Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn 2011

MỤC LỤCLỜI CẢM ƠNiMỤC LỤCiiDANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTivDANH MỤC BẢNGvDANH MỤC HÌNHviTÓM TẮTviiPHẦN I. MỞ ĐẦU11.1. Đặt vấn đề11.2. Mục tiêu của đề tài11.2.1. Mục tiêu chung11.2.2. Mục tiêu cụ thể1PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU22.1. Giới thiệu chung về cellulose và cellulase22.1.1. Giới thiệu về cellulose22.2.2. Giới thiệu về cellulase22.2. Vi sinh vật sản xuất cellulase52.3. Các ứng dụng của cellulase82.3.1. Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may82.3.2. Công nghiệp giấy và bột giấy82.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm92.3.4. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi92.3.5. Nhiên liệu sinh học102.3.6. Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh112.4. Tình hình nghiên cứu122.4.1. Nghiên cứu trong nước122.4.2. Nghiên cứu trên thế giới13PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP143.1. Vật liệu143.1.1. Đối tượng143.1.2. Thiết bị143.1.1. Hóa chất153.2. Môi trường163.3. Các phương pháp nghiên cứu173.3.1. Phân lập vi khuẩn từ dịch nước thải nhà máy giấy173.3.2. Đánh giá đặc điểm hình thái173.3.3. Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ183.3.4. Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Miller183.3.5. Thu nhận enzyme203.3.6. Điện di SDS - PAGE21PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN234.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn nước thải234.2. Đặc điểm sinh học của chủng PK 4 – 9264.3. Hoạt độ enzyme cellulase274.4. Kết quả điện di SDS – PAGE28PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ305.1. Kết luận305.2. Đề nghị30TÀI LIỆU THAM KHẢO31Tài liệu tiếng Việt31Tài liệu tiếng Anh32

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 

 -BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

“Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở

một vài chủng vi khuẩn”

HÀ NỘI – 2011

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

TÓM TẮT vii

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.2.1 Mục tiêu chung 1

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu chung về cellulose và cellulase 2

2.1.1 Giới thiệu về cellulose 2

2.2.2 Giới thiệu về cellulase 2

2.2 Vi sinh vật sản xuất cellulase 5

2.3 Các ứng dụng của cellulase 8

2.3.1 Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may 8

2.3.2 Công nghiệp giấy và bột giấy 8

2.3.3 Trong công nghiệp thực phẩm 9

2.3.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 9

2.3.5 Nhiên liệu sinh học 10

2.3.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 11

2.4 Tình hình nghiên cứu 12

2.4.1 Nghiên cứu trong nước 12

2.4.2 Nghiên cứu trên thế giới 13

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

3.1 Vật liệu 14

3.1.1 Đối tượng 14

3.1.2 Thiết bị 14

3.1.1 Hóa chất 15

3.2 Môi trường 16

3.3 Các phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Phân lập vi khuẩn từ dịch nước thải nhà máy giấy 17

3.3.2 Đánh giá đặc điểm hình thái 17

3.3.3 Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ 18

3.3.4 Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Miller 18

3.3.5 Thu nhận enzyme 20

3.3.6 Điện di SDS - PAGE 21

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Phân lập vi khuẩn từ nguồn nước thải 23

4.2 Đặc điểm sinh học của chủng PK 4 – 9 26

4.3 Hoạt độ enzyme cellulase 27

4.4 Kết quả điện di SDS – PAGE 28

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

Tài liệu tiếng Việt 31

Tài liệu tiếng Anh 32

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose 7

Bảng 3.1 Tên thiết bị dùng trong đề tài 14

Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng trong đề tài 15

Bảng 3.3 Thành phần môi trường 16

Bảng 3.4 Xây dựng đồ thị chuẩn 19

Bảng 3.5 Thành phần gel điện di SDS - PAGE 22

Bảng 4.1 Lượng đường khử sinh ra theo thời gian 24

Bảng 4.2 Hoạt tính cellulose ngoại bào của 8 chủng nghiên cứu 25

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Một số hình ảnh về cấu trúc của cellulase 2

Hình 2.2 Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T fusca, (PDB 1JS4) 4

