ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THIÊN THẢO TRỒNG TẠI AN GIANG BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG …………..o0o………….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THIÊN THẢO TRỒNG TẠI AN GIANG BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG Họ và tên: MSSV: Lớp: Cần Thơ , 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG …………..o0o………….. ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY THIÊN THẢO TRỒNG TẠI AN GIANG BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG Họ và tên: MSSV: Lớp: Cần Thơ , 2021 LỜI CẢM ƠN Quá trình thực hiện tiểu luận tốt nghiệp là giai đoạn quan trọng nhất trong quãng đời mỗi sinh viên. Tiểu luận tốt nghiệp là tiền đề nhằm trang bị cho em những kỹ năng nghiên cứu, những kiến thức quý báu trước khi lập nghiệp. Trước hết, em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Dược – Điều dưỡng, Trường Đại Học Tây Đô đã tận tình chỉ dạy và trang bị cho em những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian ngồi trên ghế giảng đường, Làm nền tảng cho em có thể hoàn thành được bài luận văn này. Em xin trân trọng cảm ơn thầy TS. Thiều Văn Đường đã tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học. Đó là những góp ý hết sức quý báu không chỉ trong quá trình thực hiện tiểu luận này mà còn là hành trang tiếp bước cho em trong quá trình học tập và lập nghiệp sau này. Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp Đại Học Dược 12B, những người luôn sẵn sàng sẻ chia và giúp đỡ trong học tập và cuộc sống. Mong rằng, chúng ta sẽ mãi mãi gắn bó với nhau. Xin chúc những điều tốt đẹp nhất sẽ luôn đồng hành cùng mọi người.” Sinh viên thực hiện (Ký ghi rõ Họ tên) Trần Khánh Duy LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân em và được sự hướng dẫn khoa học của TS. Thiều Văn Đường. Các nội dung nghiên cứu trong đề tài “Xác định tên khoa học cây Thiên Thảo trồng tại tỉnh An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA” của em là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được cá nhân thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung bài tiểu luận của mình. Sinh viên thực hiện (Ký ghi rõ Họ tên) Trần Khánh Duy TÓM TẮT TÍNH CẤP THIẾT Cây thiên thảo là cây hàng năm với chiều cao khoảng 40cm. Đây là một cây thuốc quý thường được sử dụng trong đông y. Từ lâu, cây Thiên thảo đã được sử dụng chữa xương khớp (phong thấp, đau lưng, mỏi khớp), đầy bụng, trướng bụng, ăn không tiêu. Theo y học cổ truyền, dược liệu Thiên thảo ở Khánh Hoà, nhân dân dùng toàn cây sắc thuốc chữa bạch đới, khí hư. Lá trị phong thấp, kinh phong, tim đập nhanh, bệnh thần kinh (Theo Phạm Hoàng Hộ). Đây là loại cây rất có tiềm năng để khai thác về mặt dược lý, trong tương lai có thể trở thành một dược liệu có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, việc “Xác định tên khoa học của cây Thiên thảo (Basilicum polystachyon (L.) Moench (Lamiaceae)) trồng tại An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA” rất cần thiết. Thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu khẳng định tên khoa học cây Thiên thảo bằng chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử và vai trò cây Thiên thảo chữa trị bệnh đối với sức khỏe con người. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài này được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứu chính là: Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu. Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng, (trình tự nucleotid gen ITS) của cây Phước lộc thọ theo phương pháp Sanger. Xác định những công bố mới về tác dụng của cây Thiên thảo đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị đối với sức khỏe của con người. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đề tài đã tổng hợp và trình bày tương đối đầy đủ tên khoa học, đặc điểm hình thái, vai trò của cây Thiên thảo chữa trị một số bệnh thường gặp trên đất nước Việt nam. Chiết xuất và tinh sạch DNA, giải trình tự gen DNA theo phương pháp Sanger trình tự gen ITS của cây Thiên thảo làm chỉ thị phân tử trong phân loại.. Một số công bố mới về tác dụng của cây Thiên thảo đối với chữa trị các căn bệnh đặc trị đối với sức khỏe của con người. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đề tài đã công bố được 04 kết luận chính xác, tin cậy và xác định đúng tên khoa học của cây Thiên thảo. Đưa ra 02 kiến nghị hợp lý nhằm mở rộng đề tài, nghiên cứu rộng về vai trò cây Thiên thảo đối với sự phát triển kinh tế, xã hội tại Đồng bằng Sông Cửu Long.. MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 3 1.1.1 Trên thế giới 3 1.1.2 Ở Việt Nam 3 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY THIÊN THẢO 3 1.2.1 Khái niệm về chỉ thị 3 1.2.2 Phân loại 3 1.2.3 Đặc điểm hình thái 4 1.2.4. Đặc điểm vi phẫu 6 1.2.5. Đặc điểm sinh thái 8 1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 9 1.3.1 Khái niệm 9 1.3.2 Chiết xuất và tinh sạch DNA 9 1.3.3 Phương pháp PCR 10 1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) 11 1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY THIÊN THẢO VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 11 1.4.1 Dược liệu 11 1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 12 1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay 12 1.4.4. Một số lưu ý khi sử dụng cây Thiên Thảo 12 1.4.5. Một số chế phẩm sử dụng hôm nay 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14 2.1.1. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 14 2.1.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu 14 2.1.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ 14 2.1.1.3. Cách bảo quản mẫu 14 2.1.2. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị 14 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 14 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái 15 2.2.2. Phương pháp chỉ thị phân tử 15 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 20 2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết 20 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu 20 2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 21 3.1.1. Thân. 21 3.1.2. Lá 21 3.1.3. Rễ 21 3.1.4. Hoa 21 3.1.5. Quả 21 3.1.6. Hạt 21 3.2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 21 3.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 21 3.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 21 3.3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP 21 3.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 21 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA 21 3.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 21 3.4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY THIÊN THẢO 21 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 22 4.1. KẾT LUẬN 22 4.1.1.Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí: 22 4.1.2. Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây Thiên Thảo 22 4.1.3. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên Thảo và trình tự gen của cây này 22 4.2. KIẾN NGHỊ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 PHỤ LỤC 24 Phụ lục A 24 Phụ lục B. Quy trình ly trích DNA 25 Phụ lục C. CÁC HÌNH ẢNH CÂY THIÊN THẢO TẠI AN GIANG 27 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình thái cây và cụm hoa 4 Hình 2. Cành cây, hoa, đài hoa chia đôi, tràng hoa chia đôi. 5 Hình 3. Thân và rễ cây 5 Hình 4. Hoa và tán cây 5 Hình 5. Hạt cây 6 Hình 6. Mặt cắt ngang của cuống lá cho thấy các vùng khác nhau 8 Hình 7. Ảnh hiển vi SEM của hạt phấn và hạt của cây. 9 Hình 8. Kinh Mạch Xương Khớp – Thiên Thảo Mộc 14 Hình 9. Thảo Linh Tiên 14 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất 16 Bảng 2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR 18 Bảng 3. Chương trình cài đặt các bước 19 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Kí hiệu chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 1 DNA Deoxyribonucleic Acid 2 SEM Scanning Electron Microscope 3 PCR Polemerase Chain Reaction 4 SDS Sodium Monododecyl Sulfate 5 TE Dung Dịch Đệm Te Chứa Tris 6 EB Dung Dịch Thu Hồi DNA Elution Bufer 7 ITS Internal Transcribed Spacer 8 EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng những loài cây hoang dại để làm thức ăn, vật liệu xây dựng, chất đốt, thức ăn gia súc hay làm đồ gia dụng và đặc biệt hơn là được dùng làm thuốc chữa bệnh. Lúc này, người ta chỉ biết dùng cây cỏ mọc hoang dại để làm thuốc trị một số chứng bệnh thông thường như cảm, sốt, đau đầu, bệnh ngoài da. Sau này, đi sâu tìm hiểu về cây cỏ chữa các bệnh nan y về gan, thận, tim mạch… Cho đến ngày nay, dù cho khoa học hiện đại phát triển theo hướng sử dụng hóa chất làm thuốc chữa trị thì cây cỏ làm thuốc vẫn đóng một vai trò quang trọng trong nền Y học cổ truyền và chính là nguồn nguyên liệu quý giá cho nhiều loại thuốc hiện đại có nguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên. Nước ta nằm trong vùng vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, có địa hình thay đỗi từ Bắc chí Nam, nhiệt độ và lượng mưa trung bình hằng năm phân bố không đồng đều đã tạo nên nhiều kiểu thảm thực vật quan trọng, với nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú và đa dạng chủng loại, trong đó có nguồn tài nguyên cây