1.1Đặt vấn đềChuối là một trong những loại cây ăn trái đặc trưng của vùng nhiệt đới. Hiện nay, chuối được xem là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam trên thị trường thế giới. Không chỉ mang lại giá trị kinh tế cao mà chuối còn là một loại trái cây mang đến cho con người nhiều giá trị về dinh dưỡng. Ngoài ra, chuối còn có nhiều tác dụng quý về giá trị dược liệu như chữa bệnh táo bón, ngăn ngừa bệnh sỏi mật, và đặc biệt là bệnh ung thư ruột già một căn bệnh được xem là vô cùng nguy hiểm hiện nay.Cùng với việc ứng dụng các thành tựu khoa học, kĩ thuật hiện đại, nhiều giống chuối với những giá trị to lớn về kinh tế đã được quan tâm và đưa vào nhân giống trên qui mô lớn, trong đó chuối Tiêu Hồng được xem là một trong những cây trồng mũi nhọn đang được Hưng Y ên liệt vào danh sách các cây trồng đầy tiềm năng mang lại lợi nhuận to lớn cho người dân tỉnh này. Từ những thành công trong việc ứng dụng kĩ thuật in vitro đã cho phép tạo ra được nguồn cây giống sạch bệnh, mang nhiều đặc tính vượt trội hơn so với phương pháp nhân giống truyền thống.Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay trong nhân giống in vitro cây chuối nói chung và đặc biệt là chuối Tiêu Hồng nói riêng bởi những đặc tính ưu việt của phương pháp này mà nó sẽ được trình bày trong những phần tiếp theo đây.1.2Mục tiêu đề tàiNhằm hướng đến mục tiêu kinh tế lâu dài là nâng cao sản lượng cây giống chuối Tiêu Hồng đồng thời tạo ra giống chuối Tiêu Hồng sạch bệnh nhờ vào công nghệ cấy mô đáp ứng cho thị trường hiện nay. Đề tài tiến hành việc khảo sát các ảnh hưởng của chất khử trùng cụ thể ở đây là Javel ở những nồng độ và thời gian khác nhau nhằm đưa ra qui trình khử trùng phù hợp nhất, cho tỉ lệ vô trùng mẫu cấy cao nhất, góp phần quan trọng vào hiệu quả nuôi cấy, đồng thời cũng khảo sát ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng như BA (Benzyl adenine), tỉ lệ giữa BA và IAA (Indol acetic acid) và TDZ (Thidiazuron) ở những nồng độ khác nhau lên khả năng nhân chồi của chuối Tiêu Hồng từ đó chọn được môi trường thích hợp cho hiệu quả nhân chồi tối ưutừ đỉnh sinh trưởng chuối Tiêu Hồng, tạo bước chuẩn bị quan trọng cho các giai đoạn tiếp
Trang 1CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 ðặt vấn ñề
Chuối là một trong những loại cây ăn trái ñặc trưng của vùng nhiệt ñới Hiện nay, chuối ñược xem là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam trên thị trường thế giới Không chỉ mang lại giá trị kinh tế cao mà chuối còn là một loại trái cây mang ñến cho con người nhiều giá trị về dinh dưỡng Ngoài ra, chuối còn có nhiều tác dụng quý về giá trị dược liệu như chữa bệnh táo bón, ngăn ngừa bệnh sỏi mật, và ñặc biệt là bệnh ung thư ruột già một căn bệnh ñược xem là vô cùng nguy hiểm hiện nay
Cùng với việc ứng dụng các thành tựu khoa học, kĩ thuật hiện ñại, nhiều giống chuối với những giá trị to lớn về kinh tế ñã ñược quan tâm và ñưa vào nhân giống trên qui mô lớn, trong ñó chuối Tiêu Hồng ñược xem là một trong những cây trồng mũi nhọn ñang ñược Hưng Yên liệt vào danh sách các cây trồng ñầy tiềm năng mang lại lợi nhuận to lớn cho người dân tỉnh này Từ những thành công trong việc ứng dụng kĩ
thuật in vitro ñã cho phép tạo ra ñược nguồn cây giống sạch bệnh, mang nhiều ñặc tính
vượt trội hơn so với phương pháp nhân giống truyền thống
Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là biện pháp ñang ñược sử dụng phổ biến hiện nay
trong nhân giống in vitro cây chuối nói chung và ñặc biệt là chuối Tiêu Hồng nói riêng
bởi những ñặc tính ưu việt của phương pháp này mà nó sẽ ñược trình bày trong những phần tiếp theo ñây
Trang 2từ ñỉnh sinh trưởng chuối Tiêu Hồng, tạo bước chuẩn bị quan trọng cho các giai ñoạn tiếp theo của quá trình vi nhân giống chuối Tiêu Hồng trên qui mô lớn
Trang 3CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Nguồn gốc và ựặc tắnh thực vật của chuối
2.1.1 Nguồn gốc chung của chuối
Chuối ựược thuần hóa ựầu tiên ở đông Nam Á Nhiều loài chuối dại ựược tìm thấy ở New Guinea, Malaysia, Indonesia, và Philippines Gần ựây, từ các di tắch về khảo cổ học tại ựầm lầy Kuk ở các tỉnh thuộc cao nguyên phắa tây Papua, New Guinea
ựã giúp các nhà khoa học ựưa ra kết luận rằng chuối ựược trồng ở ựây bắt ựầu trễ nhất
là năm 5000 TCN (trước công nguyên), và cũng có thể sớm hơn nữa, tức là khoảng từ
8000 năm TCN Sự khám phá này có nghĩa rằng cao nguyên New Guinea là nơi mà chuối ựược thuần hóa ựầu tiên
Một số vùng cô lập ở Trung đông có thể ựã trồng chuối từ thời gian trước khi Hồi giáo ra ựời Theo các tài liệu cổ cho rằng nhà tiên tri Muhammad ựã biết ựến chuối trong các bữa ăn của ngài Sau ựó, văn minh Hồi giáo trải ra nhiều nước, và chuối từ
ựó cũng bắt ựầu mở rộng lãnh thổ phân bố Bắt ựầu từ thế kỷ 9, chuối ựã ựược biết ựến một cách rộng rãi qua các văn kiện và những bài thơ Thánh Vào thế kỷ 10, những văn kiện Palestine và Ai Cập ựã nói ựến chuối, từ ựấy chuối lan qua Bắc Phi và Tây Ban Nha theo con ựường Hồi giáo
Các chứng cứ ựược tìm thấy trên một số mẫu cây chuối hóa thạch ở Cameroon từ thiên niên kỷ 1 TCN ựã gây ra cuộc tranh luận về lúc bắt ựầu trồng cây chuối là ở Châu Phi Theo các tài liệu về ngôn ngữ học cho rằng người Madagascar cũng ựã biết
về cây chuối từ lúc ựó Trước những khám phá này, bằng chứng sớm nhất về sự trồng chuối ở châu Phi là bắt ựầu từ cuối thế kỷ 6 TCN
canh-chuoi-tieu-hong-cong-nghe-cao-cho-lai-hon-100-trieu-111ong-ha/view)
(http://www.khuyennongvn.gov.vn/c-hdknkn/c-chuyengiaotbkt/hung-yen-mo-hinh-tham-(Ngày18/04/2008)
2.1.2 Nguồn gốc và vị trắ phân bố của chuối Tiêu Hồng