Hình 2.3 Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase 5

Hình 3.1 Thu nhận enzyme 21

Hình 4.1 Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch nuôi cấy 23

Hình 4.2 Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian 24

Hình 4.3 Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu 26

Hình 4.4 Hình ảnh chủng vi khuẩn PK 4 – 9 27

Hình 4.5 Đồ thị chuẩn glucose 28

Hình 4.6 Hoạt tính cellulase 28

Hình 4.7 Kết quả điện di SDS – PAGE 29

TÓM TẮT

Từ nguồn nước thải nhà máy giấy Phong Khê, Bắc Ninh 8 chủng vi khuẩn cókhả năng phân hủy cellulose đã được phân lập Hầu hết các chủng đều phát triển tốttrên môi trường chọn lọc có agar Khả năng sản xuất cellulase ngoại bào của các chủng

vi khuẩn được kiểm tra bằng khuếch tán đĩa thạch và nhuộm Congo đỏ Hoạt độcellulase được xác định bằng phương pháp đường khử Trong số 8 chủng phân lập,chúng tôi đã chọn được 1 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulase hiệu quảnhất (chủng PK 4 – 9) Kiểm tra hoạt độ bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch thuđược đường kính vòng sáng có kích thước 7mm Hoạt độ cellulase ngoại bào thu đượcđạt 792,5218 U/ml dịch nuôi

Enzyme ngoại bào thu được bằng cách kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy bằngethanol (80%) Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, enzyme cellulase ngoại bào củachủng vi khuẩn này có kích thước khoảng 32 kDa

Từ khóa: Nước thải nhà máy giấy, vi khuẩn phân hủy cellulose, hoạt tính

cellulase

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Hằng năm có khoảng 230 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo ra từ quá trình quang hợp

ở thực vật, trong đó có khoảng 70 tỉ tấn (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất nôngnghiệp, chất thải các nhà máy giấy, đường và dệt may Cellulose không tan trongnước và chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với kiềm hay acid hoặc bị thủy phân bởi cácenzyme cellulase (Trần Xuân Nghạch, 2005) Hiện nay, lượng phế, phụ phẩm nôngnghiệp cũng như chất thải từ các nhà máy đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môitrường

Để giải quyết vấn đề trên, việc phân lập được các chủng vi sinh vật có hoạt tínhphân huỷ cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm vi sinh

vật để xử lý ô nhiễm môi trường Từ yêu cầu đó, đề tài nghiên cứu“Phân lập và khảo

sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn” đã

được tiến hành nhằm tạo nguồn vi sinh vật ban đầu cho các nghiên cứu ứng dụng saunày

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu chung

Phân lập và sàng lọc một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme celulasengoại bào cao, trong đó tập trung vào đối tượng vi khuẩn

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào

- Mô tả đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn đã phân lập được

- Đánh giá được khả năng sản xuất enzyme ngoại bào bằng các kỹ thuật hóa sinh

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cellulose và cellulase

2.1.1 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên Hằng năm mộtlượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012 tấn) được tạo thành chủ yếu từ quá trìnhquang hợp (Klemm D và cộng sự, 2002)

Cellulose được cấu tạo từ các gốc β-D glucopyranose được liên kết với nhaubằng liên kết 1,4 glucoside Có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]ntrong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nênvách tế bào thực vật (Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến, 2007) Trong gỗ lá kim,cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích

Hình 2.1 Một số hình ảnh về cấu trúc của cellulase

1 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose

2 Hình ảnh ba chiều hợp chất cao phân tử Cellulose: Màu nâu - carbon, màu đỏ -oxy,màu trắng – hydro

2.2.2 Giới thiệu về cellulase

Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiềuenzyme khác nhau Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D – glucoside) tạo

ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides

Có 3 loại enzyme cellulose chính:

- Cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC 3.2.1.91):Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Khối lượng

không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa

lý của chúng

- Endo-β-1,4-cellulase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, EC3.2.14) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa Chúng hoạt động ở nhiệt độkhá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin vàβ-D-glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose

- β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4– 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ởnhiệt độ cao β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose (NguyễnĐức Lượng, 2004)

Enzyme thủy phân cellulose có thể được tách thành nhiều thành phần, chẳnghạn như enzyme cellulase của vi sinh vật có thể bao gồm một hoặc nhiều CBH, mộthoặc nhiều EG và có thể có β-glucosidase Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm CBHcelulase, EG và BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose Các enzyme exo-cellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành cácđoạn ngắn oligosaccharides Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó đượcthủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase (Bguin P và Henrissat B, 1994)

Celulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên,trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một

số loại nấm men Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinhenzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme

Cellulase được sử dụng trong công nghiệp dệt (Gusakov AV và cộng sự, 2000;Belghith H và cộng sự, 2001), trong chất tẩy rửa (Maurer KH, 1997; Kottwitz B vàSchambil F, 2005), ngành công nghiệp giấy (Buchert J và cộng sự, 1996), cải thiệnthức ăn chăn nuôi (Lewis GE và cộng sự, 1996), trong công nghiệp thực phẩm các

enzyme này chiếm một phần đáng kể của thị trường (Galante YM và cộng sự, 1998).Sản xuất ethanol sinh học từ cellulose, hemicellulose và lignin (lignocellulosic) sẽ giảiquyết được mối quan tâm về tình trạng thiếu nhiên liệu hóa thạch, cũng như ô nhiễmkhông khí do đốt các nguyên liệu hóa thạch Đặc biệt là sử dụng cellulase vàhemicellulase để thủy phân lignocellulosic (Himmel ME và cộng sự, 1999; Zaldivar J

và cộng sự, 2001) Tuy nhiên việc sản xuất ethanol cũng cần chú ý đến hiệu quả kinh

tế (Sheehan J và Himmel M, 1999)

Sản xuất cellulase thương mại đã được thử nghiệm bằng cách nuôi cấy cùng lúc trênmôi trường rắn hoặc nuôi cấy chìm và nuôi cấy liên tục Môi trường được sử dụng trong nuôicấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác nhau (Person I vàcộng sự, 1991; Domingues FC và cộng sự, 2000), hoặc lignocellulosic (Doppelbauer R vàcộng sự,1987; Reczey K và cộng sự, 1996), đặc biệt trong lên men chất rắn

Hình 2.2 Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T fusca, (PDB

1JS4)

Hình 2.3 Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase

1 Cắt đứt sự tương tác không cộng hóa trị trong cấu trúc tinh thể của cellulose(endocellulase) 2 Thủy phân của các sợi cellulose riêng rẽ để tạo thành các cấu trúc nhỏ hơn(exocellulase) 3 Thủy phân của disaccharides và tetrasaccharides thành glucose (beta-glucosidase)

2.2 Vi sinh vật sản xuất cellulase

Vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose chủ yếu là phân giải carbohydratethường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng(Lynd LR và cộng sự, 2002) Trong số các vi sinh vật phân giải cellulose đáng chú ýnhất là vi khuẩn Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn) Hầu hết các loại nấm có thể sửdụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose (Poulsen OM & Petersen LW, 1988;Rajoka MI & Malik KA, 1997), trong khi ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có

sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose (Ng TK, & Zeikus JG, 1982; Thurston B

và cộng sự, 1993) Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loạinấm, đặc điểm này được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn

Nấm Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại bào

(Kumar R và cộng sự, 2008) Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulosetập trung vào các loài nấm (Trichoderma, Humicola, Penicilium, Aspergillus,Actinomucor), vi khuẩn Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes vàStreptomyces) (Bảng 2.1)

Trong một số loại nấm sử dụng cellulose làm nguồn carbon, chỉ có một vàichủng có khả năng tiết ra phức hơp các enzyme cellulose có thể ứng dụng trong thực tế

để thuỷ phân cellulose Bên cạnh T reesei, một số loài nấm khác như Penicillium,

Humicola và Aspergillus có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào cao (Hayashida S

và cộng sự, 1988; Ong LG và cộng sự, 2004)

Bảng 2.1 Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose

thạch hiện nay người ta đang quan tâm đến việc khai thác các nguồn sinh khối chứalignocellulose bằng sử dụng cellulase và các enzyme khác.

2.3.1 Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may

Cellulase, đặc biệt là EG III và CBH I, thường được bổ sung trong các chất tẩy

rửa, giũ hồ vải trong công nghiệp dệt may Biến thể của EG III, đặc biệt từ T reesei rất

thích hợp cho việc sử dụng trong chất tẩy rửa (Nielsen JB, 1994; Clarkson KA vàcộng sự, 2000) Cellulase có nguồn gốc từ Humicola có khả năng hoạt động dưới điềukiện kiềm nhẹ, nhiệt độ cao do đó thường được bổ sung vào bột giặt (Mitchinson C &Wendt DJ, 2001) và chất tẩy rửa (Uhlig H, 1998)

2.3.2 Công nghiệp giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền

cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau chuyển thành bột giấychứa các sợi và bột mịn Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy,còn cellulose thì được giữ lại Phương pháp thông thường là bổ sung dung dịch chlorhoặc chlor diocide Đây là một phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môitrường do thành phần chlor tồn dư trong nước thải Vì thế, trong những năm gần đâygiải pháp mới được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống là sử dụng các chếphẩm enzyme trong đó có cellulase để xử lý bột giấy