thuốc. Theo thống kê của Viện Dược liệu (Bộ Y tế), tính đến cuối năm 2016 đã ghi nhận và thống kê được ở Việt Nam có 5.117 loài thực vật có giá trị làm thuốc, đóng một vai trò đặc biệt quan trọng trong việc cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu sản xuất thuốc trong nước và xuất khẩu thế giới. Tuy nhiên, do tình trạng khai thác tài nguyên quá mức, nạn cháy rừng, nóng lên toàn cầu, cũng như áp lực gia tang dân số và nhu cầu sử dụng thuốc chữa bệnh ngày càng nhiều, đặc biệt là các dược liệu nguồn gốc tự nhiên rất được ưa chuộng, dẫn đến nguồn tài nguyên cây thuốc ngày một bị cạn kiệt, nhiều loài cây thuốc đang phải đối mặt với nguy cơ bị tuyệt diệt. Bên cạnh đó, một số loại cây được phát hiện khá sớm ở thời điểm khoa học chưa tiên tiến hay ở những địa điểm mà trình độ kỹ thuật không cao. Điều này rất dễ dẫn đến việc sai sót trong đánh giá tiềm năng chữa bệnh của một số cây. Một số cây khi phát hiện chỉ được nghiên cứu sơ bộ về mặt hình thái hay thậm chí là những mô tả mơ hồ về hình dáng bên ngoài cây. Chính điều này khiến một số cây đáng ra có thể có tiềm năng trở thành một vị thuốc, một dược liệu, lại chỉ được con người dùng như một cây cảnh để trang trí. Điển hình như cây Thiên thảo. Về mặt dược liệu, hầu như không có bất cứ tài liệu khoa học nào nghiên cứu về cây Thiên thảo, cho nên về mặt tác dụng dược lí hầu như là không được biết đến. Điều này có thể do loại cây này lúc được phát hiện đã không được nghiên cứu kỹ. Nói đến cây Thiên thảo sự hiểu biết và mô tả theo chỉ thị hình thái mới được trình bày từ những năm 70 thế kỷ trước. Điều này khiến cho hiểu biết của chúng ta về loại cây này hầu như là rất sơ khai. Đến nay nghiên cứu DNA các cây dược liệu trở thành xu hướng chung trong nghiên cứu dược liệu. Mục đích việc xác định chính xác loài dược liệu là vô cùng cần thiết, vì khi xác định chính xác mới tìm kiếm và sử dụng tốt các sản phẩm của dược liệu. Đây chính là cơ hội cho chúng ta tìm ra những dược liệu mới từ những loại cây mà chúng ta đã lãng quên vì cho rằng chúng chỉ mang tính trang trí. Đến nay, việc tìm hiểu đầy đủ về cây Thiên thảo để đưa loại cây này thành thuốc và thực phẩm chức năng trở thành yêu cầu tất yếu với các nhà Dược học. Sự phát triển vượt bậc của công nghệ DNA và giải trình tự gen từ cuối thế kỷ XX cho tới nay, trở thành công cụ chính xác và kịp thời đã giúp xác định các loài cây cũng như cây làm dược liệu không còn khó khăn. Chỉ thị phân tử trở thành công cụ chính xác tuyệt đối trong phân loại thực vật, động vật. Nhiệm vụ của chúng tôi dựa trên các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để xác định chính xác cây Thiên thảo. Đưa chỉ thị này trở thành chỉ thị chính xác định ngay mà không còn phải chờ đợi thời gian. Vì những lý do trên đi đến thực hiện đề tài “Xác định tên khoa học cây Thiên Thảo trồng tại tỉnh An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA”. Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tử làm công cụ xác định tiềm năng trở thành dược liệu của cây Thiên thảo. Để hoàn thành mục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây: Khái quát được những hiểu biết về cây Thiên thảo cho đến hiện nay. Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Thiên thảo. Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên thảo. Giải trình được trình tự gen ITS của cây Thiên thảo làm chỉ thị phân tử. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 1.1.1 Trên thế giới Basilicum polystachyon (L.) Moench là một loài thực vật thuộc chi Lamiaceae, phân bố nhiều ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Á và Châu Úc. Loài này được tìm thấy ở phía nam của Đài Loan trong thời kỳ thuộc địa của Nhật Bản, không có tài liệu thu thập nào được thấy sau giải phóng, theo số liệu thu thập thực địa gần đây, loài này được tìm thấy ở những vùng đất trống và hoang vu phía nam Đài Loan. Bài báo này mô tả các đặc điểm phân loại, ảnh và sự phân bố của nó và lần đầu tiên báo cáo rằng nó là hạt phấn 6 khe có kiểu hình lưới trên bề mặt và nhiễm sắc thể 2n = 60. Loài này được (L.) Moench mô tả khoa học đầu tiên năm 1802. 1.1.2 Ở Việt Nam Thường mọc ở chỗ đất hoang từ Thừa Thiên Huế tới Cần Thơ. Được dùng như các vị thuốc Dân gian, chưa có nhiều nghiên cứu khoa học. 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY THIÊN THẢO 1.2.1 Khái niệm về chỉ thị Để phân biệt các cá thể khác nhau của cùng một loài, người ta thường dùng chỉ thị di truyền. Chỉ thị đi truyền là một tính trạng hay một thuộc tính có thể đo đếm được và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Theo Paterson và cộng sự, một tính trạng được coi là chỉ thị đi truyền nhất thiết phải bảo đảm hai tiêu chuẩn: Phải phản ánh được sự đa hình giữa bố và mẹ. Phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau. Các chỉ thị dị truyền có vai trò như thế nào đối với các nghiên cứu di truyền và chọn giống.Chỉ thị di truyền rất hữu ích trong việc nghiên cứu sự thừa kẻ những dấu hiệu đi truyền và sự biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là những chỉ thị liền quan đến tính trạng nông sinh học có lợi cho con người. Những chỉ thị này từ lâu đã là những công cụ có ích trong chương trình chọn giống (Retter và ctv 1993). Dựa vào 2 tiêu chuẩn của chỉ thị di truyền, người ta phân loại chỉ thị di truyền thành: chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tư DNA. 1.2.2 Phân loại Tên khoa học: Basilicum polystachyon (L.) Moench (Lamiaceae). Họ: Hoa môi Lamiaceae. Tên khác: Sonakki poondu (Tamil), Thiến thảo, Phòng phong thảo, Thổ hoắc hương. Basilicum polystachyon war. stereocladum Briq, Ocimum dimidiatum,… 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.2.3.1 Thân Cây thảo sống trên cạn, không thơm, cao đến 0,7 m; thân mọc thẳng, phân nhánh nhiều, màu xanh lục, có lông và có tuyến dọc theo các góc, màu đỏ trên các nốt sần. Hình 1. Hình thái cây (A) và cụm hoa (B) của Basilicum polystachyon (L.) Moench 1.2.3.2 Lá Phiến lá hình tam giác hình trứng hoặc hình mũi mác 27 × 15 cm, đỉnh hẹp hình chóp nhọn hoặc hình chóp, đáy rộng hình nón tròn, mép có răng cưa, màng, nhánh con xen lẫn tuyến vàng; cuống lá dài 25 cm, hình chóp. Hình 2. Basilicum polystachyon: A. Cành cây; B. Hoa; C. Đài hoa chia đôi (mặt lưng); D. tràng hoa chia đôi (mặt bụng); E. Gynoecium; F. Đai ốc. 1.2.3.3 Rễ cây Hình 3. Thân và rễ cây 1.2.3.4. Hoa Hoa nhỏ mọc thành vòng; lá bắc cỡ 1mm; đài 5 tai, một cái lớn và 2 cái rất hẹp, tràng đỏ, 4 tai gần như bằng nhau; 4 nhị. Cây ra hoa tháng 34. Hình 4. Hoa và tán cây 1.2.3.5. Quả Quả hạch có hình elip theo chiều dọc, màu nâu, hơi dẹt ở lưng và bụng, chiều dài khoảng 7 mm và có các sọc lồi giống lưới tròn trên bề mặt. Thời kỳ đậu quả: tháng 5 đến tháng 10. 1.2.3.6 Hạt Hình 5. Hạt cây 1.2.4. Đặc điểm vi phẫu Thân Mặt cắt ngang của phiến kính cho thấy biểu bì trên và biểu bì dưới. Biểu bì trên phân lớp đơn, tế bào hình chữ nhật, kích thước 8,614,221,6 x 68,712,8 µm; trichomes tuyến hoặc không tuyến được tìm thấy trên biểu bì trên. Tế bào biểu bì dưới có kích thước 9,213,615,4 x 5,46,27,6 µm. Mesophyll bao gồm nhu mô màng ngăn đơn phân lớp và 34 lớp nhu mô xốp, cả hai đều chứa đầy chất diệp lục. Nhu mô Palisade bao gồm một lớp tế bào được sắp xếp chặt chẽ, thuôn dài theo hướng tâm, có kích thước 19,53034,6 x 2,61015 µm. Nhu mô xốp sắp xếp lỏng lẻo, tế bào không đều và có kích thước 91214,6 x 59,410,5 µm. Các bó mạch là tài sản thế chấp, bao gồm xylem và phloem. Tế bào Xylem có kích thước 2,75,58 x 1,83,65,4 µm. Các tĩnh mạch được xếp lại, số lượng dây thần kinh bên ít hơn, các đầu dây thần kinh kết thúc một cách mù quáng, số lượng tiểu đảo tĩnh mạch là 7,33 mỗi sq.mm và số kết thúc tĩnh mạch là 5,37 mỗi sq.mm. Khí khổng thuộc loại diacytic, được tìm thấy ở cả biểu bì trên và biểu bì dưới (lưỡng tính) (Hình 610). Chỉ số khí khổng cho biểu bì trên là 16,6 trên một đơn vị diện tích và 19,7 trên một đơn vị diện tích cho biểu bì dưới. Lá Phần ngang của cuống lá có dạng góc cạnh. Biểu bì 1 lớp, cấu tạo bởi các tế bào nhỏ hình chữ nhật. Bên cạnh biểu bì trên được tìm thấy 23 lớp nhu mô. Một số tế bào chứa đầy chất diệp lục tạo thành chlorenchyma. Mô đất nhiều lớp, nhu mô. Các bó mạch được sắp xếp rõ ràng, bao gồm x 2535,540,8 µm (Hình 1618). 4. Sợi có thành dày, lòng ống hẹp và có đầu nhọn, kích thước 157,6257,7319,4 x 5,713,8 15,8 µm (Hình 19). 5. Các bình có bề dày hình xoắn ốc hoặc có rỗ mắt, có kích thước 109,2153,3170 x 14,42328,7 µm (Hình 2022). Hình 6. 1. Habit. 2. Cành lá. 3. Lá khô (thuốc thô). 430: Các ký tự vi thể: 46 Mặt cắt ngang của cuống lá cho thấy các vùng khác nhau. 7 8. T. s. của lamina cho thấy các mô khác nhau. 9. Mô hình Venation. 10. Vỏ biểu bì trên cho thấy lỗ khí. 11. Vỏ biểu bì dưới cho thấy lỗ khí. Rễ Hoa Tràng hoa của loại cây này có 2 thùy trên và dưới hình môi, thùy môi trên. Phấn hoa của loài này có hình cầu và hình elip theo chiều dọc, có 6 rãnh, rãnh mảnh, trên bề mặt có hoa văn giống lưới, bên dưới có lớp hình trụ rõ ràng. Quả Hạt Hình 7. Ảnh hiển vi SEM của hạt phấn và hạt của cây Basilicum polystachyon (L.) Moench từ Đài Loan. A và B, chế độ xem hướng dẫn của một hạt phấn hoa có tầng hình lưới; C và D, hình chiếu từ cực của hạt phấn 6 colpate với tectum dạng lưới; E và F, đai ốc có bề mặt lưới (thanh = 5 μm đối với A, C và F; 1 μm đối với B và D, và 100 μm đối với E). 