Trải qua hàng loạt các biến ựổi và tác ựộng của quá trình chọn lọc tự nhiên, chuối trồng ngày nay ựược tạo thành do kết quả của sự lai tự nhiên giữa hai loài chuối hoang dại ở Đông Nam Á là chuối hột và chuối rừng Ngày nay, theo thống kê có ựến 200-
300 giống chuối ựược trồng trên thế giới với các mục ựắch khác nhau như làm thực
Trang 4phẩm và làm cảnh, Tuy nhiên, hầu hết chuối ăn quả ngày nay trong ựó có chuối
Tiêu Hồng ựều thuộc loài Musa paradisiaca L (đặng Minh Quân, 2007)
Chuối Tiêu Hồng ựược xem là một trong những loại cây ựặc sản của tỉnh Hưng Yên ựồng thời cũng phân bố ở một số tỉnh lân cận như Hà Tây, Bắc Ninh, Hải Dương Trong ựó, Tứ Dân một xã nằm ở phắa tây huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên trên triền
ựê tả ngạn sông Hồng, cách trung tâm thủ ựô Hà Nội 22 km về phắa đông Nam, cách thành phố Hưng Yên 30 km về phắa Tây Bắc, và cách thị trấn Khoái Châu 6,5 km về phắa Tây là xã thâm canh cây chuối Tiêu Hồng lớn nhất Hưng Yên, chiếm 1/3 tổng diện tắch trồng chuối Tiêu Hồng của huyện Khoái Châu
http://my.opera.com/lewhenshan/blog/show.dml/3294697 (Ngày 29/05/2009)
2.1.3 đặc tắnh thực vật của chuối
Chuối có thân rễ to sống lâu năm, từ thân mọc ra những lá rất to dài tới 2m, các
bẹ lá úp vào nhau tạo thành một thân giả hình trụ cao tới 3 Ờ 4m hay hơn, thân giả sẽ chết ựi sau khi quả chắn, thân thật là phần nằm dưới ựất thường gọi là củ chuối Khi chuối ra buồng, một phát hoa từ củ chuối mọc lên xuyên qua thân giả và lồi ra ở phắa ngọn Cụm hoa chuối là một phát hoa gồm nhiều lá bắc màu ựỏ úp lên nhau thành bắp chuối, hình nón dài, ở kẽ mỗi lá bắc có khoảng 20 hoa xếp thành 1 nải chuối 2 tầng, hoa ở giữa thường là hoa lưỡng tắnh, ở phắa ngọn là hoa ựực ở phắa gốc là hoa cái Hoa không ựều, bao hoa 6 mảnh, trong ựó 3 mảnh vòng ngoài và 2 mảnh vòng trong dắnh lại với nhau thành một bản, còn mảnh thứ ba của vòng trong thường nhỏ và trong suốt gọi là cánh môi Quả mọng, không hạt do bầu noãn phát triển thành, và còn mang nhiều dấu vết của vòi nhuỵ (Hoàng Thị Sản, 2002)
Chuối là cây kém chịu rét và gió mạnh, cần nhiều nước nhưng ưa ựất thoát nước
và ựặc biệt thắch hợp với vùng ựất có nhiều Nitrogen và Kalium Lượng mưa ựều 120 150mm hàng tháng là tốt nhất, khô hạn trên 2 tháng liền thì phải tưới ựể ựảm bảo cung cấp ựủ nước cho chuối Nhiệt ựộ thắch hợp 25 - 30oC, tối thiểu trên 12oC Nắng cần vừa phải, nếu nắng gắt thì cây cháy lá, nám quả, trời âm u, cây mọc vóng và kéo dài thời gian sinh trưởng Năng suất trung bình 150 buồng/1 ha, nặng 15 ựến 20kg/buồng
-http://chothuoc24h.com/caythuoc/?ctid=C&ccthuoc=1782&Chu%E1%BB%91iC=441348.3 49773645&filethuoc=Chu%C3%A1%C2%BB%E2%80%98i (Ngày 07/10/2009)
2.1.4 đặc tắnh thực vật chuối Tiêu Hồng
Trang 5Cũng giống như ña số các loài chuối thuộc chi Musa, chuối Tiêu Hồng cũng mang các ñặc tính thực vật ñặc trưng của loài chuối Tiêu Tuy nhiên, vẫn có một số các ñặc tính phân biệt chuối Tiêu Hồng với các thứ chuối khác thuộc loài chuối Tiêu Chuối Tiêu Hồng thân chỉ cao 2,2 - 2,6m, thời gian từ lúc trồng ñến lúc thu hoạch là từ
10 - 11 tháng, buồng quả hình trụ, hình thái quả thon ñẹp, có màu vàng tươi khi chín, thịt quả chắc, hương vị thơm ngon, và ñặc biệt vỏ chuối Tiêu Hồng không bị thâm khi chín như các thứ chuối khác cùng loài, là giống có chất lượng rất tốt và tiềm năng xuất khẩu lớn Năng suất trung bình 40 - 45 tấn/ha Do tính chịu rét của chuối Tiêu Hồng khá yếu nên chuối Tiêu Hồng ñược trồng sao cho ñảm bảo mùa vụ thu hoạch chuối trong mùa hè và kết thúc trước mùa mưa bão Tức là chuối Tiêu Hồng ñược trồng vụ
thu (tháng 6-7 ÂL) và cây sẽ ra hoa vào tháng 6 - 8 năm sau, ñến tháng 9 - 11 thì thu hoạch, lúc này năng suất, phẩm chất chuối Tiêu Hồng là tốt nhất
http://www.baovecaytrong.com/kythuatcaytrongchitiet.php?Id=132&caytrongkythuat=c%C3%A2y%20chu%E1%BB%91i (Ngày 24/1/2011)
Hình 1: Chuối Tiêu Hồng ñang trong thời kì cho quả và quả chuối Tiêu Hồng khi chín
http://www.baovecaytrong.com/kythuatcaytrongchitiet.php?Id=132&caytrongkythuat=c%C3%A2y%20chu%E1%BB%91i (Ngày 24/1/2011)
2.2 Phân loại
2.2.1 Phân loại chung của chi chuối
Ngành: Ngành Hạt Kín (Angiospermatophyta) hay ngành Ngọc Lan
(Magnoliophyta)
Lớp: Monocotyledonneae (Lớp một lá mầm) hay Lớp Liliopsida (Lớp Hành)
Trang 6Phân lớp: Lilliidae (Phân lớp hành)
Siêu bộ: Zingiberana
Bộ: Zingiberales (Bộ gừng)
Họ: Musaceae
Chi: Musa
2.2.2 Phân loại chuối Tiêu Hồng
Ngành: Ngành Hạt Kín (Angiospermatophyta) hay ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp: Monocotyledonneae (Lớp một lá mầm) hay Lớp Liliopsida (Lớp Hành)
Phân lớp: Lilliidae (Phân lớp hành)
Siêu bộ: Zingiberanae
Bộ: Zingiberales (Bộ gừng)
Họ: Musaceae
Chi: Musa
2.2.3 Một số lồi chuối ở Việt Nam
ða số các lồi chuối ăn được ở Việt Nam đều thuộc lồi Musa paradisiaca L với
11 thứ khác nhau bởi hình dạng quả, màu quả và vị thịt như: chuối ngự, chuối già, chuối xiêm,…Ngồi ra, cũng cịn một số lồi chuối khác cũng thường gặp như: chuối
già lùn (M nana Lour.), chuối hột (M balbisiana Colla), chuối rừng (M Uranoscopos Lour.), chuối hoang nhọn (M acuminata Colla), chuối trăm nải ( M chiliocarpa
Back),…và nhiều lồi chuối khác cũng được trồng tại Việt Nam nhằm mục đích làm cảnh (ðặng Minh Quân, 2007)
2.3 Giá trị kinh tế, dinh dưỡng và dược liệu của chuối Tiêu Hồng
2.3.1 Giá trị kinh tế của chuối Tiêu Hồng
Theo đề án quy hoạch phát triển rau quả, hoa và cây cảnh đến năm 2010, tầm nhìn đến năm 2020 của Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn, chuối là cây sẽ được nhiều địa phương chọn làm cây trồng chủ lực Bên cạnh giá trị kinh tế to lớn mà chuối trái mang lại thì các bộ phận khác của cây chuối cũng đã được tận dụng và khai thác một cách triệt để, mang lại giá trị kinh tế.Doanh nghiệp đầu tiên và duy nhất hiện nay xuất khẩu lá chuối sang Mỹ là Cơng ty Thành Hải, huyện Nhà Bè, thành phố Hồ Chí Minh đã xuất khẩu khoảng 20 tấn lá chuối cho Tập đồn A&M Seafood Hiện nay,
