ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU NGÓT TRỒNG TẠI CẦN THƠ BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG …………..o0o………….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU NGÓT TRỒNG TẠI CẦN THƠ BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG Họ và tên MSSV Lớp Cần Thơ , 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG …………..o0o………….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU NGÓT TRỒNG TẠI CẦN THƠ BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG Họ và tên: MSSV: Lớp Cần Thơ , 2021 LỜI CẢM ƠN Được sự phân công và sự hướng dẫn của Ts. Thiều Văn Đường tôi đã thực hiện đề tài “Xác định tên khoa học cây rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen”. Với lòng tri ân vô hạn, tôi xin chân thành bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Tây Đô, Khoa Dượcđiều dưỡng Trường Đại Học Tây Đô. Đặc biệt tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với TS.Thiều Văn Đường người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tận tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khoa học. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người bạn, cùng tập thể sinh viên lớp Đại học Dược 12B đã quan tâm, động viên, khích lệ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được. Tôi rất mong được sự góp ý của Thầy Thiều Văn Đường để bài nghiên cứu được hoàn chỉnh hơn. Tôi xin chân thành biết ơn và sẽ mãi mãi khắc ghi Sinh viên thực hiện Phạm Thị Thanh Anh (Ký ghi rõ Họ tên) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Xác định tên khoa học cây rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen” là một công trình nghiên cứu độc lập không có sự sao chép của người khác. Các số liệu sử dụng phân tích trong bài nghiên cứu có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo quy định. Các kết quả nghiên cứu trong bài nghiên cứu do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn Việt Nam. Đề tài là một sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại trường Đại học Tây Đô. Sinh viên thực hiện Phạm Thị Thanh Anh (Ký ghi rõ Họ tên) TÓM TẮT TÍNH CẤP THIẾT Hiện nay, với tốc độ phát triển không ngừng của y học, xu hướng bào chế thuốc từ dược liệu đang là xu thế chung. Rau ngót cũng đang được quan tâm vì ngoài việc xuất hiện như một loại rau trong các bữa ăn gia đình thì rau ngót còn là nguồn dược liệu dễ tìm, dễ trồng, và có khá nhiều công dụng. Vì thế, việc định danh cây rau ngót ở từng địa phương để tìm ra nguồn dược liệu tối ưu nhất cả về chất lượng và chi phí cần được quan tâm. Dựa vào hình thái thực vật thì khó phân biệt được loài và chưa đủ cơ sở khoa học để định danh đúng loài đối với một số loài thực vật có hình thái giống nhau. Trong các tài liệu về cây thuốc, tên khoa học của cây rau ngót được xác định dựa vào hình thái thực vật. Sauropus androgynus (L) Merr., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm phân tích một số đặc điểm hình thái, giải trình tự gen rau ngót. Mẫu lá rau ngót được thu thập ở vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô. Kết quả đã giải được trình tự đoạn gen rbcL của cây rau ngót có sự tương đồng trình tự gen (100%) của loài Sauropus androgynus (L) Merr. đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu. Do đó bằng phương pháp giải trình tự ADN dựa trên đoạn gen rbcL đã xác định được tên khoa học của cây rau ngót là Sauropus androgynus (L) Merr.. thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Kết quả này giúp khẳng định tên khoa học của cây rau ngót đã được định danh dựa trên cơ sở phân loại theo hình thái thực vật trước đây. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài này được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứu chính là: Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu. Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng, (trình tự nucleotid gen ITS) của cây Rau ngót. Xác định những công bố mới về tác dụng của cây Rau ngót đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị và vai trò dinh dưỡng đối với sức khỏe của con người. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đề tài đã tổng hợp và trình bày đặc điểm hình thái, vai trò của cây Rau ngót chữa trị một số bệnh thường gặp và vai trò dinh dưỡng của cây Rau ngót trên đất nước Việt nam. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đề tài đã đưa ra 02 kiến nghị hợp lý nhằm mở rộng đề tài, nghiên cứu rộng về vai trò cây Rau ngót đối với sự phát triển kinh tế, xã hội tại Việt Nam. MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 3 1.1.1 Trên thế giới 3 1.1.2 Ở Việt Nam 3 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY RAU NGÓT 4 1.2.1 Khái niệm về chỉ thị 4 1.2.2 Phân loại 4 1.2.3 Đặc điểm hình thái 4 1. 2. 5. Đặc điểm sinh thái 7 Vị trí cây sinh trưởng: 7 Bộ phận được dùng để làm dược liệu: 7 Phương pháp thu hái, sơ chế và bảo quản: 7 Thời hạn sử dụng kể từ khi sơ chế: 8 Mùa thu hoạch trong năm: 8 1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 8 1.3.1 Khái niệm 8 1.3.2 Chiết xuất và tin sạch DNA 8 1.3.3 Phương pháp PCR 9 1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) 10 1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY RAU NGÓT VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 10 1.4.1 Dược liệu 10 Một số chú ý khi thu hoạch rau ngót: 11 1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 11 1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay 13 1.4.4. Một số lưu ý khi sử dụng cây rau ngót 13 1.4.5 Một số chế phẩm sử dụng hôm nay 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2. 1. 1. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 15 2. 1. 1. 1. Tiêu chuẩn chọn mẫu 15 Lá Rau ngót tươi, già, dày dặn, màu xanh đậm, vừa thu hoạch, không dập nát, không bị sâu hại, không héo úa. 15 2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 15 Lá Rau ngót non, màu nhạt. 15 Lá Rau ngót đã thu hoạch từ lâu. 15 Lá Rau ngót bị sâu hại. 15 Lá Rau ngót bị dập nát. 15 2.1.1.3 Cách bảo quản mẫu 15 2. 1. 2. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị 15 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 18 2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết 18 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu 18 Mục đích nghiên cứu tài liệu để thu thập được những thông tin sau: 18 Cơ sở lý thuyết liên quan đến chủ đề nghiên cứu 18 Thành tựu lý thuyết đã đạt được liên quan đến chủ đề nghiên cứu 18 Kết quả nghiên cứu của đồng nghiệp đã công bố trên các ấn phẩm 18 Chủ trương và chính sách liên quan đến nội dung nghiên cứu 18 Số liệu thống kê 18 Thu thập tài liệu 18 +Trong ngành 19 +Ngoài ngành 19 +Phương tiện truyền thông 19 +Sơ cấp (primary data) 19 +Thứ cấp (secondary data) 19 +Tam cấp (tertiary sources) 19 2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 19 Các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu khoa học: 19 3. 1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 21 3. 1.1. Vị trí thực mẫu 21 3. 2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 21 3.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 21 3.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 21 3. 3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RAU NGÓT 21 3.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 21 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA 21 3.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 21 3. 4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY RAU NGÓT 21 4.1. KẾT LUẬN. 22 4.2. KIẾN NGHỊ 22 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Thân cây Rau ngót 4 Hình 2. Lá cây Rau ngót 5 Hình 3. Rễ cây Rau ngót 5 Hình 4. Hoa cây rau ngót 6 Hình 5. Hạt cây Rau ngót 6 Hình 6. Quả cây Rau ngót 7 Hình 7. Bột Rau ngót Behena 14 Hình 8. Bột Rau ngót Taphashop 14 MỞ ĐẦU Rau ngót là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới Á châu nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, trong đó có Việt Nam. Cây rau ngót còn gọi là bồ ngót, bù ngót, hắc diện thần (Trung Quốc).Tên khoa học Sauropus androgynus (L) Merr.Thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae. Rau ngót có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, giải độc – tiêu độc, thông huyết, bổ huyết, kháng khuẩn, tiêu viêm, nhuận tràng, chữa tưa lưỡi ở trẻ em, trị sót nhau,... Ngoài ra, rau ngót cũng rất tốt cho đàn ông vì trong thảo dược này có chứa rất nhiều hoạt chất giúp tăng cường sinh lý nam như progesterone, glucocorticoid,... Trong Rau ngót có chứa các thành phần dinh dưỡng cao như: 3,4% gluxit, 5,3% protein, 2,4% . Trong đó chủ yếu là các thành phần vitamin C và các axit amin thiết yếu. Trong 100g rau ngót thì có 0,13g methionin. Theo cựu đại tá, lương y đa khoa Bùi Hồng Minh (Nguyên Chủ tịch Hội Đông y Ba Đình, Hà Nội), trong Đông y, Rau ngót có tính mát lạnh, vị ngọt, khi được nấu chín sẽ bớt đi tính lạnh. Lá rau ngót có tác dụng lợi tiểu, giảm độc, hoạt huyết… Nghiên cứu của y học hiện đại cho thấy, lượng chất đạm trong Rau ngót có thể so sánh với những loại đậu xưa nay nổi tiếng giàu đạm, là loại đạm thực vật quý, hiếm có, còn vitamin C trong rau ngót thậm chí được cho là có hàm lượng cao hơn cả trong cam hay ổi. Tên cây Rau ngót trước đây được xác định là Phyllanthus elegans Wall. Hiện nay tên này được dành cho cây rau sắng Phyllanthus elegans L. thuộc cùng họ. Nhưng gần đây nhất, trong quyển Arbres forestiers du Việt Nam, tome V., 198 tr. 147, rau sắng lại được xác định là Meliantha suavis Pierre thuộc họ Opiliaceae. Vì là loại cây thân thuộc, dễ tìm, dễ trồng và dễ sử dụng nên cây Rau ngót đang được quan tâm hơn bao giờ hết, đặc biệt là trong điều kiện khoa học kỹ thuật phát triển như hiện nay. Việc định danh cây Rau ngót vô cùng quan trọng để giúp xác định nguồn dược liệu tối ưu và hiệu quả nhất. Việc xác định đúng tên khoa học để cung cấp số liệu cho các nghiên cứu tiếp theo là rất cần thiết. Việc xác định tên khoa học của cây rau ngót, với hình thái bên ngoài có nhiều điểm tương đồng, có thể thông qua phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với khóa phân loại thực vật hoặc phân tích ADN và so sánh với ADN gốc trong ngân hàng gen. Hiện nay, cây Rau ngót được xác định chỉ dựa vào đặc điểm hình thái, chưa có cơ sở khoa học chứng minh nguồn gốc. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm xác định chính xác tên khoa học của cây Rau ngót dựa trên kết quả giải trình tự gen ADN của loài cây này, từ đó bổ sung thông tin góp phần phát triển cây dược liệu này ở Việt Nam. Vì những lý do trên tôi quyết định thực hiện đề tài: “Xác định tên khoa học cây rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen”. Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tử làm công cụ xác định tiềm năng trở thành dược liệu của cây Rau ngót. Để hoàn thành mục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây: Khái quát được những hiểu biết về cây Rau ngót cho đến hiện nay. Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Rau ngót. Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Rau ngót. Giải trình được trình tự gen ITS của cây Rau ngót làm chỉ thị phân tử. Từ đó xác định được tên khoa học của cây rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ. Từ đó bổ sung thông tin góp phần phát triển cây dược liệu này ở Việt Nam. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 1.1.1 Trên thế giới Rau ngót (Sauropus androgynus) là một loại cây bụi, bản địa của Đông Nam Á được trồng ở Campuchia, Indonesia, Lào, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam và Ấn Độ. Nó phát triển mạnh ở vùng khí hậu nhiệt đới trong các khu rừng mưa nhiệt đới nơi nó mọc cao từ 4 đến 6 feet. Thông tin thêm về cây Rau ngót mô tả nó như một bụi cây thẳng đứng với nhiều thân và lá màu xanh đậm, hình bầu dục. Ở vùng khí hậu nhiệt đới, cây vẫn giữ được màu xanh quanh năm, nhưng ở những nơi mát mẻ hơn, bụi cây có thể sẽ rụng lá vào mùa đông chỉ để mọc lại vào mùa xuân. Cây bụi nở hoa vào mùa hè và mùa thu với những bông hoa nhỏ, phẳng, tròn, màu vàng đến đỏ ở nách lá theo sau là một quả màu tím với những hạt đen nhỏ. Phải mất hai cây bụi rau ngót để thụ phấn và tạo quả. Rau ngót được ăn ở châu Á, cả sống và chín. Cây bụi được trồng ở các khu vực bóng râm, tưới thường xuyên và bón phân để tạo ra những mẹo mềm phát triển nhanh chóng tương tự như măng tây. Cây rất bổ dưỡng với khoảng một nửa dinh dưỡng là protein Cũng như vô cùng bổ dưỡng, rau ngót có dược tính, một trong số đó là kích thích sản xuất sữa ở các bà mẹ cho con bú. Một lời cảnh báo, tiêu thụ quá nhiều lá hoặc nước ép Rau ngót thô đã dẫn đến các vấn đề về phổi mãn tính. Tuy nhiên, Rau ngót phải mất khá nhiều nguyên liệu để gây ra bất kỳ vấn đề nào và hàng triệu người ăn nó mỗi ngày mà không có ảnh hưởng xấu. Trồng cây bụi Rau ngót tương đối dễ dàng, miễn là bạn sống trong một khu vực ẩm ướt, nóng hoặc có thể bắt chước các điều kiện như vậy trong nhà kính. Khi trồng cây bụi Rau ngót, nó sẽ hoạt động tốt nhất ở khu vực bóng râm, giống như tầng dưới của rừng mưa nhiệt đới, nhưng nó cũng sẽ hoạt động tốt dưới ánh mặt trời đầy đủ với điều kiện bạn giữ cho đất ẩm. Rau ngót dễ dàng được nhân giống thông qua việc giâm cành đặt trong nước hoặc đặt trực tiếp vào đất trong khu vực râm mát ẩm ướt. Rõ ràng, cây bụi có thể phát triển đến một chân trong một tuần trong điều kiện lý tưởng, mặc dù nó có xu hướng lật lên khi nó quá cao. Vì lý do này và để khuyến khích những chồi non mới, việc cắt tỉa thường xuyên được thực hiện bởi những người trồng trọt châu Á. 1.1.2 Ở Việt Nam Cây Rau ngót còn gọi là bồ ngót, bù ngót, hắc diện thần (Trung Quốc) là một loài cây thường thấy ở các vùng nhiệt đới Á Châu. Và ở một số nước trong đó có Việt Nam loại rau này được sử dụng như là một loại rau ăn, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc. Ngoài là loại thức ăn bổ dưỡng thì cây rau ngót cũng được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh. 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY RAU NGÓT 1.2.1 Khái niệm về chỉ thị Rau ngót, bù ngót, bồ ngót, hay rau tuốt (danh pháp hai phần: Sauropus androgynus) là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới Á châu nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, như ở Việt Nam. 1.2.2 Phân loại Phân loại khoa học Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots (không phân hạng) Rosis Bộ (ordo) Malpighiales Họ (familia) Phyllanthaceae Tông (tribus) Phyllantheae Phân tông (subtribus) Flueggeniae Chi (genus) Sauropus Loài (species) S. androgynus 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.2.3.1 Thân Rau ngót thuộc dạng cây bụi, có thể cao đến 2 m, phần thân khi già cứng chuyển màu nâu. Hình 1. Thân cây Rau ngót 1.2.3.2 Lá Lá cây Rau ngót hình bầu dục, mọc so le; sắc lá màu lục thẫm, cuống lá rất ngắn chỉ khoảng từ 1 đến 2mm. Phiến lá mỏng, láng mịn và không thấm nước. Khi hái ăn, thường chọn lá non. Vị rau tương tự như măng tây. Hình 2. Lá cây Rau ngót 1.2.3.3 Rễ cây Rễ củ, vị hơi đắng, được dùng để chữa bệnh trong Đông y. Hình 3. Rễ cây Rau ngót 1. 2.3. 4.Hoa Hoa cây Rau ngót, thường có màu trắng hoặc đỏ thẫm, mọc đơn lẻ trải dọc theo lá. Hoa cái mọc ở phía trên còn hoa được mọc ở phía dưới kẽ là thành xim đơn. Hình 4. Hoa cây rau ngót 1.2.3.6 Hạt Hạt màu nâu, cứng. Hình 5. Hạt cây Rau ngót 1.2.3.5. Quả Quả cây Rau ngót có hình cầu, màu trắng ngà. Hình 6. Quả cây Rau ngót 1. 2. 4. Đặc điểm vi phẫu Thân Lá Rễ Hoa Quả Hạt 1. 2. 5. Đặc điểm sinh thái Vị trí cây sinh trưởng: Cây Rau ngót là loài cây mọc hoang, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á. Loại cây này cũng được trồng nhiều ở nước ta và thường lấy lá rau ngót để nấu canh hoặc làm thuốc. Bộ phận được dùng để làm dược liệu: Người ta sẽ sử dụng lá và rễ cây Rau ngót để làm dược liệu. Phương pháp thu hái, sơ chế và bảo quản: Để làm thuốc, người ta thường chọn các cây Rau ngót có tuổi đời trên 2 năm. Sử dụng các lá tươi và rễ tươi cũng như sơ chế ngay khi thu hái về. Lá và rễ Rau ngót rất dễ héo và úng, vì thế tốt nhất là nên sử dụng trong ngày. Nếu có nhu cầu sử dụng qua ngày, dược liệu cần phải được bảo quản trong tủ lạnh. Thời hạn sử dụng kể từ khi sơ chế: Sử dụng ngay trong ngày ngay sau khi thu hoạch và sơ chế. Mùa thu hoạch trong năm: Cây Rau ngót có thể thu hái quanh năm với những cây đã được trồng từ 2 năm trở lên. 1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1.3.1 Khái niệm Chỉ thị phân tử (molecular marker) hay còn gọi là chỉ thị di truyền (genetic marker) ở thực vật là đoạn DNA ngắn có liên kết chặt chẽ với gen quy định một tính trạng cụ thể của cây trồng, tạo nên tính đặc trưng để phân biệt giữa các cá thể. (Ví dụ: tính kháng sâu hoặc bệnh, màu sắc hoặc kích thước quả hạt,..). Điều đặt biệt là những chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài mà dựa trên sự khác biệt về trình tự gen giữa các cá thể. Nhờ tính liên kết chặt chẽ với tính trạng đang khảo sát, chỉ thị phân tử được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, do đó nó được sử dụng như một công cụ hữu ích trong việc chọn lọc giống. Hiện nay, chỉ thị phân tử DNA có các dạng phổ biến như: Chỉ thị phân tử của trình tự đa hình từng nucleotid ( Single Nucleotid Polymorphism – SNP) là sự khác biệt trong trình tự DNA ở một nucleotid; Chỉ thị phân tử tử của các trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR ) là những đoạn ngắn của DNA có chứa từ 2 đến 6 nucleotid có trình tự lặp lại từ 2 đến 40 lần; Chỉ thị phân tử đa hình của các đoạn cắt giới hạn (Cleave Amplified Polymorphic Sequences – CAPS ) là sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA bị cắt bởi enzyme cắt giới hạn tại vị trí nucleotid khác biệt giữa hai cá thể; Chỉ thị phân tử đa hình của các đoạn khuếch đại (Amplified Fragment Legth Polymorphism AFLP ) là sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA đại diện choc ac alen khác nhạu khi khuếch đại. 1.3.2 Chiết xuất và tin sạch DNA 1.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số: ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết ADN DNeasy plant mini kits (QIAGEN, USA). ADN toàn phần đượckiểm tra lại bằng phương pháp điện di trên gel agarose. 1.3.2.2 Điện di ADN trên gel agarose Nguyên tắc: Các đoạn ADN mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường theo chiều từ cực âm sang cực dương. Trên bản gel agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường. Nhuộm ADN bằng Ethidium bromid để quan sát ADN dưới ánh sáng tử ngoại, bước sóng 254 nm. Tiến hành: Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel. Chạy điện di ở điện thế 110 V. Sau đó nhuộm bản gel bằng Ethidium bromid, rửa sạch bằng nước cất rồi quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. 