1.2.5. Đặc điểm sinh thái Cây Thiên Thảo dễ dàng phát triển với sự chăm sóc tối thiểu. Nó có thể thích nghi với ánh sáng lọc hoặc ánh nắng đầy đủ, nó có thể chịu bóng râm một phần hoặc toàn phần. Tuy nhiên, nó sẽ ra hoa nhiều hơn ở nơi ấm áp và nhiều nắng. Tưới nước thường xuyên và vừa phải. Nó thích một môi trường ẩm ướt. Thích đất ẩm, màu mỡ hoặc giàu mùn và thoát nước tốt. Nó có khả năng chịu mặn và phát triển tốt gần bãi biển.Thỉnh thoảng nên phun sương nếu thời tiết quá nóng và khô. 1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1.3.1 Khái niệm Nói chung thì chỉ thị (marker) là một dấu hiệu, một đặc trưng có thể nhận biết được giúp chúng ta phân biệt thứ này với thứ khác. Ví dụ, khi muốn phân biệt giữa lúa tẻ và lúa nếp chúng ta có thể quan sát hình thái của hạt; hạt lúa nếp thường tròn hơn hạt lúa tẻ. Khi đó, hình dạng hạt là một loại chỉ thị, gọi là chỉ thị hình thái (morphological marker). Tương tự, chỉ thị phân tử (molecular marker) hay chỉ thị di truyền (genetic marker) cũng là các dấu hiệu, hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể. Điểm khác biệt là những chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài mà là dựa trên sự khác biệt về trình tự gen của mỗi sinh vật. Chỉ thị phân tử thường là các đoạn DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể, và đoạn DNA này liên kết chặt với tính trạng đang khảo sát. Liên kết chặt có nghĩa là trong quá trình sinh sản, chỉ thị phân tử đó luôn được di truyền kèm với tính trạng đang khảo sát cho thế hệ con. Ví dụ: Giả sử ta cần chọn giống lúa kháng bệnh XYZ. Hiện tại, ta đã thu thập được 2 dòng lúa thuần L1 và L2 phục vụ cho việc lai tạo. Dòng L1 có năng suất cao, chất lượng gạo ngon nhưng lại dễ nhiễm bệnh. Dòng L2, có năng suất khá, chất lượng trung bình nhưng có khả năng kháng bệnh XYZ. Hi vọng là bằng cách lai tạo giữa L1 và L2 ta có thể thu được dòng F1 có năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh tốt. Nếu việc này được thực hiện bằng phương pháp chọn giống truyền thống thì sẽ mất rất nhiều thời gian. Đó là do sau mỗi lần lai tạo ta lại phải trồng con lai, đợi chúng trưởng thành và sau đó đánh giá từng tính trạng một. Như trong trường hợp này là phải đánh giá khả năng kháng bệnh, năng suất và chất lượng gạo. Nếu bằng cách nào đó chúng ta phát hiện được các chỉ thị phân tử (đoạn DNA) luôn xuất hiện kèm với (1) đặc điểm năng suất cao, (2) chất lượng tốt, và (3) kháng bệnh thì ta có thể sàng lọc bố mẹ hoặc con lai mong muốn ngay từ rất sớm dựa trên việc xác định những đoạn DNA này. Chỉ cần tách chiết DNA tổng số và tiến hành thêm vài bước phân tích nữa là được.Chúng ta tìm hiểu thêm về các chỉ thị phân tử thường dùng. 1.3.2 Chiết xuất và tinh sạch DNA Tách chiết DNA là một quá trình vật lý và hóa học được sử dụng để tinh lọc DNA từ một mẫu. Tách chiết DNA là một khía cạnh quan trọng trong bối cảnh sinh học phân tử và khoa học pháp y. Quy trình này gồm ba bước cơ bản. Ban đầu, các ô quan tâm sẽ được lấy. Tiếp theo, quá trình ly giải tế bào được tạo điều kiện để phá vỡ màng tế bào, màng tế bào mở ra và bộc lộ tế bào chất cùng với DNA. Các chất hoạt động bề mặt hoặc các chất tẩy rửa khác có thể được sử dụng để tách lipid khỏi màng tế bào trong khi các protein hiện diện được dị hóa bởi protease. Đây là một bước tùy chọn. Một khi tế bào bị ly giải, các phân tử bị dị hóa sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc kết tụ các phân tử dị hóa bởi các dung dịch muối đậm đặc. Tiếp theo là ly tâm dung dịch để tách các cục vụn ra khỏi DNA. Trong giai đoạn này, DNA đã biệt hóa được trộn với thuốc thử và muối được sử dụng trong chu kỳ tế bào. Để làm sạch nó hơn nữa, các bước sau có thể được sử dụng. Một phương pháp là kết tủa bằng etanol, bao gồm trộn etanol đá lạnh với mẫu DNA đã tách. DNA không hòa tan trong rượu và do đó tạo ra viên do sự tập hợp các phân tử DNA lại với nhau. Natri axetat được thêm vào trong quá trình này để tăng cường mức độ kết tủa bằng cách tăng cường độ ion. Ngoài quá trình kết tủa etanol, quá trình chiết xuất phenolcloroform cũng có thể được tạo ra cho việc này. Trong phương pháp này, phenol làm biến tính các protein có trong mẫu. Sau khi ly tâm, các protein bị biến tính sẽ vẫn ở trong pha hữu cơ trong khi các phân tử DNA được trộn với cloroform sẽ có trong pha nước. Cloroform sẽ loại bỏ dư lượng phenol. Sau khi chiết xuất xong, DNA được giữ hòa tan trong dung dịch đệm TE hoặc nước siêu tinh khiết. 1.3.3 Phương pháp PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó. Được phát triển năm 1983 bởi Kary Mullis, PCR là một kỹ thuật phố biến và không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học với nhiều ứng dụng khác nhau như nhân bản ADN để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựa trên bằng chứng về ADN, hoặc phân tích chức năng của gen; chẩn đoán các bệnh di truyền; xác định các dấu vân tay ADN (sử dụng trong khoa học pháp y và xác định quan hệ huyết thống ); phát hiện và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm. Năm 1993, Mullis được trao giải thưởng Nobel Hóa học cùng với Michael Smith cho nghiên cứu của mình về PCR. Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính ADN và tái bản ADN. Đoạn mồi (là đoạn ADN ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự ADN đích và ADN polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, ADN mới được tạo ra từ ADN khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân. Hầu như tất cả các kỹ thuật PCR sử dụng một ADN polymerase bền nhiệt, như Taq polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus). ADN polymerase này có hoạt tính lắp ráp tổng hợp sợi ADN mới từ các đơn phân nucleotide bằng cách sử dụng khuôn ADN sợi đơn và các đoạn ADN oligonucleotide ( hay còn gọi là ADN mồi), đây cũng là các thành phần bắt buộc để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA. Phần lớn các phương pháp PCR sử dụng chu trình nhiệt, nghĩa là, tiến hành xen kẽ quá trình gia nhiệt và giảm nhiệt các mẫu PCR thông qua một chuỗi các giai đoạn nhiệt khác nhau được xác định. Ở bước đầu tiên, hai sợi xoắn kép của ADN được tách ra ở nhiệt độ cao, quá trình được gọi là quá trình biến tính ADN. Ở bước thứ hai, nhiệt độ được hạ xuống và hai sợi ADN trở thành khuôn cho ADN polymerase tổng hợp đoạn ADN đích. Khả năng khuếch đại chọn lọc là do việc sử dụng mồi mang trình tự bổ sung với đoạn ADN đích khuếch đại dưới những chu trình nhiệt đặc hiệu. 1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) Giải trình tự ADN là quá trình xác định trình tự các bazo nucleotide (As, Ts, Cs và Gs) trong một đoạn phân tử ADN, Khởi đầu với sự phát hiện ra cấu trúc phân tử ADN, những bước tiến dài đã đạt được trong hiểu biết về tính đa dạng và phức tạp của phân tử ADN. Một loạt đổi mới về chất cũng như máy móc thiết bị đã khởi đầu cho dự án Hệ gen người. Ngày nay, giải trình tự ADN đã trở nên toàn diện, nhanh chóng và chính xác hơn nhiều. Phương pháp giải trình gen phổ biến hiện nay: Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (phương pháp Maxam – Gilbert). Phương pháp giải trình bằng enzyme hay phương pháp Dideoxy (phương pháp Sanger) Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của bộ môn sinh học hiện đại. Hiện nay, có rất nhiều máy giải trình tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger. 1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY THIÊN THẢO VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 1.4.1 Dược liệu 1.4.1.1 Cách thu hái Cây mọc hoang dại ở khắp nơi trong nước ta. Còn mọc ở nhiều nước nhiệt đới châu Á Người ta thường hái bộ phận trên mặt đất. 1.4.1.2 Cách bảo quản Nơi khô ráo, thoáng mát, tránh những nơi ẩm mốc, không nên đặt dược liệu ở những nơi gần mặt đất để tránh sâu bọ. 1.4.3.1 Chế biến Dùng tươi hay phơi khô. Sắc lấy nước uống. 1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 1.4.2.1. Theo Đông y Cây thiên thảo chữa phong thấp, đau nhức khớp xương, đầu gối: Thiên thảo 18g, Cỏ xước 18g, Cà gai leo 12g, Quế chi 6g, Thiên niên kiệu 12g, rễ cây Lá lốt 12g, Thổ phục linh 18g, Dây đau xương 12g, Cốt khí củ 12g. Sắc uống mỗi ngày một thang. Cây thiên thảo chữa phong thấp, đau lưng, mỏi các khớp xương: Thiến thảo 18g, Bướm bạc 12g, Cỏ xước 12g, Cà gai leo 12g, Quế chi 6g, rễ Rung rúc 12g, rễ cây Lá lốt 12g, Tỳ giải 18g, Dây đau xương 12g. Sắc uống mỗi ngày một thang. Bài thuốc chữa ăn không tiêu, đau bụng đầy hơi, bụng trướng, đi ngoài phân sống từ cây thiên thảo: Cỏ thiến thảo 20g, Nghệ đen 8g. Sắc uống mỗi ngày một thang. 1.4.2.2. Trong Tây y Từ 1963, Hồ Đắc Ân và cộng sự (1963, Bull Soc Chim Fr 1922) đã chiết được từ lá cỏ thiên thảo một chất có tinh thể độ chảy 148150℃, có công thức thô C_20 H_24 O_4 đặt tên là ovatodiolide. Năm 1965, H.Immer và cộng sự (Tetrahedron 21,211, 72131) đã xác định chất ovatodiolide có một nhân vòng tới 14 cacbon, 4 nối kép và là một dilacton. 