Trang 7bình quân mỗi tháng công ty Thành Hải lại xuất một container lá chuối sang thị trường
Mỹ, tương lai con số sẽ còn gia tăng vì ñơn ñặt hàng tại các siêu thị ñang ngày một tăng lên Ngoài ra, dây chuối cũng ñược người dân tận dụng một cách tốt nhất cho việc sản xuất các ñồ thủ công mĩ nghệ mang lại hiệu quả kinh tế cao không chỉ cung cấp cho thị trường tiêu thụ trong nước mà còn hướng ñến thị trường nước ngoài Theo một vài nghiên cứu gần ñây, rác thải từ cây chuối còn ñược nghiên cứu làm than tổ ong, sản xuất chất dẻo ðặc biệt trái chuối bị hư hỏng, vạt bỏ trong quá trình thu hoạch, chế biến còn ñược nghiên cứu cho phân hủy và tạo ra một nguồn năng lượng ñiện mới Các sản phẩm từ chuối cũng ngày càng trở nên ña dạng như chuối khô, chuối sấy, mứt chuối, rượu chuối,… ñang hướng ñến một tiềm năng xuất khẩu rất lớn
Hiện nay, chuối là ñối tượng ñược chọn góp phần vào việc xóa ñói giảm nghèo bởi tính dễ trồng, không kén ñất, năng suất và thị trường ổn ñịnh Năm 2009, nông dân Hướng Hóa ñã thu hơn 80 tỷ ñồng từ việc bán chuối quả Nhiều hộ nông dân ở tỉnh Lào Cai thu tiền tỷ từ trồng cây chuối Tiêu Xã Bản Lầu có hơn 60 hộ trồng ñến 87 ha chuối, tổng thu nhập từ bán chuối gần 10 tỷ ñồng
Chuối còn ñược nông dân nhiều ñịa phương trồng xen canh, như xã Quang Trung, huyện Thống Nhất, tỉnh ðồng Nai trồng xen canh hơn 1.200 ha Gần ñây, việc mua bán chuối cũng lại càng trở nên thuận lợi hơn do các tiểu thương chuối ñến tận nhà ñể thu mua, do vậy các nhà trồng chuối không phải tốn nhiều kinh phí cho việc vận chuyển chuối bán
Nhiều ñịa phương ñã chuyển sang trồng chuyên canh cây chuối Gần 600 ha chuối Tiêu Hồng tập trung ở một số xã huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Chuối Tiêu Hồng năng suất bình quân 40 – 45 tấn/ha, cao gấp ñôi chuối Tiêu bình thường, bình quân thu lãi trên 100 triệu ñồng/ha, gấp khoảng 4 lần trồng lúa Xã Tứ Dân hiện ñang thâm canh cây chuối Tiêu Hồng lớn nhất huyện Khoái Châu, chiếm gần 1/3 diện tích chuối toàn huyện
2.3.2 Dinh dưỡng từ chuối Tiêu Hồng
Chuối là loại trái cây duy nhất hội tụ ñầy ñủ thành phần những chất dinh dưỡng
cần thiết cho cơ thể con người Thành phần dinh dưỡng do 100 gram thịt chuối chín
Trang 8cung cấp bao gồm:
Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng trong 100g thịt chuối chín
Thành phần Giá trị trong 100g thịt Thành phần Giá trị trong 100g thịt
2.3.3 Giá trị về dược liệu của chuối Tiêu Hồng
Theo một nghiên cứu tại Nhật, trái chuối chứa chất TNF (Tumor Necrosis Factor)
có những tính chất chống ung thư Mức ñộ chống ung thư này tương ứng với ñộ chín của trái chuối, tức là trái chuối càng chín thì tính chất chống ung thư của nó càng cao Chuối làm tăng số lượng tế bào máu trắng, ñẩy mạnh sức miễn dịch của cơ thể và sản xuất ra chất chống ung thư TNF
TNF tương tác với các tế bào khối u ñể khởi ñộng sự tự tiêu (hay chết) của tế bào (cytolisis) TNF tương tác với các thụ thể (receptor) trên các tế bào nội mô (endothelial cells), làm tăng tính thẩm thấu của mạch máu giúp cho các bạch cầu (leukocyte) xâm nhập vào ñược vùng bị nhiễm khuẩn ðây là một dạng ñáp ứng khu trú viêm (localized inflammatory response), mặc dầu một sự phóng thích toàn thân (systemic release) có thể dẫn ñến “sốc nhiễm khuẩn” (septic shock) và tử vong
Với 1 tới 2 trái chuối mỗi ngày giúp tăng sức miễn dịch của cơ thể chống lại các bệnh như cảm lạnh, cúm và những bệnh khác Cũng theo nghiên cứu này thì ñối với
Trang 9các loài chuối, vỏ chuối có ñốm ñen khi chín có tác dụng tăng cường tính chất của các
tế bào máu trắng lên gấp 8 lần so với vỏ chuối xanh
(http://67.52.177.156/default.aspx?LangID=0&tabId=437&ArticleID=24054)
(Ngày 22/11/2009)
Sau ñây là một vài công dụng khác của chuối, quý giá và dễ áp dụng nhưng còn
ít ñược quan tâm
Potassium trong chuối là một chất khoáng thiên nhiên có khả năng làm nhịp tim
ổn ñịnh và giúp tăng cường lượng oxy lên não ðồng thời, cũng làm cân bằng lượng nước trong cơ thể Khi chúng ta bị căng thẳng mức ñộ chuyển hóa (metabolism) tăng làm cho lượng Potassium giảm Chất Potassium trong chuối sẽ giúp lập lại mức ñộ quân bình và từ ñó làm giảm cường ñộ stress
Bệnh cao huyết áp
Chuối có hàm lượng Potassium khá cao Do vậy, việc ăn chuối sẽ giúp cung cấp một lượng Potassium cho cơ thể có tác dụng làm cân bằng lượng ñường huyết trong cơ thể Bên cạnh ñó, với hàm lượng Potasium cao còn có khả năng phóng thích lượng Sodium dư thừa ra khỏi cơ thể và làm ổn ñịnh huyết áp
Thiếu máu (Anemie)
Trong chuối có hàm lượng chất Sắt rất cao, vì thế ñã có thể kích thích sự sản sinh Hemoglobine trong máu, giúp chống lại căn bệnh thiếu máu
Tăng cường hoạt ñộng trí não
Do trong chuối có chứa một lượng cao Potassium có tác dụng tích cực ñến sự bền
bỉ trong hoạt ñộng trí não ñồng thời giúp tăng cường trí nhớ, làm tăng sự nhạy bén và minh mẫn
Trang 10có thể giúp bảo vệ niêm mạc ruột phòng ngừa nhiều chứng bệnh ở ruột già
Chứng nôn nghén (Morning sickness)
Ăn chuối giữa các bữa ăn giúp ñường trong máu ở mức cao và tránh ñược chứng nôn nghén vào buổi sáng
Loét dạ dày, tá tràng
Chuối xanh có khả năng kích thích sự tăng trưởng của lớp màng nhày ở thành trong của dạ dày ñối với các bệnh nhân loét dạ dày, tá tràng Những tế bào sản xuất chất nhầy ñược tăng sinh, lớp màng nhầy dày lên ñể bảo vệ thành dạ dày tránh khỏi bị loét
Những căn bệnh do thời tiết thay ñổi (Seasonal affective disorder-SAD)