1.3.2.3 Phương pháp tinh sạch ADN Để tinh sạch ADN, sử dụng kit tinh sạch của hãng Fermentas (Đức) gồm các bước tiến hành như sau: 1. Lấy 100 μL đệm tách ADN, cùng với 100μL ADN rồi trộn đều. 2. Chuyển lên cột Genne JetTm. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòngphút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới 3. Thêm 700 μL đệm rửa để loại tạp chất.Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòngphút trong 2 phút, bỏ phần dịch bên dưới. 4. Đặt cột vào trong ống 1,5 μL. Cho 30μL H2O vào cột sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòngphút trong 2 phút. 5. Bảo quản ADN ở 20 đến 80 o C. 1.3.3 Phương pháp PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó. Được phát triển năm 1983 bởi Kary Mullis, PCR là một kỹ thuật phố biến và không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học với nhiều ứng dụng khác nhau như nhân bản ADN để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựa trên bằng chứng về ADN, hoặc phân tích chức năng của gen; chẩn đoán các bệnh di truyền; xác định các dấu vân tay ADN (sử dụng trong khoa học pháp y và xác định quan hệ huyết thống ); phát hiện và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm. Năm 1993, Mullis được trao giải thưởng Nobel Hóa học cùng với Michael Smith cho nghiên cứu của mình về PCR. Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính ADN và tái bản ADN. Đoạn mồi (là đoạn ADN ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự ADN đích và ADN polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, ADN mới được tạo ra từ ADN khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân. Hầu như tất cả các kỹ thuật PCR sử dụng một ADN polymerase bền nhiệt, như Taq polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus). ADN polymerase này có hoạt tính lắp ráp tổng hợp sợi ADN mới từ các đơn phân nucleotide bằng cách sử dụng khuôn ADN sợi đơn và các đoạn ADN oligonucleotide ( hay còn gọi là ADN mồi), đây cũng là các thành phần bắt buộc để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA. Phần lớn các phương pháp PCR sử dụng chu trình nhiệt, nghĩa là, tiến hành xen kẽ quá trình gia nhiệt và giảm nhiệt các mẫu PCR thông qua một chuỗi các giai đoạn nhiệt khác nhau được xác định. Ở bước đầu tiên, hai sợi xoắn kép của ADN được tách ra ở nhiệt độ cao, quá trình được gọi là quá trình biến tính ADN. Ở bước thứ hai, nhiệt độ được hạ xuống và hai sợi ADN trở thành khuôn cho ADN polymerase tổng hợp đoạn ADN đích. Khả năng khuếch đại chọn lọc là do việc sử dụng mồi mang trình tự bổ sung với đoạn ADN đích khuếch đại dưới những chu trình nhiệt đặc hiệu. 1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) Giải trình tự ADN là quá trình xác định trình tự các bazo nucleotide (As, Ts, Cs và Gs) trong một đoạn phân tử ADN, Khởi đầu với sự phát hiện ra cấu trúc phân tử ADN, những bước tiến dài đã đạt được trong hiểu biết về tính đa dạng và phức tạp của phân tử ADN. Một loạt đổi mới về chất cũng như máy móc thiết bị đã khởi đầu cho dự án Hệ gen người. Ngày nay, giải trình tự ADN đã trở nên toàn diện, nhanh chóng và chính xác hơn nhiều. Phương pháp giải trình tự Nguyên tắc: Dựa theo phương pháp Sanger cải tiến có sử dụng các dideoxynucleotid. Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotid sẽ có cùng một màu. Trình tự ADN được giải trình tự bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc) trên máy đọc trình tự tự động. So sánh trình tự ADN Trình tự ADN của các mẫu được phân tích bằng phần mềm MEGA 6,0 và so sánh với ADN của loài thuộc chi Aconitum đã công bố trên ngân hàng gen bằng công cụ NCBIBLAST, công cụ này sẽ chỉ ra độ tương đồng của các gen giữa loài nghiên cứu với các công bố trước đây. 1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY RAU NGÓT VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 1.4.1 Dược liệu 1.4.1.1 Cách thu hái Cây rau ngót có thể thu hái quanh năm với những cây đã được trồng từ 2 năm trở lên. Khi cây rau ngót cao khoảng 30 – 40 cm, các bạn nên vặt bỏ các lá xung quanh gốc nhằm giúp cho gốc cây được thông thoáng, giữ lại phần lá non gần ngọn để cây phát triển tiếp. Phần lá quanh gốc này, nếu không quá già thì vẫn có thể sử dụng để nấu ăn. Tùy theo điều kiện chăm sóc, trồng ở ruộng vườn hay trong thùng xốp mà thời gian thu hoạch có thể nhanh hoặc lâu, nhưng thông thường, sau khi trồng rau ngót bằng cành khoảng 2 tháng, chúng ta sẽ được thu hoạch lứa rau ngót lần đầu tiên. Cách thu hoạch rau ngót rất đơn giản, có thể dùng tay tỉa hoặc dùng kéo để cắt cành lá. Các bạn chỉ cần lấy tay tỉa cành, hoặc dùng kéo cắt sát thân, hết phần cành lá là được. Để làm thuốc, người ta thường chọn các cây rau ngót có tuổi đời trên 2 năm. Sử dụng các lá tươi và rễ tươi cũng như sơ chế ngay khi thu hái về. Một số chú ý khi thu hoạch rau ngót: • Không nên thu hoạch rau ngót khi lá cây quá non hoặc quá già. Nếu hái rau ngót già quá, rau ăn sẽ không mềm, và làm chậm sự phát triển của các nhánh mới. • Nên hái rau ngót vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát, tránh thu hoạch lúc nắng nóng vì nhiệt độ cao và ánh nắng mặt trời sẽ làm rau ngót bị héo, giảm chất lượng rau. • Sau mỗi lần tỉa hát rau ngót, chúng ta cần bón phân bổ sung thêm dinh dưỡng cho cây phát triển, đồng thời vun đất vào gốc cho cây nếu cây bị trơ gốc. NNO khuyến khích việc sử dụng các loại phân hữu cơ để bón cho rau ngót để đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Việc bón phân sau mỗi lần thu hoạch rau ngót là một yếu tố quan trọng để có vườn rau ngót xanh tốt quanh năm. 1.4.1.2 Cách bảo quản Tốt nhất là nên nhặt rau nhẹ nhàng, loại bỏ các lá úa rồi cho vào túi nilon có đục lỗ và để vào ngăn mát tủ lạnh. Nếu rau dính nhiều đất cát thì nhặt rau, đựng vào 1 cái rổ, sóc rổ rau nhẹ nhàng qua 1 chậubồn nước đầy, sau đó để ráo nước rồi trữ lạnh, khi dùng chỉ việc mang ra rửa sạch và chế biến. Đặc biệt, đối với rau ngót, chỉ cần để trong tủ lạnh 12 ngày là các lá đã rụng, nên rau ngót được dùng trong khoảng 23 ngày sau khi thu hái về là tốt nhất. Các loại rau ăn lá nhất thiết phải được để trong túi nilon hoặc bọc kín bằng giấy báo trước khi để vào tủ lạnh, nếu không, rau sẽ bị héo. Ngoài ra, rau lá sẽ chỉ tươi ngon trong tủ lạnh tối đa là 34 ngày, quá thời hạn này thì rau sẽ bắt đầu úa và mất chất dinh dưỡng. Lá và rễ rau ngót rất dễ héo và úng, vì thế tốt nhất là nên sử dụng trong ngày. Nếu có nhu cầu sử dụng qua ngày, dược liệu cần phải được bảo quản trong tủ lạnh. 1.4.3.1 Chế biến Rau ngót thông thường được dùng để nấu canh cùng với thịt, cá làm món ăn thanh nhiệt. Ngoài ra, người ta còn chế biến rau ngót theo các bài thuốc dân gian để chữa một số bệnh như táo bón, tiểu đường, sót nhau,… Cây rau ngót thường được bào chế làm thuốc bằng cách đem giã nhuyễn lá hoặc rễ tươi rồi đem sắc và uống. Hoặc sau khi giã nát lá và rễ tươi, người ta sẽ đem hòa với một ít nước rồi chắt bã lấy nước uống còn bã có thể sử dụng để đắp lên các vùng da bị thương hoặc sưng đau. 1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 1. 4. 2. 1. Theo Đông y Đổ mồ hôi trộm, táo bón ở trẻ em Lấy 30g rau ngót, 30g bầu đất, 1 quả bầu dục lợn rồi nấu canh cho trẻ ăn. Đây không chỉ là món canh ngon, bổ dưỡng lại có tác dụng chữa bệnh, mà nó còn là vị thuốc kích thích ăn uống với những trẻ chán ăn. Đặc biệt, canh rau ngót nấu với thịt lợn nạc hoặc giò sống... không chỉ tốt cho trẻ em mà còn rất tốt cho cả người lớn bởi nó là một vị thuốc bổ, giúp tăng cường sức khoẻ với người mới ốm dậy, người già yếu hoặc phụ nữ sau khi sinh. Chữa tưa lưỡi Lấy 10g lá tươi, rửa sạch, giã nhỏ vắt lấy nước, thấm vào gạc mềm, sạch, đánh trên lưỡi (tưa trắng), lợi, vòm miệng trẻ em. Đánh nhẹ cho tới khi hết tưa trắng. Đái dầm ở trẻ em 40g rau ngót tươi rửa sạch, giã nát, sau đó cho một ít nước đun sôi để nguội vào rau ngót đã giã, rồi khuấy đều, để lắng và gạn lấy nước uống. Phần nước gạn được chia làm hai lần để uống, mỗi lần uống cách nhau khoảng 10 phút. Trẻ bị sốt nóng thân nhiệt tăng Dân gian vẫn thường dùng lá rau ngót rửa sạch, giã nát, lọc lấy nước cho trẻ uống, bã đắp vào thóp sẽ có công hiệu. Đau mắt đỏ, nhức nhối khó chịu Lá rau ngót 50g, rễ cỏ xước 30g, lá dâu 30g, lá tre 30g, rau má 30g, lá chanh 10g. Tất cả đều dùng tươi, sắc đặc, chắt lấy nước uống nhiều lần trong ngày. Chữa sót rau thai Lá rau ngót 40g rửa sạch giã nát, thêm một ít nước đã đun sôi để nguội vào. Vắt lấy chừng 100ml nước, chia hai lần uống mỗi lần cách nhau 10 phút. Sau chừng 15 đến 20 phút rau sẽ ra. Trị nám da Rau ngót (sau khi đã rửa sạch) cho vào máy xay sinh tố để xay lấy nước uống mỗi ngày. rau ngót (sau khi đã rửa sạch) cho vào máy xay sinh tố để xay lấy nước uống mỗi ngày. Một cách khác đó là giã nát rau ngót với một chút đường, sau đó đắp chúng lên vùng da bị nám trong khoảng 2030 phút và rửa lại với nước lạnh. Cách làm này nếu được áp dụng thường xuyên sẽ đem đến sự bất ngờ cho bạn.. 1. 4. 2. 