Cellulase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổinhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% nănglượng cho quá trình nghiền cơ học Đồng thời việc xử lý cellulase trước khi xử lý hóachất nghiền bột hóa học sẽ phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, tăng khả năng khuếch tán củahóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004 và

Hồ Sỹ Tráng, 2006) Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, cellulase được sử dụng đểtẩy mực in bám trên giấy Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngànhcông nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh (Howard RL và cộng sự, 2003)

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng trong quá trình chiết vàlọc các loại nước ép trái cây, sản xuất mật hoa và súp đặc và trong chế biến dầu oliu(Galante YM và cộng sự, 1998) Trong công nghệ sản xuất bia, cellulase được bổ sungnhằm cải thiện sự tạo mạch nha của lúa mạch (Barbesgaard PO và cộng sự, 1984).Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, màu sắc rượu tạo đạt nhờ sử dụng enzymengoại bào hemicellulase và cellulase (Galante YM và cộng sự, 1998) Cellulase cònđược sử dụng khai thác carotenoid trong sản xuất chất màu thực phẩm (Pajunen E,1986).

2.3.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc thườngchứa nhiều cellulose và glucan Những thành phần này thường không được tiêu hóatriệt để và làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu cácchất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật Bổ sung cellulasevào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóngglucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyểnhóa thức ăn (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2000)

Omogbenigun và cộng sự (2004) cho thấy, khi xử lý thức ăn cho lợn con 25ngày tuổi bằng cách bổ sung tổ hợp chế phẩm cellulase và một số enzyme khác(amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) đã nâng cao khả năng tiêu hóa

so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme cụ thể như sau: khả năngtiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytatetăng 59-70% (Omogbenigun OF và cộng sự, 2004)

Tiềm năng ứng dụng to lớn của các enzyme thuộc nhóm cellulase trong chănnuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, giacầm Một số chế phẩm như SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trường Việt Nam là tổhợp của 6 loại enzyme: β-cellulase (200 BGU/g), phytase (1000 PU/g), α-amylase(30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g), protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn , 2006)

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chănnuôi Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủngnấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất xơ làm thức ăn cho gia súc(Chu Thị Thanh Bình và cộng sự, 2002)

2.3.5 Nhiên liệu sinh học

Nghiên cứu sử dụng các chất thải có chứa lignocellulose để sản xuất nhiên liệusinh học đang được quan tâm Các phế liệu có chứa lignocellulose là nguồn nguyênliệu phong phú nhưng lại bị giới hạn do thiếu các yếu tố cần thiết như enzyme thủyphân cellulose và các quy trình công nghệ Một ứng dụng tiềm năng khác của cellulase

là việc chuyển đổi nguyên liệu cellulose thành glucose và các đường lên menkhác.Mặc dù các vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase có khả năng chuyển đổi sinhkhối tạo thành rượu đã được nghiên cứu (Martin JW, 1978; Kundu S và cộng sự, 1983)tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào thể hiện được hiệu quả khả thi về mặt kinh tế Chiếnlược sử dụng hiện tại trong sản xuất ethanol sinh học từ nguồn lignocellulosic một quátrình gồm nhiều bước nhằm loại bỏ phần dư lượng lignin và hemicellulase, xử lýcellulase ở 500C thuỷ phân các dư lượng cellulose để tạo ra đường lên men, và cuốicùng sử dụng lên men vi sinh vật để tạo ra cồn (Sudha Rani K và cộng sự, 1997) Việc

sử dụng các enzyme tinh khiết trong chuyển đổi sinh khối thành ethanol hoặc lên mencác sản phẩm hiện nay chưa đạt hiệu quả kinh tế do chi phí của các enzyme cellulasethương mại cao, chiến lược hiệu quả vấn đang tiếp tục được nghiên cứu

Ngoài những ứng dụng phổ biến, cellulase còn được sử dụng trong các côngthức để loại bỏ chất nhờn công nghiệp (Van Zessen E và cộng sự, 2003), nghiên cứutạo ra các thế hệ (Wiatr CL, 1990), tạo thể kháng khuẩn chitooligosaccharide có thểđược sử dụng trong bảo quản thực phẩm (Liu W & Zhu WM, 2000), tạo thuốc chống ubướu (Wu GJ & Tsai GJ, 2004)