Chuối có thể hỗ trợ những người bị SAD vì có chứa chất Tryptophan là chất làm gia tăng khí sắc thiên nhiên, và tăng sức ñề kháng của cơ thể trước ñiều kiện thời tiết bất lợi
Cai thuốc lá
Chuối có thể giúp những người cai thuốc lá chống lại với những cơn thèm thuốc Các vitamin B6, B12 cũng như các chất Potassium và Magnesium có trong chuối giúp cho cơ thể hồi phục sau những phản ứng của sự thiếu Nicotine
ðột quỵ (Stroke)
Theo nghiên cứu ñăng trên tập san The New England =2 0 Journal of Medicine, một chế ñộ ăn uống có thêm chuối sẽ giảm tỉ lệ tử vong vì ñột quỵ xuống 40% Cơ quan Quản Trị Thực Phẩm và Dược Phẩm Hoa Kỳ (FDA) ñã công nhận tác dụng chống cao huyết áp và ñột quỵ của chuối
Mụn cóc (warts)
Trang 11ðắp mặt trong vỏ chuối lên chỗ mụn cóc, rồi dùng băng keo dán lại , sau một thời gian mụn cóc sẽ mất
Say rượu
Hỗn hợp : chuối + sữa + mật ong cho vào máy xay sinh tố rồi cho người ñang say rượu uống, người say rượu sẽ chóng trở lại bình thường vì chuối làm cho bao tử dịu lại, mật ong thì làm ổn ñịnh ñường huyết và sữa sẽ giúp tái lập lại lượng nước trong cơ thể
Kiểm soát nhiệt ñộ
Chuối là loại thực phẩm ñược xếp vào loại có tính mát (cooling fruit ) nên có thể làm hạ nhiệt ñộ và giữ ổn ñịnh nhiệt ñộ cho cơ thể
http://thuvienphathoc.blogspot.com/2010/01/chuoi-va-nuoc-dua.html
(Ngày 06/01/2010)
2.4.1 Nhân giống theo phương pháp truyền thống
Dựa trên những ñặc tính thực vật của cây chuối có thân củ sống lâu năm, thân củ này có thể tồn tại trong ñất sau khi thân giả bị chết ñi hoặc bị ñốn bỏ sau mỗi vụ thu hoạch Khi gặp ñiều kiện thuận lợi hoặc ñược kích thích bằng cách bón phân thì từ thân củ của chuối sẽ mọc ra rất nhiều chồi con Các chồi con này sẽ sinh trưởng và phát triển thành cây chuối trưởng thành và cứ như vậy vòng ñời của củ chuối ban ñầu
cứ thế ñược tiếp diễn
Việc nhân giống chuối theo phương pháp truyền thống chủ yếu là bứng con (nhân giống vô tính) Tức là, từ một gốc chuối ban ñầu sau khi thu hoạch sẽ nhảy ra nhiều chồi chuối con, các chồi chuối con khi lớn sẽ ñược tách ra khỏi gốc ban ñầu và trồng
Trang 12trên ựất như một cá thể ựộc lập và từ cây chối con này sẽ cho ra nhiều chồi chuối con mới
2.4.2 Nhân giống hiện ựại
a đôi nét về lĩnh vực nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực ựược nhà thực vật học người đức Haberlandt, người tiên phong trong lĩnh vực này nghiên cứu lần ựầu tiên 1902 Từ ựó ựến nay, lĩnh vực nuôi cấy mô ựã phát triển một cách nhanh chóng và có nhiều ựóng góp hết sức to lớn vào sự phát triển của công nghệ sinh học và nông nghiệp hiện ựại Nuôi cấy mô và tế bào thực vật chắnh là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy ựược xác ựịnh rõ ựối với từng ựối tượng nuôi cấy và mục ựắch nuôi cấy Việc nuôi cấy ựược duy trì dưới các ựiều kiện ựược kiểm soát tương ựối nghiêm ngặt như ánh sáng, nhiệt ựộ, và ẩm ựộẦ
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào bắt ựầu thực hiện trong khoảng năm 1997 ở Phân Viện Khoa Học thành phố Hồ Chắ Minh Hiện nay, có rất nhiều phòng thắ nghiệm nuôi cấy mô ở các trường ựại học, các viện nghiên cứu, sở Khoa Học và Công Nghệ ở các tỉnh, thành phố đà lạt do có ựiều kiện khắ hậu ựặc biệt thuận lợi nên ựây là nơi có nhiều phòng thắ nghiệm ựược xây dựng ựể phục vụ cho lĩnh vực nuôi cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
b Thành phần môi trường dùng trong nuôi cấy mô
Nước
Nước là thành phần không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của
thực vật trong môi trường tự nhiên cũng như trong nuôi cấy in vitro
Phẩm chất nước là ựiều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trong nuôi cấy là nước cất một lần Trong một số trường hợp, cũng có thể sử dụng nước cất hai
lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn đức Lượng, 2002)
Trang 13và hữu cơ Ở dạng vô cơ chủ yếu là NO3- và NH4+ còn dạng hữu cơ là các amino acid
và các polyamine (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Lân (P)
Lân là nguyên tố không thể thiếu trong thành phần cấu tạo nên acid nhân, màng
tế bào, ATP, NADPH,…Lân ñược cung cấp cho cây chủ yếu dưới các dạng như
H2PO4-, HPO42-, PO43- (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Potassium (K)
Potassium là thành phần xúc tác của nhiều enzyme liên quan ñến quá trình tổng hợp carbohydrate, protein và cần thiết cho sự quang tổng hợp và hô hấp ở cây trồng là nguyên tố tham gia vào tiềm năng thẩm thấu và áp suất trương của tế bào Nếu thiếu Potassium thì các phản ứng trong cây bị ảnh hưởng, cây sẽ tích tụ nhiều NO3- nhưng khi ñó ñã trở nên vô ích, việc tích tụ nhiều NH4+ cũng xảy ra ñồng thời gây ñộc cho cây và cản trở quá trình tổng hợp amino acid Mô cây hấp thu (K) ở dạng K+ ( Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Magnessium (Mg)
Magnesium là thành phần cấu tạo của Chlorophyll và tham gia vào sự phân cắt tế bào Ngoài ra, Magnessium còn là thành phần của nhiều enzyme cần thiết cho quá trình biến dưỡng năng lượng trong sự tổng hợp ATP Cây hấp thu Magnessium ở dạng
Mg2+ (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Calcium (Ca)
Calcium là thành phần của vách tế bào, màng tế bào và hoạt tính của một số enzyme Calcium sẽ liên kết chặt chẽ với Pectin tạo thành Calcium pectate cần thiết cho sự vững chắc của vách tế bào và mô thực vật Mô hấp thu Calcium chủ yếu ở dạng
Ca2+ (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Lưu huỳnh (S)
Lưu huỳnh là thành phần của một số amino acid như Cystein, Methionin và vài vitamine khác Mô cây hấp thu lưu huỳnh ở dạng SO42- (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Sodium (Na)