1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay Vai trò đối với sức khỏe con người Năm 1963 Hồ Đắc Ân và Bửu Hội (1969 Therapie, XXIV, 627631) đã nghiên cứu một số tác dụng dược lý của cỏ thiên thảo và đã đi tới kết luận là cho chuột uống ovatodiolide với liều cao (250mg750mgkg) có tác dụng kích thích sự bài tiết mật của các tế bào gan (cholesretique), hàm lượng nước trong mật không thay đổi chứng tỏ ovatodiolide có tác dụng kích thích tiết mật thực sự. Trong thực nghiệm ovatodiolide không có tác dụng giảm co thắt cũng không có tác dụng kháng sinh rõ rệt. Ở Khánh Hoà, nhân dân dùng toàn cây sắc thuốc chữa bạch đới, khí hư. Lá trị phong thấp, kinh phong, tim đập nhanh, bệnh thần kinh (Theo Phạm Hoàng Hộ). Mới được dùng trong phạm vi nhân dân: Dân tộc miền núi vùng Nha Trang dùng lá và cây sắc uống chữa đau bụng. Tại Ấn Độ và Philipin được dùng chữa đau bụng và chữa sốt cơn. 1.4.4. Một số lưu ý khi sử dụng cây Thiên Thảo Cần phân biệt thiến thảo (Basilicum polystachyon (L.)) và thiến thảo (Tây thảo, Thiến căn, Huyết kiến sầu, Hoạt huyết đan, Địa huyết là rễ phơi hay sấy khô của cây Thiến thảo) có tên khoa học là Rubia cordifolia L. 1.4.5. Một số chế phẩm sử dụng hôm nay Hình 8. Kinh Mạch Xương Khớp – Thiên Thảo Mộc Hình 9. Thảo Linh Tiên CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Dược liệu cây Thiên Thảo trồng tại An Giang được thu thập để chiết xuất. 2.1.1. Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu Thu cây Thiên Thảo nguyên vẹn (đầy đủ thân, lá, rễ, hoa, quả,…). Cây còn tươi, không bị héo, vàng, không bị sâu, bệnh. Cây không non cũng không già. 2.1.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ Cây bị sâu, bệnh và héo, vàng. Cây bị khiếm khuyết hay bị hư hại một phần. Cây non quá hay già quá. 2.1.1.3. Cách bảo quản mẫu Sau khi thu mẫu theo tiêu chuẩn, để mẫu vào túi ni lông có nước hay thu cây có cẩ đất để giữ ẩm, không để cây bị héo. Khi xử lý mẫu xong, chúng ta trồng lại để tiến hành nghiên cứu các chỉ tiêu chưa đạt. 2.1.2. Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị Nguyên liệu: Mẫu lá của cây Thiên Thảo, thu 5 đến 6 lá nguyên vẹn, không bị sâu, bệnh để chiết xuất và phân tích DNA giải trình tự gen. Hóa chất PCR và điện di: PCRMix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Laddeer 1 kb phí (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh sạch (nước cất 2 lầnvà đã qua thanh trùng ở 121ºC trong 20 phút). Thiết bị Điện di ATTO CORPORATION AE 7344, máy điện di gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGETwin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystem – Malaysia), máy đọc gel bằng tia UV (BioBlockScientific, Pháp). Công cụ và máy xử lý Giải trình tự DNA và xác định gen ITS. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu . Thời gian bắt đầu: 29062021 Thời gian kết thúc: 15082021 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái Đặc điểm hình thái Quan sát và mô tả hình thái bên ngoài và vi phẫu cây Thiên Thảo. Dựa vào các phương pháp nghiên cứu thực vật của PGS.TS Trương Thị Đẹp (2010) có cải tiến, các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá, rễ, hoa, quả , hạt. Mỗi đặc điểm thực hiện 10 mẫu Thân: Đo hết phần thân trên trên mặt đất, từ mặt đất đến cuối chồi ngọn.. Lá: Đo hai chỉ số: Chiều dài lá từ cuống lá đến chót lá; chiều rộng phần phiến lá lớn nhất.. Rễ: Đo từ phần dưới mặt đất (miền trưởng thành) đến chóp rễ. Hoa: Đếm số tràng hoa, nhị và nhụy. Mô tả màu săc và hình dạng tràng hoa. Quả: Đo kích thước quả, mô tả màu săc và hình dạng quả. Hạt: Mô tả màu săc và hình dạng hạt, số lượng hạt trong một quả. Cách đo: Đặt thước có chia đơn vị đo cm và mm. Đặt thước song song với mẫu và vuông góc với mặt đất hoặc vuông góc giữa hai thước. Sau khi đo đủ mỗi chỉ số 10 mẫu ta lấy kích thước trung bình. 2.2.2. Phương pháp chỉ thị phân tử 2.2.2.1. Tách chiết tổng số và tinh sạch DNA Thu thập mẫu Thu thập mẫu lá tươi, tốt nhất khi lá còn non. Đông khô mẫu lá tươi dùng lâu dài. Tách chiết DNA Sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo CTAB cải tiến (protocol của Phòng Thí nghiệm Di truyền học Trường Đại học Tổng hợp Ghent, Vương Quốc Bỉ). 1. Thu 25 gam lá, Tốt nhất là lá non, lá non sẽ cho ta lượng DNA nhiều nhất. Lá không bị nấm, vi khuẩn, virus. Dùng tươi hoặc đông khô. 2. Cắt lá thành từng đoạn 3mm – 5mm vào ống eppendoft 2ml, lượng lá khoảng 23 ống. Mỗi ống cho vào 1 viên bi sắt chuyên dụng, đậy nắp lại. 3. Cho eppendoft chứa lá vào nitơ lỏng ( sau khi đã ngâm dụng cụ đựng eppendoft vào nitơ lỏng), khi đủ độ lạnh lấy dụng cụ và eppendoft chứa mẫu ra. Lắp vào máy nghiền 2 phút, nếu chưa mịn ta cho thêm 1 chu kỳ 2 phút nữa. 4. Cho thêm vào mỗi eppendoft 1ml Extraction buffer (EB) đã được đun cách thủy 650C trước đó 20 phút, trộn đều, cắm trong nước đá. Thêm vào mỗi eppendoft 50 µl S.D.S 10% (lượng S.D.S cho vào theo tỉ lệ 50µlml Wv). Ủ trong máy lắc nước thời gian 30 phút ở nhiệt độ 650C. Chú ý: trước khi cho dịch EB vào eppendoft ta cho thêm β Mecaptoethanol 0,2% theo tỷ lệ 7µl BME10ml EB, trộn đều. Trong quá trình ủ ở 650C, cứ 5 phút ta lại đảo bằng tay một lần. 5. Ly tâm bằng máy ly tâm lạnh 40C, tốc độ 13.500 vòngphút trong 20 phút. 6. Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang 1 ống eppendoft 2ml khác mới (ghi lại số của mẫu). Thêm 1ml isopropanol (đã giữ ở tủ lạnh – 200C), đảo bằng tay một cách nhẹ nhàng trong 5 phút. Rồi để vào tủ lạnh 40C trong 30 phút hoặc qua đêm. 7. Ly tâm lạnh 40C tốc độ 13.500 vòngphút trong 15 phút. 8. Đổ hết dịch nổi phía trên chỉ giữ lại tủa ở dưới đáy eppendoft để khô tự nhiên, thêm vào 400µl TE 8.0 (10:0.1). Cho vào ủ ở 650C trong 5 phút. Lấy ra búng cho tan tủa hoặc dùng pipetteman 200 hoặc 20 để hòa tan tủa (có thể để tan tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ 40C) 9. Cho 3µl RNase (10mg1ml) vào mỗi ống, trộn đều eppendoft bằng tay. Ly tâm cho lắng xuống khi tốc độ đạt 2000 vòng thì dừng lại. Ủ ở 370C trong 6 giờ, sau đó cho vào giữ ở 40C (có thể ủ qua đêm) cho tới khi làm tiếp bước 10. 10. Thêm vào mỗi eppendoft 400µl đệm CTAB và ủ trong bình cách thủy 650C, trong 15 phút. Thỉnh thoảng đảo trộn đều bằng tay. 11. Cho vào tủ hood, cho thêm 800µl Choloroform: isomylalcohol (24:1) vào mỗi eppendoft, lắc trộn bằng tay từ 57 phút. 12. Ly tâm ở 13.500 vòngphút trong 10 phút. 13. Dùng pipetteman hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang ống eppendoft mới (ghi lại số ống). 14. Lặp lại bước 11. 15. Lặp lại bước 12. 16. Lặp lại bước 13. 17. Thêm 1400 µl ethanol 96% (đã làm lạnh) và giữ trong tủ lạnh – 200C qua đêm. 18. Ly tâm 13.500 vòngphút ở 40C trong 30 phút, loại bỏ cồn giữ lại kết tủa ở dưới đáy ống. 19. Rửa tiếp bằng 400 µlethanol 70% (đã làm lạnh) ly tâm 13.500 vòngphút trong 5 phút ở 40C. Sau đó đổ ethanol giữ tủa lại. 20. (Lặp lại bước 19). 21. Đổ ethanol giữ tủa lại để khô tự nhiên hoặc cho vào máy ly tâm khô chân không khoảng 10 phút để làm khô DNA. 22. Cho thêm vào mỗi eppendoft 50µl TE (10:0,1) để hòa tan DNA. 23. Giữ DNA trong tủ lạnh – 200C, dùng dần. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất. Bảng 1. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất Đệm CTAB (EB) 500ml + CTAB 2% 10 gam CTAB + EDTA(pH:8) 0,5M 50ml + NACL 2M 200ml 5M + Tris. Cl (pH = 7.5) 0,2M 100ml 1M(pH = 7,5) isopropanol (2Propanol) SDS 10% βMercaptoethanol : 0,2% TE pH 8 (10:0,1) + 600µl Tris.HCL 1M pH = 8 + 12µl EDTA 0,5M pH = 8 + Thêm dH2O cho đủ V = 60ml. RNase – 10mg RNase10ml H2O đun sôi 1015 phút, giữ trong 200C. Hỗn hợp Chloroform: isoamylalcohol (24:1). Ethanol tuyệt đối và ethanol 70% giữ ở 200C. 2.2.2.2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA Độ tinh sạch DNA của lá Thiên Thảo được kiểm tra bằng cách xác định O.D ở 260nm và O.D ở 280nm trên máy quang phổ kế. Tỷ lệ O.D260O.D280 trong khoảng từ 1,61,8 là DNA đủ độ tinh sạch. Tỷ lệ O.D260O.D280 nhỏ hơn giới hạn trên thì DNA không tinh sạch mẫu còn lẫn protein hay tạp chất nào đó. Nồng độDNA được tính theo công thức: DNA = (µl)⁄ml=(O.D260x50x5)1000 50 là độ pha loãng, khi mỗi cuvet mẫu đo ta chỉ cho 2µl mẫu. 2.2.2.3. Kỹ thuật phân tích DNA bằng chỉ thị vi vệ tinh (SSR) Chuẩn bị gel agarose Cân 1g agarose, đun sôi trong 100ml 1xTAE cho đến khi agarose tan hết. Để nguội xuống còn 500600C, cho thêm 4µl EtBr, lắc đều, Đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài lược sẵn, để nguội, rút lược ra. Đặt khay gel vào bể điện di và cho 1xTAE ngập gel từ 23mm. Tra mẫu điện di: lần lượt tra mẫu vào các giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu). Mẫu là DNA trộn với thuốc nhuộm Bromophenol blue 0,25% và nước cho đủ 10µl (2:2:6) (vvv). Cường độ dòng điện và thời gian chạy điện di phụ thuộc vào mẫu điện di và mục đích sử dụng. Thường để thuốc nhuộm qua giếng 2mm. Kiểm tra mẫu điện di trên máy soi DNA (tia UV) Hóa chất: 1xTAE được pha từ dịch gốc 20xTAE 20xTAE: + 96,8g Tris base + 22,84 ml glacial acetic acid + 40 ml EDTA 0.5M Chỉnh pH = 8 bằng Acetic acid Thêm H2O khử trùng đủ 1 lít Thuốc nhuộm Bromophenol Blue 0,25% Bromophenol Blue 0,05g 40% Saccharose trong nước 8g H2O khử trùng Thêm H2O cho đủ 20ml Kỹ thuật này được thực hiện theo phương pháp của Phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Khoa thực vật và Thổ nhưỡng, thuộc trường ĐH Công nghệ Texas, ở Hòa Kỳ. Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR Bảng 2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR Thành phần Thứ tự Thêm vào Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng Nước cất 2 lần đã khử ion, khử trùng 1 X 5xPCR Buffer (với dNTP, mỗi loại 10µl + 10µl BSA +450 µl dH2O) 2 4 1x(dNTP= 200µl) MgCl2 3 0,64 15mM Mồi thuận (10µM) 4 y 0,2µM Mồi nghịch (10µM) 5 0,2µM TaqDNA polymerase (5unitsµl) 6 0,3 1.5 Units ADN khuôn (30ngµl) 7 3 90ng20µl Tổng thể tích 20µl Để làm phản ứng, Pha DNA khuôn (template) của các mẫu đồng nhất 30nglµl. Kiểm tra mồi để làm phản ứng, với các mồi còn tốt chỉ dùng 0,32µl (10µMµl) cho một phản ứng (tổng số 20µl) Trình tự primer ITS ITS 1 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’ ITS 4 5’TCCTCCGCTTATTG ATATGC Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: Sau khi làm xong phản ứng ta ly tâm 2000vphút, cho mẫu lắng xuống bằng máy ly tâm cân bằng. Khi tốc độ đạt 2000vphút ta lấy ra. Tiến hành phản ứng PCR. Mỗi phản ứng PCR chúng tôi thường chạy 30 chu kỳ. Chường trình chạy phụ thuộc nhiệt độ ủ (annealing) của mồi . Thường nhiệt độ ủ là 550, ta có chương trình cài đặt như sau: Bảng 3. Chương trình cài đặt các bước Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ I 940 5’ 1 II 950 1:30’’ 30 550 1:30’’ 720 1:30’’ III 720 5’ 1 IV 40 Cho đến khi lấy ra (Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011) Trường hợp nhiệt độ ủ là 600C hay 630C ta chỉ thay đổi nhiệt độ ủ 550C ở bước II thành 600C hay 630C. 2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Phân tích phân ly di truyền Các số liệu phân tích phân ly di truyền tính trạng kháng rầy được xử lý thống kê (Gomez and Gomez, 1984) theo phép thử “x2”. Như vậy ở đây, khi có 2 lớp phân ly (m=2), ta có: X2=〖(|Q_1L_1 |0,5)〗2L_1 + 〖(|Q_(2) L_2 |0,5)〗2L_2 Còn trong trường hợp có trên 2 lớp phân ly (m>2), ta có: X2=∑_(i=1)m▒(Q_iL_i )2L_i Trong đó: i= 1, 2, …., m m là số lớp phân ly Qi là tần số quan sát thực tế của lớp i Li là tần số xuất hiện lý thuyết của lớp i Từ giá trị « X2 tìm được , tra bảng thống kê để tìm giá trị P tương ứng. Nếu P>0,05 thì tỉ lệ phân ly thực nghiệm được coi là phù hợp với lý thuyết. Tương dồng di truyền và khoảng cách di truyền Phân tích mức tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo chương trình PopGene, theo công thức của Nei (1972) 146 : I=q_12√(Q_1 Q_2 ) và D = ln (I) Trong đó : I – mức tương đồng di truyền D – khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu q12 – số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu Q1 và Q2 tổng số các alen của mẫu 1 và mẫu 2. Phân tích liên kết Phân tích liên kết các chỉ thị phân tử với locut gen kháng rầy nâu và định vị các locut gen kháng rầy nâu trên nhiễm sắc thể của lúa được tiến hành theo chương trình máy tính MapMarker. 2.2.2.5. Giải trình tự DNA và xác định gen ITS Kỹ thuật nàydựa trên phương pháp Sanger (Sanger er al.,1977). Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy các oligonucleotid cuùng chấm dứt tại một dideoxxynucleotid sẽ có cùng một màu. DNA được giải trình tự bởi công ty DNA Sequencing ServicesGeneral Order Information, Hàn Quốc trên máy đọc trình tự tự động. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết Phương pháp thu thập thông tin, phân tích, so sánh, tổng hợp. Phân loại thông tin nghiên cứu. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu Nội dung cần thu thập trong quá trình nghiên cứu tài liệu. Nguồn tài liệu: các Bài báo, Hội thảo khoa học, Giáo trình Hóa sinh, các Luận văn và Luận án khoa học liên quan đến cây Phước lộc thọ, các trang Web liên quan Phân tích tài liệu. Tổng hợp tài liệu. 2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Các thông tin được thu thập phải đảm bảo chính xác, có độ tin cậy cao nhất.. Kết quả của nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến hoạt động kinh doanh và sản xuất của các cơ quan nghiên cứu. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí: Kinh độ: …. Vĩ độ: …… Loài (species): … Chi (genus): … Họ (familia): …. Bộ (ordo):… Lớp: Giới (regnum): Tên khác: 3.1.1. Thân. 3.1.2. Lá 3.1.3. Rễ 3.1.4. Hoa 3.1.5. Quả 3.1.6. Hạt 3.2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 3.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 3.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 3.2.2.1. Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR 3.2.2.2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: 3.2.2.3. Tiến hành phản ứng PCR. 3.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA 3.3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP 3.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA 3.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 3.4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY THIÊN THẢO CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu, tổng hợp tài liệu qua các báo cáo khoa học của đã khẳng định. 4.1.1.Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí: Kinh độ: Vĩ độ: Tên khoa học: Loài (species): Chi (genus): Họ (familia): Lớp: Giới (regnum): Plantae. Tên khác: Đặc điểm chỉ thị hình thái thu được phù hợp với cây Thiên Thảo mô tả trong đề tài. Thân Lá Rễ Hoa Quả Hạt Kết luận: 4.1.2. Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây Thiên Thảo 4.1.3. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên Thảo và trình tự gen của cây này 4.2. KIẾN NGHỊ Nhà trường tạo điều kiện để chúng em nghiên cứu sâu thêm về dược liệu cây Phước lộc thọ ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tiếp tục xây dựng thêm chỉ thị phân tử cho nguồn dược liệu ở Đồng bằng sông Cửu Long. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Basilicum polystachyon (L.) Moench a Rare Mint in Taiwan, Department of Biological Sciences and Technology, National University of Tainan, Tainan, Taiwan, 2017. 2. Bộ Y Tế, 2006. Giáo trình Dược cổ truyền.Nhà xuất bản Y học. Tr. 358 3. Bộ Y Tế, 2018. Dược điển Việt Nam 5. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 11541156 4. Bộ Y tế, 2018. Dược Điển Việt Nam 4. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 606607608. 5. Bộ Y tế, 2018. Dược Thư Quốc Gia Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 30813087. 6. Nguyễn Đức Thành, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH CN Việt Nam, Tạp chí sinh học Các kĩ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và chọn lọc thực vật, 2014. 7. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006. Các phương pháp nghiên cứu thực vật. NXB Giáo Dục. 8. Pharmacognostical studies on the leaves of Basilicum polystachyon Moench Asian Journal of Traditional Medicines, 2013. 9. The journal of economy, environment and society, JEES Vol. 2 Issue 2 Singh, V.K., Chaudhuri, S., Maiti, G.G. Mandal, M . 2018. 10. Trang web https:thongtinthuoc.orgcaythienthao.html truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021. 11. Trang web https:www.academia.edudownload38604710basilicum.pdf truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021. 12. Trang web https:amp.thaythuoccuaban.comvithuoccaythienthao.htm truy cập ngày 29 tháng 9 năm 2021. PHỤ LỤC Phụ lục A   Phụ lục B. Quy trình ly trích DNA Tách chiết DNA: Nghiền 200l mẫu trong túp eppendorf bằng máy nghiền. Thêm 1ml dung dịch trích (EB) và 50l SDS (10%). Ủ 65 trong 30’ (5’ đảo nhẹ) Li tâm 13.000rpm trong 10’. Chuyển phần trong (800l) vào túp mới và thêm một lượng tương đương Isopropanol, ủ 2 giờ ở 20oC. Li tâm 13.000rpm trong 10’, hoà tan DNA trong 400 l TE. Thêm 10l Rnase (10mgml) ủ ở 37 trong 15’. Thêm 400l CTAB buffer và ủ ở 65 trong 15’, thỉnh thoảng đảo ngược ống túp để trộn đều. Thêm 800l ChloroformIsoamylalcohol (24:1) và trộn đều.Litâm 13.000rpm trong 5’. Chuyển phần dung dịch trong qua túp 2.2 ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15’. Li tâm 13.000rpm trong 10’, đổ bỏ phần trong và rửa phần cặn với ethanol 70% bằng 700l.Li tâm lần nữa để loại bỏ ethanol. Để vào máy li tâm chân không 45 trong 10’. Hoà tan DNA trong 200l TE 0.1. (Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011) Phản ứng PCR Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (White et al., 1990) có trình tự sau: ITS 1: 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’ ITS 4: 5’TCCTCCGCTTATTG ATATGC3’ Quá trình thực hiện phản ứng PCR: Hóa chất Thể tích (µl) H20 34,5 PCR buffer (10X Taq buffer (NH4)2SO4) 5 Polymerisation MgCl2 (25mM) 3 dNTPS 3 Primer F 1 Primer R 1 Taq DNA polymerase (5uµL) 0,5 DNA 2 Tổng cộng 50 Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 Biến tính 30 95 5 phút 95 60 giây 2 Bắt cặp 30 54 50 giây 3 Kéo dài 30 72 90 giây 72 5 giây Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự bằng hệ thống giải trình tự tự động. Kết quả này sẽ được so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank trên trang web NCBI bằng công cụ BLASTN.   Phụ lục C. CÁC HÌNH ẢNH CÂY THIÊN THẢO TẠI AN GIANG   XÁC NHẬN CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TP. Cần Thơ, ngày… tháng… năm 202.. GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN CHẤM 1 Họ và Tên:… Nhận xét: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….   NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN CHẤM 2 Họ và Tên:………………………………..…………………………………….. Nhận xét: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

