy cing với nắm men
rượu vang (từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ sinh học quốc
gia) để đánh giá khả năng tạo este Quá trình thực nghiệm và kết quả
được trình bày ở hình 3.8 và 3.9
3.4.3 Nuôi cấy hỗn hop ching vi khuan C; Cp voi nam
men
3.4.3.1 Bồ trí thí nghiệm
- 16 -
Trong đó: Mi: mẫu bổ sung hỗn hop vi khuan C; + Cy (mau
đối chứng) M;: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn Cs + C¡¿ và nắm men
3.4.3.2 Kết quả
Mẫu lên men
Hình 3.9: Khả năng tạo este của hỗn hợp vi khuẩn và nắm men Kết quả cho thấy, mẫu bổ sung nắm men có chỉ số este cao hơn
mẫu không bỗ sung (380,11>243,56) Chúng tôi chọn mô hình này để
nghiên cứu một số yếu tô ảnh hưởng đến chỉ số este
3.5 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chỉ số este 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hôn hợp vi khuẩn bổ sung lén men dén chi sé este
Để xác định tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiễn hành bổ sung hỗn hợp vi khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%, 6%, 8%
3.5.1.1 Bố trí thí nghiệm.
Trang 9_17-
Để xác định tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên
men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung hỗn hợp vi
khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%,
6%, 8%
3.5.1.2 Kết quả
370
360
350
340
330
320
310
300
290
280
Hình 3.11 Ảnh hướng tỷ lệ vi khuẩn bồ sung đến chỉ số este
Kết quả thể hiện ở hình 3.11 cho thấy khi bố sung 6% tỷ lệ hỗn
hợp vi khuẩn thì chỉ số este cao nhất là 369,72; và thấp nhất khi bổ
sung tỷ lệ 2% là 311,05
Chúng tôi lựa chọn tỷ lệ bổ sung vi khuẩn/khối lượng hạt cà
phê tươi thích hợp nhất là 6% (v/w) để tiến hành nghiên cứu tiếp
theo
3.5.2 Nghiên cứu ảnh hướng tỷ lệ nẫm men bồ sung đến chỉ
SỐ esfe
3.5.2.1 Chuẩn bị mẫu
Đề xác định tỷ lệ nắm men thích hợp bỗ sung vào khối lên men
cà phê kết hợp với hỗn hợp vi khuẩn lactic cho hạt cà phê có hàm
-18-
lượng este cao, chúng tôi tiên hành bố sung nắm men/ khối lượng hạt
cà phê ứng với các tỷ lệ 2%, 4%, 6%(v/w)
3.5.2.2 Kết quả
Mẫu hạt cà phê sau khi lên men được đem phân tích, kết quả trình bày ở hình 3.13
600
500
400
300
200
Tỷ lệ nắm men bồ sung (%)
Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ nắm men bồ sung và hỗn hợp
ví khuẩn đến chỉ số este Qua biểu đồ, ta có thể nhận thấy, khi tăng tỷ lệ nằm men bổ sung, chỉ số este càng giảm
Dựa vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi chọn tỷ lệ bổ sung
nấm men là 2%, khi đó chỉ số este đạt giá trị cao nhất (528.12) để
tiến hành nghiên cứu ánh hưởng thời gian lên men đến chỉ số este 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hướng thời gian lên men đến chỉ số este trong hạt cà phê sau lên men
3.5.3.1 Bố trí thí nghiệm.
Trang 10- 19 -
Để khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến chỉ số este chúng
tôi tiến hành lấy mẫu phân tích sau 3, 4 và 5 ngày lên men Kết quả
phân tích được thể hiện ở hình 3 15
3.5.3.2 Kết quả
3 4 5
Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men đến chỉ số este
Từ kết quả thu được chúng tôi nhận thấy, sau 4 ngày lên men
chỉ số este đạt cao nhất (531,23) trong 3 khoảng thời gian khảo sát
Sau 5 ngày, chỉ số este có giá trị thấp nhất (489,17) Chính vì vậy,
chúng tôi chọn thời điểm dừng quá trình lên men là sau 4 ngày
3.6 So sánh hiệu quả lên men tạo hương cà phê hạt tươi với
cà phê thóc
3.6.1 Sơ đô bố trí thí nghiệm
Để so sánh hiệu quả tạo hương của hai phương pháp lên men
cà phê hạt tươi và cà phê thóc, chúng tôi tiến hành lên men hai mẫu
song song
Trong dé: M, : mau 1én men ca phé thóc
- 20 -
M;: mẫu lên men cà phê hạt tươi có bố sung hỗn hợp vi khuẩn
và nắm men
3.6.2 Kết quả
Sau 4 ngày lên men, lấy mẫu hạt đem rửa sạch và tiễn hành phân tích chi sé este
Két qua thé hién 6 hinh 3.17
M17 M18 Mau lén men
Hình 3.17 Chi sé este theo hai phương pháp lên men Kết quả ở bảng biểu thể hiện chỉ số este của phương pháp lên men cà phê thóc thấp hơn rất nhiều so với lên men cà phê hạt tươi (211,15 <565,11)
Băng việc phân lập, lựa chọn nguôn vi khuẩn lactic có sẵn trong môi trường lên men cà phê tự nhiên và ứng dụng trở lại để chủ động cho quá trình lên men tạo hương, sau khi khảo sát thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng việc lên men cả vỏ có bổ sung nguồn vi khuân kêt hợp với nầm men thì chỉ sô este của hạt cà phê nhân sau