Trang 14Sodium ñược hấp thu vào cây ở dạng ion Na+ tuy nhiên chức năng của nguyên tố này ñối với cây trồng thực sự vẫn chưa ñược biết rõ Theo các nhà khoa học cho rằng, Sodium có chức năng ổn ñịnh áp suất thẩm thấu trong cây (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Bo (B)
Vai trò của Bo trong cây cũng chưa thực sự ñược rõ Theo các nghiên cứu gần ñây thấy rằng Bo có liên quan ñến sự ñiều hòa hoạt ñộng của enzyme Phenolase, biến dưỡng acid Phenolic và sự tổng hợp Lignin Ngoài ra, Bo cần thiết cho sự phát triển và chuyên hóa mô, gia tăng sự ổn ñịnh của tế bào Thiếu Bo sẽ có những biến ñổi về các triệu chứng như chóp rễ không dãn dài ra một cách bình thường, kèm theo sự ức chế tổng hợp của DNA và RNA (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Mangan (Mn)
Mangan là một trong các nguyên tố vi lượng quan trọng trong môi trường nuôi cấy Mangan giữ vai trò quan trọng trong sự quang phân li nước của quá trình quang hợp ñồng thời cũng là thành phần hoạt hóa cho nhiều enzyme Mô hấp thu Mangan ở dạng Mn2+ (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Kẽm (Zn)
Kẽm có liên quan ñến các phản ứng tổng hợp của Indol acetic acid (IAA) và là
Trang 15thành phần hoạt hóa của nhiều enzyme quan trọng Kẽm cung cấp cho cây ở dạng Zn2+(Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Albuminium, Nickel (Al, Ni)
Vai trò của cả hai nguyên tố này vẫn chưa thực sự ñược biết rõ Người ta thấy rằng, Nickel là thành phần của Urease biến ñổi Urea sang Ammonium (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Carbon và nguồn năng lượng
Nguồn Carbon có vai trò quan trọng giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ giúp tế bào phân chia và tăng sinh khối ñược bổ sung vào môi trường dưới dạng ñường, thường gặp là Glucose và Sucrose (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Vitamine
Trang 16Vitamine ñược sử dụng như là coenzyme và ñược sử dụng một lượng rất nhỏ (mg/l)
Vitamine thường ñược sử dụng là Nicotinic acid, Pyridoxine (vitamine B6), Thiamine (vitamine B1), Myo - inositol, và cả vitamine C ñược sử dụng như là một chất chống oxi hóa Thiamine có chức năng như là một coenzyme trong biến dưỡng carbohydrate, Nicotinic acid sử dụng như là coenzyne trong biến dưỡng các chất Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD) hay Nicotinamide dinucleotide phosphate (NADH), Pyridoxine có chức năng trong phản ứng dị hóa amino acid, Myo - inositol
là một carbohydrate không phải vitamine, là thành phần của Phosphatidyl inostol và Phytic acid ñược các nghiên cứu chứng minh là có tác dụng hỗ trợ cho sự sinh trưởng của tế bào nên cũng ñược xếp vào nhóm như các vitamine (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Các chất hữu cơ không xác ñịnh
Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác vào môi trường nuôi cấy thường mang lại nhiều kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô Các chất bổ sung này là protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, dịch chuối quả, nước cam, nước cà chua…Tuy nhiên, ñược sử dụng rộng rãi hiện nay là nước dừa Cho ñến nay, chất có hoạt tính trong nước dừa là Myo - inositol và một số acid amin khác Lượng nước dừa dùng trong nuôi cấy mô là 15 – 29% thể tích môi trường Theo Nguyễn Thị Kim Huê (2005) việc bổ sung thêm các chất hữu cơ tự nhiên sẽ giúp làm
ổn ñịnh pH cho môi trường và góp phần gia tăng tốc ñộ sinh trưởng của một số ñối tượng cây trồng nhất ñịnh Ngoài ra, các amino acid và nguồn cung cấp Nitrogen khác cũng ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñể cung cấp cho cây, mặc dù tế bào thực vật có khả năng tự tổng hợp các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid này vào môi trường nuôi cấy là ñể kích thích sự tăng trưởng của tế bào Các nguồn Nitrogen khác ñược sử dụng ñể bổ sung vào môi trường nuôi cấy như Casein hydrolysate, L – glutamine, L – asparagine và adenie Tyrosine cũng ñược sử dụng ñể kích thích sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy tế bào (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Than hoạt tính
Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi và có tác dụng khử ñộc Than hoạt tính khi ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ có tác dụng kích
Trang 17thích sự tăng trưởng và biệt hóa của một số loài cây nhưng lại có tác dụng kìm hãm ñối với một số ñối tượng cây khác Nói chung, ảnh hưởng của than hoạt tính trên 3 mặt chủ yếu sau: hút các hợp chất cản, hút các chất ñiều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy, và làm tối môi trường (ñối với môi trường tạo rễ) Than hoạt tính có khả năng liên kết với nhiều chất ñiều hòa sinh trưởng và làm giảm hoạt tính của các chất này, nhưng lại có khả năng kết hợp với các chất phenol ñộc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy làm tăng khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào thực vật Do
ñó, việc sử dụng than hoạt tính phải thực sự phù hợp và cần thiết trên từng ñối tượng nuôi cấy cũng như môi trường nuôi cấy, không nên lạm dụng than hoạt tính một cách quá mức (Nguyễn ðức Lượng, 2002 )
Chất tạo gel
Chất tạo gel thường sử dụng trong nuôi cấy mô là Agar, một sản phẩm tự nhiên ñược trích từ tảo, có tác dụng tạo giá ñỡ cho mô cấy trong môi trường dinh dưỡng tránh sự chìm ngập khá lâu của mô trong quá trình nuôi cấy sẽ dẫn ñến những hư hỏng của mô làm cản trở ñến năng suất nuôi cấy Tuy nhiên, việc sử dụng Agar phải chú ý ñến các vấn ñề sau:
ðộ tinh khiết của Agar
Hàm hượng ẩm ñộ chứa trong Agar
Sự sinh trưởng của mẫu cấy trong môi trường có Agar
Nồng ñộ Agar ñược sử dụng sẽ ảnh hưởng ñến
• Thế năng nước trong môi trường nuôi cấy