DNA

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS THIỀU VĂN ĐƯỜNG Họ và tên:

MSSV:

Lớp:

Cần Thơ , 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

DNA

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS THIỀU VĂN ĐƯỜNG Họ và tên:

MSSV:

Lớp:

Cần Thơ , 2021

2

LỜI CẢM ƠN

"Quá trình thực hiện tiểu luận tốt nghiệp là giai đoạn quan trọng nhất trongquãng đời mỗi sinh viên Tiểu luận tốt nghiệp là tiền đề nhằm trang bị cho em những

kỹ năng nghiên cứu, những kiến thức quý báu trước khi lập nghiệp

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Dược – Điều dưỡng,Trường Đại Học Tây Đô đã tận tình chỉ dạy và trang bị cho em những kiến thức cầnthiết trong suốt thời gian ngồi trên ghế giảng đường, Làm nền tảng cho em có thể hoànthành được bài luận văn này

Em xin trân trọng cảm ơn thầy TS Thiều Văn Đường đã tận tình giúp đỡ, định

hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học Đó là những góp ý hết sức quý báukhông chỉ trong quá trình thực hiện tiểu luận này mà còn là hành trang tiếp bước cho

em trong quá trình học tập và lập nghiệp sau này

Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp Đại HọcDược 12B, những người luôn sẵn sàng sẻ chia và giúp đỡ trong học tập và cuộc sống.Mong rằng, chúng ta sẽ mãi mãi gắn bó với nhau

Xin chúc những điều tốt đẹp nhất sẽ luôn đồng hành cùng mọi người.”

Sinh viên thực hiện (Ký ghi rõ Họ tên)

Trần Khánh Duy

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân em và được sựhướng dẫn khoa học của TS Thiều Văn Đường Các nội dung nghiên cứu trong đề tài

“Xác định tên khoa học cây Thiên Thảo trồng tại tỉnh An Giang bằng chỉ thị hình thái

và giải trình tự gen DNA” của em là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thứcnào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhậnxét, đánh giá được cá nhân thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ nguồn gốc Nếuphát hiện có bất kỳ sự gian lận nào em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung bàitiểu luận của mình

Sinh viên thực hiện (Ký ghi rõ Họ tên)

Trần Khánh Duy ii

TÓM TẮT

TÍNH CẤP THIẾT

Cây thiên thảo là cây hàng năm với chiều cao khoảng 40cm Đây là một câythuốc quý thường được sử dụng trong đông y Từ lâu, cây Thiên thảo đã được sử dụngchữa xương khớp (phong thấp, đau lưng, mỏi khớp), đầy bụng, trướng bụng, ăn khôngtiêu Theo y học cổ truyền, dược liệu Thiên thảo ở Khánh Hoà, nhân dân dùng toàncây sắc thuốc chữa bạch đới, khí hư Lá trị phong thấp, kinh phong, tim đập nhanh,bệnh thần kinh (Theo Phạm Hoàng Hộ) Đây là loại cây rất có tiềm năng để khai thác

về mặt dược lý, trong tương lai có thể trở thành một dược liệu có giá trị kinh tế cao Vìvậy, việc “Xác định tên khoa học của cây Thiên thảo (Basilicum polystachyon (L.)Moench (Lamiaceae)) trồng tại An Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự genDNA” rất cần thiết Thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu khẳng định tên khoa học câyThiên thảo bằng chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử và vai trò cây Thiên thảo chữa trịbệnh đối với sức khỏe con người

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đề tài này được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứu chính là:

- Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu

- Phương pháp chỉ thị phân tử để xác định chính xác gen đặc trưng, (trình tựnucleotid gen ITS) của cây Phước lộc thọ theo phương pháp Sanger

- Xác định những công bố mới về tác dụng của cây Thiên thảo đối với chữa trịcác căn bệnh đặc trị đối với sức khỏe của con người

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đề tài đã tổng hợp và trình bày tương đối đầy đủ tên khoa học, đặc điểm hìnhthái, vai trò của cây Thiên thảo chữa trị một số bệnh thường gặp trên đất nước Việtnam

Chiết xuất và tinh sạch DNA, giải trình tự gen DNA theo phương pháp Sangertrình tự gen ITS của cây Thiên thảo làm chỉ thị phân tử trong phân loại

Một số công bố mới về tác dụng của cây Thiên thảo đối với chữa trị các căn

bệnh đặc trị đối với sức khỏe của con người

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Đề tài đã công bố được 04 kết luận chính xác, tin cậy và xác định đúng tên khoahọc của cây Thiên thảo Đưa ra 02 kiến nghị hợp lý nhằm mở rộng đề tài, nghiên cứu rộng về vai trò cây Thiên thảo đối với sự phát triển kinh tế, xã hội tại Đồng bằng Sông Cửu Long