2.3.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh

mục đích khác chẳng hạn như glucose, ethanol (bổ sung tài liệu tham khảo) Trongnhững năm gần đây, các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme phânhủy cellulose đã được ứng dụng để để xử lý rác thải sinh hoạt (bổ sung tài liệu thamkhảo)

Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn đượcmột số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rácthải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày Nhiều chủng vikhuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình

xử lý rác thải ở Việt Nam (Nguyễn Lan Hương và cộng sự, 1999)

Nhiều chế phẩm vi sinh chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đãđược nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải Chẳng hạn chế phẩm Micromix 3khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửathời gian lên men so với đối chứng Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rácbằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% sovới đối chứng Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sungthêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sửdụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảmthiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường (Lý Kim Bảng và cộng sự,1999)

Ngoài ra, những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm gây bệnhcây trồng như cellulase của Trichoderma harzianum đã được áp dụng để sản xuấtthuốc bảo vệ thực vật sinh học (Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng, 2003)

2.4 Tình hình nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiệnlên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulasecủa một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điềukiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rácthải chứa nhiều cellulose Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khảnăng chịu được nhiệt độ 80oC, nhiệt độ lên men tối ưu từ 45oC đến 55oC, pH môitrường ban đầu thích hợp nhất khoảng 8,0 Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng vàsinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC, nguồnnitrogen là peptone và cao nấm men Các tác giả cũng đã nghiên cứu động học của quátrình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48h lênmen (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999)

Nguyễn Đức Lượng và cộngsự đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợpcellulase của Actinomyces griseus Qua nghiên cứu các tác giả thấy rằng khả năng sinh

tổng hợp cellulase của A griseus rất cao và tối ưu ở 58oC, pH ban đầu là 6,7, độ ẩmban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72h Nguồn lignocellulose thích hợp là bãmía hoặc mùn cưa (Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh, 1990) Phạm Thị NgọcLan và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạkhuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh.Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập được từ cácmẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnhnhất (Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự, 1999)

Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tượng có khảnăng sinh tổng hợp cellulase cao Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủycellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đềđược nhiều tác giả quan tâm Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọnđược hai chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose cao Tác giả cũng đã nghiêncứu và tìm ra được một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase củahai chủng nấm này (Đặng Minh Hằng , 1999) Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên

tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thảicông nghiệp như mật rỉ đường (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003)

Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulosecao, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chếphẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm nàyđược bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, một nửa thờigian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen Lượng mùn tạo thànhcủa bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dưỡng cao hơn10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng và cộng sự, 1999)

2.4.2 Nghiên cứu trên thế giới

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch có thể thủy phân CMC (Carbomethylcellulose), trấu, bã mía, và giấy vụn, trong đó CMC cho kết quả thủy phân tốt hơn.Hiệu suất thủy phân CMC tăng lên khi nồng độ CMC ngày càng tăng từ 5 – 50 g/l.Khi nồng độ CMC là 10g/l thì sản lượng đường khử và tốc độ sản sinh đường khử chỉđạt được lần lượt là 5,531mg/l và 92,9 mg/l/h Vả lại, việc phân lập vi khuẩn sinh H2

(mà chủ yếu là dòng Clostridium) đã được sử dụng để biến đổi sự thủy phân cellulose

cellulose) (Yung-Chung Lo và cộng sự, 2008)

Clostridium josui sp nov là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí bắt

buộc, ưa ấm phát triển tốt nhất ở 45oC và pH = 7,0, là vi khuẩn tạo bào tử hình trònđược tìm thấy trong phân Dòng này thủy phân cellulose nguyên thủy, trấu, và nhữngnguyên liệu có chứa cellulose khác Đây là dòng vi khuẩn sản xuất ethanol, acetate,butyrate, hydrogen, CO2 trong suốt quá trình phát triển trên môi trường cellulose vàcellobiose (Jiraporn Sukhumavasi và cộng sự, 1988)

Chín dòng vi khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ trong nguồn đất, trong

đó có một dòng là Cellolorimicrobium cellulans Hoạt tính của enzim thủy phâncellulose (gồm cellulase và xylanase) được sản xuất từ những chủng này hiện diện chính lànhững enzim ngoại bào và những sản phẩm enzyme hoạt động độc lập với môi trường pháttriển có celulose (xylan, trấu và cám) (Yung- Chung Lo và cộng sự, 2009)

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu

Bảng 3.1 Tên thiết bị dùng trong đề tài

3.1.1 Hóa chất