2. Trong Tây y Rau ngót chứa 5,3% protit, 3,4% gluxit, 2,4% trong đó chủ yếu là canxi (169mg%), photpho (64,5mg%), vitamin C (185mg%). Rau ngót có nhiều axit amin cần thiết: trong 100g rau ngót có 016g lysin, 0,13g metionin, 0,05g tryptophan, 0,25g phenylalanin, 0,34g treonin, 0,17g valin, 0,24 leuxin và 0,17 izoleuxin. Theo sách Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Rau ngót có nhiều tác dụng chữa bệnh như: thanh nhiệt, trị cảm nhiệt gây ho suyễn, trị táo bón, giảm cân, hỗ trợ điều trị đái tháo đường hoặc trị chảy máu cam…đái tháo đường Ngoài ra, thành phần insulin trong Rau ngót còn giúp làm chậm quá trình hấp thụ đường nên hỗ trợ điều trị rất tốt cho các bệnh nhân bị đái tháo đường. Mặt khác, khả năng sinh nhiệt của insulin chỉ bằng 19 của chất béo. Bên cạnh đó, chất papaverin trong Rau ngót có tác dụng gây dãn mạch, chống co thắt cơ trơn, giảm huyết áp, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não do tắc mạch, nghẽn mạch. 1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay 1.4.3.2 Vai trò đối với sức khỏe con người Rau ngót được đánh giá là thực phẩm lành, dễ ăn và có giá trị dinh dưỡng cao tốt cho sức khỏe. Trong Rau ngót có chứa chủ yếu là canxi, photpho và vitamin C; đặc biệt là trong rau có chứa nhiều hoạt chất axit amin. Ngoài ra còn nhiều loại khoáng chất thiết yếu có thể kể đến như: protit, gluxit, tro, kali, mangan,… giúp mang lại nhiều công dụng cho sức khỏe và trị một số bệnh thường hay gặp. a. Giúp cân bằng huyết áp b. Hỗ trợ giảm cân c.. Thanh lọc cơ thể d. Điều trị đái tháo đường e. Điều trị táo bón ở trẻ em f. Điều trị đái dầm g. Điều trị nám da h. Nâng cao hệ miễn dịch i. Tăng cường sinh lý nam giới 1.4.4. Một số lưu ý khi sử dụng cây rau ngót 1.4.4.1 Gây sảy thai Đối với những người phụ nữ đang trong thời gian thai kì, việc ăn Rau ngót quá nhiều có thể sẽ bị mắc phải hiện tượng co thắt cơ trơn tử cung khiến cho rất dễ bị sảy thai. Đặc biệt là với những thai phụ có tiền sử sảy thai liên tục, đẻ non hoặc thụ tinh trong ống nghiệm. Khi mang thai bình thường, vẫn có thể ăn một ít Rau ngót cách vài tuần và chỉ ăn sau khi đã luộc hoặc nấu canh. Tuy nhiên nên chọn mua những loại rau sạch và tươi để tránh bị ngộ độc thực phẩm. 1.4.4.2 Gây hạn chế quá trình hấp thụ các khoáng chất Bên cạnh việc tăng cường cho quá trình trao đổi chất trong cơ thể, tuy nhiên với hợp chất glucocorticoid thì lại cho ra kết quả không mong muốn của quá trình trao đổi chất của lá Rau ngót. Việc này làm hạn chế quá trình hấp thụ canxi và photpho không chỉ riêng ở loại lá này mà còn ở những thực phẩm khác khi ăn kèm với Rau ngót nữa. 1.4.4.3 Gây chứng khó ngủ, mất ngủ Ở một số nơi trên thế giới ghi nhận tác dụng phụ của Rau ngót là gây ra chứng mất ngủ, khó ngủ hoặc kém ăn do sử dụng 150g nước ép liên tục trong thời gian dài. Vậy nên bạn cần phải lưu ý về việc điều chỉnh liều lượng để tránh mắc phải những tác dụng phụ không mong muốn. 1.4.5 Một số chế phẩm sử dụng hôm nay Hình 7. Bột Rau ngót Behena Hình 8. Bột Rau ngót Taphashop Hiện nay, ngoài việc sử dụng Rau ngót tươi để tiện sử dụng và bảo quản người ta còn sản xuất những chế phẩm từ rau ngót trên thị trường chủ yếu là dạng bột khô, dùng để pha thành nước uống giúp bổ sung dinh dưỡng và hỗ trợ điều trị một số bệnh như đái tháo đường, tăng huyết áp, táo bón,… CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Dược liệu cây Rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ được thu thập để chiết xuất. 2. 1. 1. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 2. 1. 1. 1. Tiêu chuẩn chọn mẫu Lá Rau ngót tươi, già, dày dặn, màu xanh đậm, vừa thu hoạch, không dập nát, không bị sâu hại, không héo úa. 2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ Lá Rau ngót non, màu nhạt. Lá Rau ngót đã thu hoạch từ lâu. Lá Rau ngót bị sâu hại. Lá Rau ngót bị dập nát. 2.1.1.3 Cách bảo quản mẫu Tốt nhất là nên nhặt rau nhẹ nhàng, rồi cho vào túi nilon có đục lỗ và để vào ngăn mát tủ lạnh. 2. 1. 2. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị Nguyên liệu: Mẫu lá non tươi của cây rau trồng ở vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô được thu thập để chiết và phân tích ADN, giải trình tự gen. Hóa chất ly trích ADN: CTAB Buffer (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8.0, 20 Mm EDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl), βmercaptoethanol, Chloro form: Isoamylalcohol (24:1), Enzyme RNase, Isopropanol, ethanol (70%). Tất cả các hóa chất dùng trong thí nghiệm này đều có nguồn gốc từ công ty Merck, Đức. Hóa chất PCR và điện di: PCR Mix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Ladder 1 kb plus (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh sạch (nước cất 2 lần và đã qua thanh trùng ở 121 oC trong 20 phút). Thiết bị Điện di: Điện di ATTO CORPORA TION AE 7344, máy điện di gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGE Twin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystems – Malaysia), máy đọc gel bằng tia UV (BioBlock Scientific, Pháp). 2. 1. 3. Thời gian nghiên cứu . Thời gian bắt đầu: ngày 13 tháng 09 năm 2021 Thời gian kết thúc: ngày 08 tháng 10 năm 2021 2. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái Quan sát và mô tả hình thái bên ngoài của cây Rau ngót. Dựa vào phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có cải tiến, các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá... 2. 2. 2. Phương pháp chỉ thị phân tử 2. 2. 2. 1. Tách chiết tổng số và tinh sạch DNA ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến (Doyle and Doyle, 1990). Cân 100 mg mẫu lá cây cho vào cối và tiến hành nghiền mịn trong 1 mL dung dịch CTAB 2X đã được ủ ở 65 oC trong 15 phút. Cho thêm CTAB, chuẩn lên vạch 1,5 mL vào mẫu đã được nghiền. Trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Sau khi ly tâm xong, hút lần lượt mỗi tuýp 1000 μL lớp dịch trong bên trên và cho vào tuýp mới. Sau đó thêm vào 10 μL βmercaptoetha noltuýp. Tiến hành ủ ở nhiệt độ 65 oC trong 60 phút (mỗi 10 phút trộn đều mẫu 1 lần). Tiếp theo cho thêm vào mỗi tuýp 500 μL chloroform, trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Hút 750 μL phần dung dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó tiếp tục thêm vào 500 μL chloroform, trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Chuyển 550 μL dung dịch bên trên và cho vào tuýp mới, sau đó thêm 500 μL chloroform vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Rút 350 μL lớp dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó thêm 5 μL RNase vào mỗi tuýp, lắc đều và ủ mẫu ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 μL CTAB 2X và 500 μL chloroform vào mỗi tuýp. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Tiếp theo rút mỗi tuýp 400 μL lớp dịch bên trên và cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 μL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở nhiệt độ 20 oC trong 30 phút. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong phút, phần kết tủa lắng tụ bên dưới được thêm 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để rửa sạch mẫu, sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa. Thêm tiếp tục 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp để rửa sạch mẫu lần hai và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút. Sau đó đổ bỏ phần cồn phơi khô mẫu dưới quạt trần trong 1 giờ. Cuối cùng thêm vào mỗi tuýp 30 μL TE (pH = 8.0) để hòa tan ADN và trữ lạnh ở nhiệt độ 20 oC.Rút 350 μL lớp dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó thêm 5 μL RNase vào mỗi tuýp, lắc đều và ủ mẫu ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 μL CTAB 2X và 500 μL chloroform vào mỗi tuýp. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Tiếp theo rút mỗi tuýp 400 μL lớp dịch bên trên và cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 μL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở nhiệt độ 20 oC trong 30 phút. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong phút, phần kết tủa lắng tụ bên dưới được thêm 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để rửa sạch mẫu, sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa. Thêm tiếp tục 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp để rửa sạch mẫu lần hai và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút. Sau đó đổ bỏ phần cồn phơi khô mẫu dưới quạt trần trong 1 giờ. Cuối cùng thêm vào mỗi tuýp 30 μL TE (pH = 8.0) để hòa tan ADN và trữ lạnh ở nhiệt độ 20 oC. 2. 2. 2. 2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA Phương pháp tinh sạch ADN Để tinh sạch ADN, sử dụng kit tinh sạch của hãng Fermentas (Đức) gồm các bước tiến hành như sau: 1. Lấy 100 μL đệm tách ADN, cùng với 100μL ADN rồi trộn đều. 2. Chuyển lên cột Genne JetTm. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòngphút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới 3. Thêm 700 μL đệm rửa để loại tạp chất. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòngphút trong 2 phút, bỏ phần dịch bên dưới. 4. Đặt cột vào trong ống 1,5 μL. Cho 30μL H2O vào cột sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòngphút trong 2 phút. 5. Bảo quản ADN ở 20 đến 80 o C. 2. 2. 2. 3. Kỹ thuật phân tích DNA bằng chỉ thị vi vệ tinh (SSR) Chỉ thị ví vệ tỉnh là những đoạn DNA lập lại gồm những đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 nucleotid, theo kiểu lặp lại ngắn một cách có trật tự. Chỉ thị này đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga 1982; Weber và ctv 1989). Hiện nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của rất nhiều sinh vật bậc cao khác như một số loài cây một lá mầm và hai lá mầm (Morgante và ctv 1993; Wang và ctv 1994): một số gia cầm, động vật có vú (Cheng và ctv 1994; Love và ctv 1990; Moran và ctv 993: Serikawa và ctv 1992); cá (Estuop và ctv 1993). Sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại, có thể sinh ra đa hình SSR. Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, đễ dàng phát hiện bằng PCR. Các chỉ thị SSR đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật ( Bell và Ecker 1994; Tautz và Renz 1984). Ở người, SSR được xem là thẻ hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử.Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên các cây rừng nhiệt đới (Condit và Hubell 1991).bắp cải (Lagercrantz và ctv 1993), lúa mì (Roder và ctv 1995), và 34 giống cây trồng khác (Morgante và Olivieri 1993). Những kết quả nghiền cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật thì SSR mang trình tự lặp lại (AT)n, nhiều hơn, còn ở động vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n , hơn. Những nghiên cứu trên lúa (Wu và Tanksley 1993), ngô (Senio và Heun 1993) và Arabidopsis (Bell và Ecker 1994) cũng cho kết quả tương tự. Trong các nghiên cứu thư viện hệ trên lúa, sau khi sàng lọc (screening) cho thấy có khoảng 5.70010.000 vi vệ tinh ở lúa (McCouch và ctv 1997). Hạn chế lớn nhất của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém, đồng thời mỗi một lô riêng biệt chỉ đặc trưng bởi một loại mới. 2. 2. 2. 4. Phương pháp xử lý số liệu Thu thập và xử lí các số liệu theo phương pháp thống kê Phân tích xử lí các số liệu bằng phần mềm Excel. Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm Gel Analyzer. Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản cập nhật mới nhất 7.0.5 (Hall, 1999). Sau đó sử dụng phương pháp BLAST trên hệ thống ngân hàng gene NCBI (http:www.ncbi.nlm.nih.govblast). dùng cho việc nhận diện loài. 2. 2. 2. 5. Giải trình tự DNA và xác định gen ITS 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết Phương pháp nghiên cứu lý thuyết là phương pháp thu thập thông tin thông qua đọc sách báo, tài liệu nhằm mục đích tìm chọn những khái niệmvà tư tưởng cơ bản là cơ sở cho lý luận của đề tài, hình thành giả thuyết koa học, dự đoán về những thuộc tính của đối tượng nghiên cứu , xây dựng những mô hìh lý thuyết hay thực nghiệm ban đầu. Sử dụng phương pháp nghiên cứu lý thuyết ( còn gọi là phương pháp nghiên cứu tài liệu) , người nghiên cứu cần hướng vào thu thập và xử lý ngững thôn gtin sau: • Cơ sở lý thuyết liên quan đến xhủ đề nghiên cứu của mình • Thành tựu lý thuyết đã đạt được liên quan trực tiếp đến chủ đề nghiên cứu • Các kết quả nghiên cứu cụ thể đã công bố trên ác ấn phẩm • Số liệu thống kê. • Chủ trương, chính sách liên quan đến nội dung nghiên cứu Nguồn tài liệu 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu Phương pháp nghiên cứu tài liệu là một trong những công cụ nghiên cứukhoa học để thực hiện nhiệm vụ của đề tài. Mục đích nghiên cứu tài liệu để thu thập được những thông tin sau: Cơ sở lý thuyết liên quan đến chủ đề nghiên cứu Thành tựu lý thuyết đã đạt được liên quan đến chủ đề nghiên cứu Kết quả nghiên cứu của đồng nghiệp đã công bố trên các ấn phẩm Chủ trương và chính sách liên quan đến nội dung nghiên cứu Số liệu thống kê Thu thập tài liệu • Các nguồn tài liệu: +Trong ngành +Ngoài ngành +Phương tiện truyền thông • Dữ liệu: +Sơ cấp (primary data) +Thứ cấp (secondary data) +Tam cấp (tertiary sources) 2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Các thông tin được thu thập phải đảm bảo chính xác, có độ tin cậy cao nhất.. Kết quả của nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến hoạt động kinh doanh và sản xuất của các cơ quan nghiên cứu. Các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu khoa học: Nguyên tắc tôn trọng con người Tôn trọng quyền tự quyết: Các cá nhận có quyền quyết định tham gia hoặc không tham gia vào một nhóm nghiên cứu khoa học. Họ phải được đối xử một cách tôn trọng. Nhà nghiên cứu sẽ vi phạm đạo đức nghiên cứu nếu ép buộc bất kỳ người nào đó tham gia vào nhóm nghiên cứu của mình dù là người đó có khả năng hoặc không có khả năng tự cân nhắc để đưa ra các quyết định cá nhân. Bảo vệ những người bị hạn chế hoặc giảm sút quyền tự quyết: Nhà nghiên cứu khi tiến hành một nghiên cứu khoa học cần đảm bảo an toàn, chống lại mọi xâm hại, lạm dụng đối với người bị phụ thuộc vào hoàn cảnh hoặc bị tổn thương, ví dụ như: phụ nữ, trẻ em, người nghèo… Nguyên tắc hướng thiện Nguyên tắc này được đề ra nhằm hướng tới mục tiêu đảm bảo nghĩa vụ của mọi nghiên cứu khoa học là phải tối đa hóa lợi ích và tối thiểu hóa tác hại. Đây là nguên tắc nâng dần đến các chuẩn mực đòi hỏi rằng rủi ro nghiên cứu phải ở mức hợp lý so với lợi ích mong đợi; thiết kế nghiên cứu phải hợp lý và người thực hiện nghiên cứu phải có đủ năng lực chuyên môn để bảo vệ lợi ích của đối tượng nghiên cứu. Nguyên tắc này còn ngăn cấm mọi sự gây hại có chủ tâm đến con người, xã hội nói chung khi thực hiện các nghiên cứu khoa học. Nguyên tắc công bằng Nguyên tắc công bằng đề cập đến nghĩa vụ đạo đức là phải đối xử với mọi người nghiên cứu một cách đúng đắn và phù hợp về mặt đạo đức, phải đảm bảo mỗi cá nhân tham gia vào nghiên cứu phải nhận được tất cả những gì mà họ có quyền được hưởng. Trong đạo đức nghiên cứu liên quan đến con người, nguyên tắc là chủ yếu đề cập tới sự phân chia công bằng, trong đó công bằng cả thiệt thòi lẫn lợi ích của việc tham gia nghiên cứu cho mọi đối tượng. Sự khác nhau về phân chia thiệt thòi và lợi ích chỉ được chấp thuận khi sự khác biệt về đạo đức giữa người này với người kia; một trong những khác biệt đó chính là “ tính dễ bị tổn thương”. “Tính dễ bị tổn thương” đề cập đến một người không có đủ khả năng để bảo vệ lợi ích của mình hay thiếu năng lực để đưa ra quyết định đồng ý, ví dụ người nghèo, thành viên cấp dưới, thành viên phụ thuộc của nhóm người có cấu trúc thứ bậc. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3. 1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 3. 1.1. Vị trí thực mẫu 3. 1. 2. Chỉ thị hình thái 3.1.2.1. Thân 3.1.2.2. Lá 3.1.2.3. Rễ 3.1.2.4. Hoa 3.1.2.5. Quả 3.1.2.6. Hạt 3. 2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 3.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 3.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 3.2.2.1. Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR 3.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA 3. 3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RAU NGÓT 3.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA 3.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 3. 4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY RAU NGÓT CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN. 4.2. KIẾN NGHỊ Nhà trường tạo điều kiện để chúng em nghiên cứu sâu hơn về dược liệu cây Rau ngót ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tiếp tục xây dựng thêm chỉ thị phân tử cho nguồn dược liệu ở Đồng bằng sông Cửu Long. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kress W.J and Erickson D.L, 2007. A twolocus global DNA barcode for land plants: the coding rbcLa gene complements the noncoding trnHpsbA spacer region. PLoS One, vol 6, pp.110. 2. Levin R.A., Wagner W.L., Hoch P.C., Nepokroeff M, Pires J.C, Zimmer E.A, Sytsma K.J.., 2003. Familylevel relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcLa and ndhF data. American Journal of Botany, vol 90, pp.107115. 3. Hall T.A., 1999. BioEdit: a user friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 9598NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. Vol 41, pp.9598. 4. Carneiro D.M.C., Brambach, F., Jair H.B.K., Krutovsky, K. V., Kreft, H., Tjitrosoedirdjo, S. S., . . . Gailing, O. (2019). Integrating DNA Barcoding and Traditional Taxonomy for the Identification of Dipterocarps in Remnant Lowland Forests of Sumatra. Plants, 8(11), 461. 5. Doyle J.J. and Doyle J.L., 1990. Isolation of Plant DNA from fresh tissue. Focu, vol 12(6), pp. 13 – 15. 6. Nguyễn Văn Đạt và Trần Thị Phương Anh, 2015. Đặc điểm hình thái các chi trong họ ngũ gia bì ở Việt Nam. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr. 69 75. 7. Võ Văn Chi, 2012. Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 1. NXB Y học Hà Nội, tr. 937938. 8. Phạm Hoàng Hộ, 2003. Cây cỏ Việt Nam, tập 1. NXB Trẻ, Hà Nội,tr. 516 – 518. 9. Nguyễn Thị Ánh Tuyết,, Nguyễn Thuý Anh Thư, Nguyễn Thuý Hằng, Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Kim Phi Phụng (2009). Oleanane saponins from Polyscias guilfoylei Bail. (Araliaceae). Tạp chí Phát triển Khoa Học và Công nghệ, ĐHQG TP. HCM. Tr. 2128. 10. Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Chemical examination of Polyscias guilfoylei Bail. family Araliaceae, Tuyển tập các công trình Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hoá hữu cơ toàn quốc lần thứ tư. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. Tr 561564. 11. Sanger S., Nicklen S., and Coulson A.R, 1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, vol 74 (12), pp. 5463–5467. 12. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006. Các phương pháp nghiên cứu thực vật. NXB Giáo dục.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