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY THIÊN THẢO 3

1.2.1 Khái niệm về chỉ thị 3

1.2.2 Phân loại 3

1.2.3 Đặc điểm hình thái 4

1.2.4 Đặc điểm vi phẫu 6

1.2.5 Đặc điểm sinh thái 8

1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ 9

1.3.1 Khái niệm 9

1.3.2 Chiết xuất và tinh sạch DNA 9

1.3.3 Phương pháp PCR 10

1.3.4 Giải trình tự gen (DNA) 11

1.4 VAI TRÒ CỦA CÂY THIÊN THẢO VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI 11 1.4.1 Dược liệu 11

1.4.2 Một số bài thuốc cổ truyền 12

1.4.3 Vai trò đối với sức khỏe con người hiện nay 12

1.4.4 Một số lưu ý khi sử dụng cây Thiên Thảo 12

1.4.5 Một số chế phẩm sử dụng hôm nay 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Thời gian, chọn mẫu và nguyên vật liệu nghiên cứu 14

2.1.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 14

2.1.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 14

iv

2.1.1.3 Cách bảo quản mẫu 14

2.1.2 Nguyên liệu, Hóa chất, Thiết bị 14

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái 15

2.2.2 Phương pháp chỉ thị phân tử 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 20

2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết 20

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tài liệu 20

2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 21

3.1.1 Thân 21

3.1.2 Lá 21

3.1.3 Rễ 21

3.1.4 Hoa 21

3.1.5 Quả 21

3.1.6 Hạt 21

3.2 HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 21

3.2.1 Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn 21

3.2.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn 21

3.3 KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP 21

3.3.1 Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA 21

3.3.2 Kết quả giải trình tự gen DNA 21

3.3.3 Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI 21

3.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY THIÊN THẢO 21

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 22

4.1 KẾT LUẬN 22

4.1.1.Mẫu cây Thiên Thảo được thu thập tại An Giang ở vị trí: 22

4.1.2 Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây Thiên Thảo 22

4.1.3 Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên Thảo và trình tự gen của cây này 22

4.2 KIẾN NGHỊ 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

PHỤ LỤC 24

Phụ lục A 24

Phụ lục B Quy trình ly trích DNA 25

Phụ lục C CÁC HÌNH ẢNH CÂY THIÊN THẢO TẠI AN GIANG 27

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Hình thái cây và cụm hoa 4

Hình 2 Cành cây, hoa, đài hoa chia đôi, tràng hoa chia đôi 5

Hình 3 Thân và rễ cây 5

Hình 4 Hoa và tán cây 5

Hình 5 Hạt cây 6

Hình 6 Mặt cắt ngang của cuống lá cho thấy các vùng khác nhau 8

Hình 7 Ảnh hiển vi SEM của hạt phấn và hạt của cây 9

Hình 8 Kinh Mạch Xương Khớp – Thiên Thảo Mộc 14

Hình 9 Thảo Linh Tiên 14

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất 16 Bảng 2 Thành phần và thứ tự phản ứng PCR 18 Bảng 3 Chương trình cài đặt các bước 19

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT Kí hiệu chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

ii

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng những loài cây hoang dại để làm thức ăn,vật liệu xây dựng, chất đốt, thức ăn gia súc hay làm đồ gia dụng và đặc biệt hơn làđược dùng làm thuốc chữa bệnh Lúc này, người ta chỉ biết dùng cây cỏ mọc hoang dại

để làm thuốc trị một số chứng bệnh thông thường như cảm, sốt, đau đầu, bệnh ngoài

da Sau này, đi sâu tìm hiểu về cây cỏ chữa các bệnh nan y về gan, thận, tim mạch…Cho đến ngày nay, dù cho khoa học hiện đại phát triển theo hướng sử dụng hóa chấtlàm thuốc chữa trị thì cây cỏ làm thuốc vẫn đóng một vai trò quang trọng trong nền Yhọc cổ truyền và chính là nguồn nguyên liệu quý giá cho nhiều loại thuốc hiện đại cónguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên

Nước ta nằm trong vùng vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, có địa hình thay đỗi

từ Bắc chí Nam, nhiệt độ và lượng mưa trung bình hằng năm phân bố không đồng đều

đã tạo nên nhiều kiểu thảm thực vật quan trọng, với nguồn tài nguyên thiên nhiênphong phú và đa dạng chủng loại, trong đó có nguồn tài nguyên cây thuốc Theo thống

kê của Viện Dược liệu (Bộ Y tế), tính đến cuối năm 2016 đã ghi nhận và thống kêđược ở Việt Nam có 5.117 loài thực vật có giá trị làm thuốc, đóng một vai trò đặc biệtquan trọng trong việc cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu sản xuất thuốc trong nước

và xuất khẩu thế giới

Tuy nhiên, do tình trạng khai thác tài nguyên quá mức, nạn cháy rừng, nóng lêntoàn cầu, cũng như áp lực gia tang dân số và nhu cầu sử dụng thuốc chữa bệnh ngàycàng nhiều, đặc biệt là các dược liệu nguồn gốc tự nhiên rất được ưa chuộng, dẫn đếnnguồn tài nguyên cây thuốc ngày một bị cạn kiệt, nhiều loài cây thuốc đang phải đốimặt với nguy cơ bị tuyệt diệt

Bên cạnh đó, một số loại cây được phát hiện khá sớm ở thời điểm khoa học chưatiên tiến hay ở những địa điểm mà trình độ kỹ thuật không cao Điều này rất dễ dẫnđến việc sai sót trong đánh giá tiềm năng chữa bệnh của một số cây Một số cây khiphát hiện chỉ được nghiên cứu sơ bộ về mặt hình thái hay thậm chí là những mô tả mơ

hồ về hình dáng bên ngoài cây Chính điều này khiến một số cây đáng ra có thể cótiềm năng trở thành một vị thuốc, một dược liệu, lại chỉ được con người dùng như mộtcây cảnh để trang trí Điển hình như cây Thiên thảo

Về mặt dược liệu, hầu như không có bất cứ tài liệu khoa học nào nghiên cứu vềcây Thiên thảo, cho nên về mặt tác dụng dược lí hầu như là không được biết đến Điềunày có thể do loại cây này lúc được phát hiện đã không được nghiên cứu kỹ

Nói đến cây Thiên thảo sự hiểu biết và mô tả theo chỉ thị hình thái mới đượctrình bày từ những năm 70 thế kỷ trước Điều này khiến cho hiểu biết của chúng ta về

loại cây này hầu như là rất sơ khai Đến nay nghiên cứu DNA các cây dược liệu trởthành xu hướng chung trong nghiên cứu dược liệu Mục đích việc xác định chính xácloài dược liệu là vô cùng cần thiết, vì khi xác định chính xác mới tìm kiếm và sử dụngtốt các sản phẩm của dược liệu Đây chính là cơ hội cho chúng ta tìm ra những dượcliệu mới từ những loại cây mà chúng ta đã lãng quên vì cho rằng chúng chỉ mang tínhtrang trí

Đến nay, việc tìm hiểu đầy đủ về cây Thiên thảo để đưa loại cây này thành thuốc

và thực phẩm chức năng trở thành yêu cầu tất yếu với các nhà Dược học Sự phát triểnvượt bậc của công nghệ DNA và giải trình tự gen từ cuối thế kỷ XX cho tới nay, trởthành công cụ chính xác và kịp thời đã giúp xác định các loài cây cũng như cây làmdược liệu không còn khó khăn Chỉ thị phân tử trở thành công cụ chính xác tuyệt đốitrong phân loại thực vật, động vật Nhiệm vụ của chúng tôi dựa trên các chỉ thị hìnhthái và chỉ thị phân tử để xác định chính xác cây Thiên thảo Đưa chỉ thị này trở thànhchỉ thị chính xác định ngay mà không còn phải chờ đợi thời gian Vì những lý do trên

đi đến thực hiện đề tài “Xác định tên khoa học cây Thiên Thảo trồng tại tỉnh An

Giang bằng chỉ thị hình thái và giải trình tự gen DNA”

Đề tài này khi hoàn thành đảm bảo được mục tiêu chính là xác lập chỉ thị phân tửlàm công cụ xác định tiềm năng trở thành dược liệu của cây Thiên thảo Để hoàn thànhmục tiêu này đòi hỏi nghiên cứu phải thực hiện được mục tiêu cụ thể sau đây:

- Khái quát được những hiểu biết về cây Thiên thảo cho đến hiện nay

- Sử dụng chỉ thị hình thái mô tả chính xác đặc điểm thực vật học của cây Thiênthảo

- Xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA cây Thiên thảo

- Giải trình được trình tự gen ITS của cây Thiên thảo làm chỉ thị phân tử

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN

1.1.1 Trên thế giới

Basilicum polystachyon (L.) Moench là một loài thực vật thuộc chi Lamiaceae, phân

bố nhiều ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Á và Châu Úc Loài này được tìm thấy ở phíanam của Đài Loan trong thời kỳ thuộc địa của Nhật Bản, không có tài liệu thu thập nàođược thấy sau giải phóng, theo số liệu thu thập thực địa gần đây, loài này được tìm thấy ởnhững vùng đất trống và hoang vu phía nam Đài Loan Bài báo này mô tả các đặc điểmphân loại, ảnh và sự phân bố của nó và lần đầu tiên báo cáo rằng nó là hạt phấn 6 khe cókiểu hình lưới trên bề mặt và nhiễm sắc thể 2n = 60 Loài này được (L.) Moench mô tả khoahọc đầu tiên năm 1802

1.1.2 Ở Việt Nam

Thường mọc ở chỗ đất hoang từ Thừa Thiên - Huế tới Cần Thơ Được dùng như các

vị thuốc Dân gian, chưa có nhiều nghiên cứu khoa học

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI CÂY THIÊN THẢO

1.2.1 Khái niệm về chỉ thị

Để phân biệt các cá thể khác nhau của cùng một loài, người ta thường dùng chỉ thị ditruyền Chỉ thị đi truyền là một tính trạng hay một thuộc tính có thể đo đếm được và có khảnăng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác

Theo Paterson và cộng sự, một tính trạng được coi là chỉ thị đi truyền nhất thiết phảibảo đảm hai tiêu chuẩn:

- Phải phản ánh được sự đa hình giữa bố và mẹ

- Phải được truyền lại chính xác cho thế hệ sau

Các chỉ thị dị truyền có vai trò như thế nào đối với các nghiên cứu di truyền và chọngiống.Chỉ thị di truyền rất hữu ích trong việc nghiên cứu sự thừa kẻ những dấu hiệu đitruyền và sự biến đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là những chỉ thị liền quan đến tínhtrạng nông sinh học có lợi cho con người Những chỉ thị này từ lâu đã là những công cụ cóích trong chương trình chọn giống (Retter và ctv - 1993)

Dựa vào 2 tiêu chuẩn của chỉ thị di truyền, người ta phân loại chỉ thị di truyền thành:chỉ thị hình thái, chỉ thị sinh hóa và chỉ thị phân tư DNA

1.2.2 Phân loại

Tên khoa học: Basilicum polystachyon (L.) Moench (Lamiaceae).