• ðộ cứng của môi trường
• Sự sinh trưởng của mẫu cấy
• Các vấn ñề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước
• Sự hoạt ñộng của cytokinin trong môi trường có Agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Chất ñiều hòa sinh trưởng
• Nhóm auxin
Auxin tự nhiên
Trang 18Auxin tự nhiên ñược tìm thấy ở thực vật là Indole – 3 – acetic acid (IAA), hiện diện với nồng ñộ cao ở vùng phân sinh mô, có hiệu quả chính trong sự kích thích tạo
rễ, ñược ứng dụng nhiều trong vi nhân giống và tạo rễ của cành giâm (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Auxin tổng hợp
Thường sử dụng rộng rãi là Indole – 3 butyric acid (IBA) (hiện nay cũng ñược chứng minh là có mặt trong tự nhiên ở cây trồng), Alpha – naphthaleneacetic acid (NAA), 2,4 – dichlorophenoxyacetic (2,4 - D) (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
• Nhóm cytokinin
Cytokinin là adenin ñược thay thế N-6, kết hợp với auxin gây ra sự phân chia ở tế bào thực vật Cytokinin ñược cây tổng hợp ở rễ sau ñó vận chuyển lên chồi, ñóng vai trò chính trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô
Bảng 2: Tóm tắt vai trò của nhóm auxin và cytokinin lên sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy
Indol acetic acid (IAA)
Indol butyric acid (IBA)
1-Napthalene acetic acid (NAA)
Phenylacetic acid (PAA)
2,4 – Diclrophenoxy acetic acid (2,4 – D)
Dicamba
P- chloro phenoxy acetic (CPA)
Tạo rễ bất ñịnh ở nồng ñộ cao
Tạo chồi bất ñịnh ở nồng ñộ thấp
Kích thích phôi sinh trưởng
Phân chia tế bào
Thành lập mô sẹo và tăng trưởng
Ức chế sự phát triển của chồi nách
Phân chia tế bào
Thành lập mô sẹo và tăng trưởng
Kích thích mọc chồi nách
Ức chế sự vươn dài chồi
Ức chế sự lão hóa lá
Trang 19Sự tương tác giữa auxin và cytokinin theo những tỉ lệ khác nhau sẽ cho ra những kết quả khác nhau Một tỉ lệ cao auxin và thấp cytokinin thích hợp cho sự tạo rễ và ngược lại tỉ lệ thấp auxin và cao cytokinin thích hợp cho sự tạo chồi, mức ñộ trung gian giữa hai tỉ lệ này thích hợp cho sự tạo callus (Nguyễn Bảo Toàn, 2004; Phillips và Chilton, 1991)
Kéo dài chồi
Khử miên trạng hạt, phôi sinh dưỡng, chồi ngọn và thân củ
Ức chế sự thành lập rễ bất ñịnh
Kích thích sự tạo thân củ, rễ củ, gốc củ Thúc ñẩy sự thích nghi
• Abscisis acid (ABA)
ABA có tác dụng ngăn cản mạnh mẽ sự sinh trưởng ở cây, làm trưởng thành phôi sinh dưỡng, tạo thân củ và rễ củ, kích thích sự phát triển miên trạng, tác dụng tương tác với các chất kích thích tăng trưởng khác, ñược sử dụng rộng rãi trong sự tạo phôi
vô tính và biến ñổi phôi thành cây con ABA ñược tổng hợp từ Mevalonic acid ñóng vai trò chính liên hệ với nước trong cây, sự lão hóa và phát triển của phôi thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
• Ethylene
Là một chất khí, là một hormone bay hơi Ethylene làm tăng nhanh sự lão hóa của mô và kích thích ñôi khi là ức chế sự tái sinh của mô Hoạt tính của Ethylene có thể bị cố ñịnh bởi Ag+ ở nhiều dạng khác nhau (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
c Khử trùng bề mặt mẫu cấy
Khử trùng bề mặt mẫu cấy là một giai ñoạn cực kì quan trọng trong nuôi cấy mô, ảnh hưởng trực tiếp ñến hiệu quả nuôi cấy, thường sử dụng với các chất diệt mầm
Trang 20bệnh, nhưng phải thỏa các ñiều kiện phải là các sản phẩm rẻ tiền, không ñộc với mẫu cấy cũng như ñối với người thao tác nhưng cho hiệu quả loại trừ các vi sinh vật trong phạm vi rộng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Hóa chất sử dụng cho việc vô trùng bề mặt mẫu cấy có nhiều loại
• Dung dịch hypochloride
Ion hypochloride có trong Sodium hypochloride (NaOCl) hoặc Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] Tác dụng diệt khuẩn của hypochloride là cả hypochlorous acid (HOCl) và ion OCl- Người ta cho rằng HOCl có tác dụng diệt khuẩn mạnh hơn OCl- do hiệu quả tiệt trùng của HOCl tốt hơn ở dung dịch có tính acid nhẹ vì thế dung dịch hypochloride nên sử dụng ở pH từ 6 – 7 Sodium hypochloride hoạt ñộng trên cơ
sở ion Cl- và các phản ứng oxy hóa khác
Sodium hypochloride hòa tan trong nước, thường có trong các sản phẩm tẩy rửa như Javel và Clorox chiếm khoảng 5 – 20% thể tích Thông thường dung dịch Javel và Clorox chứa khoảng 5.25% nồng ñộ các hoạt chất khử trùng, và ñược pha loãng trong nước từ 5 – 25%, ñối với Javel thương mại con số này là từ 10 – 20% (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
• Cồn
Trong số các loại cồn ñược sử dụng ñể khử trùng thì Ethanol ñược sử dụng nhiều nhất Ethanol có tác dụng diệt khuẩn do có khả năng làm biến tính protein, trong khi cồn 95% có khả năng hòa tan các chất sáp ở bề mặt mô cấy Ngoài ra, cồn 70% còn có tác dụng làm tăng diện tích tiếp xúc của chất khử trùng trong quá trình khử trùng mẫu Ethanol có thể dùng ñể ngâm mẫu trước hoặc sau khi xử lý với Hypochloride, thời gian xử lý này là từ 1 -5 phút, Methanol tỏ ra kém hiệu quả, còn Isopropanol cũng khá hiệu quả nhưng thời gian khử trùng tương ñối ngắn (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
• Ion kim loại nặng
Chất khử trùng thông dụng là Mercuric Chloride (HgCl2) với nồng ñọ từ 0.1 – 1% trong 30 – 60 phút Hóa chất này rất ñộc ñối với thực vật, ñộng vật, con người và môi trường nên phải hết sức cẩn thận khi sử dụng và xử lý chất thải sau khi dùng HgCl2 hoạt ñộng trên cơ sở ion Cl- và kim loại nặng ñể làm biến tính protein (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
• Chất kháng sinh
Trang 21Một số kháng sinh thường ñược sử dụng (Peniciline G, Streptomycin, Tetramycine,…) ñể hỗ trợ thêm cùng với Ethanol và các chất tẩy rửa Nếu mô cấy bị nhiễm bệnh thì sau khi khử trùng bề mặt nên ngâm trong kháng sinh với nồng ñộ 40 – 50mg/l trong 30 – 60 phút (Bùi Bá Bổng, 1995) hoặc với nồng ñộ 50 – 100mg/l trong thời gian 30 phút (Dương Công Kiên, 2006)