DNA

MSSV Lớp

Cần Thơ , 2021

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

DNA

MSSV:

Lớp

Cần Thơ , 2021

2

LỜI CẢM ƠN

Được sự phân công và sự hướng dẫn của Ts Thiều Văn Đường tôi đã

thực hiện đề tài “Xác định tên khoa học cây rau ngót trồng tại

thành phố Cần Thơ bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự

gen”.

Với lòng tri ân vô hạn, tôi xin chân thành bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban

Giám Hiệu Trường Đại học Tây Đô, Khoa Dược-điều dưỡng Trường Đại Học Tây Đô

Đặc biệt tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với TS.Thiều Văn Đường người đã

trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tận tình giúp đỡ để tôi

hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khoa học

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người bạn, cùng tập thể

sinh viên lớp Đại học Dược 12B đã quan tâm, động viên, khích lệ tôi rất nhiều trong

quá trình học tập và nghiên cứu

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Song

do hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không tránh khỏi những thiếu sót nhất

định mà bản thân chưa thấy được Tôi rất mong được sự góp ý của Thầy Thiều Văn

Đường để bài nghiên cứu được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành biết ơn và sẽ mãi mãi khắc ghi!

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Thanh Anh

(Ký ghi rõ Họ tên)

i

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đề tài: “Xác định tên khoa học cây rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen” là một công trình nghiên cứu độc lập không có

sự sao chép của người khác

Các số liệu sử dụng phân tích trong bài nghiên cứu có nguồn gốc

rõ ràng, đã công bố theo quy định Các kết quả nghiên cứu trongbài nghiên cứu do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực,khách quan và phù hợp với thực tiễn Việt Nam

Đề tài là một sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu trong quátrình học tập tại trường Đại học Tây Đô.