Họ: Hoa môi - Lamiaceae.

Tên khác: Sonakki poondu (Tamil), Thiến thảo, Phòng phong thảo, Thổ hoắc hương.

Basilicum polystachyon war stereocladum Briq, Ocimum dimidiatum,…

Hình 2 Basilicum polystachyon: A Cành cây; B Hoa; C Đài hoa chia đôi (mặt lưng); D tràng hoa chia đôi (mặt bụng); E Gynoecium; F Đai ốc.

4

1.2.3.3 Rễ cây

Hình 3 Thân và rễ cây 1.2.3.4 Hoa

Hoa nhỏ mọc thành vòng; lá bắc cỡ 1mm; đài 5 tai, một cái lớn và 2 cái rất hẹp, tràng đỏ, 4tai gần như bằng nhau; 4 nhị Cây ra hoa tháng 3-4

Hình 4 Hoa và tán cây 1.2.3.5 Quả

Quả hạch có hình elip theo chiều dọc, màu nâu, hơi dẹt ở lưng và bụng, chiều dài khoảng 7

mm và có các sọc lồi giống lưới tròn trên bề mặt Thời kỳ đậu quả: tháng 5 đến tháng 10

15 µm Nhu mô xốp sắp xếp lỏng lẻo, tế bào không đều và có kích thước 9-12-14,6 x 10,5 µm Các bó mạch là tài sản thế chấp, bao gồm xylem và phloem Tế bào Xylem có kíchthước 2,7-5,5-8 x 1,8-3,6-5,4 µm

5-9,4-Các tĩnh mạch được xếp lại, số lượng dây thần kinh bên ít hơn, các đầu dây thần kinhkết thúc một cách mù quáng, số lượng tiểu đảo tĩnh mạch là

6

7,33 mỗi sq.mm và số kết thúc tĩnh mạch là 5,37 mỗi sq.mm Khí khổng thuộc loạidiacytic, được tìm thấy ở cả biểu bì trên và biểu bì dưới (lưỡng tính) (Hình 6-10) Chỉ số khíkhổng cho biểu bì trên là 16,6 trên một đơn vị diện tích và 19,7 trên một đơn vị diện tíchcho biểu bì dưới.

Lá

Phần ngang của cuống lá có dạng góc cạnh Biểu bì 1 lớp, cấu tạo bởi các tế bàonhỏ hình chữ nhật Bên cạnh biểu bì trên được tìm thấy 2-3 lớp nhu mô Một số tế bào chứađầy chất diệp lục tạo thành chlorenchyma Mô đất nhiều lớp, nhu mô Các bó mạch đượcsắp xếp rõ ràng, bao gồm x 25-35,5-40,8 µm (Hình 16-18) 4 Sợi có thành dày, lòng ốnghẹp và có đầu nhọn, kích thước 157,6-257,7-319,4 x 5,7-13,8- 15,8 µm (Hình 19) 5 Cácbình có bề dày hình xoắn ốc hoặc có rỗ mắt, có kích thước 109,2-153,3-170 x 14,4-23-28,7

µm (Hình 20-22)

Hình 6 1 Habit 2 Cành lá 3 Lá khô (thuốc thô) 4-30: Các ký tự vi thể: 4-6 Mặt cắt ngang của cuống lá cho thấy các vùng khác nhau 7- 8 T s của lamina cho thấy các mô khác nhau 9 Mô hình Venation 10 Vỏ biểu bì trên cho thấy lỗ khí 11 Vỏ biểu bì dưới cho thấy lỗ

khí.

Rễ

Hoa

Tràng hoa của loại cây này có 2 thùy trên và dưới hình môi, thùy môi trên Phấn hoacủa loài này có hình cầu và hình elip theo chiều dọc, có 6 rãnh, rãnh mảnh, trên bề mặt cóhoa văn giống lưới, bên dưới có lớp hình trụ rõ ràng.

Quả

Hạt

Hình 7 Ảnh hiển vi SEM của hạt phấn và hạt của cây Basilicum polystachyon (L.) Moench từ Đài Loan A và B, chế độ xem hướng dẫn của một hạt phấn hoa có tầng hình lưới; C và D, hình chiếu từ cực của hạt phấn 6 colpate với tectum dạng lưới; E và F, đai ốc

có bề mặt lưới (thanh = 5 em đối với A, C và F; 1 em đối với B và D, và 100 em đối với E).

1.2.5 Đặc điểm sinh thái

Cây Thiên Thảo dễ dàng phát triển với sự chăm sóc tối thiểu Nó có thể thích nghivới ánh sáng lọc hoặc ánh nắng đầy đủ, nó có thể chịu bóng râm một phần hoặc toàn phần.Tuy nhiên, nó sẽ ra hoa nhiều hơn ở nơi ấm áp và nhiều nắng Tưới nước thường xuyên vàvừa phải Nó thích một môi trường ẩm ướt

Thích đất ẩm, màu mỡ hoặc giàu mùn và thoát nước tốt Nó có khả năng chịu mặn vàphát triển tốt gần bãi biển.Thỉnh thoảng nên phun sương nếu thời tiết quá nóng và khô

8

1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ

1.3.1 Khái niệm

Nói chung thì chỉ thị (marker) là một dấu hiệu, một đặc trưng có thể nhận biết đượcgiúp chúng ta phân biệt thứ này với thứ khác Ví dụ, khi muốn phân biệt giữa lúa tẻ và lúanếp chúng ta có thể quan sát hình thái của hạt; hạt lúa nếp thường tròn hơn hạt lúa tẻ Khi

đó, hình dạng hạt là một loại chỉ thị, gọi là chỉ thị hình thái (morphological marker)

Tương tự, chỉ thị phân tử (molecular marker) hay chỉ thị di truyền (genetic marker)cũng là các dấu hiệu, hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể Điểm khác biệt lànhững chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài mà là dựa trên sự khác biệt về trình tựgen của mỗi sinh vật Chỉ thị phân tử thường là các đoạn DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễmsắc thể, và đoạn DNA này liên kết chặt với tính trạng đang khảo sát Liên kết chặt có nghĩa

là trong quá trình sinh sản, chỉ thị phân tử đó luôn được di truyền kèm với tính trạng đangkhảo sát cho thế hệ con

Ví dụ: Giả sử ta cần chọn giống lúa kháng bệnh XYZ Hiện tại, ta đã thu thập được 2dòng lúa thuần L1 và L2 phục vụ cho việc lai tạo Dòng L1 có năng suất cao, chất lượng gạongon nhưng lại dễ nhiễm bệnh Dòng L2, có năng suất khá, chất lượng trung bình nhưng cókhả năng kháng bệnh XYZ Hi vọng là bằng cách lai tạo giữa L1 và L2 ta có thể thu đượcdòng F1 có năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh tốt

Nếu việc này được thực hiện bằng phương pháp chọn giống truyền thống thì sẽ mấtrất nhiều thời gian Đó là do sau mỗi lần lai tạo ta lại phải trồng con lai, đợi chúng trưởngthành và sau đó đánh giá từng tính trạng một Như trong trường hợp này là phải đánh giákhả năng kháng bệnh, năng suất và chất lượng gạo Nếu bằng cách nào đó chúng ta pháthiện được các chỉ thị phân tử (đoạn DNA) luôn xuất hiện kèm với (1) đặc điểm năng suấtcao, (2) chất lượng tốt, và (3) kháng bệnh thì ta có thể sàng lọc bố mẹ hoặc con lai mongmuốn ngay từ rất sớm dựa trên việc xác định những đoạn DNA này Chỉ cần tách chiếtDNA tổng số và tiến hành thêm vài bước phân tích nữa là được.Chúng ta tìm hiểu thêm vềcác chỉ thị phân tử thường dùng

1.3.2 Chiết xuất và tinh sạch DNA

Tách chiết DNA là một quá trình vật lý và hóa học được sử dụng để tinh lọc DNA từmột mẫu Tách chiết DNA là một khía cạnh quan trọng trong bối cảnh sinh học phân tử vàkhoa học pháp y Quy trình này gồm ba bước cơ bản Ban đầu, các ô quan tâm sẽ được lấy.Tiếp theo, quá trình ly giải tế bào được tạo điều kiện để phá vỡ màng tế bào, màng tế bào

mở ra và bộc lộ tế bào chất cùng với DNA Các chất hoạt động bề mặt hoặc các chất tẩy rửakhác có thể được sử dụng để tách lipid khỏi màng tế bào trong khi các protein hiện diệnđược dị hóa bởi protease Đây là một bước tùy chọn Một khi tế bào bị ly giải, các phân tử

bị dị hóa sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc kết tụ các phân tử dị hóa bởi các dung dịchmuối đậm đặc Tiếp theo là ly tâm dung dịch để tách các cục vụn ra khỏi DNA Trong giai