• Các chất khử trùng khác
Hai chất oxy hóa mạnh ñó là Hydrogen peroxide (H2O2) và Potassium penmanganate (KMnO4) cũng cho hiệu quả cao trong việc khử trùng bề mặt H2O2thường ñược dùng ở nồng ñộ 10 – 12% trong 5 – 15 phút Các chất này thường ñược dùng kết hợp trước hoặc sau khi khử trùng với chất khử trùng khác (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Sodium dichloroiso cyanuriate (Dichloroiso cyanuric acid sodium salt – NADCC): NADCC ít ñộc với mô thực vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vô trùng sau khi xử lý mẫu với hóa chất này (Dương Công Kiên, 2006)
2.4.3 Phương pháp vi nhân giống – một trong những ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào, những ưu ñiểm và khuyết ñiểm của phương pháp này
a Phương pháp vi nhân giống
Tế bào thực vật có chức năng sinh lý ñặc biệt ñó là tính toàn năng, có nghĩa là từ một tế bào ñã chuyên hóa (tế bào rễ, thân, lá,…) có thể phản biệt hóa ñể trở thành tế
bào gốc và có thể phân chia không giới hạn trong môi trường nuôi cấy in vitro có sự
hiện diện của các chất ñiều hòa sinh trưởng ở nồng ñộ và tỉ lệ nhất ñịnh Các tế bào sau ñó có thể chuyển hóa trực tiếp thành cây hoặc phát triển thành phôi vô tính rồi phân chia và chuyên hóa ñể phát triển thành cây hoàn chỉnh ðối với một cây nguyên vẹn, một sinh vật ña bào có nguồn gốc từ tế bào duy nhất là hợp tử, khi ñó hợp tử sẽ chuyên hóa, biệt hóa thành các tế bào có hình dạng và chức năng khác nhau trong các
mô và cơ quan khác nhau Trong trường hợp này, tính toàn năng của tế bào không biểu hiện ñược do tác ñộng của các tế bào khác, nếu các ảnh hưởng ñó bị vô hiệu hóa thì tế bào sẽ hoạt ñộng như là một tế bào non trẻ (Nguyễn Thiện Tịch, 2006)
Vi nhân giống là việc nhân ñúng kiểu cây (true – to – type) của một kiểu gen ñược tuyển chọn bằng cách sử dụng kĩ thuật in vitro Vi nhân giống ñược bắt ñầu bằng cách tách ñỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây, sau ñó khử trùng và ñưa vào môi
Trang 22trường thích hợp Các chồi mới phát sinh sẽ ñược tách ra và chuyển sang môi trường mới thích hợp và qui trình cứ thế ñược lập lại Ngoài ra, vi nhân giống cũng có thể ñược thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây qua mô sẹo, phương pháp này
sẽ cho ra số lượng cây giống ñồng nhất trong một khoảng thời gian ngắn (Nguyễn ðức Thành, 2000) Tuy nhiên, khi cấy chuyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồi ngang có thể chuyển sang tạo các chồi bất ñịnh gây ra các biến dị soma cho cây con không ñồng nhất (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004) các giai ñoạn của quá trình vi nhân giống bao gồm:
• Giai ñoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ
• Giai ñoạn 1: Bắt ñầu tiệt trùng
• Giai ñoạn 2: Nhân
• Giai ñoạn 3a: Kéo dài
• Giai ñoạn 3b: Tạo rễ và thuần dưỡng
• Giai ñoạn 4: Thuần dưỡng
b Ưu ñiểm
Nhân giống theo phương pháp in vitro giúp giảm chi phí cây giống Kỹ thuật vi nhân giống ñảm bảo cho cả hai mục ñích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý
Cùng với lợi ích cụ thể về kinh tế, kỹ thuật sản xuất giống in vitro còn là kỹ thuật
ưu việt trong việc tạo ra cây giống sạch bệnh ñặc biệt là ñối với các virus gây bệnh, có sức kháng bệnh rất cao, có thể sản xuất cây giống rất nhanh với quy mô lớn một cách
dễ dàng rút ngắn thời gian lai tạo giống thay vì dùng phương pháp cổ truyền, chủ ñộng
về sản xuất cây giống, sản xuất cây giống ñảm bảo chất lượng cao, giảm nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu ñược lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống
trong-nhan-giong-cac-loai-rau-hoa-cu/newsitem_view?b_start:int=120&-C
http://www.khuyennongvn.gov.vn/e-khcn/uu-111iem-cua-phuong-phap-invitro-(Ngày 25/05/2010)
Trang 23c Nhược ñiểm
Tuy nhiên, bên cạnh những hiệu quả mà phương pháp vi nhân giống mang lại, vẫn còn những khuyết ñiểm sau: Hệ thống vi nhân giống thường tiến hành trên môi trường thạch có tỷ lệ nhiễm cao, môi trường nuôi cấy bão hoà hơi nước nên làm cho cây bị các hiện tượng trương nước, bị thủy tinh thể dẫn ñến nhanh chóng bị mất nước khi ñưa ra ngoài ñiều kiện có ñộ ẩm thấp hơn như ở ngoài vườn ươm làm cho cây khô
và chết rất nhanh Ngoài ra trên môi trường thạch thường hạn chế hệ số nhân chồi của cây Cùng với tỷ lệ nhiễm cao, tỷ lệ sống sót thấp ngoài vườn ươm, chi phí cho môi trường thạch, nhân công cao ñã làm cho giá thành sản xuất lên cao
d Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và mô phân sinh vùng ñỉnh sinh trưởng
Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là một trong những ứng dụng của phương pháp vi nhân giống Mô phân sinh ñỉnh chứa những tế bào sinh trưởng và ñược bao bọc một lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin giúp hạn chế thấp nhất sự mất nước ñồng thời lớp cutin này cũng bao bọc cả chồi ñỉnh
Ở thực vật, sự hình thành các cơ quan bắt ñầu trong các mô phân sinh ñỉnh, các
mô này phân hóa ngay từ những giai ñoạn phát triển ñầu của phôi và ñược giữ lại trong suốt ñời sống của cây Nguyên nhân là do mô phân sinh ñỉnh có chứa các tế bào khởi sinh Sự sinh trưởng của ñỉnh sinh trưởng ñược chia làm 3 giai ñoạn: khởi sinh, kéo dài, và kết thúc sự phân hóa tế bào Trước hết, các u lồi dần dần ñược tạo thành và ñược gọi là các u lá Thể tích của các u tăng rất nhanh và kéo theo nó là phần lớn của ñỉnh sinh trưởng Sau ñó, các u lồi dần chuyển thành các phát lá Sự sinh trưởng diễn
ra không ñều nên các phát lá tự cong lên phía ñỉnh Sau khi lá tách ra sẽ lập lại sự phân