Sinh viên thực hiện Phạm Thị Thanh Anh (Ký ghi rõ Họ tên)

ii

iii

TÓM TẮT

TÍNH CẤP THIẾT

Hiện nay, với tốc độ phát triển không ngừng của y học, xu hướng bào chế thuốc

từ dược liệu đang là xu thế chung Rau ngót cũng đang được quan tâm vì ngoài việcxuất hiện như một loại rau trong các bữa ăn gia đình thì rau ngót còn là nguồn dượcliệu dễ tìm, dễ trồng, và có khá nhiều công dụng Vì thế, việc định danh cây rau ngót ởtừng địa phương để tìm ra nguồn dược liệu tối ưu nhất cả về chất lượng và chi phí cầnđược quan tâm

Dựa vào hình thái thực vật thì khó phân biệt được loài và chưa đủ cơ sở khoahọc để định danh đúng loài đối với một số loài thực vật có hình thái giống nhau Trongcác tài liệu về cây thuốc, tên khoa học của cây rau ngót được xác định dựa vào hìnhthái thực vật

Sauropus androgynus (L) Merr., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm phân tích một số đặc điểm hình thái, giải trình tựgen rau ngót Mẫu lá rau ngót được thu thập ở vườn Dược liệu Trường Đại học Tây

Đô Kết quả đã giải được trình tự đoạn gen rbcL của cây rau ngót có sự tương đồngtrình tự gen (100%) của loài Sauropus androgynus (L) Merr đã được công bố trênngân hàng dữ liệu Do đó bằng phương pháp giải trình tự ADN dựa trên đoạn gen rbcL

đã xác định được tên khoa học của cây rau ngót là Sauropus androgynus (L) Merr thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Kết quả này giúp khẳng định tên khoa học củacây rau ngót đã được định danh dựa trên cơ sở phân loại theo hình thái thực vật trướcđây

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đề tài này được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứuchính là:

- Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu

- Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng,(trình tự nucleotid gen ITS) của cây Rau ngót

- Xác định những công bố mới về tác dụng của cây Rau ngót đối vớichữa trị các căn bệnh đặc trị và vai trò dinh dưỡng đối với sức khỏecủa con người

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Đề tài đã tổng hợp và trình bày đặc điểm hình thái, vai trò củacây Rau ngót chữa trị một số bệnh thường gặp và vai trò dinh dưỡngcủa cây Rau ngót trên đất nước Việt nam

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Đề tài đã đưa ra 02 kiến nghị hợp lý nhằm mở rộng đề tài, nghiên cứu rộng về vai trò cây Rau ngót đối với sự phát triển kinh tế, xã hội tại Việt Nam

iv

v

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY RAU NGÓT 4

1.2.1 Khái niệm về chỉ thị 4

1.2.2 Phân loại 4

1.2.3 Đặc điểm hình thái 4

1 2 5 Đặc điểm sinh thái 7

Vị trí cây sinh trưởng: 7

Bộ phận được dùng để làm dược liệu: 7

Phương pháp thu hái, sơ chế và bảo quản: 7

Thời hạn sử dụng kể từ khi sơ chế: 8

Mùa thu hoạch trong năm: 8

1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 8

1.3.1 Khái niệm 8

1.3.2 Chiết xuất và tin sạch DNA 8

1.3.3 Phương pháp PCR 9

1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) 10

1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY RAU NGÓT VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 10 1.4.1 Dược liệu 10

Một số chú ý khi thu hoạch rau ngót: 11

1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 11

1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay 13

1.4.4 Một số lưu ý khi sử dụng cây rau ngót 13

1.4.5 Một số chế phẩm sử dụng hôm nay 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

vi

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15

2 1 1 Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 15

2 1 1 1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 15

Lá Rau ngót tươi, già, dày dặn, màu xanh đậm, vừa thu hoạch, không dập nát, không bị sâu hại, không héo úa 15

2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 15

Lá Rau ngót non, màu nhạt 15

Lá Rau ngót đã thu hoạch từ lâu 15

Lá Rau ngót bị sâu hại 15

Lá Rau ngót bị dập nát 15

2.1.1.3 Cách bảo quản mẫu 15

2 1 2 Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 18

2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tài liệu 18

Mục đích nghiên cứu tài liệu để thu thập được những thông tin sau: 18

- Cơ sở lý thuyết liên quan đến chủ đề nghiên cứu 18

- Thành tựu lý thuyết đã đạt được liên quan đến chủ đề nghiên cứu 18

- Kết quả nghiên cứu của đồng nghiệp đã công bố trên các ấn phẩm 18

- Chủ trương và chính sách liên quan đến nội dung nghiên cứu 18

- Số liệu thống kê 18

Thu thập tài liệu 18

+Trong ngành 19

+Ngoài ngành 19

+Phương tiện truyền thông 19

+Sơ cấp (primary data) 19

+Thứ cấp (secondary data) 19

vii

+Tam cấp (tertiary sources) 19

2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 19

Các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu khoa học: 19

3 1 KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 21

3 1.1 Vị trí thực mẫu 21

3 2 HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 21

3.2.1 Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 21

3.2.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 21

3 3 KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RAU NGÓT 21

3.3.1 Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 21

3.3.2 Kết quả giải trình tự gen DNA 21

3.3.3 Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 21

3 4 MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY RAU NGÓT 21

4.1 KẾT LUẬN 22

4.2 KIẾN NGHỊ 22

viii

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Thân cây Rau ngót 4

Hình 2 Lá cây Rau ngót 5

Hình 3 Rễ cây Rau ngót 5

Hình 4 Hoa cây rau ngót 6

Hình 5 Hạt cây Rau ngót 6

Hình 6 Quả cây Rau ngót 7

Hình 7 Bột Rau ngót Behena 14

Hình 8 Bột Rau ngót Taphashop 14

x

MỞ ĐẦU

Rau ngót là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới

Á châu nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước,trong đó có Việt Nam Cây rau ngót còn gọi là bồ ngót, bù ngót, hắcdiện thần (Trung Quốc).Tên khoa học Sauropus androgynus (L)Merr.Thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae

Rau ngót có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, giải độc –tiêu độc, thông huyết, bổ huyết, kháng khuẩn, tiêu viêm, nhuậntràng, chữa tưa lưỡi ở trẻ em, trị sót nhau, Ngoài ra, rau ngót cũngrất tốt cho đàn ông vì trong thảo dược này có chứa rất nhiều hoạtchất giúp tăng cường sinh lý nam như progesterone,glucocorticoid,

Trong Rau ngót có chứa các thành phần dinh dưỡng caonhư: 3,4% gluxit, 5,3% protein, 2,4% Trong đó chủ yếu là các thànhphần vitamin C và các axit amin thiết yếu Trong 100g rau ngót thì

có 0,13g methionin

Theo cựu đại tá, lương y đa khoa Bùi Hồng Minh (NguyênChủ tịch Hội Đông y Ba Đình, Hà Nội), trong Đông y, Rau ngót có tínhmát lạnh, vị ngọt, khi được nấu chín sẽ bớt đi tính lạnh Lá rau ngót

có tác dụng lợi tiểu, giảm độc, hoạt huyết… Nghiên cứu của y học hiện đại cho thấy, lượng chất đạm trong Raungót có thể so sánh với những loại đậu xưa nay nổi tiếng giàu đạm,

là loại đạm thực vật quý, hiếm có, còn vitamin C trong rau ngót thậmchí được cho là có hàm lượng cao hơn cả trong cam hay ổi

Tên cây Rau ngót trước đây được xác định là Phyllanthuselegans Wall Hiện nay tên này được dành cho cây rau sắngPhyllanthus elegans L thuộc cùng họ Nhưng gần đây nhất, trongquyển Arbres forestiers du Việt Nam, tome V., 198 tr 147, rau sắnglại được xác định là Meliantha suavis Pierre thuộc họ Opiliaceae

Vì là loại cây thân thuộc, dễ tìm, dễ trồng và dễ sử dụngnên cây Rau ngót đang được quan tâm hơn bao giờ hết, đặc biệt làtrong điều kiện khoa học kỹ thuật phát triển như hiện nay Việc địnhdanh cây Rau ngót vô cùng quan trọng để giúp xác định nguồn dượcliệu tối ưu và hiệu quả nhất

Việc xác định đúng tên khoa học để cung cấp số liệu chocác nghiên cứu tiếp theo là rất cần thiết Việc xác định tên khoa họccủa cây rau ngót, với hình thái bên ngoài có nhiều điểm tương đồng,

có thể thông qua phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với khóaphân loại thực vật hoặc phân tích ADN và so sánh với ADN gốc trongngân hàng gen

Hiện nay, cây Rau ngót được xác định chỉ dựa vào đặcđiểm hình thái, chưa có cơ sở khoa học chứng minh nguồn gốc Vìvậy, nghiên cứu này nhằm xác định chính xác tên khoa học của cây

Rau ngót dựa trên kết quả giải trình tự gen ADN của loài cây này, từ

đó bổ sung thông tin góp phần phát triển cây dược liệu này ở ViệtNam

Vì những lý do trên tôi quyết định thực hiện đề tài: “Xác

định tên khoa học cây rau ngót trồng tại thành phố Cần Thơ bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen”.

Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tửlàm công cụ xác định tiềm năng trở thành dược liệu của cây Rau ngót Để hoàn thànhmục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây:

- Khái quát được những hiểu biết về cây Rau ngót cho đến hiện nay

- Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Raungót

- Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Rau ngót

- Giải trình được trình tự gen ITS của cây Rau ngót làm chỉ thị phân tử

Từ đó xác định được tên khoa học của cây rau ngót trồng tại thành phố CầnThơ Từ đó bổ sung thông tin góp phần phát triển cây dược liệu này ở Việt Nam

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN

1.1.1 Trên thế giới

Rau ngót (Sauropus androgynus) là một loại cây bụi, bản địa củaĐông Nam Á được trồng ở Campuchia, Indonesia, Lào, Malaysia,Philippines, Thái Lan, Việt Nam và Ấn Độ Nó phát triển mạnh ở vùng khíhậu nhiệt đới trong các khu rừng mưa nhiệt đới nơi nó mọc cao từ 4 đến

6 feet

Thông tin thêm về cây Rau ngót mô tả nó như một bụi cây thẳng đứngvới nhiều thân và lá màu xanh đậm, hình bầu dục Ở vùng khí hậu nhiệtđới, cây vẫn giữ được màu xanh quanh năm, nhưng ở những nơi mát mẻhơn, bụi cây có thể sẽ rụng lá vào mùa đông chỉ để mọc lại vào mùaxuân Cây bụi nở hoa vào mùa hè và mùa thu với những bông hoa nhỏ,phẳng, tròn, màu vàng đến đỏ ở nách lá theo sau là một quả màu tím vớinhững hạt đen nhỏ Phải mất hai cây bụi rau ngót để thụ phấn và tạoquả

Rau ngót được ăn ở châu Á, cả sống và chín Cây bụi được trồng ở cáckhu vực bóng râm, tưới thường xuyên và bón phân để tạo ra những mẹomềm phát triển nhanh chóng tương tự như măng tây Cây rất bổ dưỡngvới khoảng một nửa dinh dưỡng là protein!

Cũng như vô cùng bổ dưỡng, rau ngót có dược tính, một trong số đó làkích thích sản xuất sữa ở các bà mẹ cho con bú

Một lời cảnh báo, tiêu thụ quá nhiều lá hoặc nước ép Rau ngót thô đã dẫnđến các vấn đề về phổi mãn tính Tuy nhiên, Rau ngót phải mất khánhiều nguyên liệu để gây ra bất kỳ vấn đề nào và hàng triệu người ăn nómỗi ngày mà không có ảnh hưởng xấu

Trồng cây bụi Rau ngót tương đối dễ dàng, miễn là bạn sống trong mộtkhu vực ẩm ướt, nóng hoặc có thể bắt chước các điều kiện như vậy trongnhà kính Khi trồng cây bụi Rau ngót, nó sẽ hoạt động tốt nhất ở khu vựcbóng râm, giống như tầng dưới của rừng mưa nhiệt đới, nhưng nó cũng

sẽ hoạt động tốt dưới ánh mặt trời đầy đủ với điều kiện bạn giữ cho đấtẩm

Rau ngót dễ dàng được nhân giống thông qua việc giâm cành đặt trongnước hoặc đặt trực tiếp vào đất trong khu vực râm mát ẩm ướt Rõ ràng,cây bụi có thể phát triển đến một chân trong một tuần trong điều kiện lýtưởng, mặc dù nó có xu hướng lật lên khi nó quá cao Vì lý do này và đểkhuyến khích những chồi non mới, việc cắt tỉa thường xuyên được thựchiện bởi những người trồng trọt châu Á

3

1.1.2 Ở Việt Nam

Cây Rau ngót còn gọi là bồ ngót, bù ngót, hắc diện thần (Trung Quốc) làmột loài cây thường thấy ở các vùng nhiệt đới Á Châu Và ở một số nướctrong đó có Việt Nam loại rau này được sử dụng như là một loại rau ăn,đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc Ngoài là loại thức ăn bổ dưỡng thì cây raungót cũng được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY RAU NGÓT

1.2.1 Khái niệm về chỉ thị

Rau ngót, bù ngót, bồ ngót, hay rau tuốt (danh pháp hai phần: Sauropusandrogynus) là một loài cây bụi mọc hoang ở vùng nhiệt đới Áchâu nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số nước, nhưở Việt Nam

1.2.2 Phân loại

Phân loại khoa học

Phân tông (subtribus) Flueggeniae

Hình 1 Thân cây Rau ngót

1.2.3.2 Lá

Lá cây Rau ngót hình bầu dục, mọc so le; sắc lá màu lục thẫm, cuống lárất ngắn chỉ khoảng từ 1 đến 2mm Phiến lá mỏng, láng mịn và khôngthấm nước

Khi hái ăn, thường chọn lá non Vị rau tương tự như măng tây

Hình 2 Lá cây Rau ngót

1.2.3.3 Rễ cây

Rễ củ, vị hơi đắng, được dùng để chữa bệnh trong Đông y

5

Hình 5 Hạt cây Rau ngót

1.2.3.5 Quả

Quả cây Rau ngót có hình cầu, màu trắng ngà

Hình 6 Quả cây Rau ngót

1 2 5 Đặc điểm sinh thái

Vị trí cây sinh trưởng:

Cây Rau ngót là loài cây mọc hoang, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đớichâu Á Loại cây này cũng được trồng nhiều ở nước ta và thường lấy lárau ngót để nấu canh hoặc làm thuốc

Bộ phận được dùng để làm dược liệu:

Người ta sẽ sử dụng lá và rễ cây Rau ngót để làm dược liệu

Phương pháp thu hái, sơ chế và bảo quản:

7

Để làm thuốc, người ta thường chọn các cây Rau ngót có tuổi đời trên 2năm Sử dụng các lá tươi và rễ tươi cũng như sơ chế ngay khi thu hái về

Lá và rễ Rau ngót rất dễ héo và úng, vì thế tốt nhất là nên sử dụng trongngày Nếu có nhu cầu sử dụng qua ngày, dược liệu cần phải được bảoquản trong tủ lạnh

Thời hạn sử dụng kể từ khi sơ chế:

Sử dụng ngay trong ngày ngay sau khi thu hoạch và sơ chế

Mùa thu hoạch trong năm:

Cây Rau ngót có thể thu hái quanh năm với những cây đã được trồng từ 2năm trở lên

1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ

1.3.1 Khái niệm

Chỉ thị phân tử (molecular marker) hay còn gọi là chỉ thị di truyền(genetic marker) ở thực vật là đoạn DNA ngắn có liên kết chặt chẽ vớigen quy định một tính trạng cụ thể của cây trồng, tạo nên tính đặc trưng

để phân biệt giữa các cá thể (Ví dụ: tính kháng sâu hoặc bệnh, màu sắc hoặc kíchthước quả hạt, ) Điều đặt biệt là những chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài màdựa trên sự khác biệt về trình tự gen giữa các cá thể Nhờ tính liên kết chặt chẽ với tínhtrạng đang khảo sát, chỉ thị phân tử được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, do đó nóđược sử dụng như một công cụ hữu ích trong việc chọn lọc giống

Hiện nay, chỉ thị phân tử DNA có các dạng phổ biến như:

Chỉ thị phân tử của trình tự đa hình từng nucleotid ( Single Nucleotid Polymorphism –SNP) là sự khác biệt trong trình tự DNA ở một nucleotid;

Chỉ thị phân tử tử của các trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR ) lànhững đoạn ngắn của DNA có chứa từ 2 đến 6 nucleotid có trình tự lặp lại từ 2 đến 40 lần;Chỉ thị phân tử đa hình của các đoạn cắt giới hạn (Cleave Amplified PolymorphicSequences – CAPS ) là sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA bị cắt bởi enzyme cắt giớihạn tại vị trí nucleotid khác biệt giữa hai cá thể;

Chỉ thị phân tử đa hình của các đoạn khuếch đại (Amplified Fragment LegthPolymorphism - AFLP ) là sự khác biệt về độ dài của các đoạn DNA đại diện choc ac alenkhác nhạu khi khuếch đại

1.3.2 Chiết xuất và tin sạch DNA

1.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số:

ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết ADN DNeasy plantmini kits (QIAGEN, USA) ADN toàn phần đượckiểm tra lại bằng phương pháp điện di trêngel agarose

1.3.2.2 Điện di ADN trên gel agarose

8