Trang 24chia tế bào Kết quả thể tích của ñỉnh sinh trưởng ñược khôi phục Ở mỗi nách lá (cây hai lá mầm), bẹ lá (cây một lá mầm) ñều có chồi bên tiềm ẩn và có cấu tạo không khác
gì ñỉnh sinh trưởng (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993)
Theo các nghiên cứu, ñỉnh sinh trưởng là nơi có vận tốc phân chia tế bào nhanh hơn vận tốc xâm nhiễm của virus, quá trình sinh tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong tế bào ñỉnh sinh trưởng Vì vậy, mô ñỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus trong một cây bị nhiễm virus Do ñặc tính về sinh lý của ñỉnh sinh trưởng là hoàn toàn sạch virus mà phương pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng ñang ngày ñược phát triển giúp tạo ra các cây sạch ñược virus (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Thành phần môi trường ñể nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng tương ñối ñơn giản vì ñỉnh sinh trưởng chỉ hấp thu rất ít chất dinh dưỡng ñể tăng trưởng Thông thường, ñỉnh sinh trưởng ñược nuôi cấy cấy trên môi trường ñặc (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Tuy nhiên, do kích thước của ñỉnh sinh trưởng khá bé vì vậy mà các thao tác cấy ñỉnh sinh trưởng ñều phải ñược tiến hành dưới kính nhìn nổi
Mô phân sinh ñỉnh sinh trưởng có chứa phần ñỉnh sinh trưởng là nơi có tốc ñộ phân chia tế bào mạnh, và vô số các chồi tiềm ẩn vùng lân cận của ñỉnh sinh trưởng cũng có cấu trúc tương tự ñỉnh sinh trưởng làm tăng khả năng cho hiệu quả tái sinh chồi trên môi trường thích hợp Tuy nhiên, ñiều thuận lợi là vùng này có kích thước vừa phải có thể nhìn thấy bằng mắt thường, vì vậy khá dễ dàng trong quá trình thao tác với mẫu cấy (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
2.5 Nhân chồi – bước ngoặt của quá trình vi nhân giống
Như ñã trình bày ở trên, vi nhân giống trải qua 4 giai ñoạn Trong ñó, giai ñoạn nhân là giai ñoạn kích thích các trung tâm mô phân sinh như ñỉnh sinh trưởng, chồi chính, chồi bên Ở giai ñoạn này, việc gia tăng số chồi phụ thuộc vào việc sử dụng cytokinin Tuy nhiên, việc quá lạm dụng cytokinin cũng gây ra một số vấn ñề như: sự thừa nước, tạo thành bụi rậm, biến dị vô tính, các vấn ñề về rễ…(Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Do tác dụng chủ yếu trong giai ñoạn 2 này là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất có thể có, vì vậy giai ñoạn này ñược xem là giai ñoạn mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho cả quá trình vi nhân giống ñây là ñiểm khác biệt rất có ý nghĩa so với các phương
Trang 25pháp nhân giống khác Chính vì thế mà giai ñoạn này ñược xem là bước ngoặt của quá trình vi nhân giống (Nguyễn ðức Lượng, 2002)
Trang 26CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1.Thời gian và ñịa ñiểm thí nghiệm
Thời gian thực hiện thí nghiệm: 12/2010 – 05/2011
ðịa ñiểm: Phòng công nghệ gen thực vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ sinh Học, trường ñại học Cần Thơ
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị
Thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, nồi khử trùng autoclave, cân phân tích, pH
kế, máy khuấy từ, máy cất nước, tủ lạnh,…
Dụng cụ: Bình tam giác 250ml và 100ml, ống ñong, ca nhựa, micropipet, dao cấy, kẹp cấy, ñèn cồn, cốc thủy tinh,…
3.1.3 Nguyên vật liệu thí nghiệm
Chồi chuối ñược thu có tuổi khoảng 4 - 6 tháng Mô cấy là phần mô phân sinh ñỉnh của củ chuối, kích thước mô cấy ñược chia làm 2 dạng:
• Dạng 1: Cấy nguyên phần chồi ñỉnh có chứa một phần thân
• Dạng 2: Cắt nhỏ ra thành từng mảnh ở vùng ñỉnh sinh trưởng với kích thước từ
3.1.5 ðiều kiện thí nghiệm
Nhiệt ñộ tiến hành thí nghiệm là 28o ± 2oC, mẫu cấy ñược nuôi trong ñiều kiện ánh sáng phòng thí nghiệm với cường ñộ chiếu sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày
3.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy in vitro ñược sử dụng chính là nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng, với vị trí mẫu cấy là vùng phân sinh ñỉnh Do ñó, nguồn nguyên liệu ban ñầu thích hợp nhất ñược chọn là các chồi chuối con Chồi chuối sử dụng cho việc nuôi cấy là những
Trang 27chồi con khỏe mạnh ở ñộ tuổi từ 4 – 6 tháng tuổi Mẫu cấy sau khi ñược khử trùng ñược chia làm 2 dạng: dạng 1 cấy nguyên phần chồi ñỉnh có chứa một phần thân và dạng 2 là các mẫu cấy ñược cắt nhỏ thành từng mảnh từ ñỉnh sinh trưởng và vùng xung quanh ñỉnh sinh trưởng
Chất khử trùng chủ yếu ñược sử dụng cho việc vô trùng mẫu cấy là Javel thương mại + Tween 20% Các bước vô trùng mẫu cấy ñược thực hiện theo qui trình như sau: Chồi chuối con từ 4 – 6 tháng tuổi
Rửa sạch dưới vòi nước chảy (10 phút)
Cắt bỏ phần rễ và các bẹ lá già
Ngâm trong xà phòng (15 phút)
Rửa sạch lại dưới vòi nước chảy (15 phút)
Lau khô mẫu bằng gòn
Ngâm trong cồn 70o (5 phút)
Ngâm trong Javel, Tween 20 (thời gian tùy thuộc
vào từng nghiệm thức thí nghiệm)
Rửa lại bằng nước cất vô trùng khoảng 5 lần
Cắt lấy phần ñỉnh sinh trưởng
Cấy vào môi trường nuôi cấy
Hình 2: Qui trình khử trùng mẫu cấy chuối Tiêu Hồng
Tiến hành các bước vô trùng mẫu cấy theo quy trình trên ở các mức thời gian và nồng ñộ Javel khác nhau ñể tìm ra nghiệm thức khử trùng cho hiệu quả tối ưu trong việc vô trùng mẫu cấy Sau khi ñã chọn ñược nghiệm thức khử trùng phù hợp nhất về thời gian và nồng ñộ chất khử trùng, nghiệm thức này sẽ ñược áp dụng ñể tiến hành cho giai ñoạn tiếp theo là giai ñoạn vô mẫu tạo nguồn mẫu cấy vô trùng ñể bố trí cho các nghiệm thức nhân chồi kế tiếp
Ở giai ñoạn vô mẫu, các mẫu cấy sau khi ñã vô trùng sẽ ñược nuôi trên môi trường B50.5D, sau 15 ngày trên các mẫu cấy sẽ bắt ñầu xuất hiện các chồi nhỏ li ti ở
